JPWO2009116592A1 - Ｈｐｖに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキット - Google Patents
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-
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Abstract
ＨＰＶに起因する癌細胞の検出や組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を、高い精度で、かつ簡便に行なうことができるプライマーセット、方法、そのキットを提供する。プライマーセットとして、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外のシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含むプライマーセットを用いる。
Description
本発明は、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキットに関する。
ヒトパピローマウイルス（以下、「ＨＰＶ」という）は、環状二本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスであり、増殖性病変を誘発する。ＨＰＶは、１００種以上のサブタイプに分類されている。また、ＨＰＶのサブタイプは、共通する領域として、非構造タンパク質をコードするＥ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域、Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域、キャプシドタンパク質をコードするＬ１領域及びＬ２領域、並びにＬＣＲを有していることが知られている。
ＨＰＶのＤＮＡは、子宮頸癌や子宮頸部異形成の病変部、及び口腔癌や咽頭癌の組織から検出されている。そのため、ＨＰＶの感染は、子宮頸癌、口腔癌及び咽頭癌のリスクファクターの１つとされている。ＨＰＶの感染の様式は、ほとんどの場合、感染成立から一定期間後に細胞からＨＰＶが自然消失する一過性感染である。しかしながら、ＨＰＶの感染のうち５〜１０％の感染は、ＨＰＶが消失せず、子宮頸癌を引き起こす持続感染となる場合がある。
なお、子宮頸部の組織診では、子宮頸部異形成は、癌細胞が発生する前段階として、上皮内における異型細胞の出現の程度により、軽度、中等度又は高度の３段階の異形成に分類されている。高度異形成からさらに悪化すると、子宮頸部異形成の病変は、上皮内に癌細胞が出現する段階となる。そして、子宮頸部異形成は、癌細胞が上皮内に限局する「上皮内癌」、並びに癌細胞が上皮から皮下組織に浸潤する「微小浸潤扁平上皮癌」及び「浸潤扁平上皮癌」へと進行する。
軽度異形成又は中等度異形成の病変は、特に治療を行なわずに経過観察されることがほとんどである。しかしながら、高度異形成の前駆病変を治療せずに放置すると、病変が浸潤癌に進行する可能性が高いので、高度異形成と判断された被験者には、手術等の治療を施すことが多い。よって、被験者の病変が高度異形成又はそれより重篤な段階であるか否かを判断することは、被験者に対する治療方法を決定するために、重要である。
高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちシトシンの５位がメチル化されていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。近年、ＨＰＶのゲノムＤＮＡにおけるメチル化の有無が、癌の発症に強く関係していることを示す報告がなされている。
例えば、特許文献１には、患者の子宮頸部の細胞に含まれるＨＰＶのＥ６領域及びＬＣＲが、メチル化されていない場合、子宮頸癌の細胞の存在がより強く示されることが記載されている。しかしながら、メチル化されていないＥ６領域及びＬＣＲは、子宮頸癌細胞以外の細胞から検出される場合がある。そのため、Ｅ６領域及びＬＣＲのメチル化の状態のみを確認することで、患者の子宮頸部の細胞から、高い精度でＨＰＶに起因する癌細胞を検出することは困難である。
また、非特許文献１には、子宮頸癌において、ＨＰＶ−１８のＬ１領域は、強くメチル化されているが、ＬＣＲ及びＥ６領域はメチル化されていないことが記載されている。ここで、非特許文献１では、ＨＰＶ−１８のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩で処理した後の核酸の塩基配列を決定し、そのメチル化の状態を確認している。しかしながら、塩基配列の決定によるＤＮＡのメチル化の確認は、時間がかかり、かつ操作が煩雑である。そのため、被験者から採取された試料から、簡便にＨＰＶに起因する癌細胞を検出することは困難である。
Tolga Turan et al., Virology 349 (2006) 175-183 特表２００６−５２２６０７号公報
Tolga Turan et al., Virology 349 (2006) 175-183
本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出や組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を行なうことができるプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、ＨＰＶに起因する癌を診断することができるキットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、高い精度で、かつ簡便に、異形成の段階を診断することができるキットを提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ） 被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含むＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、
（２）前記ステップ（Ａ）が、
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
を含む、前記（１）に記載の検出方法、
（３）前記ステップ（Ａ）が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、
（ａ１）ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、前記（２）に記載の検出方法、
（４）（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法、
（５）組織が、子宮頸部の組織である、前記（４）に記載の判定方法、
（６）ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、
ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーと
を含み、
非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたＨＰＶのゲノムＤＮＡの塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット、
（７）第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（８）第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（９）他の塩基が、ウラシル又はチミンである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１０）第１プライマー及び第２プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１１）前記（６）に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット、
（１２）非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、前記（１１）に記載の診断用キット、
（１３）ＨＰＶに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、前記（１１）に記載の診断用キット、並びに
（１４）前記（６）に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、異形成の段階の診断用キット
に関する。
（１）（Ａ） 被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含むＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法、
（２）前記ステップ（Ａ）が、
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
を含む、前記（１）に記載の検出方法、
（３）前記ステップ（Ａ）が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、
（ａ１）ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、前記（２）に記載の検出方法、
（４）（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法、
（５）組織が、子宮頸部の組織である、前記（４）に記載の判定方法、
（６）ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、
ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーと
を含み、
非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたＨＰＶのゲノムＤＮＡの塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット、
（７）第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（８）第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（９）他の塩基が、ウラシル又はチミンである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１０）第１プライマー及び第２プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、前記（６）に記載のプライマーセット、
（１１）前記（６）に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット、
（１２）非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、前記（１１）に記載の診断用キット、
（１３）ＨＰＶに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、前記（１１）に記載の診断用キット、並びに
（１４）前記（６）に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有する、異形成の段階の診断用キット
に関する。
本発明のプライマーセットは、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列（「第１塩基配列」ともいう）における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列（「第２塩基配列」ともいう）からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列（「第３塩基配列」ともいう）における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列（「第４塩基配列」ともいう）からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含み、ＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を、核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセットである。なお、前記第２塩基配列は、第１塩基配列からなる核酸を変換した後の核酸の塩基配列であり、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換されている点を除いて、第１の塩基配列に対応する配列である。また、前記第４塩基配列は、第３塩基配列からなる核酸を変換した後の核酸の塩基配列であり、全てのシトシンが他の塩基に変換されている点を除いて第３の塩基配列に対応する配列である。
本発明のプライマーセットは、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを含有している点に１つの大きな特徴がある。
ＨＰＶに起因する癌細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡは、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。そのため、本発明のプライマーセットを核酸増幅反応に用いれば、癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸を特異的に増幅することができる。これにより、本発明のプライマーセットによれば、ＨＰＶに起因する癌細胞を、高い精度で、かつ簡便に検出することができる。したがって、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、子宮頸癌、口腔癌及び咽頭癌の診断も行なうことができる。
また、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡは、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。そのため、本発明のプライマーセットを核酸増幅反応に用いれば、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸を特異的に増幅することができる。したがって、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、異形成の段階を診断することができる。また、本発明のプライマーセットによれば、高い精度で、かつ簡便に、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。
なお、本明細書において、ＨＰＶに起因する癌細胞とは、ＨＰＶの感染により、癌化した細胞及び癌化するリスクの高い細胞をいう。より具体的には、ＨＰＶに起因する癌細胞とは、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌の発症を引き起こすＨＰＶ感染細胞、子宮頸癌細胞、口腔癌細胞又は咽頭癌細胞をいう。
本明細書において、「高度異形成以上の段階」とは、日本産婦人科学会による「子宮頸癌取り扱い規約1997」に基づく分類により、「高度異形成」又はそれより重篤な段階である「上皮内癌」、「微小浸潤扁平上皮癌」若しくは「浸潤扁平上皮癌」に分類される段階をいう。組織の病変が、これらの段階の病変であると判断されると、被験者は、ほとんどの場合、手術等の治療を必要とするので、高度異形成以上の段階の病変であるか否かを判断することは、臨床上、非常に重要である。一方、「高度異形成」より軽症の病変は、「上皮異常なし」、「軽度異形成」又は「中等度異形成」の段階の病変に分類される。病変が、これらの段階の病変である場合、被験者は、特別の治療を施さずに、経過観察されることがほとんどである。
本明細書において、「異常細胞」とは、異型細胞及び癌細胞をいう。ここで、「異型細胞」とは、癌細胞ではないが、核腫大、クロマチン増量、核形不整等の核の異常が認められる細胞をいう。
上述のように、ＨＰＶに起因する癌細胞は、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶのゲノムＤＮＡを有している。前記ＨＰＶに起因する癌細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡを、非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤で処理した場合、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンは、他の塩基に変換されないが、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンは、他の塩基に変換される。したがって、本発明のプライマーセットを用いれば、非メチル化シトシン変換剤によって処理されたＨＰＶのゲノムＤＮＡのうち、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位がシトシンとグアニンとからなるジヌクレオチドの塩基配列のままであり、ＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンが他の塩基に変換された核酸のみを核酸増幅反応により増幅することができる。
また、本発明のプライマーセットでは、第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。そして、第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。そのため、本発明のプライマーセットによれば、ＨＰＶ感染細胞の癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡ中の少なくともＬ２領域若しくはＬ１領域の一部とＬＣＲ若しくはＥ６領域の一部とを含む連続した領域のＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸を、１回の核酸増幅反応で増幅することができる。
ＨＰＶは、約８ｋｂの環状ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶとしては、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ８２等が挙げられる。
ＨＰＶゲノムは、図１に示されるように、非構造タンパク質をコードする初期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域、Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域）と、キャプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｌ１領域及びＬ２領域）と、ＬＣＲの遺伝子領域とを有している。Ｅ１領域は、ウイルスゲノムの複製に関与する領域である。Ｅ２領域は、ウイルスの転写の調節に関与する領域である。Ｅ５領域、Ｅ６領域及びＥ７領域は、がん化に関与する領域である。Ｅ６領域は、がん抑制遺伝子であるｐ５３と結合し、ｐ５３の分解を促進するタンパク質をコードする領域である。Ｅ７領域は、がん抑制遺伝子であるＲｂと結合し、Ｒｂを不活化するタンパク質をコードする領域である。Ｌ１領域及びＬ２領域は、キャプシド形成に関与する領域である。ＬＣＲ（Long control region)は、ウイルス遺伝子の発現調節に関与する領域である。
一般的に、ＨＰＶが細胞に感染し、侵入すると、ＨＰＶのゲノムＤＮＡは、生体内におけるＤＮＡのメチル化機構により、ゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ部位のうち、所定のＣｐＧ部位におけるシトシンがメチル化される。なかでも、子宮頸癌細胞中のＨＰＶでは、図２に示されるように、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない。
表１は、ＨＰＶ感染細胞に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡのＬ１領域及びＬ２領域並びにＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位におけるメチル化の状態を示す。ここで、表１で示されるＨＰＶ感染細胞のうち、ＨＰＶ感染細胞２は、ＨＰＶに起因する癌細胞を示している。なお、表１中、「○」は、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることを示し、「×」は、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないことを示す。
上述のように、子宮頸癌細胞内のＨＰＶでは、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位に、ＤＮＡのメチル化が検出される。ところが、表１に示されるように、ＨＰＶに起因する癌細胞ではないＨＰＶ感染細胞においても、Ｌ１領域又はＬ２領域のＤＮＡのメチル化が見られる場合がある。そのため、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、Ｌ１領域又はＬ２領域のメチル化のみを指標とすると、ＨＰＶに起因する癌細胞と、他のＨＰＶ感染細胞との区別化が困難な場合がある。すなわち、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、Ｌ１領域又はＬ２領域のメチル化のみを指標とすると、表１に示されるＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２のみではなく、ＨＰＶ感染細胞１も検出されることがある。
また、子宮頸癌細胞内のＨＰＶでは、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位は、非メチル化状態となっている。ところが、ＨＰＶに起因する癌細胞ではないＨＰＶ感染細胞等においても、ＬＣＲ又はＥ６領域のＣｐＧ部位が非メチル化状態となっている場合がある。そのため、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、ＬＣＲ又はＥ６領域における非メチル化状態のみを指標とすると、ＨＰＶに起因する癌細胞と、他のＨＰＶ感染細胞の区別化が困難な場合がある。すなわち、ＨＰＶに起因するがん細胞の検出に際して、ＬＣＲ又はＥ６領域における非メチル化状態のみを指標とすると、表１に示されるＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２のみではなく、ＨＰＶ感染細胞４も検出されることがある。
しかしながら、本発明のプライマーセットは、表１に示されるＨＰＶ感染細胞２に含まれるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸を、特異的に核酸増幅反応で増幅することができる。そのため、本発明のプライマーセットを用いれば、表１に示されるＨＰＶ感染細胞１〜４のなかから、ＨＰＶに起因する癌細胞であるＨＰＶ感染細胞２を特異的に検出することができるという優れた効果が奏される。
一方、高度異形成以上の段階の組織内のＨＰＶにおいても、Ｌ１領域及びＬ２領域中のＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されており、ＬＣＲ及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていない。したがって、本発明のプライマーセットを用いれば、高度異形成以上の段階の組織のＨＰＶのＤＮＡを特異的に検出することができるという優れた効果が奏される。
なお、本明細書において、「プライマーがハイブリダイズする」とは、プライマーが、核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることをいう。プライマーが核酸にハイブリダイズした状態は、核酸増幅反応を進行させるに適した状態で核酸中の相補的な配列とアニーリングした状態となる。ここで、ストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件である。前記ストリンジェントな条件は、本発明のプライマーセットが、ＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシン変換剤で処理された核酸中における目的の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), ColdSpringHarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件等を用いることができる。
なお、「他の塩基」としては、ウラシル、チミンが挙げられる。例えば、非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いた場合、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換される。また、本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、このウラシルは、チミンに変換されることとなる。
第１プライマー及び第２プライマーは、核酸増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである。具体的には、第１プライマー及び第２プライマーは、それぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーであることが好ましい。これにより、非メチル化シトシン変換剤で処理された、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行えば、増幅反応の結果から簡便に、ＨＰＶに起因する癌細胞を有する被験者や高度異形成以上の段階の組織を確認することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応法は、慣用の手法により実施することができる。鎖置換反応法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法、ＳＭＡＰ法等が挙げられる。転写増幅法としては、例えば、ＴＡＳ法等が挙げられる。
本発明のプライマーセットは、使用する核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で作製することができる。より具体的には、まず、Ｌ１領域又はＬ２領域の塩基配列とＬＣＲ又はＥ６領域の塩基配列に関して、非メチル化シトシン変換剤による処理後の塩基配列を予測する。その後、予測した塩基配列から、市販のプライマー設計用ソフトウエア等を用いて、本発明のプライマーセットの各プライマーの塩基配列を設計し、各プライマーを合成することにより、本発明のプライマーセットを作製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応法であるリアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットの各プライマーを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸやｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。また、鎖置換反応法であるＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットの各プライマーを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ等が挙げられる。
本発明のプライマーセットによれば、前記のように、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができるため、ＨＰＶに起因する癌を診断することができる。したがって、本発明には、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット（以下、「診断用キット１」ともいう）も包含される。
本発明の診断用キット１は、前述したプライマーセットと、核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤とを含有するキットである。
非メチル化シトシン変換剤としては、核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換するのであればよく、例えば、亜硫酸水素塩等が挙げられる。前記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
本発明の診断用キット１では、前述したプライマーセットは、核酸を安定に保持するに適した緩衝液等の溶媒に溶解させ、核酸を安定に保持するに適した容器等に封入されて提供される。また、非メチル化シトシン変換剤は、この非メチル化シトシン変換剤を溶解させるに適した溶媒に溶解され、適切な容器等に封入されて提供される。
本発明の診断用キット１を適用することができるＨＰＶに起因する癌としては、例えば、子宮頸癌、口腔癌、咽頭癌等が挙げられる。
前述した本発明のプライマーセットによれば、前記のように、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができる。本発明には、ＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法も包含される。
本発明の癌細胞の検出方法は、
（Ａ）被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含む方法である。本発明の癌細胞の検出方法は、例えば、前述したＨＰＶに起因する癌の診断用キットを用いることにより、簡便に行なうことができる。
（Ａ）被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含む方法である。本発明の癌細胞の検出方法は、例えば、前述したＨＰＶに起因する癌の診断用キットを用いることにより、簡便に行なうことができる。
本発明の癌細胞の検出方法では、まず、被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製する〔ステップ（Ａ）〕。
前記ステップ（Ａ）では、被験者の細胞からのＤＮＡを含有する試料の調製は、公知の方法等により行なえばよい。前記ＤＮＡを含有する試料の調製は、例えば、
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
により行なうことができる。前記ステップ（Ａ）において、これらのステップ（ａ）〜（ｃ）を行なうことにより、被験者の細胞からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを含有する試料を調製することができる。
（ａ）界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
により行なうことができる。前記ステップ（Ａ）において、これらのステップ（ａ）〜（ｃ）を行なうことにより、被験者の細胞からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを含有する試料を調製することができる。
また、前記ステップ（Ａ）は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、（ａ１）ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップをさらに含んでもよい。この場合、前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る。
界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、テトラデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム（ＣＨＯ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。また、物理的処理を行なう方法としては、物理的に細胞を破砕する公知の方法であればよく、例えば、ホモジナイザーにより細胞を破砕する方法やミキサーにより細胞を振盪して破砕する方法等が挙げられる。ＤＮＡを含有する試料の調製には、市販のＤＮＡを抽出するためのキットを用いてもよい。
抽出したＤＮＡは、水や緩衝液に溶解してＤＮＡ溶液として用いることができる。ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、溶解したＤＮＡを安定に保持することができるものが好ましい。前記ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、例えば、ヌクレアーゼを含まないＰＣＲグレードの水や、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）等が挙げられる。
被験者の細胞としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞であればよい。被験者の細胞としては、特に限定されない。例えば、粘膜の細胞、皮膚の細胞等が挙げられる。粘膜としては、例えば、泌尿生殖器、消化器、呼吸器等の管腔臓器の内腔面の粘膜が挙げられる。より具体的な粘膜としては、子宮頸部の粘膜、口腔咽喉部の粘膜等が挙げられる。被験者の細胞の中では、子宮頸部の細胞及び口腔咽頭部の細胞が好ましい。本発明の検出方法では、被験者の細胞として、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞を用いることにより、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌の発症を引き起こすＨＰＶに起因する癌細胞を検出できる。子宮頸部の細胞は、被験者の子宮頸部（例えば、子宮頸部の粘膜等）から採取することができる細胞である。また、口腔咽頭部の細胞は、被験者の口腔咽頭部（例えば、口腔咽頭部の粘膜等）から採取することができる細胞である。
つぎに、前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する〔ステップ（Ｂ）〕。
他の塩基への非メチル化シトシンの変換は、前記非メチル化シトシン変換剤により行なうことができる。非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いる場合、前述のように、メチル化シトシンは、変換されず、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換されることとなる。前記亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。他の塩基への非メチル化シトシンの変換は、非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩である亜硫酸水素ナトリウムを用いる場合、ＤＮＡを含有する試料に１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加し、得られた混合物を適切な温度条件下にインキュベーションすることにより行なうことができる。
つぎに、前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なう〔ステップ（Ｃ）〕。本発明の検出方法では、ステップ（Ｃ）において、前記変換試料と、前記第１プライマー及び第２プライマーとを用いて核酸増幅反応を行なうため、癌化の原因となるＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された核酸を、特異的に増幅することができる。したがって、本発明の検出方法によれば、高い精度でＨＰＶに起因する癌細胞を検出することができる。
核酸増幅反応は、前記ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により行なわれる。これらのなかでは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応法である。
前記プライマーセットを用いた核酸増幅反応では、上述の非メチル化シトシン変換剤により処理されたＤＮＡを含有する試料中に、Ｌ２領域又はＬ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶのゲノムＤＮＡが存在している場合、増幅産物が得られることとなる。すなわち、被験者の細胞のＤＮＡを含有する試料中に、表１のＨＰＶ感染細胞２に示されるＨＰＶのゲノムＤＮＡが存在する場合、増幅産物が得られることとなる。一方、被験者の細胞のＤＮＡを含有する試料中に、表１に示されるＨＰＶ感染細胞１、３、及び４に示されるＨＰＶのゲノムＤＮＡしか存在ない場合、増幅産物が得られないこととなる。
その後、ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出する〔ステップ（Ｄ）〕。核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合、被験者が、ＨＰＶに起因する癌細胞を有すると判断される。すなわち、前記増幅産物の存在は、被験者が持続感染したＨＰＶを有することの指標となり得る。一方、核酸増幅反応により増幅産物が得られない場合、被験者がＨＰＶに起因する癌細胞を有していないと判定される。この場合、前記増幅産物が存在しないことは、被験者が、ＨＰＶに感染していないか、ＨＰＶに感染していたとしても一過性感染の感染であることの指標となり得る。このように、本発明の検出方法では、増幅産物の存在を確認することにより、ＨＰＶに起因する癌細胞を、簡便に検出することができる。
なお、核酸増幅反応により増幅産物が得られたか否かは、公知の方法によって確認することができる。かかる方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、標識プローブを増幅産物にハイブリダイズさせて検出する方法、二本鎖ＤＮＡに結合可能なインターカレータ（例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ等）を用いて蛍光を検出する方法及び核酸増幅で生じる副生成物の濁りを検出する方法等が挙げられる。
また、本発明のプライマーセットによれば、被験者から得られた組織が、高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができ、異形成の段階を診断することもできる。したがって、本発明には、異形成の段階の診断用キット（以下、「診断用キット２」ともいう）も包含される。
本発明の診断用キット２は、前述したプライマーセットと、前記非メチル化シトシン変換剤とを含有するキットである。本発明の診断用キット２では、前述したプライマーセット及び非メチル化シトシン変換剤は、前述した診断用キット１と同様の形態で提供される。
本発明の診断用キット２を適用することができる被験者の組織としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞を含む組織であればよい。例えば、子宮頸部や口腔咽喉部から採取した組織が挙げられ、特に、子宮頸部から採取した組織の異形成を診断するのに適用することが好ましい。
さらに、本発明のプライマーセットによれば、前記のように、被験者の組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。本発明には、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法も包含される。
本発明の判定方法は、
（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む方法である。
（Ａ）被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む方法である。
本発明の判定方法では、まず、被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製する〔ステップ（Ａ）〕。
本判定方法のステップ（Ａ）では、被験者の組織からのＤＮＡを含有する試料の調製は、公知の方法等により行なえばよい。また、前述のＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法におけるステップ（Ａ）の被験者の細胞からのＤＮＡを含有する試料の調製と同じ操作で、被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製することもできる。
被験者の組織としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞を含む組織であればよい。具体的な被験者の組織としては、被験者の子宮頸部及び口腔咽喉部から採取された組織が挙げられる。
本発明の判定方法におけるステップ（Ｂ）及びステップ（Ｃ）は、前述のＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法におけるステップ（Ｂ）及びステップ（Ｃ）と同じ操作で行なうことができる。本発明の判定方法では、前記ステップ（Ｃ）において、前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、前記第１プライマー及び第２プライマーとを用いて核酸増幅反応を行なうため、高度異形成以上の段階の病変部に存在するＨＰＶのゲノムＤＮＡに対応する非メチル化シトシンが他の塩基に変換された核酸を、特異的に増幅することができる。したがって、本発明の判定方法によれば、高い精度で、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定することができる。
その後、本発明の判定方法では、核酸増幅ステップにおける核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織か否かを判定する〔ステップ（Ｄ）〕。核酸増幅反応により増幅産物が得られた場合、被験者の組織が、高度異形成以上の段階の組織であると判定される。逆に、核酸増幅反応により増幅産物が得られない場合、被験者の組織が、高度異形成以上の段階の組織ではないと判定される。このように、本発明の判定方法では、増幅産物の有無を確認することにより、この増幅産物の有無を指標として、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを、簡便に判定することができる。
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
（実験例１）
ＨＰＶ１６ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ１μｇに、３００μＬの０．３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、１０Ｍ亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）３００μＬを添加し、８０℃で４０分間インキュベートすることにより、前記ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれるＤＮＡをＤＮＡ精製キット〔キアジェン社製、商品名：Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡに、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
ＨＰＶ１６ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ１μｇに、３００μＬの０．３Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、１０Ｍ亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）３００μＬを添加し、８０℃で４０分間インキュベートすることにより、前記ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれるＤＮＡをＤＮＡ精製キット〔キアジェン社製、商品名：Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。精製したＤＮＡに、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
分析用試料２μＬに対して、ＰＣＲ用試薬〔タカラバイオ株式会社製、商品名：ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ〕に含まれている試薬（×１０ ｂｕｆｆｅｒ）２．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５Ｕ／μＬ）〕０．１２５μＬ及び２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 ２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水１６．３８μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルを表２に示す。
表２中、ＰＣＲサーマルプロファイル（１）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃３０秒間と７２℃４０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。また、表２中、ＰＣＲサーマルプロファイル（２）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。
前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ後の増幅産物を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製、商品名：ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）に含まれるベクターに組み込んだ。得られた構築物を用いて、大腸菌（ＴＯＰ１０）を形質転換した。形質転換した大腸菌を、ＬＢ寒天培地〔組成：１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）寒天〕を用いて、３７℃で、一晩培養した。得られた大腸菌のコロニーを、ＬＢ液体培地に播種して、３７℃、一晩培養した。得られた大腸菌から、プラスミド抽出キット（シグマ−アルドリッチ社製、商品名：ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いて、プラスミドを精製した。得られたプラスミドに組み込まれている前記増幅産物の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法により、遺伝子解析システム〔アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００〕を用いて決定した。
ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されている場合（メチル化ＣｐＧ部位）、前記ＣｐＧ部位は、決定された塩基配列では、「ＣＧ」として現れる。一方、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていない場合（非メチル化ＣｐＧ部位）、前記ＣｐＧ部位は、決定された塩基配列では、「ＴＧ」として現れる。そこで、決定された増幅産物の塩基配列に基づき、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の局在を解析した。その結果を図２に示す。図２は、ＳｉＨａ細胞に組み込まれているＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図中、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１５２６（配列番号：９）におけるゲノムポジションを示す。
図２に示される結果から、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１６（組込型ＨＰＶ１６）の塩基配列のうち、Ｌ１領域におけるＣｐＧ部位及びＬ２領域におけるＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、メチル化されていることがわかる。それに対し、ＬＣＲにおけるＣｐＧ部位及びＥ６領域におけるＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、ほとんどメチル化されていないことがわかる。したがって、図２に示される結果から、Ｌ１領域のＣｐＧ部位及びＬ２領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位及びＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡの有無により、子宮頸癌の発症を引き起こす組込型ＨＰＶ１６を検出できる可能性が示唆される。
（試験例１）
ＨＰＶ１６の感染が確認された子宮頸部の組織のうち、病理学的に異形成が起こっていない正常組織と、癌組織それぞれを、厚さ２０μｍに薄切して、正常組織試料及び癌組織試料を得た。得られた各組織試料に、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液５００μＬを添加した。得られた混合物を、１００℃で２０分間保温した。保温後の混合物を、４℃で遠心分離し、上清を回収した。
ＨＰＶ１６の感染が確認された子宮頸部の組織のうち、病理学的に異形成が起こっていない正常組織と、癌組織それぞれを、厚さ２０μｍに薄切して、正常組織試料及び癌組織試料を得た。得られた各組織試料に、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液５００μＬを添加した。得られた混合物を、１００℃で２０分間保温した。保温後の混合物を、４℃で遠心分離し、上清を回収した。
得られた上清に、上述の亜硫酸水素塩溶液５００μＬを添加した。その後、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベートすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれる核酸を核酸精製キット〔キアジェン社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加した。つぎに、得られた混合物を室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
分析用試料４μＬに対して、ＰＣＲ用試薬（ロシュ社製、商品名：ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に含まれる試薬（商品名：×１０ ｂｕｆｆｅｒ） ２μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）〕０．１６μＬ及び２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．６μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．８μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．８μＬと、水１０．６４μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルを表３に示す。
表３中、実施例１のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆと、リバースプライマーである１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｒとからなる。前記１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、所定のメチル化されたＣｐＧ部位を含むＬ１領域に対応する部分とハイブリダイズする。前記１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、所定のメチル化されていないＣｐＧ部位を含むＬＣＲに対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、かつＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、実施例１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
表３中、比較例１のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６Ｌ１Ｍｅ１−Ｆと、リバースプライマーである１６Ｌ１Ｍｅ１−Ｒとからなる。前記１６Ｌ１Ｍｅ１−Ｆ及び１６Ｌ１Ｍｅ１−Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、それぞれ所定のメチル化されたＣｐＧ部位を含むＬ１領域に対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されているＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、比較例１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
表３中、比較例２のプライマーセットは、フォワードプライマーである１６ＬＣＲＵｎＭｅ１−Ｆと、リバースプライマーである１６ＬＣＲＵｎＭｅ１−Ｒとからなる。前記１６ＬＣＲＵｎＭｅ１−Ｆ及び１６ＬＣＲＵｎＭｅ１−Ｒは、ＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡに対応する亜硫酸水素塩処理された核酸において、それぞれ所定のメチル化されていないＣｐＧ部位を含むＬＣＲに対応する部分とハイブリダイズする。すなわち、分析用試料中に、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して得られた核酸が含まれる場合、比較例２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行なうと、増幅産物が生じることになる。
また、表３中、ＰＣＲサーマルプロファイル（３）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。ＰＣＲサーマルプロファイル（４）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。ＰＣＲサーマルプロファイル（５）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５６℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４５サイクルの反応を行なう条件である。
前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行ない、増幅産物の有無を確認した。その結果を図３に示す。図３は、実施例１、比較例１及び比較例２のプライマーセットそれぞれと、正常組織試及び癌組織試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。図３のパネル（ａ）〜（ｃ）のレーン１は、正常組織試料から得られた核酸の場合の増幅産物、レーン２は、癌組織試料から得られた核酸の場合の増幅産物を示す。また、図３のパネル（ａ）は、比較例１のプライマーセットを用いた場合の結果、パネル（ｂ）は、実施例１のプライマーセットを用いた場合の結果、パネル（ｃ）は、比較例２のプライマーセットを用いた場合の結果を示す。パネル（ｄ）〜（ｆ）は、増幅対象の核酸に対応するＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおける遺伝子領域のメチル化・非メチル化の状態を模式化して示したものである。パネル（ｄ）〜（ｆ）において黒丸はメチル化シトシンの存在、及び白丸は非メチル化シトシンの存在を、それぞれ模式的に示している。
図３のパネル（ａ）に示される結果から明らかなように、比較例１のプライマーセットを用いた場合、レーン１及びレーン２において増幅産物が検出されている。すなわち、比較例１のプライマーセットでは、正常組織及び子宮頸癌組織から調製されたいずれの分析試料からも、増幅産物が得られてしまう。この結果から、メチル化されたＬ１領域（ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されたＬ１領域）を検出するだけでは、正常組織と子宮頸癌組織を識別できないことがわかる。
また、図３のパネル（ｃ）に示される結果から明らかなように、比較例２のプライマーセットを用いた場合、レーン１及びレーン２において増幅産物が検出されている。すなわち、比較例２のプライマーセットでは、正常組織及び子宮頸癌組織から調製されたいずれの分析試料からも、増幅産物が得られてしまう。この結果から、メチル化されていないＬＣＲ（ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＬＣＲ）を検出するだけでは、正常組織と子宮頸癌組織を識別できないことがわかる。
これに対して、図３のパネル（ｂ）に示される結果から明らかなように、実施例１のプライマーセットを用いた場合、レーン１では増幅産物は検出されず、レーン２では増幅産物が検出されている。すなわち、実施例１のプライマーセットでは、正常組織から調整された分析用試料では、増幅産物が得られず、子宮頸癌組織から調整された分析用試料では、増幅産物が得られることがわかる。実施例１のプライマーセットでは、図３のパネル（ｅ）に示されるように、メチル化されているＬ１領域に対応する核酸におけるプライマーがハイブリダイズする部位から、メチル化されていないＬＣＲに対応する核酸におけるプライマーがハイブリダイズする部位までの連続した領域に対応する核酸を増幅対象とする。したがって、実施例１のプライマーセットによれば、前記表１に示されるＨＰＶ感染細胞２に含まれるＨＰＶ１６のゲノムＤＮＡにおける所定のＬ１領域及びＬＣＲを含む連続した核酸に対応する亜硫酸水素塩処理後の核酸のみが増幅される。その結果、実施例１のプライマーセットによれば、正常組織試料と子宮頸癌組織試料とを区別することが可能となる。
以上の結果から、ＨＰＶのＬ１領域のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外のシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲのＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとからなるプライマーセットを用いることにより、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出できることが示唆された。
（実験例２）
実験例１と同様の操作により、ＨＰＶ１８ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＣ４−１細胞を用い、ＨＰＶ１８ゲノムにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の解析を行なった。具体的には、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに代えて、Ｃ４−１細胞のゲノムＤＮＡを用い、かつ表２に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルに代えて、表４に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイル（６）を用いてＰＣＲ反応を行なったことを除き、実験例１と同様の操作を行ない、増幅産物の塩基配列を決定した。
実験例１と同様の操作により、ＨＰＶ１８ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるＣ４−１細胞を用い、ＨＰＶ１８ゲノムにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の解析を行なった。具体的には、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに代えて、Ｃ４−１細胞のゲノムＤＮＡを用い、かつ表２に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイルに代えて、表４に示されるプライマーセット及びＰＣＲサーマルプロファイル（６）を用いてＰＣＲ反応を行なったことを除き、実験例１と同様の操作を行ない、増幅産物の塩基配列を決定した。
表４中、ＰＣＲサーマルプロファイル（６）は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と５４℃３０秒間と７２℃４０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件である。
そこで、決定された増幅産物の塩基配列に基づき、ＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位の局在を解析した。その結果を図４に示す。図４は、Ｃ４−１細胞に組み込まれているＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図中、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１３５７（配列番号：１６）におけるゲノムポジションを示す。
図４に示される結果から、Ｃ４−１細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１８（組込型ＨＰＶ１８）も、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ１６（組込型ＨＰＶ１６）と同様に、Ｌ１領域におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されており、ＬＣＲにおけるＣｐＧ部位及びＥ６領域のＣｐＧ部位それぞれのシトシンは、メチル化されていないことがわかる。この結果から、本発明のプライマーセットを用いれば、ＨＰＶの種類に関わらず、子宮頸癌の発症を引き起こす組込型ＨＰＶを検出できる可能性が示唆される。
（試験例３）
被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１６の感染が確認された１４種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「手術摘出試料」という）及び被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ１６の感染が確認された７種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「生検試料」という）のそれぞれを、厚さ１０μｍとなるように薄切し、組織試料を得た。
被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１６の感染が確認された１４種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「手術摘出試料」という）及び被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ１６の感染が確認された７種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（以下、「生検試料」という）のそれぞれを、厚さ１０μｍとなるように薄切し、組織試料を得た。
なお、前記手術摘出試料及び生検試料は、いずれも、従来の組織診により異形成以上の段階の組織であることが診断された組織を含むものである。１４種類の手術摘出試料のうち、軽度異形成（ＣＩＮ１)の試料は１種類、中等度異形成（ＣＩＮ２)の試料は４種類、高度異形成（ＣＩＮ３)の試料は４種類、癌（ＳＣＣ）の試料は４種類、正常試料は１種類である。また、生検試料のうち、軽度異形成（ＣＩＮ１)の試料は２種類、高度異形成（ＣＩＮ３)の試料は２種類、癌（ＳＣＣ）の試料は３種類である。
１．５ｍＬチューブに、同じパラフィンブロックから得られた組織試料３枚と、キシレン１ｍＬとを添加した。得られた混合物を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、ペレットに１００体積％エタノール１ｍＬを添加して懸濁し、得られた懸濁物を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、再度ペレットに１００体積％エタノールを添加して懸濁し、得られた懸濁物を再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上清を除き、ペレットを乾燥させた。得られたペレットを、以下、「乾燥ペレット」という。
１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液７００μＬを、手術摘出試料から得られた乾燥ペレットに添加した。また、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと０．１Ｍ水酸化ナトリウムとを含む溶液５００μＬを、生検試料から得られた乾燥ペレットに添加した。得られた各混合物を、１００℃で２０分間保温した。保温後の各混合物を、４℃で１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供し、上清を回収した。
前記亜硫酸水素塩溶液７００μＬを、手術摘出試料から得られた上清に添加し、混合した。また、前記亜硫酸水素塩溶液５００μＬを、生検試料から得られた上清に添加し、混合した。その後、得られた各混合物を８０℃で４０分間インキュベートすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれる核酸を核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように、水酸化ナトリウムを添加した。つぎに、得られた混合物を室温で５分間インキュベートした。その後、得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−３００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、分析用試料を得た。
分析用試料として、手術摘出試料由来の分析用試料を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行なって、ＰＣＲ用反応液を調製した。また、分析用試料として、生検試料由来の分析用試料を用い、分析用試料の量を２μＬとしたことを除き、試験例１と同様の操作を行なって、ＰＣＲ用反応液を調製した。ＰＣＲ用反応液のプライマーセットとして、配列番号：１０で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１１で示される塩基配列からなるプライマーとからなる実施例１のプライマーセットを用いた。
なお、手術摘出試料由来の分析用試料を含むＰＣＲ用反応液を用いた場合のＰＣＲ条件は、表３中のＰＣＲサーマルプロファイル（３）と同じ条件である。生検試料由来の分析用試料を含むＰＣＲ用反応液を用いた場合のＰＣＲ条件は、９５℃４．５分間の保温後、９５℃３０秒間と６０℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルで反応を行なう条件である。
前記ＰＣＲ用反応液を用いて、プライマーセットの種類に応じたＰＣＲ条件で、ＰＣＲを行ない、増幅産物の有無を確認した。その結果を図５に示す。図５は、実施例１のプライマーセットと、手術摘出試料及び生検試料から調製された各分析用試料とを用いた核酸増幅後の増幅産物の結果を示す電気泳動図である。図５中、レーン１は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン２は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン３は、ＣＩＮ１の手術摘出試料を用いた結果、レーン４は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン５は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン６は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン７は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン８は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン９は、ＳＣＣの手術摘出試料を用いた結果、レーン１０は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１１は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１２は、ＣＩＮ２の手術摘出試料を用いた結果、レーン１３は、ＣＩＮ３の手術摘出試料を用いた結果、レーン１４は、正常の手術摘出試料を用いた結果、レーン１５は、ＣＩＮ１の生検試料を用いた結果、レーン１６は、ＣＩＮ１の生検試料を用いた結果、レーン１７は、ＣＩＮ３の生検試料を用いた結果、レーン１８は、ＣＩＮ３の生検試料を用いた結果、レーン１９は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果、レーン２０は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果、レーン２１は、ＳＣＣの生検試料を用いた結果を示す。図５中、ＰＣは、分析用試料として、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した核酸を用いた結果、ＮＣは、分析用試料として、蒸留水を用いた結果を示す。さらに、図５の結果について、異形成の段階に基づいて分析した結果を表５に示す。表５中、「Ｌ１−ＬＣＲ陽性」は、増幅産物が検出された試料を示す。また、表５において、全試料数に対するＬ１−ＬＣＲ陽性の試料数の割合（％）を、括弧内に示す。
図５及び表５に示される結果から、実施例１のプライマーセットによれば、組織診により高度異形成（ＣＩＮ３）以上の段階の組織であると判定された組織から調製された分析用試料を用いた場合、高い割合で、増幅産物が得られるが、組織診により中度異形成（ＣＩＮ２）以下の段階の組織であると判定された組織から調製された分析用試料を用いた場合、増幅産物が得られる割合が低いことがわかる。この結果から、実施例１のプライマーセットによれば、手術摘出試料、生検試料等の臨床検体として得られた組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定できることがわかる。
（試験例４）
被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１８の感染が確認された癌組織のパラフィンブロック及び被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された子宮頸部の組織のパラフィンブロック（手術摘出試料）、並びに被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された患者由来の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（生検試料）を用い、試験例２と同様の操作を行なうことにより、それぞれの分析用試料を得た。
被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ１８の感染が確認された癌組織のパラフィンブロック及び被験者から手術により摘出され、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された子宮頸部の組織のパラフィンブロック（手術摘出試料）、並びに被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３の段階の組織であると診断された患者由来の子宮頸部の組織のパラフィンブロック（生検試料）を用い、試験例２と同様の操作を行なうことにより、それぞれの分析用試料を得た。
分析用試料２μＬに対して、ＰＣＲ用試薬〔タカラバイオ株式会社製、商品名：ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ〕に含まれている試薬（×１０ ｂｕｆｆｅｒ）１．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５Ｕ／μＬ）〕０．０７５μＬ及び２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 １．２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと水９．０２５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
ＨＰＶ１８を含む試料由来の分析用試料に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを表６に示す。ＨＰＶ５８を含む試料由来の分析用試料に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを表７に示す。
なお、ＰＣＲ条件として、実験例２で用いたＰＣＲサーマルプロファイル（６）及び手術摘出試料由来の分析用試料及び生検試料由来の分析用試料それぞれを用い、実験例１と同様の操作を行ない、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ５８それぞれのゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を解析した。これらの結果を図６〜８に示す。
図６は、手術摘出試料由来のＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図７は、手術摘出試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図８は、生検試料由来のＨＰＶ５８のゲノムＤＮＡにおけるメチル化ＣｐＧ部位及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す模式図である。図中、黒丸は、メチル化ＣｐＧ部位を示し、白丸は、非メチル化ＣｐＧ部位を示す。また、図６において、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１３５７（配列番号：１６）におけるゲノムポジションを示す。また、図７及び８において、ＣｐＧ部位の欄の数値は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１４４３（配列番号：３７）におけるゲノムポジションを示す。
図６に示される結果から、ＨＰＶ１８の感染が確認された癌組織由来のＨＰＶ１８では、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンが高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンがほとんどメチル化されておらず、かつＥ６領域のＣｐＧ部位のシトシンはメチル化されていないことがわかる。また、図７に示される結果から、ＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３と診断された子宮頸部の組織由来のＨＰＶ５８では、Ｌ１領域及びＬ２領域のＣｐＧ部位のシトシンは、高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていないことがわかる。さらに、図８に示される結果から、コルポスコピー観察下で得られたＨＰＶ５８の感染が確認され、かつＣＩＮ３と診断された患者由来の子宮頸部の組織由来のＨＰＶ５８は、Ｌ１領域のＣｐＧ部位のシトシンは、高頻度でメチル化されており、ＬＣＲのＣｐＧ部位のシトシンは、ほとんどメチル化されていないことがわかる。
これらの結果から、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとからなるプライマーセットによれば、ＨＰＶの種類に関わらず、子宮頸癌の発症を引き起こすＨＰＶを検出できることが示唆される。また、前記プライマーセットによれば、手術摘出試料や生検試料等の臨床検体として得られた組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定できることが示唆された。
（調製例１）
ＨＰＶに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットを調製した。その一例を、以下に示す。かかるキットは、下記プライマーセットの各プライマーの水溶液が入ったヌクレアーゼフリーの容器と非メチル化シトシン変換剤である亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）が入ったヌクレアーゼフリーの容器とからなる。
ＨＰＶに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットを調製した。その一例を、以下に示す。かかるキットは、下記プライマーセットの各プライマーの水溶液が入ったヌクレアーゼフリーの容器と非メチル化シトシン変換剤である亜硫酸水素塩溶液（１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液）が入ったヌクレアーゼフリーの容器とからなる。
ＨＰＶに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットの内容：
容器１
フォワードプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器２
リバースプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器３
１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液
容器１
フォワードプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器２
リバースプライマー水溶液（配列番号：１０に示される塩基配列からなるプライマー１６Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液）
容器３
１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム水溶液
かかるキットを用いて、前記試験例１と同様の操作を行なうことにより、ＨＰＶに起因する癌を、高い精度で、かつ簡便に診断することができる。また、本キットを用いて、前記試験例３と同様の操作を行なうことにより、異形成の段階を、高い精度で、かつ簡便に診断することができる。
配列番号：１は、プライマーの配列である。
配列番号：２は、プライマーの配列である。
配列番号：３は、プライマーの配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
配列番号：８は、プライマーの配列である。
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
配列番号：１４は、プライマーの配列である。
配列番号：１５は、プライマーの配列である。
配列番号：１７は、プライマーの配列である。
配列番号：１８は、プライマーの配列である。
配列番号：１９は、プライマーの配列である。
配列番号：２０は、プライマーの配列である。
配列番号：２１は、プライマーの配列である。
配列番号：２２は、プライマーの配列である。
配列番号：２３は、プライマーの配列である。
配列番号：２４は、プライマーの配列である。
配列番号：２５は、プライマーの配列である。
配列番号：２６は、プライマーの配列である。
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配列番号：２８は、プライマーの配列である。
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配列番号：３０は、プライマーの配列である。
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配列番号：３４は、プライマーの配列である。
配列番号：３５は、プライマーの配列である。
配列番号：３６は、プライマーの配列である。
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配列番号：３５は、プライマーの配列である。
配列番号：３６は、プライマーの配列である。
Claims (14)
- （Ａ） 被験者の細胞からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ） 前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ） 前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ） 前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、ＨＰＶに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含むＨＰＶに起因する癌細胞の検出方法。 - 前記ステップ（Ａ）が、
（ａ） 界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
（ｂ） 前記ステップ（ａ）で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
（ｃ） 前記ステップ（ｂ）で得られた上清を分取するステップ、
を含む、請求項１に記載の検出方法。 - 前記ステップ（Ａ）が、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間において、
（ａ１） ステップ（ａ）で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からＤＮＡを遊離させるステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ１）で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、請求項２に記載の検出方法。 - （Ａ） 被験者の組織からＤＮＡを含有する試料を調製するステップ、
（Ｂ） 前記ステップ（Ａ）で得られた試料に含まれるＤＮＡ中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
（Ｃ） 前記ステップ（Ｂ）で得られた変換試料と、ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーとを用いて、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
（Ｄ） 前記ステップ（Ｃ）の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法。 - 組織が、子宮頸部の組織である、請求項４に記載の判定方法。
- ＨＰＶのＬ１領域又はＬ２領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第１プライマーと、
ＨＰＶのＬＣＲ又はＥ６領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第２プライマーと
を含み、
非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたＨＰＶのゲノムＤＮＡの塩基配列からなる核酸のうち、第１プライマーがハイブリダイズする部位から第２プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット。 - 第１プライマーが、ＨＰＶのＬ１領域中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、ＣｐＧ部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
- 第２プライマーが、ＨＰＶのＬＣＲ中のＣｐＧ部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
- 他の塩基が、ウラシル又はチミンである、請求項６に記載のプライマーセット。
- 第１プライマー及び第２プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、請求項６に記載のプライマーセット。
- 請求項６に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有してなる、ＨＰＶに起因する癌の診断用キット。 - 非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、請求項１１に記載の診断用キット。
- ＨＰＶに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、請求項１１に記載の診断用キット。
- 請求項６に記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と
を含有してなる、異形成の段階の診断用キット。
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