JPWO2007055261A1

JPWO2007055261A1 - Ｕｇｔ１ａ１遺伝子多型の検査法

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Publication number: JPWO2007055261A1
Application number: JP2007544171A
Authority: JP
Inventors: 純一東; 慈藤尾; 剛史福田; 大野　雅子; 雅子大野; 智子田邊
Original assignee: Osaka University NUC; New Industry Research Organization NIRO
Current assignee: Osaka University NUC; New Industry Research Organization NIRO
Priority date: 2005-11-10
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2009-04-30
Also published as: WO2007055261A1

Abstract

本発明は、ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法であって、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域のほか、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する少なくとも１つの遺伝子領域を同一の遺伝子増幅反応によって増幅する工程と、得られた増幅断片を制限酵素によって消化した後、キャピラリー電気泳動に供する工程とを含み、キャピラリー電気泳動の結果に基づいて複数の多型を同時に判定する。同様の方法で、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子多型も簡易迅速かつ精度良く検査することができる。

Description

本発明は、ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法に関し、より詳細には、臨床的に重要なＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型と一緒に、他の重要な多型である一塩基多型（ＳＮＰ）を簡易迅速かつ精度良く検査する方法に関する。本発明は、例えば、ＵＧＴ１Ａ１で代謝される薬剤の薬効あるいは副作用を調べる検査などに有用な技術を提供するものである。

生体内抱合酵素であるＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（以下、「ＵＧＴ１Ａ１」という。）は、ビリルビンおよび外来薬物の代謝に関与する酵素である。この酵素には、その発現量や酵素活性に影響を及ぼす遺伝子多型の存在が幾つか報告されている（下記非特許文献１〜４）。さらに、幾つかのＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型は、抗がん剤であるイリノテカンの副作用に関係し、あるいは日本人に比較的多い新生児黄疸に関係することが報告されている（下記非特許文献５〜７）。

これまでＵＧＴ１Ａ１遺伝子には３０種類以上の遺伝子多型が報告されているが、ここでは臨床的に重要と考えられている６つの遺伝子多型について説明する。１つは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の上流、プロモーター領域に存在するＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型である。ＵＧＴ１Ａ１＊２８アレルは、プロモーター領域ＴＡＴＡボックスにおけるＴＡ配列の繰り返しが、多数を占める野生型アレル（ＵＧＴ１Ａ１＊１アレル）では６回であるのに対し、７回の繰り返し配列になっている。ゲノム上、−４０〜―３９番目にＴＡ配列が挿入されたアレルであるので、「-40_-39insTA」とも表記される。（ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の翻訳開始点を「＋１」とする。）

他の５つの遺伝子多型は、ＵＧＴ１Ａ１＊６、ＵＧＴ１Ａ１＊２７、ＵＧＴ１Ａ１＊２９、ＵＧＴ１Ａ１＊７、及びＵＧＴ１Ａ１＊６０に関する多型である。これら５つの遺伝子多型はすべて一塩基多型（ＳＮＰ）であり、ＵＧＴ１Ａ１＊６０に関する多型を除いてエキソンに存在し、翻訳産物にアミノ酸置換を生じさせる。ＵＧＴ１Ａ１＊６アレルは、野生型ではグアニン（Ｇ）であるエキソン１上の２１１番目の塩基がアデニン（Ａ）になっており、その多型部位は「G211A」と表記される。ＵＧＴ１Ａ１＊２７アレルは、野生型ではシトシン（Ｃ）であるエキソン１上の６８６番目の塩基がアデニン（Ａ）になっており、その多型部位は「C686A」と表記される。ＵＧＴ１Ａ１＊２９アレルは、野生型ではシトシン（Ｃ）であるエキソン４上の１０９９番目の塩基がグアニン（Ｇ）になっており、その多型部位は「C1099G」と表記される。ＵＧＴ１Ａ１＊７アレルは、野生型ではチミン（Ｔ）であるエキソン５上の１４５６番目の塩基がグアニン（Ｇ）になっており、その多型部位は「T1456G」と表記される。

ＵＧＴ１Ａ１＊６０アレルは、野生型ではチミン（Ｔ）であるー３２７９番目の塩基がグアニン（Ｇ）になっており、その多型部位は「T-3279G」と表記される。（「T-3263G」と表記されることもある。）このように、ＵＧＴ１Ａ１＊６０アレルの多型部位は、プロモーター領域に存在するＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型部位よりも更に上流に位置するものとなっている。

上記６種の遺伝子多型はいずれも臨床的に重要と考えられているが、日本人に存在が確認され、臨床的に特に重要なものして、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６、及びＵＧＴ１Ａ１＊６０の３種の多型を挙げることができる。なかでも、ＵＧＴ１Ａ１＊２８をもつ患者がイリノテカンの投与を受けた場合、副作用の危険性が高くなるといわれているが、上記のように、ＵＧＴ１Ａ１＊２８はＴＡＴＡボックスにおいてＴＡ配列の繰り返しが１回多い多型であり、野生型との長さの差異がわずか２塩基であるため、通常のＰＣＲ-ＲＦＬＰ法などでは多型の検出が困難であった。

ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型を検出する方法として、これまでにメルティングカーブ法、ダイレクトシークエンス法、パイロシークエンス法による検出例が報告されている。メルティングカーブ法は、ＤＮＡ分子の融解温度がその核酸組成に依存することを利用し、メルティングカーブ分析によってＰＣＲ産物の融解温度（Ｔｍ値）を解析することで、多型を検出する方法である。同方法は、ロシュ社製のライトサイクラー機器において採用されており、多型検出に要する時間は短いが、初期に設備コストがかかる。ダイレクトシークエンス法は、ＰＣＲ産物をシークエンサーにより直接配列決定し、多型を検出する方法であり、判定は正確だが、コストと時間と手間がかかる。パイロシークエンス法は、化学発光を観測し、その発光から相補鎖合成を検知し、ＤＮＡ分子を配列決定することで、多型を検出する方法である。同方法は、Biotage社製の機器において採用されており、所要時間は短いものの、初期に設備コストがかかる。

また、上記いずれの方法も各多型を個別に検出する方法であり、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型と一緒に、臨床的に重要な他の一塩基多型を、低コストで簡易迅速かつ精度良く検出する方法は未だ確立されていないのが現状である。
N Engl J Med 1995;333:1171-5 Biochim Biophys Acta 1998;1406:267-73 Drug Metab Dispos 2003;31:108-13 Biochem Biophys Res Commun 2002;292:492-7 Cancer Res 2000;60:6921-6 Pharmacogenet Genomics 2005;15:35-41 Pediatrics 1999;103:1224-7

本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、その第１の課題は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法を提供すること、より詳細には、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型と一緒に、臨床的に重要な他の一塩基多型を、低コストで簡易迅速かつ精度良く検査する方法を提供することである。

本発明の第２の課題は、上記方法を他の遺伝子多型検査法に応用し、目的遺伝子に関連する複数の多型、即ち、ある塩基配列が挿入された挿入型とこれを欠く欠失型との間の多型と一塩基多型との組み合わせからなる複数の多型を、低コストで簡易迅速かつ精度良く検査する方法を提供することである。

上記のように、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型はわずか２塩基の長さの差異であり、これを視覚的に検出する必要がある。そのため、ＰＣＲ産物を１００ｂｐ以下に短くし、分解能の高いキャピラリー電気泳動を用いることによって２塩基の長さの差異を検出することを試みた。さらに、同一の遺伝子増幅反応および同一の電気泳動によって、臨床的に重要な他の２箇所の一塩基多型（ＵＧＴ１Ａ１＊６とＵＧＴ１Ａ１＊６０の多型）を同時検査することを試みた。そのため、各一塩基多型を含む遺伝子領域の増幅に際してミスマッチプライマーを使用し、多型部位の塩基に応じて切断される制限酵素切断部位を作り出した。また、３組のプライマーによって３箇所の遺伝子領域を同時に増幅するための条件を検討した。その結果、３箇所の遺伝子領域を同一のＰＣＲ反応で増幅し、制限酵素による消化反応後、キャピラリー電気泳動することによって、簡易迅速かつ高精度に複数の多型を同時検査できること等を見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、産業上並びに医学・医療上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｋ）の発明を包含するものである。
Ａ）ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法であって、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域のほか、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する少なくとも１つの遺伝子領域を同一の遺伝子増幅反応によって増幅する工程と、得られた増幅断片を制限酵素によって消化した後、キャピラリー電気泳動に供する工程とを含み、キャピラリー電気泳動の結果に基づいて複数の多型を同時に判定する方法。
Ｂ）一塩基多型が存在する遺伝子領域として、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及び／又はＵＧＴ１Ａ１＊６に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域を増幅する、上記Ａ）記載の検査方法。
Ｃ）ミスマッチプライマーを使用して一塩基多型が存在する遺伝子領域を増幅する、上記Ｂ）記載の検査方法。
Ｄ）ＵＧＴ１Ａ１＊６０に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域について、配列番号１の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うと共に、制限酵素にＨｉｎｃＩＩを用いることを特徴とする、上記Ｃ）記載の検査方法。
Ｅ）ＵＧＴ１Ａ１＊６に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域について、配列番号５の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うと共に、制限酵素にＭｓｐＩを用いることを特徴とする、上記Ｃ）記載の検査方法。
Ｆ）ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域について、配列番号３の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うことを特徴とする、上記Ａ）記載の検査方法。
Ｇ）ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６に関する３箇所の多型部位を同時に検査することを特徴とする、上記Ｂ）記載の検査方法。
Ｈ）目的遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法であって、挿入部分の有無による多型を含む遺伝子領域のほか、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する少なくとも１つの遺伝子領域を同一の遺伝子増幅反応によって増幅する工程と、得られた増幅断片を制限酵素によって消化した後、キャピラリー電気泳動に供する工程とを含み、キャピラリー電気泳動の結果に基づいて複数の多型を同時に判定する方法。
Ｉ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の検査方法を用いて、被検者の薬剤に対する反応性またはその副作用の程度を予測する方法。
Ｊ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の検査方法を用いて、被検者の抗がん剤に対する反応性またはその副作用の程度を予測する方法。
Ｋ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の検査方法を用いた、遺伝子多型検査キット。

本発明によれば、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域と、一塩基多型が存在する少なくとも１つの遺伝子領域とを同一の遺伝子増幅反応によって増幅後、一塩基多型における塩基の相違に応じて異なる長さのＤＮＡ断片が得られるように、制限酵素によって消化反応を行う。その後、キャピラリー電気泳動によって各試料中のＤＮＡ断片を断片長にしたがって分離・検出する。キャピラリー電気泳動は高分解能であるため、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型における２塩基の長さの差異を検出可能であり、同時に検出された他のＤＮＡ断片の長さから一塩基多型のタイピングが可能である。このように、ＰＣＲ等による増幅反応、制限酵素による消化反応、キャピラリー電気泳動という一連の簡便かつ迅速な方法によって、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の臨床的に重要な複数の多型を高精度に検査・判定することができる。また、キャピラリー電気泳動は大型の設備が不要であり、複数のＰＣＲ産物を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲのため、本発明により低コストでの検査を実現できる。

本発明によってＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型検査を行うことで、ＵＧＴ１Ａ１で代謝される薬剤の薬効または副作用の程度を予測する方法を提供することができる。例えば、抗がん剤イリノテカンの副作用とＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型との間に相関が認められる旨の研究結果が多数報告されており（非特許文献５、６等）、このような研究結果に基づき、本発明による検査結果からイリノテカンを投与した場合の副作用の程度を予測することができる。本発明は複数の遺伝子多型を同時に検査するものであるが、複数の遺伝子多型に基づいて薬の副作用予測、薬効予測することは好ましく、ゲノム情報に基づく個々の患者に適した適正な薬物治療の実現に資し、医療の質の向上、薬の安全性並びに治療効率の向上に寄与することができる。

ＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査によって、血清ビリルビン高値に影響する遺伝的素因を有するか否かを判断することができ、即ち、ＡＳＴ、ＡＬＴなどの肝機能検査値の異常を伴わない血清ビリルビン高値を科学的に説明することが可能となる。本発明の検査方法は、このような検査にも利用可能である。

さらに、本発明によれば、上記検査方法を他の遺伝子多型検査法に応用し、目的遺伝子に関連する複数の多型を、低コストで簡易迅速かつ精度良く検査する方法を提供することができる。

本発明の実施例に係るＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法における、キャピラリー電気泳動の結果を示すゲルイメージである。（ａ）〜（ｃ）は、上記キャピラリー電気泳動の結果を示すグラフである。

以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、塩基・アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、たとえばＤＮＡの塩基の表記については以下のとおりである。

Ａまたはａ：アデニン、Ｇまたはｇ：グアニン、Ｃまたはｃ：シトシン、Ｔまたはｔ：チミン、Ｒまたはｒ：アデニンまたはグアニン、Ｍまたはｍ：アデニンまたはシトシン、Ｗまたはｗ：アデニンまたはチミン、Ｓまたはｓ：グアニンまたはシトシン、Ｋまたはｋ：グアニンまたはチミン、Ｙまたはｙ：シトシンまたはチミン、である。

また、遺伝子多型、遺伝子配列等に関する番号、数値その他の情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のウェブページなどで利用可能な主要な遺伝子データベースにおいて使用されている番号、数値等を参酌して解釈されるものとする。

［１］ＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法
まず、本発明者が実際に行ったＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法（実施例）について説明する。
［本発明のＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法］
日本人由来の１５５サンプルについて、本発明の検査法を用いてＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査・判定した。本実施例では、ＵＧＴ１Ａ１＊６０、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、及びＵＧＴ１Ａ１＊６に関する３箇所の多型を検査対象とし、各多型を含む遺伝子領域の増幅にはＰＣＲ法を使用した。本検査法の特徴の１つは、３組のプライマーを使用し、同一のＰＣＲ条件による同一の遺伝子増幅反応によって、同時に３種のＰＣＲ産物を得る点である。使用した３組のプライマーの配列は下記表１に記載のとおりである。

表１の「配列」の欄において、カッコ内の数字は、同プライマー配列が記載される配列表の配列番号を示す。また、下線部の塩基は、制限酵素切断部位を創出するため、人為的に異なる塩基を挿入した箇所である。このように、ＵＧＴ１Ａ１＊６０用、及びＵＧＴ１Ａ１＊６用の一方のプライマーについては変異プライマー（ミスマッチプライマー）を作製し、これを使用してＰＣＲ反応を行った。

上記ＰＣＲ反応は、表１に示す６本のプライマーを１つのチューブに入れて行った。反応液（２０μＬ）は、６０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．０ユニットのAmpliTaq DNAポリメラーゼ、０．２５μＭのＵＧＴ１Ａ１＊６０用プライマー、０．２μＭのＵＧＴ１Ａ１＊２８用プライマー、０．０７５μＭのＵＧＴ１Ａ１＊６用プライマー、各０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、を含む組成とした。ＰＣＲ条件は、（１）９４℃５分の後、（２）９４℃３０秒、５５℃４０秒、７２℃４０秒を１サイクル（表１参照）として、これを４０サイクルに設定して反応を行った。

上記のように、２つのミスマッチプライマーを含む３組のプライマーを反応液に混合してＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物に、Ｌｏｗバッファーおよび制限酵素のＨｉｎｃＩＩとＭｓｐＩを加え、３７℃で１時間、消化反応を行った。なお、反応時間は３０分程度でもよい。制限酵素による消化反応後、簡易型多検体用キャピラリー電気泳動装置「HDA GT-12^TM（eGene社）」を用いて各反応液を電気泳動に供し、各反応液中のＤＮＡ断片をそのサイズ（断片長）にしたがって分離し検出した。

ＵＧＴ１Ａ１＊６の多型部位に関し、野生型アレル「Ｗ」であるときは、多型部位は制限酵素ＭｓｐＩにより切断されるので、表１に示すように、断片長は２０３ｂｐと３２ｂｐになる。他方、変異型アレル「Ｍ」であるときは、多型部位は制限酵素ＭｓｐＩにより切断されないので、断片長は２３５ｂｐになる。

ＵＧＴ１Ａ１＊６０の多型部位に関し、野生型アレル「Ｗ」であるときは、多型部位は制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより切断されないので、表１に示すように、断片長は１１５ｂｐと９３ｂｐになる（増幅断片中に制限酵素切断部位が１箇所存在するため）。他方、変異型アレル「Ｍ」であるときは、多型部位は制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより切断されるので、断片長は１１５ｂｐと６７ｂｐと２６ｂｐになる。

ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型部位は、制限酵素によっては切断されず、２塩基繰り返し配列（ＴＡリピート）が野生型アレル「Ｗ」よりも１つ多い変異型アレル「Ｍ」であるときは、表１に示すように、断片長は８５ｂｐになり、野生型アレル「Ｗ」であるときは、断片長は８３ｂｐになる。

［本発明の検査法の精度確認のための従来法による判定］
本発明の検査法の精度を確認するため、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法、メルティングカーブ法、ダイレクトシークエンス法などの従来法を用いて、各多型の検査・判定をあわせて行った。検査対象は、ＵＧＴ１Ａ１＊６０、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、及びＵＧＴ１Ａ１＊６の３多型のほかに、比較的マイナーな多型であるＵＧＴ１Ａ１＊７、ＵＧＴ１Ａ１＊２７、及びＵＧＴ１Ａ１＊２９を加えた合計６多型である。これらの６多型について、これまでに報告されているＰＣＲ法による判定方法をアレンジして、それぞれの多型に対し個別に判定を行った。各多型の判定に使用したプライマーとＰＣＲ条件（増幅プロセスにおける１サイクルの設定）は、下記表２に記載のとおりである。

表１と同様に、「配列」の欄のカッコ内の数字は、同プライマー配列が記載される配列表の配列番号を示す。また、下線部の塩基は、制限酵素切断部位を創出するため、人為的に異なる塩基を挿入した箇所である。ＵＧＴ１Ａ１＊２８を除く５つの多型については、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法により判定した。ＵＧＴ１Ａ１＊２８は、以前報告された方法（Hepatology 2000;32:792-5）に従って、ロシュ社のライトサイクラーを用いたメルティングカーブ法により判定した。また、この判定法で結果がはっきりしない場合には、ダイレクトシークエンス法を用いてＵＧＴ１Ａ１＊２８の遺伝子型を決定した。

ＵＧＴ１Ａ１＊６アレルについては、既に報告されている方法（Cancer Res 2000;60:6921-6）を若干改良した方法を用いて判定した。この判定においては、上記のように、野生型アレル「Ｗ」であるときのみ、ＭｓｐＩ認識部位を持つようなミスマッチプライマーを設計した（表２参照）。ＵＧＴ１Ａ１＊２９アレル、及びＵＧＴ１Ａ１＊６０アレルについても同様に、野生型アレル「Ｗ」であるときのみ、それぞれＣｆｒ１３Ｉ、ＤｒａＩ認識部位を持つようなミスマッチプライマーを設計した。ＵＧＴ１Ａ１＊７アレル、及びＵＧＴ１Ａ１＊２７アレルについては、既に報告されている方法（Cancer Res 2000;60:6921-6）にしたがって、制限酵素ＢｓｒＩを用いたＰＣＲ-ＲＦＬＰ法により判定した。

さらに、ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊６の両方がヘテロの場合、あるいは、ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊２７の両方がヘテロの場合に、被検者のハプロタイプを決定するために、ＵＧＴ１Ａ１＊６またはＵＧＴ１Ａ１＊２７に対してアレルスペシフィックＰＣＲ法（Allele specific PCR法）を次のように行った。ＵＧＴ１Ａ１＊２８アレルについては、各々のＰＣＲ産物を精製し、ダイレクトシークエンスを行ってＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型を確認した。

ＰＣＲは、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２．５ユニットのAmpliTaq DNAポリメラーゼ、各２００ｎＭプライマー、各０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む５０μＬのＰＣＲ反応液で行った。使用したプライマーとＰＣＲ条件（増幅プロセスにおける１サイクルの設定）は、下記表３に記載のとおりである。

野生型アレル検出用のリバースプライマー（Ｗ）では野生型アレルのみ増幅される一方、変異型アレル検出用のリバースプライマー（Ｍ）では変異型アレルのみ増幅される。各増幅断片におけるＵＧＴ１Ａ１＊２８の判定結果とあわせてハプロタイプを判定した。

［結果］
本実施例の結果、日本人由来の１５５サンプルについて、本発明の検査法により複数の多型を同時に判定した結果と、従来法により個別に各多型を判定した結果とが完全に一致した。図１は、本発明の検査法によるキャピラリー電気泳動の結果の一部を示すゲルイメージであり、図２（ａ）〜（ｃ）は、当該キャピラリー電気泳動の結果の一部を示すグラフである。各図において、野生型アレルは「＊１」として示される。これらの図に示すように、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位の２塩基の差異を、キャピラリー電気泳動を用いることによって増幅断片を８５ｂｐと８３ｂｐとに分け、視覚的に検出することが可能となった。同時に、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６に関する一塩基多型についても精度良く検出することができた。

ＵＧＴ１Ａ１＊７アレルとＵＧＴ１Ａ１＊２９アレルを保有する被検者は、今回調査した１５５サンプル中には存在しなかった。また、アレルスペシフィックＰＣＲ法による分析結果から、ＵＧＴ１Ａ１＊２７アレルはＵＧＴ１Ａ１＊２８アレルに含まれることが確認された。

以上のように、本実施例の結果から、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する臨床的に重要な３つの多型ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６を、本発明の検査法によって簡易迅速かつ精度良く検査・判定できることがわかった。

［２］本発明の検査法の変更態様
勿論、本発明の検査法は、上記方法に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。例えば、上記方法は、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６の３箇所の多型を同時に検査するものであったが、本発明はこれら３箇所の多型の検査に制限されるものではない。これら３箇所の多型は、日本人に観察される臨床的に重要な多型であるので、これら多型の検査に本発明の検査法を適用することは好ましいが、臨床的に重要なＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型として、他にもＵＧＴ１Ａ１＊２７、ＵＧＴ１Ａ１＊２９、ＵＧＴ１Ａ１＊７などが知られており、本発明において、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型と同時に検査する一塩基多型はこれらの多型であってもよい。このように、ＵＧＴ１Ａ１＊２７、ＵＧＴ１Ａ１＊２９、ＵＧＴ１Ａ１＊７などの一塩基多型をＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型と同時に検査する場合は、例えば表２に掲げるプライマー配列を使用してＰＣＲ反応を行うことで、一塩基多型を含む遺伝子領域を増幅することができる。また、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のゲノム配列は、GenBank等の遺伝子配列データベースにアクセッション番号「NG_002601」（GeneID：54658）で登録・掲載されており、ＵＧＴ１Ａ１のｃＤＮＡ配列はアクセッション番号「NM_000463」などで登録・掲載されているので、これらのデータベースに開示されている塩基配列などを参考に各プライマーを設計してもよい。

上記実施例の方法は３箇所の多型を同時に検査するものであったが、本発明は２箇所の多型を同時に検査するものであってもよい。この場合は、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型のほかに、臨床的に重要な他の一塩基多型を検査する。４箇所以上の多型を同時に検査することも可能であるが、異なる増幅断片が重なって検出困難になることがないよう、プライマーの設計などに十分留意する必要がある。上記実施例の検査法では、プライマーの設計にあたり、（１）ＵＧＴ１Ａ１＊２８については２ｂｐの差異を検出するため増幅断片を１００ｂｐ以下になるようにし、（２）制限酵素による消化後の各ＤＮＡ断片が互いに重なって検出困難にならないようにし、また、（３）各ＤＮＡ断片の相対的な距離、位置関係から多型の検出が容易になるように配慮した。具体的には、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型検出のため、当該増幅断片の前後いずれか約３０ｂｐ以内に他の増幅断片が少なくとも１つ（好ましくは複数）出現するようにプライマーを設計した。したがって、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６の３箇所の多型を検査する場合に、表１に掲げる３組のプライマーを使用することは好ましい。各プライマーの長さは、表１に掲げるものより多少短くても長くてもよいが、同一の反応条件で３箇所の遺伝子領域を増幅できるよう留意する。

上記実施例の検査法において、遺伝子試料は各被検者の末梢血からゲノムＤＮＡを抽出して調製したが、本発明において、検査に供する遺伝子試料は、被検者の任意の器官・組織・細胞（血液、羊水中の細胞、採取した組織等を培養した細胞を含む）から常法に従ってＤＮＡを精製・抽出すればよい。なお、ＰＣＲ法（又は他の遺伝子増幅法）による遺伝子増幅が可能な限りにおいて、ＤＮＡの精製・抽出工程は省略又は簡略化してもよい。

被検者から調製した試料中のゲノムＤＮＡを鋳型にして、多型部位を含む遺伝子領域をＰＣＲ法によって増幅する場合、ＰＣＲ法における反応条件、使用する試薬・反応液の組成、使用機器などは特に上記実施例の方法に制限されるものではないが、目的の遺伝子領域がすべて増幅されるように反応条件など留意するとよい。ＰＣＲ法は簡便な方法であり、精度も良好であるので、遺伝子増幅法にはＰＣＲ法の使用が好ましいが、ＰＣＲ法以外の他の増幅法（例えば、ＲＣＡ法など）を使用してもよい（「ポストシークエンスのゲノム科学（１）ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」（中山書店）など参照）。

制限酵素による消化反応についても、使用する制限酵素の種類等に応じてバッファーの種類、反応温度、反応時間などを決定すればよい。上記実施例の方法のように、２種類の制限酵素を同時に使用し、２種のＳＮＰをＰＣＲ-ＲＦＬＰ法によって検出することは好ましい。

キャピラリー電気泳動は、キャピラリー内でＤＮＡを電気泳動させることによって通常のゲル電気泳動に比べて高分解能でＤＮＡを分離・検出するものであり、市販の装置を用いて行うことができる。ＵＧＴ１Ａ１＊２８の多型における２ｂｐの差異を検出できるものであれば、いずれの装置を用いてもよい。

本発明の検査法を用いた遺伝子多型検査キットとしては、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する複数の多型を検査するために設計されたプライマーを含むものであればよく、さらに、（１）試料の調製に用いる酵素や試薬、（２）ＰＣＲ法に用いる酵素や試薬、（３）制限酵素による消化反応に用いる酵素や試薬、などのうち１又は２以上を含むものであってもよい。ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６の３箇所の多型を検査する場合、検査キットに含まれるプライマーとしては、表１に掲げる３組のプライマーが例示されるが、各プライマーの長さはこれより１〜５塩基程度長くても短くてもよい。また、他の組み合わせの複数の多型を検査する場合は、表２に掲げるプライマー群の中から選択された１組又は複数組のプライマーを含んだキット構成としてもよい。なお、本発明は、「ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する複数の多型」を同時に検査するものであるが、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子に関連する多型とは、換言すれば、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子またはゲノム上その近傍に存在する多型を意味し、ＵＧＴ１Ａ１ゲノム遺伝子のエキソン領域あるいはイントロン領域に存在する多型の検査に制限されず、そのプロモーター領域など転写調節領域、制御領域などに存在する多型を検査するものであってもよい。本明細書において、「遺伝子多型」とは、このようなプロモーター領域などに存在する多型を含み、当該遺伝子に関連する多型という広義の意味である。

本発明によってＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型検査を行うことで、ＵＧＴ１Ａ１で代謝される薬剤の薬効または副作用の程度を予測することができる。例えば、ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊６０は単独で、また、ＵＧＴ１Ａ１＊６はＵＧＴ１Ａ１＊２８と一緒に存在することでイリノテカンの副作用のリスクが高まることが報告されており、これらの多型を判定することでイリノテカンの重篤な副作用を起こす可能性の高い患者を予測することができる。

［３］ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子多型の検査法
本発明の検査法は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子多型の検査にも応用可能であり、目的遺伝子に関連する複数の多型を、低コストで簡易迅速かつ精度良く検査する方法を提供することができる。

即ち、本発明は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外の遺伝子に関連する複数の多型であって、挿入部分の有無による多型（ある２塩基以上の塩基配列が挿入された挿入型と当該塩基配列を欠く欠失型との間の多型）と、一塩基多型（ＳＮＰ）との組み合わせからなる複数の多型を同時に検査する場合にも適用することができる。このような複数の多型をもつ遺伝子としては、例えば次のようなものを挙げることができる。（下記表４では、各遺伝子によってコードされる分子名を示す。）

表中の各分子は、1：セロトニントランスポーター、2：モノアミンオキシダーゼＡ、3：アンドロゲン受容体、4：チロシンヒドロキシラーゼ、5：セロトニン受容体5-HT2C、6：芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)、7：ドーパミンD2受容体DRD2、8：セロトニン受容体5-HTR3B、9：セロトニン受容体5-HTR6、10：GABAのA型受容体α5サブユニット(GABRA5)、11：ドーパミントランスポーター(SLC6A3(DAT))、12：ドーパミンD4受容体DRD4、13：ドーパミンD5受容体DRD5、14：Phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase type 2 α、15：Adenylate cyclase 9(ADCY9)、16：GABA受容体β３サブユニット(GABRB3)、17：Adrenergic receptor alpha 2B(ADRA2B)、18：Adrenergic receptor alpha 2C(ADRA2C)、19：アンギオテンシン変換酵素、20：Adenylate cyclase 7(ADCY7)、21：レプチン受容体、22：CYP19(アロマターゼ)、23：G Protein beta3 subunit(GNB3)、である。

また表中、略号で示した各関連文献は、以下のとおりである。
Ｄ１：Science. 1996 Nov 29;274(5292):1527-31
Ｄ２：Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2004 May 15;127(1):104-12
Ｄ３：Lancet. 1996 Mar 16;347(9003):731-3
Ｄ４：Hum Genet. 1998 Sep;103(3):273-9
Ｄ５：Exp Gerontol. 2004;39:1603-11
Ｄ６：Eur J Pharmacol. 2000 Dec 27;410:215-226
Ｄ７：Diabetologia. 2000 Mar;43(3):373-6
Ｄ８：J Neural Transm. 2002 May;109:939-46
Ｄ９：Hum Mol Genet. 2005 Jun 15;14:1691-8
Ｄ１０：Hum. Mol. Genet.1997； 6： 577-582
Ｄ１１：J. Biol. Chem 1996； 271： 26013-26017
Ｄ１２：Pharmacogenetics. 1997 Dec;7(6):479-84
Ｄ１３：J Clin Oncol. 2003 Jun 1;21(11):2147-55
Ｄ１４：Schizophr Res. 2002 Nov 1;58(1):93-7.
Ｄ１５：Psychiatry Clin Neurosci. 2005 Jun;59(3):345-9
Ｄ１６：Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2003 Apr 1;118(1):36-40
Ｄ１７：Neurosci Lett. 2005 Jun 10-17;381(1-2):108-13
Ｄ１８：J Nucl Med. 2005 May;46(5):745-51
Ｄ１９：Biol Psychiatry. 2005 May 1;57(9):999-1003
Ｄ２０：Mol. Psychiatry 2000；5：64-69
Ｄ２１：Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2004 Feb 15;125(1):38-42
Ｄ２２：Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2003 Nov 15;123(1):50-8
Ｄ２３：Psychiatr Genet. 2005 Sep;15(3):223-7.
Ｄ２４：Am J Med Genet. 2002 Jan 8;114(1):84-92
Ｄ２５：Psychiatry Res. 2001 Nov 1;104(2):109-17
Ｄ２６：J Clin Endocrinol Metab. 2003 Mar;88(3):1184-7
Ｄ２７：Br J Clin Pharmacol. 2005 Oct;60(4):414-7
Ｄ２８：Hypertens Res. 2002 Nov;25(6):843-8
Ｄ２９：Am J Med Genet. 1997 Feb 21;74(1):95-8
Ｄ３０：J Atheroscler Thromb. 2004;11(2):73-8
Ｄ３１：Anticancer Res. 2003 Nov-Dec;23(6D):4941-6
Ｄ３２：Pharmacogenetics 2002, 12:209-220

表４に示した各分子について、複数の遺伝子多型を上記ＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法と同様に検査し、その検査結果を薬剤に対する応答性予測や副作用予測に利用することも可能である（上記関連文献など参照）。

表４に示す一塩基多型（第２、第３の多型）の検査についても、上記実施例の方法と同様に、制限酵素を用いたＰＣＲ-ＲＦＬＰ法によって行うことができ、必要に応じてミスマッチプライマーを使用し、制限酵素切断部位を作り出すとよい。

本発明の検査法は、多型部位における２ｂｐの差異を高精度に検出するため、挿入部分の有無による多型について、その差異が１０ｂｐ以下（より好ましくは５ｂｐ以下）の場合に特に優位性の高い検査法ということができる。

また、本発明の検査法を用いて、挿入部分の有無による多型と一塩基多型を同時に検査する場合に、両多型は同一遺伝子に関連する多型でなくてもよく、別々の遺伝子に関連する複数の多型の検査に本発明を適用してもよい。

本発明は、以上のように、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子多型の検査法等に関するものであり、前述したとおり、簡易迅速な複数の多型検査に利用できるほか、ＵＧＴ１Ａ１で代謝される薬剤の薬効または副作用の程度を調べる検査、診断などに利用することができる。

Claims

ＵＤＰ-グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法であって、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域のほか、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する少なくとも１つの遺伝子領域を同一の遺伝子増幅反応によって増幅する工程と、得られた増幅断片を制限酵素によって消化した後、キャピラリー電気泳動に供する工程とを含み、キャピラリー電気泳動の結果に基づいて複数の多型を同時に判定する方法。
一塩基多型が存在する遺伝子領域として、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及び／又はＵＧＴ１Ａ１＊６に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域を増幅する、請求項１記載の検査方法。
ミスマッチプライマーを使用して一塩基多型が存在する遺伝子領域を増幅する、請求項２記載の検査方法。
ＵＧＴ１Ａ１＊６０に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域について、配列番号１の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うと共に、制限酵素にＨｉｎｃＩＩを用いることを特徴とする、請求項３記載の検査方法。
ＵＧＴ１Ａ１＊６に関する一塩基多型が存在する遺伝子領域について、配列番号５の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うと共に、制限酵素にＭｓｐＩを用いることを特徴とする、請求項３記載の検査方法。
ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関する多型部位を含む遺伝子領域について、配列番号３の塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列を有するリバースプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅を行うことを特徴とする、請求項１記載の検査方法。
ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６０及びＵＧＴ１Ａ１＊６に関する３箇所の多型部位を同時に検査することを特徴とする、請求項２記載の検査方法。
目的遺伝子に関連する複数の多型を同時に検査する方法であって、挿入部分の有無による多型を含む遺伝子領域のほか、一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する少なくとも１つの遺伝子領域を同一の遺伝子増幅反応によって増幅する工程と、得られた増幅断片を制限酵素によって消化した後、キャピラリー電気泳動に供する工程とを含み、キャピラリー電気泳動の結果に基づいて複数の多型を同時に判定する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の検査方法を用いて、被検者の薬剤に対する反応性またはその副作用の程度を予測する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の検査方法を用いて、被検者の抗がん剤に対する反応性またはその副作用の程度を予測する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の検査方法を用いた、遺伝子多型検査キット。