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JPWO2007119811A1 - 高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法 - Google Patents

高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、反応添加物として酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムの中から選ばれた少なくとも1種の化合物、及び少量の水の存在下でPUFA含有油脂をリパーゼによりアルコリシス反応させたのち、グリセリド画分を分離して得ることを特徴とするPUFA濃縮油の製造方法を提供する。

Description

本発明はリパーゼを用いたアルコリシスによる高度不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid、以下、PUFAと略す）を高濃度に含有する油脂の製造法に関するものである。
n-3系PUFAであるエイコサペンタエン酸（以下、EPAと略す）やドコサヘキサエン酸（以下、DHAと略す）は様々な生理作用を持ち、医薬品、健康食品、食品素材などとして利用されている。EPAエチルエステルは動脈硬化や高脂血症の治療薬として用いられ、またEPA、DHAを含む魚油を添加した飲料は特定保健用食品としても認可されている。さらに国内外においてサプリメントとしての需要も非常に高い。
PUFAは二重結合数が多いことから、酸化に対し非常に不安定性である。したがって、PUFA含有油脂の製造工程において、常温常圧といった温和な条件で反応が進行する酵素反応を利用することは非常に望ましい。
主に微生物から得られる産業用のリパーゼ製品の中にはこうしたPUFAに作用しにくい性質があるものが知られている。こうした性質を有するリパーゼを用い炭素数の少ない脂肪酸を優先的に遊離させ、これを除去することでPUFAを濃縮した油脂を製造できる。例えばキャンディダ シリンドラセア（Candida cylindoracea）のリパーゼを用いてマグロ油を加水分解した後、遊離脂肪酸を除去することでDHAを濃縮した油脂の製造方法が開示されている（特許文献１）。
また、従来から有機溶媒中の酵素反応においても水が酵素活性発現に重要な働きをすることは知られている（非特許文献１）。アルコールを作用させて脂肪酸をグリセリドから切断する反応であるアルコリシス反応を用い、タラ肝油からPUFAを濃縮する際に、水の添加がリパーゼ反応を促進することが報告されている（非特許文献２）。一方、特定の酵素ではほぼ無水の条件で同様のアルコリシスが進行することも開示されている（特許文献２）。しかしリパーゼの使用量が油に対し10％と非常に多く、生産性向上のためにはリパーゼを固定化する必要がある。
低級のアルコール類でアルコリシス反応を行った場合は除去すべき成分が脂肪酸低級アルコールエステルとなるため蒸留等で除去するのが容易になる。
特開昭５８−１６５７９６号 特表平９−５１００９１号 J. S. Dordick, "Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents", Enzyme Microb. Technol., 1989, 11, April, 194-211 L. Zui and O. P. Ward, "Lipase-catalyzed alcoholysis to concentrate the n-3 polyunsaturated fatty acid of cod liver oil", Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, July, 601-606
上述のようなリパーゼの性質を応用して魚油等のPUFAを濃縮した濃縮油は既に市場に出ているが、濃縮度には限界があり、高濃度の製品は得難いかまたは非常に多くの酵素を必要とする。また、反応と不要成分の除去操作を繰り返し行うなどの必要があり、製造コストが上昇するため極めて高価な製品となってしまう。本発明は、原料油中に含まれるPUFA、特にEPA、DHA等を濃縮する方法を提供することを課題とする。
発明者らは産業用のリパーゼを用いた反応を様々な角度から研究した結果、酸化マグネシウム（以下、MgOと略す）、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムなどを少量添加することによって、リパーゼの使用量が少なくても、アルコリシス反応の効率を飛躍的に向上させることを見出した。しかも、目的物であるEPAやDHAなどのPUFAには作用しにくいというリパーゼの性質が、当該反応中に厳格に維持されることが確認された。
本発明は、反応添加剤として酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムの中から選ばれた少なくとも１種の化合物、及び少量の水の存在下でPUFA含有油脂をリパーゼによりアルコリシス反応させたのち、グリセリド画分を分離して得ることを特徴とするPUFA濃縮油の製造方法を要旨とする。
すなわち、本発明によれば、反応添加物として酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムの中から選ばれた少なくとも1種の化合物、及び少量の水の存在下で、油脂を構成する脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する油脂をリパーゼによるアルコリシス反応に付す工程、および、油脂を構成する脂肪酸としてグリセリド画分を分離する工程、を含む高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法が提供される。
本発明は安価な添加剤と水を少量添加することにより酵素の反応性を高め、かつグリセリドにエステル結合するPUFAへ作用しにくいという選択性も向上させる。その結果として、PUFAを高度に含有する濃縮油を高収率で安価に製造できる。
 発明を実施するための形態
本発明において高度不飽和脂肪酸（PUFA）とは炭素数１６以上、二重結合数２つ以上の脂肪酸をいう。良く知られたものでは、エイコサペンタエン酸（EPA)、ドコサヘキサエン酸（DHA)、アラキドン酸、リノレン酸、リノール酸等が例示される。本発明の高度不飽和脂肪酸含有油脂は、油脂を構成する脂肪酸として当該高度不飽和脂肪酸を含有する油であれば特に限定されず、PUFAを含む、魚油をはじめとする水産物油、微生物油、藻類油、植物油などが例示される。本発明の原料として用いる場合、それらの原油（搾油したそのもの）でもよいし、何らかの精製工程を経たものでもよい。本発明の製造方法においては水分含量が重要な要素であるので、油脂中に含まれる水分量について考慮するのが望ましい。本発明の方法は、高度不飽和脂肪酸の中でも炭素数が２０以上、二重結合数が４〜６個、特に炭素数が２０〜２２、二重結合が４〜６個の脂肪酸の濃縮に適している。本発明の方法に適した脂肪酸としては、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸が例示される。
油脂は、通常脂肪酸のトリグリセリドを意味するが、本発明ではジグリセリド、モノグリセリドを含むグリセリドを意味する。
本発明において高度不飽和脂肪酸の濃縮とは、原料油脂の「高度不飽和脂肪酸の量／脂肪酸全量」より、反応後の「高度不飽和脂肪酸の量／脂肪酸全量」を大きくすることを意味し、原料油脂に比べて「高度不飽和脂肪酸の量／脂肪酸全量」が大きくなった油脂が高度不飽和脂肪酸濃縮油である。
本発明において、グリセリドとは、脂肪酸のトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドの総称である。
本発明で使用するリパーゼはアルコリシス反応を触媒し、PUFAに作用しにくい性質を有すれば特に限定されない。例示すればアルカリゲネス エスピー（Alcaligenes sp.）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼQLM、リパーゼQLC、リパーゼPL、いずれも名糖産業(株)製）、バークホリデリア セパシア（Burkholderia cepacia）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼPS、天野エンザイム(株)製）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）に属する微生物から得られるリパーゼ（リパーゼAK、天野エンザイム(株)製）、サーモマイセス ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosa）に属する微生物から得られるリパーゼ（リポザイムTLIM、ノボザイム社製）などが挙げられる。リパーゼの使用量については特に限定されないが、粉末のリパーゼについては油脂に対して10 unit/g以上、反応速度を考えた実用性を考えると30 unit/g以上用いるのが好ましく、固定化リパーゼについては油脂に対し0.01％(w/w)以上が好ましい。
反応添加剤としてはMgO、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムが利用できるが、MgOは効果も高く、食品用途にも用いることができるため特に好ましい。粉末、細粒状、顆粒状などのものが扱いやすく、産業用に市販されているものを用いることができる。反応添加剤の添加量は特に限定されないが、好ましくは原料油脂に対して0.01％(w/w)〜30％(w/w)、より好ましくは0.05％(w/w)〜5％(w/w)の範囲で用いられる。さらに少量の水の添加が非常に有効であり、好ましくは使用するアルコールに対して1％(v/v)〜30％(v/v)、より好ましくは5％(v/v)〜20％(v/v)添加する。反応に用いるアルコールも特に限定されないが、エタノールはもっとも好ましいアルコールの一つである。アルコールの量は、脂肪酸に対し0.2〜5当量、より好ましくは0.2〜1.5当量用いる。
反応方法は所定量の原料油脂、水、反応添加剤、アルコールを混合できれば特に限定されないが、酵素が高活性を示す反応温度（例えば、20℃〜60℃）で、1時間から24時間程度の反応時間で、良く混合されるように攪拌するのが一般的である。カラム等に充填した固定化酵素を反応に使用しても良い。反応後は反応添加剤及び酵素等を、ろ過及び水性溶液による洗浄等で除き、グリセリドの分離、精製を行うことでグリセリド画分としてPUFA濃縮油を得ることができる。グリセリド画分の分離方法は特に限定されないが、例えば、分子蒸留、短行程蒸留などの蒸留法や各種クロマトグラフィを用いた分離方法が利用できる。精製方法も通常油脂の精製に用いられる方法を用いればよく、各種クロマトグラフィ、水蒸気蒸留などが例示される。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。なお、原料油、およびグリセリド画分のＰＵＦＡの含有量は、メチルエステル化後に、ガスクロマトグラフィの面積比により決定した。なお、ガスクロマトグラフィ測定前に行ったメチルエステル化は、日本油化学会の定める基準油脂試験法にて行った（日本油化学会制定 基準油脂分析試験法（I）１９９６年版、２．４．１ 脂肪酸誘導体化法、２．４．１．２−１９９６ メチルエステル化法（三フッ化ホウ素−メタノール法））。
精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）１ｇにリパーゼQLM（アルカリゲネス エスピー、名糖産業(株)製）を1.65 mg（100 unit/g）、水を17μl、MgO（純正化学(株)特級試薬９９％以上)（油に対し0.25％(w/w)または2.5％(w/w)）、エタノールを170μl（脂肪酸に対し0.75当量）加え、40℃で16時間撹拌した。反応後、固形分をろ別し、ろ液をヘキサンにより抽出した。以下に示す方法により分取TLCでグリセリド画分を分離した（特に言及がなければ、以後の分取TLCは同様の方法により行った）。ヘキサン抽出液150μLを分取用TLC（メルク社製シリカゲル 60F254 プレート）に塗布し、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（70：30：1、体積比）で展開した。展開後、エチルエステル以外の画分をグリセリド画分として回収した。
得られたグリセリド画分をメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィ−にて脂肪酸組成の分析を行った。ガスクロマトグラフィの分析条件は以下に示す。
キャピラリーカラム：DB-WAX(J&W Scientific)、Fused Silica Capillary Column、0.25mmI.D.×30m ,0.25μm film thickness
キャリヤーガス：ヘリウム
検出器：250℃,FID
注入口250℃,スプリット比=100:1
カラム温度.：180℃→3℃/min →230℃(15min)
装置：Hewlett Packard 6890
リパーゼPS（バーカホリデリア セパシア、天野エンザイム(株)製）3.3mg（100unit/g）についても同様の条件で反応させた。
また、比較例として、それぞれのリパーゼについて、水及びMgO無添加、水のみ添加、MgOのみ0.25％(w/w)添加する以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った。
グリセリド画分の脂質組成はTLC/FID（イアトロスキャンTH-10、三菱化学ヤトロン社製）を用いて、5重量%のヘキサン溶液（1μl）をシリカゲルロッドにスポット後、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（90：10：1、体積比）で展開して分析を行った。結果は、得られたチャートよりグリセリド、エステルのピーク面積比を得て、それに基づいてグリセリド回収率算出した。EPA、DHA等PUFAの回収率は、（反応後のグリセリドのPUFAの割合（％）×グリセリドの含量（％））／（反応前のPUFAの割合（％））により算出する。EPA、DHAの面積％、EPA、DHAの脂肪酸回収率およびグリセリド回収率の結果を表１に、比較例の結果を表２に示す。
例えば、特許文献２（特表平９−５１００９１号）では、粉末酵素を油に対し10％も使用しているが、本発明の方法であれば、リパーゼ使用量は100 unit/g（原料油脂に対し、リパーゼQLMは0.165%、リパーゼPSは0.33％）とはるかに少ないリパーゼ使用量でも反応が進んでいることがわかる。また、比較例と比べると、リパーゼ量が同じでも水、MgOを添加することによるEPA等の濃縮に及ぼす効果が明らかである。また、MgO添加量増加に伴い、EPAが濃縮されたことがわかる。さらに、EPA回収率が非常に高く、当該反応の脂肪酸選択性が保持されている。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
実施例１で用いたイワシ油よりもEPA、DHAの含有量が少ないイワシ油（EPA 15.7%, DHA 8.99%、日本水産(株)製）を原料として用い、実施例１と同じ条件、油脂１ｇにリパーゼQLM 1.65mg（100 uni/g）、水17μl、MgO 2.5％(w/w)、エタノール170μl、で40℃で16時間エタノリシス反応を行った。EPA、DHA面積％、回収率、グリセリド回収率の結果を表３に示す。
Figure 2007119811
精製マグロ油（EPA 6.75％、DHA 24.3％、日本水産（株）製）2gにリポザイムTLIM（サーモマイセス ラヌギノサス、ノボザイム社製）2mg（油に対し0.1％(w/w)）、水34μl、MgO（0.25％(w/w)または2.5％(w/w)）、エタノール340μlを加え、40℃で16時間撹拌した。また、比較例として、水及びMgO無添加、水のみ添加、MgOのみ0.25％(w/w)添加する以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った。反応後、固形分をろ別し、分取TLCでグリセリド画分を分離し、メチルエステル化後、脂肪酸組成の分析を行った。EPA、DHAの脂肪酸回収率、グリセリド回収率を表４に、比較例のEPA、DHAの面積％と脂肪酸回収率、グリセリド回収率を表５に示す。
水、MgOの添加によりDHAが非常に濃縮されていることがわかる。MgOの添加量の増加に伴い、DHA濃度の濃縮度は向上した。比較例では、同じ酵素量を使用しているにもかかわらず、DHAはほとんど濃縮されてなかった。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
MgO以外の反応添加剤の効果を調べるため、実施例１と同様の反応条件で、反応添加剤9種類を原料油に対し1％(w/w)添加した。すなわち、精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLM（アルカリゲネス エスピー、名糖産業(株)製）を1.65mg（100 unit/g）、水を17μl、表６に示す反応添加物9種類を油に対し１％(w/w)、エタノールを170μl（脂肪酸に対し0.75当量）加え、40℃で16時間撹拌した。反応後、固形分をろ別し、分取TLCでグリセリド画分を分離し、メチルエステル化後、脂肪酸組成を測定した。表６にグリセリド画分のEPA面積％を示す。MgOの他に水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化カルシウムおよび水酸化カルシウムにEPA濃縮効果が見られた。
Figure 2007119811
リパーゼQLMによるEPA濃縮油脂の製造
精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）１kgにリパーゼQLM（アルカリゲネス エスピー、名糖産業(株)製）0.83g、水17ｇ、MgO 2.5ｇ、エタノールを173ｍｌ加え、40℃で16時間撹拌した。遠心分離後、固形分を除き、エタノールを留去し、1.06kg得た。希硫酸で洗浄後、湯洗浄し、薄膜蒸留装置により、エステル、脂肪酸を留去し、グリセリド画分としてのEPA濃縮油を583g得た。脂肪酸組成を測定したところ、EPA48.3％、DHA17.3％であった。
リポザイムTLIMによるDHA濃縮油脂の製造
精製マグロ油（EPA 6.75％、DHA 24.3％）1kgにリポザイムTLIM（サーモマイセス、ノボザイム社製）１g、水 17g、MgO 5g、エタノール173ｍｌを加え、40℃16時間撹拌した。固形分をろ過後、エタノールを留去し、1.07kgを得た。リン酸で洗浄後、湯洗浄し、分子蒸留装置により、エステル、脂肪酸を留去し、グリセリド画分としてのDHA濃縮油416gを得た。脂肪酸組成を測定したところ、EPA 9.4％、DHA 52.8％であった。
MgOの添加量の検討
実施例１と同じ条件、すなわち、精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを1.65 mg（100 unit/g）、水を17μl、MgO（油に対し0〜10％w/w)）、エタノールを170μl（脂肪酸に対し0.75当量）加え、40℃16時間撹拌という条件でアルコリシスを行った。
結果を表７に示す。MgOの添加量は多いほど反応を促進させ、EPAを濃縮させた。
Figure 2007119811
水の添加量の検討
精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを0.83 mg（50 unit/g）、水をエタノール量に対して3.5〜20％(v/v)、MgO（油に対し0.25％w/w)）、エタノールを170μl（脂肪酸に対し0.75当量）加え、40℃16時間撹拌するという条件でアルコリシスを行った。
結果を表８に示す。水の添加量はエタノール量に対して5〜20％(v/v)が好ましいことがわかった。
Figure 2007119811
エタノール量の検討
精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを0.83 mg（50 unit/g）、水を17μl、MgO（油に対し0.25％w/w)）、エタノールを脂肪酸に対し0.5〜1.5当量加え、40℃16時間撹拌するという条件でアルコリシスを行った。
結果を表９に示す。エタノールの使用量は脂肪酸量に対して0.5〜1.5等量が好ましいことがわかった。
Figure 2007119811
リパーゼ使用量の検討
精製イワシ油（EPA 28.2%、DHA12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを10〜50 unit/g、水を17μl、MgO（油に対し0.25~1%w/w)）、エタノールを脂肪酸に対し0.75当量加え、40℃で16時間撹拌するという条件でアルコリシスを行った。
結果を表１０に示す。リパーゼの使用量は25 unit/g以上が好ましいことがわかった。また、同じリパーゼ量でもMgO量を増加させることにより反応性を高めることができることが確認された。
Figure 2007119811
反応時間の検討
精製イワシ油（EPA28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを1.65mg（100 unit/g）、水を17μl、MgO（油に対し0.25％w/w)）、エタノールを脂肪酸に対し1当量加え、40℃で0〜24時間撹拌するという条件でアルコリシスを行った。
結果を表１１に示す。
Figure 2007119811
 ［参考例］
MgO、水を使用しない場合のリパーゼの反応
精製イワシ油（EPA 28.2%, DHA 12.5%、日本水産(株)製）1ｇにリパーゼQLMを100〜1000 unit/g）、エタノールを脂肪酸に対し1当量加え、40℃で16時間撹拌するという条件でアルコリシスを行った。
結果を表１２に示す。水、MgOを添加しない反応系では、リパーゼ量を1000 unit/g量使用してもなお、本発明のレベルにＥＰＡが濃縮されなかった。
Figure 2007119811
ギンザケ抽出油への適用
ギンザケ抽出油（EPA 9.8%, DHA 14.0%）１ｇにリポザイムTLIM（サーモマイセス ラヌギノサス、ノボザイム社製）を2mg（0.2％）、水を10μl、MgO（純正化学(株)特級試薬９９％以上)（油に対し0.5％(w/w)または2.5％(w/w)）、エタノールを170μl（脂肪酸に対し0.75当量）加え、40℃で16時間撹拌した。反応後、固形分をろ別し、分取TLCでグリセリド画分を分離し、メチルエステル化後、ガスクロマトグラフィ−にて脂肪酸組成の分析を行った。ガスクロマトグラフィの分析条件は以下に示す。
キャピラリーカラム：DB-WAX(J&W Scientific)、Fused Silica Capillary Column、0.25mmI.D.×30m ,0.25μm film thickness
キャリヤーガス：ヘリウム
検出器：250℃,FID
注入口250℃,スプリット比=100:1
カラム温度.：180℃→3℃/min →230℃(15min)
装置：Hewlett Packard 6890
また、比較例として、水及びMgO無添加以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った。
グリセリド画分のEPA、DHAの面積％、EPA、DHAの脂肪酸回収率およびグリセリド回収率の結果を表１３に、比較例の結果を表１４に示す。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
スケトウダラ抽出油への適用
スケトウダラ抽出油（EPA12.3%, DHA 7.9%）を原料として用い、油脂１ｇにリパーゼQLM 1.65mg（100 unit/g）、水17μl、MgO 2.5％(w/w)、およびエタノール170μlを加え、40℃で16時間エタノリシス反応を行った。またリポザイムTLIM 5mg（0.5％）についても同様に水、MgOを添加し、エタノリシス反応を行った。EPA、DHA面積％、回収率、グリセリド回収率の結果を表１５に示す。リパーゼQLMではEPAが濃縮され、リポザイムTLIMではDHAが濃縮された。いずれもEPAとDHAを合わせた面積％は原料の倍以上に濃縮された。
また比較例として、MgOおよび水無添加以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った結果を表１６に示す。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
マンボウ肝油への適用
マンボウ肝油（アラキドン酸（AA） 5.1%、EPA 4.2%, ドコサペンタエン酸（DPA）7.7％、DHA 10.5%）を原料として用い、油脂1ｇにリパーゼQLM 1.65mg（100 unit/g）、水17μl、MgO 2.5％(w/w)、およびエタノール170μlを加え、40℃で16時間エタノリシス反応を行った。またリポザイムTLIM 5mg（0.5％）についても同様に水、MgOを添加し、エタノリシス反応を行った。AA、EPA、DPA、DHA面積％、回収率、グリセリド回収率の結果を表１７に示す。リパーゼQLMではAA、EPA、DPAおよびDHAが濃縮されたのに対し、リポザイムTLIMはDHAのみが濃縮された。
また比較例として、MgOおよび水無添加以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った結果を表１８に示す。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
二種類のリパーゼの併用
イワシ油（EPA 15.7%, DHA 9.0%、日本水産(株)製）を原料として用い、油脂１ｇにリパーゼQLM 1.65mg（100 unit/g）とリポザイムTLIM 5mg（0.5％）を組み合わせて、水10μl、MgO 2.5％または0.25％ (w/w)、およびエタノール 170μlを加え、40℃で16時間エタノリシス反応を行った。EPA、DHA面積％、回収率、グリセリド回収率の結果を表１９に示す。EPA濃縮効果のあるリパーゼQLMとDHA濃縮効果のあるリポザイムTLIMを組み合わせることで、EPA、DHAのいずれも濃縮することが可能であった。
また比較例として、MgOおよび水無添加以外は上記の条件でエタノリシス反応を行った結果を表２０に示す。
Figure 2007119811
Figure 2007119811
本発明により、EPA、DHA等のPUFAを高濃度に含む油脂を提供することができる。すなわち、健康食品等にEPA、DHA等のPUFAを一定量添加する場合に、従来よりも少ない量の油脂を添加すればよいことになる。

Claims (8)

  1. 反応添加物として酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムの中から選ばれた少なくとも1種の化合物、及び少量の水の存在下で、油脂を構成する脂肪酸として高度不飽和脂肪酸を含有する油脂をリパーゼによるアルコリシス反応に付す工程、および、高度不飽和脂肪酸が濃縮されたグリセリド画分を分離する工程、を含む高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  2. 反応添加物が酸化マグネシウムである、請求項１に記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  3. アルコリシス反応がエタノリシスである、請求項１又は２に記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  4. 高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  5. 高度不飽和脂肪酸含有油脂が魚油である、請求項１〜４のいずれかに記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  6. 反応添加物の添加量が高度不飽和脂肪酸含有油に対して０．０１〜３０％(w/w)である、請求項１〜５のいずれかに記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  7. 水分の添加量がアルコールに対して１〜３０％(w/w)である、請求項１〜６のいずれかに記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
  8. リパーゼが、アルカリゲネス エスピー（Alcaligenes sp.）、サーモマイセス ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、バークホリデリア セパシア（Burkholderia cepacia）、シュードモナス フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）のいずれかに属する微生物から得られるリパーゼから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の高度不飽和脂肪酸濃縮油の製造方法。
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