KR0149015B1 - 마가이닌 펩타이드의 결실 동족체 - Google Patents

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마가이닌 펩타이드의 결실 동족체

본 발명은 마가이닌(magainin)으로서 공지된 생물학적으로 활성인 펩타이드 그룹에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 펩타이드 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩타이드 쇄로부터 생략되어 있는 마가이닌 펩타이드의 동족체에 관한 것으로, 이러한 동족체를 통상 결실 동족체(deletion analogue)라 부른다.

본 발명의 한 측면에 따라, 아미드 또는 카복시 말단화된 마가이닌 I 펩타이드의 결실 동족체를 포함하는 화합물이 제공되며, 여기서 마가이닌 I은 단일 문자 아미노산 코드를 사용하여 하기의 서열식으로 표시되고, 각각의 아미노산 잔기 아래에 있는 숫자는 펩타이드내 잔기의 위치를 나타내며, 아미노산 잔기 15 내지 23번중 하나 이상이 생략된다:

바람직한 양태에서는, 아미노산 잔기 15, 16, 18, 19, 21, 22 및 23번중 하나 이상이 생략된다. 한가지 양태에서는, 적어도 아미노산 잔기 18번이 생략되며, 다른 양태에서는 적어도 아미노산 잔기 19번이 생략되며, 또다른 양태에서는 적어도 아미노산 잔기 21번이 생략된다. 바람직한 양태에서는, 각각의 아미노산 잔기 18, 19 및 21번 중 단지 하나만이 생략된다. 다른 바람직한 양태에서는, 아미노산 잔기 21, 22 및 23번이 생략되며, 아미노산 잔기 19 내지 23번이 생략되고, 아미노산 잔기 18 내지 23번이 생략되며, 아미노산 잔기 17 내지 23번이 생략된다. 이러한 화합물이 아미드- 또는 카복시-말단화된 마가이닌 I의 결실 동족체일 수 있다.

결실 동족체가 하기에서는 마이너스 기호(-), 아미노산 잔기에 대한 단일문자 코드 및 서열내 잔기의 위치를 나타내는 어깨 숫자를 사용한 속기 형태로 표시된다. 마가이닌 I 또는 II에 대해 참조한다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 아미드- 또는 카복시- 말단화된 마가이닌 II의 결실 동족체인 펩타이드를 포함하는 화합물이 제공되며, 여기서 마가이닌 II는 단일문자 아미노산 코드를 사용하여 하기의 서열식으로 표시되고, 각각의 아미노산 잔기 아래에 있는 숫자는 펩타이드내 잔기의 위치를 나타내며, 아미노산 잔기 15 내지 22번중 하나 이상이 생략된다:

바람직한 양태에서는, 아미노산 잔기 15, 18, 19, 20, 21 및 22번중 하나 이상이 생략된다. 한가지 양태에서는 적어도 아미노산 잔기 18번이 생략된다. 다른 양태에서는, 적어도 아미노산 잔기 19번이 생략된다. 또다른 양태에서는 적어도 아미노산 잔기 21번이 생략되며, 또한 다른 양태에서는 적어도 아미노산 잔기 22번이 생략된다. 바람직한 양태에서는, 각각의 아미노산 잔기 18, 19, 21 및 22번 중 단지 하나만이 생략된다. 이러한 화합물이 아미드 말단화된 마가이닌 II의 결실 동족체일 수 있다.

상술한 바와 같은 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 결실 동족체는 그램-양성 및 그램-음성 세균에 대해서는 효과적인 반면에, 사람의 적혈구 세포에 대해서는 무시할 정도로 미미한 용혈 작용을 가짐을 발견하였다.

본 발명에 따른 마가이닌 I 또는 마가이닌 II 펩타이드의 결실 동족체를 포함하는 이들 화합물의 용도는 항생제로서 효과적이며, 미생물(예: 세균, 진균, 바이러스 등)의 성장 또는 증식을 억제하거나 방해하거나 파괴시키기 위해 사용할 수 있다. 유사하게, 이러한 화합물들은 바이러스의 성장 또는 증식을 억제하거나 방해하거나 파괴시키기 위한 항바이러스 조성물로서 사용될 수 있다.

상기 화합물들은 또한 정자의 운동성을 억제하거나 방해하거나 파괴시키기 위한 살정자제로서 사용될 수 있다.

상기 화합물들은 또한 종양의 성장을 억제하거나 파괴시키기 위한 항종양제로서 사용될 수 있다.

상기 화합물은 그램-양성 및 그램-음성 세균, 진균 및 원생동물 등을 포함하는 다수의 미생물에 대해 광범위하게 효능있는 항생제 활성을 가진다. 이러한 화합물은, 이 화합물에 대해 민감한 유기체에 의해 유발되는 미생물 감염을 치료하거나 억제하기 위해 사용될 수 있다.

상기 화합물은 또한 미생물에 의해 오염되기 쉬운 물질에 대한 방부제 또는 멸균제로서 사용될 수 있다.

본 발명을 특정한 이론적 근거에 한정시키려는 것은 아니나, 예비 NMR 연구 결과, 마가이닌 II의 구조가 용매에 따라 물 중에서는 랜덤 코일형에서 보다 소수 성인 용매(예: 트리플루오로에탄올) 중에서는 α-나선형으로 변화되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 마가이닌이 다양한 미생물 유기체의 지질막과 접촉시 α-나선형 구조로 유도되는 잠재력을 지님을 제시하는 것이다.

일반적으로, 마가이닌 I 또는 마가이닌 II 펩타이드의 결실 동족체는 전신투여시 체중 kg당 약 1mg 내지 약 500mg의 용량으로 투여된다. 국소투여시, 이 펩타이드는 약 0.5% 내지 약 5%의 농도로 사용된다.

본 발명에 따른 마가이닌 I 또는 마가이닌 II의 결실 동족체를 포함하는 화합물은 다양한 숙주를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 숙주는 동물일 수 있으며, 이러한 동물은 사람 또는 사람이 아닌 동물일 수 있다.

마가이닌 I 또는 마가이닌 II의 결실 동족체를 포함하는 화합물은 충전제, 무독성 완충제 또는 생리학적 염수 용액과 같은 무독성 약제학적 담체 또는 비히클과 혼합하여 다양한 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 국소 또는 전신투여될 수 있으며, 액제, 고형제, 반-고형제, 주사용 액제, 정제, 연고제, 로션제, 페이스트제 또는 캡슐제 등과 같은 적절한 형태로 존재할 수 있다. 마가이닌 I 또는 마가이닌 II의 결실 동족체를 포함하는 화합물은 또한 보조제, 프로테아제 억제제, 또는 혼합시 원생동물, 바이러스 등을 포함하는 유해한 미생물에 의해 유발되는 감염을 억제하는데 바람직하거나 유용하다고 여겨지는 적합한 약제와 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 마가이닌 I 또는 마가이닌 II의 결실 동족체를 포함하는 화합물은 항생물 및/또는 항종양 및/또는 항-바이러스 및/또는 항-미생물 및/또는 살정자 유효량으로 숙주, 특히 동물에 투여될 수 있다.

본 발명의 마가이닌 I 및 마가이닌 II 펩타이드의 결실 동족체 뿐만 아니라 마가이닌 I 및 마가이닌 II(아미드- 및 카복시-말단화된 마가이닌 I 및 마가이닌 II 형태)는 당해분야의 전문가에게 잘 알려진 용이한 펩타이드 합성 방법에 의해 합성할 수 있다. 고체상 합성방법이 특히 바람직하다.

본 명세서에 기술된 펩타이드는 동시 다수 펩타이드 합성(simultaneous multiple peptide synthesis: SMPS) 방법에 의해 제조된다. 이 방법은 문헌[참조: Houghten, R.A., General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides; Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., Vol. 82, pgs. 5131-5135 (1985), and Houghten, R.A., et al., Simultaneous Multiple Peptide Synthesis; The Rapid Preparation of Large Numbers of Discrete Peptides for Biological, Immunological, and Methodological Studies, Peptide Chemistry, pgs. 295-298 (1987)]에 상세히 기술되어 있다. 상기 방법에 의해, 일련의 생략 또는 결실 동족체 모두를 제조할 수 있다.

하기의 실시예를 위한, 일련의 결실 동족체들은 23가지의 펩타이드 시리즈로 이루어지는데, 이때 아미노산 잔기 1번은 제1 펩타이드로부터 생략되며, 아미노산 잔기 2번은 제2 펩타이드로부터 생략되는 등 아미노산 잔기 23번이 23번째 펩타이드로부터 생략되어 있는 결실 동족체까지 제조가능하다. 이와 같이 결실 동족체 시리즈가 마가이닌 I 및 마가이닌 II 모두에 대해 제조될 수 있다.

비교를 위해, 아미드-말단화되거나 카복시-말단화된 완전한 마가이닌 I 및 마가이닌 II도 SMPS 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 범위내에서 마가이닌 I 또는 마가이닌 II 구조로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 생략된 결실 동족체도 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드가 실시예 5에 기술되어 있다.

본 발명을 도면을 참고로 하여 기술한다.

제la도는 1/(흡광도 변화) 대 마가이닌 I 또는 동족체 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 함유 샘플에 대한 펩타이드(㎍/ml)의 그래프이다.

제1b도는 1/(흡광도 변화) 대 마가이닌 II 또는 동족체 및 이.콜라이 함유 샘플에 대한 펩타이드(㎍/ml)의 그래프이다.

제2a도는 1/(흡광도 변화) 대 마가이닌 I 또는 동족체 및 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis) 함유 샘플에 대한 펩타이드(㎍/ml)의 그래프이다.

제2b도는 1/(흡광도 변화) 대 마가이닌 II 또는 동족체 및 에스. 에피더미스 함유 샘플에 대한 펩타이드(㎍/ml)의 그래프이다.

제3도는 log(㎖당 1.0 x 10⁶CFU 이. 콜라이의 10^-2, 10^-3및 10^-4배 희석물로부터의 세균수) 대 이. 콜라이 유기체를 마가이닌 II의 -G¹⁸결실 동족체(○), 마가이닌 II의 -E¹⁹결실 동족체(----), 아미드-말단화된 마가이닌 II(■), 또는 대조용(□)와 함께 배양시킨 시간에 대한 그래프이다.

본 발명은 하기의 실시예를 참조로 기술하지만, 본 발명의 범위를 이로써 제한하고자 함은 아니다.

[펩타이드 합성]

마가이닌 I, 마가이닌 II 및 결실 동족체의 펩타이드 합성은 동시 다수 펩타이드 합성법을 이용하여 수행한다. 모든 용매 및 시약은 분석등급이며 추가의 정제없이 사용한다. 표준 N-t-Boc-보호된 아미노산을 합성시 사용한다. 사용된 측쇄 작용기는 벤질(Ser, Glu), 2-Cl-Z(Lys) (Z=벤질옥시카보닐), N^im-DNP (His) 및 설폭사이드(Met)이다. 펩타이드 합성은 C-말단 카복실 펩타이드를 제조하기 위해서는 Boc-아미노산-Pam 수지[Applied Biosystems로부터 구입한 PAM(치환도 0.56meq/gm)은 아미노 폴리스티렌의 아미노아실-4-[옥시메틸]페닐아세트산 유도체이다] 100mg으로 출발하거나 C-말단 아미드 펩타이드를 제조하기 위해서는 수지 팩키트(packet) 당 메틸 벤즈하이드릴 아민 수지(치환도-0.65meq/gm) 100mg으로 출발하여 수행한다.

합성 후, 완전히 보호된 펩타이드 수지를 DMF 중의 0.5M 티오페놀로 3회 처리하여 히스티딘으로부터 N^im-디니트로페닐 그룹을 제거한다. 최종 Boc-그룹은 TFA를 사용하여 제거하여 최종 HF 처리 동안 메티오닐 잔기의 t-부틸화를 막는다. 저-고 (Low-High) HF 방법[참조: Tam, et at. J. Am. Chem. Soc. Vol. 105, p. 6442 (1983)]을 이용하여 절단시킨다. Pam 수지상에 합성된 펩타이드에 대해서는, 팩키트로부터 수지를 제거시키지 않으면서 다수 용기 HF 장치를 사용하여 0℃에서 2시간 동안 저-HF 방법을 수행한다. MBHA 수지를 사용하여 제조한 펩타이드에 대해서는, 통상의 반응용기 중, 0℃에서 2시간 동안 저 HF 방법을 수행한다. Pam 수지 펩타이드의 경우, 물 흡입기에 이어 기계식 펌프를 사용하여 24개의 개개 반응용기로 부터 저-HF 혼합물을 배출시킨다. 디메틸설파이드(낮은 단계로부터 유도됨) 및 HF가 제거되면, 펩타이드를 -5℃ 내지 0℃에서 1-½시간 동안 고-HF(10% 아니솔) 처리한다. HF를 강한 질소류에 의해 증발시킨다. 액체를 폐기 용기에 따라 버림으로써 MBHA 수지가 담긴 백을 포함하는 저-HF 반응용기안의 저-HF 혼합물을 비울 수 있다. 백을 즉시 냉 에테르로 세척한 다음, CH₂Cl₂, DMF, CH₂Cl₂, IPA, CH₂Cl₂로 번갈아 세척한다. 그 다음에 팩키드를 건조시켜 스캐빈저(scavenger)로서 아니솔 0.7ml를 함유하는 24개 용기를 갖는 HF 장치의 개개 튜브로 옮긴다. 고-HF 처리는 -70℃에서 무수 불화수소를 응축시켜 수행한다. 반응은 -10℃에서 1시간 동안 및 -5℃ 내지 0℃에서 마지막 30분 동안 일어난다. HF는 강한 질소류를 이용하여 증발시킨다. 최종적으로, 잔류하는 카보늄 이온 스캐빈저는 무수 에테르로 세척하여 제거한다.

이어서 조 펩타이드를 10% 아세트산으로 추출한 다음 벡크만-알텍(Beckman-Altek) 모델 421 HPLC 시스템 및 2개의 모델 110A 펌프를 사용하여 분석용 역상 컬럼(Vidac ODS 25cm x 4.6mm)상에서 RP-HPLC 한다. 용매계는 완충액 A(0.05% TFA/H₂0) 및 완충액 B(0.05% TFA/CH₃CN)로 구성되며, 유속은 1.0ml/분이다. 펩타이드는 215nm에서 Hitachi 100-20 분광광도계를 사용하여 검출한다.

펩타이드의 정제는 CH₃CN 및 0.05% TFA로 구성된 용출 구배를 사용하여 Vidac C₁₈(22mm x 25cm) 10㎛ 팩킹 컬럼상에서 역상 HPLC에 의해 수행한다. 아미노산 분석은 110℃에서 24시간 동안 일정한(비등) 6N HCl 중에서 펩타이드를 가수 분해시켜 벡크만 6300 분석기상에서 수행하며, 이러한 분석결과는 이론치의 ±10% 범위내에 속한다.

[실시예 2]

[항미생물 분석]

항미생물 분석은 96개의 웰 조직 배양판에서 수행한다. 각각의 웰을 LB 배지(에스케리키아 콜라이 및 스타필로코커스 에피더미스) 또는 YTB 배지(캔디다 알비칸스: Candida albicans) 중에 현탁시킨 제시된 미생물과 함께 배양한다. (1 x PBS, pH 7.0에 용해시킨) 펩타이드 또는 그들의 결실 동족체의 첨가시, 각각의 웰은 최종 세포 밀도가 1.0 x 10⁶콜로니 형성 단위(colony forming unit: CFU)/ml이다. 사용된 최종 펩타이드 농도는 100㎍/ml, 75.0㎍/ml, 50.0㎍/ml, 25㎍/ml, 및 10㎍/ml이다. 그러나 씨. 알비칸스에 대해서는 500㎍/ml 이하의 농도가 사용된다.

웰에 펩타이드를 첨가하는 시점을 0으로 정의한다. 6시간 후, 배양판을 티터텍 멀티스칸(Titertek Multiskan) 장치에 놓고 0.D.₆₂₀을 측정한다. 배양판 및 초기 접종물을 37℃에서 배양한다.

배양판당 5개의 웰은 배지만을 함유하는 반면에 다른 5개는 배지 + 세포를 함유한다. 이들 대조군은 미생물의 비억제된 성장 측정치를 제공하고 배지 오염의 가능성을 배제시키는데 사용된다. 이. 콜라이 또는 에스. 에피더미스의 상기 콜로니 형성단위와 함께 상기 언급된 다양한 농도의 펩타이드 또는 그들의 결실 동족체를 함유하는 웰에 대한 1/(흡광도 변화)의 측정치가 제1 및 2도에 제시되어 있다. 제1도는 마가이닌 I 또는 마가이닌 II 펩타이드 또는 그들의 결실 동족체 및 이. 콜라이를 포함하는 웰에 대한 1/(흡광도 변화)의 측정치의 그래프이다. 제1a도는 마가이닌 I(X로 표시됨) 및 그의 결실 동족체(아미노산 잔기 23번이 생략된 결실 동족체는 시험되지 않음)에 관련된 그래프이다. 제 1b도는 마가이닌 II(X로 표시됨) 및 그의 결실 동족체에 관련된 그래프이다. 두 그래프에서 Z는 배지 + 세포의 대조군이다.

제2도는 마가이닌 I 또는 마가이닌 II 펩타이드 또는 그들의 결실 동족체 및 에스. 에피더미스를 포함하는 웰에 대한 1/(흡광도 변화)의 측정치의 그래프이다. 제2a도는 마가이닌 I(X로 표시됨) 및 그의 결실 동족체(아미노산 잔기 23번이 결실된 결실 동족체는 시험되지 않음)에 관련된 그래프이다. 제2b도는 마가이닌 II(X로 표시됨) 및 그의 결실 동족체에 관련된 그래프이다. 두 그래프에서, Z는 배지 + 세포의 대조군이다. 마가이닌 I 및 마가이닌 II 펩타이드 및 그들의 결실 동족체에 대해 측정한 1/(흡광도 변화)의 측정치는 이. 콜라이 및 에스. 에피더미스에 대한 그들의 효과 측정치와 상호관계가 있을 수 있다.

펩타이드 활성도는 6시간에 걸쳐 결실 동족체의 활성을 대조용 세포의 비억제된 성장과 비교하여 결정한다. 각각의 펩타이드 및 그들의 결실 동족체의 효과적인 성장억제가 하기의 표1에 제시되어 있다. 표1에 제시된 바와 같이, M1C는 마가이닌 I [C-말단 카복실(카복시-말단화됨)]인 반면에, M2A는 마가이닌 II [C-말단 아미드(아미드-말단화됨)]이다. 각각의 M1C 또는 M2A 펩타이드 다음에 오는 문자 및 숫자 코드는 마가이닌 I(카복시-말단화됨) 또는 마가이닌 II(아미드-말단화됨)의 특정한 결실 동족체로부터 결실된 아미노산 잔기를 나타낸다.

또한 조 마가이닌 I 및 마가이닌 II 펩타이드 및 조 결실 동족체 제제의 항미생물 효과는 정제된 마가이닌 I 및 마가이닌 II 펩타이드 및 그들의 결실 동족체의 효과와 실험적 오차 범위내에서 동일함을 발견하였다.

제1도 및 제2도 및 상기 표1에 제시된 바와 같이, N-말단 영역(아미노산 1 내지 14번)에 펩타이드 결실을 갖는 동족체는 이. 콜라이 및 에스. 에피더미스에 대해 펩타이드의 활성이 감소되었다. 마가이닌 I 또는 마가이닌 II로부터 글리신(아미노산 18번) 또는 글루탐산(아미노산 19번)의 생략으로, 그들의 상대적인 억제 농도에 대해 비교시, 마가이닌 I 및 마가이닌 II 모두에 대해 가장 활성인 결실 동족체가 생성되었다. 씨. 알비칸스의 경우, 결실 동족체는 100㎍/ml에서 활성이 전혀 없지만, 400㎍/ml에서 시험시 알라닌(아미노산 15번)이 결실된 마가이닌 I의 결실 동족체는 낮지만 유의한 활성을 보였다.

마가이닌 I 및 마가이닌 II의 전체 서열을 비교할 경우, C-말단 아미드를 갖는 펩타이드가 C-말단 카복시를 갖는 펩타이드보다 활성임이 밝혀졌다. 마가이닌 I 아미드의 경우, 펩타이드 농도가 25㎍/ml일 때 이. 콜라이의 성장이 100% 억제되었다. 그러나, 25㎍/ml에서 상응하는 카복시 형태의 경우는 단지 70%의 성장 억제가 감지되었다. 마가이닌 II의 아미드 및 카복시 형태의 경우, 이. 콜라이에서의 항미생물 효능에 있어서 차이가 더욱 상당하였다. 표1에 제시된 바와 같이, 마가이닌 II의 C-말단 카복시 형태는 50㎍/ml에서 100% 억제를 보였지만, 마가이닌 II 아미드는 25㎍/ml에서 100% 억제를 보였다.

[실시예 3]

[미생물 살생 역학]

아미드-말단화된 마가이닌 II, 글리신(아미노산 18번)이 결실된 아미드-말단화된 마가이닌 II, 및 글루탐산(아미노산 19번)이 결실된 아미드-말단화된 마가이닌 II가 용해된 펩타이드 제제를 이. 콜라이(1.0 x 10 CFU/ml)를 함유하는 시험관에 가하여 최종 펩타이드 농도를 25㎍/ml로 만든다. 제3도에 도시된 바와 같이, 첨가한지 15, 30, 45 및 60분 후에 각 튜브로부터 10.0μl를 덜어내고, 이어서 LB 배지 중에 10의 계수로 4회 연속 희석시킨다. 10 , 10 및 10 희석액 10.0μl를 도말하여 매회 세균 수를 측정한다. 각 시점에서 상기 회석액으로부터의 세균 수에 대한 log 값을 결정하여 제3도의 그래프에 도시한다. 하나에는 배지만 있고 다른 하나는 펩타이드가 없는 두개의 대조군을 세포 및 펩타이드를 포함하는 튜브와 함께 배양한다. 사용된 한천판 및 튜브를 37℃에서 배양한다.

제3도에 제시된 바와 같이, 마가이닌 II의 -G18 또는 -E19 결실 동족체와 함께 배양시 이. 콜라이의 성장은 급속히 멈추었다. 각각의 경우, 모든 이. 콜라이 세포가 펩타이드 제제를 첨가한지 15분 이내에 죽었다. 이. 콜라이를 완전히 죽이는데 있어서 아미드-말단화된 마가이닌 II의 전체 서열의 속도가 -G 및 -E 결실 동족체보다 훨씬 느렸다. 아미드-말단화된 마가이닌 II의 -G 및 -E 결실 동족체가 이. 콜라이에서 상당히 높은 세포용해 속도를 나타내었다.

[실시예 4]

사람의 적혈구 세포의 용혈작용

마가이닌 및 그들의 결실 동족체의 용혈활성을 사람의 적혈구 세포에 대해 관찰한다. 10μl의 혈액을 등장성 PBS 완충액(pH 7)에 현탁시킨 다음 펩타이드를 첨가하여 최종 용적을 1ml로 만든다. 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음, 37℃에서 30분간 항온처리한다. 샘플을 5분간 1000g에서 원심분리시킨다. 상등액을 펠렛으로부터 분리하고 414nm에서 흡광도를 측정한다. 순수한 HO에 사람의 적혈구를 파괴시키면 100% 용혈작용이 관찰된다. 상기한 시험의 결과가 하기의 표2에 제시되어 있다.

상기의 표2에 제시된 바와 같이, 50㎍/ml에서 아미드-말단화된 마가이닌 II는 2% 용혈작용을 나타내는 반면에 카복시-말단화된 마가이닌 I은 1% 용혈작용을 나타내었다. 25㎍/ml에서는 마가이닌 I 또는 마가이닌 II의 경우 사람의 적혈구의 용해가 관찰되지 않았다. 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 -G 및 -E 결실 동족체는 실시예2의 항미생물 분석에서 제시된 최소한의 억제농도인 10㎍/ml에서는 용혈활성을 나타내지 않았다.

또한, 표2에 제시된 바와 같이, 아미노산 15 내지 22번중 하나가 결실된 마가이닌 I의 결실 동족체는 100 및 75㎍/ml의 농도에서 용혈활성이 감소되었다. 50㎍/ml에서는 아미노산 16, 18, 19, 20, 21 또는 22번 중 하나가 결실된 마가이닌 I의 결실 동족체의 경우 용혈활성이 감소되었다. 또한, 아미노산 16, 17, 19, 20, 21 또는 22번 중 하나가 결실된 마가이닌 II의 결실 동족체의 경우 100, 75 및 50㎍/ml의 농도에서 용혈활성이 감소되었다.

따라서, 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 결실동족체는 마가이닌 I 및 마가이닌 II 보다 사람의 적혈구 세포의 용혈 작용이 덜하다는 것이 밝혀졌다. 따라서 마가이닌 I 또는 마가이닌 II보다 증가된 항-미생물 활성을 나타내지 않더라도 적혈구 세포에 대한 용혈작용이 감소된 특정 결실 동족체를 사용하는 것이 바람직하다.

[실시예 5]

다수의 펩타이드 결실을 갖는 마가이닌 I의 아미드-말단화된 결실 동족체의 이.콜라이에 대한 효과적인 성장억제

아미드-말단화된 마가이닌 I의 결실 동족체를 상술한 바와 같은 동시 다수 펩타이드 합성방법에 의해 제조한다. 본 실시예에 사용하기 위해 제조된 펩타이드는 아미노산 잔기 23번 결실 펩타이드, 아미노산 잔기 22 및 23번 결실 펩타이드, 아미노산 잔기 21, 22 및 23번 결실 펩타이드 및 아미노산 잔기 17 내지 23번 결실 펩타이드이다.

그 다음 각각의 펩타이드를 LB 배지 중에 현탁시킨 이. 콜라이와 함께 조직 배양판의 웰 중에서 배양한다. 결실 동족체(1 x PBS에 용해시킴, pH 7.0)의 첨가시 각각의 웰은 최종 세포 밀도가 1.0 x 10 콜로니 형성 단위(CFU)/ml이다. 웰에 펩타이드를 첨가하는 시점을 시간 0으로 정의한다. 사용된 최종 펩타이드 농도는 100㎍/ml, 75.0㎍/ml, 50.0㎍/ml 및 25㎍/ml이다. 펩타이드를 37℃에서 6시간 동안 이. 콜라이 유기체와 함께 배양한다. 6시간후 배양판을 티터텍 멀티스칸 장치에 놓고 0.D.을 측정한다.

펩타이드 활성도를 6시간에 걸쳐 이. 콜라이의 성장을 억제하는 상대적인 능력에 대해 결실 동족체와 최초 서열을 비교함으로써 결정한다. 각 펩타이드의 효과적인 성장억제가 하기의 표3에 제시되어 있다. 하기 표3에서, 각 펩타이드의 말단에 있는 B는 마가이닌 I 결실 동족체의 아미드-말단을 나타낸다.

상기 언급된 바와 같이 마가이닌 I과 마가이닌 II 모두가 α-나선형 구조를 채택할 수 있는 것으로 가정되었다. 펩타이드의 구조적 특성과 그들의 생물학적 활성간의 관계를 결정하기 위해 수많은 시도가 있었다. 본 발명을 특정의 이론적 근거에 제한시키고자 함은 아니나, 구조-활성 관계를 연구하기 위한 보다 일반적인 기초를 제공하는 시도는 펩타이드 쇄에서 하나의 아미노산 잔기를 생략함으로써 이루어졌다. 펩타이드 쇄에 따른 아미노산 잔기의 생략은 펩타이드 골격을 축소시켜 측쇄의 새로운 공간적 배위를 유도하므로, α-나선형으로 유도되는 경우 이러한 동족체는 새로운 배위를 취한다. 따라서, 보다 안정한 양극성 구조에 유리한 방식으로 골격을 축소시키는 주요 생략이 생물학적으로 활성인 펩타이드의 고안시 중요한 요인일 수 있다. 펩타이드의 구조 및 역학을 결정하기 위해 사용될 수 있는 여러 가지 물리적 방법이 있지만, 단연코, 이들 분자를 적용시킬 수 있는 가장 결정적인 시험은 그들의 생물학적 활성이다.

결실 동족체와 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 비교시, 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 N-말단이 그들의 항미생물 활성을 위해 중요한 것으로 나타난다. 실시예 2 및 표1에 제시된 바와 같이 잔기 1 내지 14번 중의 생략은 항생물 효과에 부정적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 마가이닌 펩타이드가 미생물의 지질막과 접촉시 양극성 구조를 채택하는 경우, 이들 펩타이드는 그들의 본래의 골격 및/또는 구조적 배열을 유지해야 하는 것으로 보인다.

그러나, 마가이닌 I 및 마가이닌 II 아미드의 일련의 생략 동족체에 의해 나타나는 항미생물 효능은 다소 상이하다. 이는 보다 큰 활성의 마가이닌 II를 인용한 선행의 문헌과 일치하는 것으로 보인다[참조: Zasloff, M., Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 84, pgs. 5449-5453 (1987)]. 본 명세서에 제시된 데이타로 입증되는 바와 같이, 마가이닌 I 및 마가이닌 II에서 세린(아미노산 잔기 8번), 알라닌(아미노산 잔기 9번), 글리신(아미노산 잔기 13번) 또는 보다 덜한 정도의 글리신(아미노산 잔기 3번)의 생략은 표1에 제시된 바와 같이 이. 콜라이에 대해 상이한 활성을 나타내었다. 에스. 에피더미스의 경우, 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 N-말단(잔기 1 내지 14번)에서의 생략 동족체간에는 항미생물 활성에 있어서 실질적인 차이가 없는 것으로 밝혀졌다.

주요 아미노산 잔기의 생략에 의한 N-말단 마가이닌 I 동족체의 나선형 특성의 붕괴는 미생물 막과 상호작용하는 그들의 능력을 감소시키리라 예상할 수 있다. 일반적으로, 마가이닌 II의 N-말단 생략 동족체는 마가이닌 I의 N-말단 생략 동족체에서 나타낸 것과 같은 활성의 손실없이 수용될 수 있다. N-말단 영역에서의 유일한 차이는 마가이닌 II에서는 글리신 대신 리신이 치환된 것으로, 강하게 α-나선형을 유도하는 잔기인 리신이 마가이닌 II의 안정화에 수반되는 주요 아미노산일 수 있는 것으로 믿어진다.

C-말단 영역은 두 형태의 동족체에 대해 아미노산 잔기 생략 후 활성을 유지하려는 경향이 보다 크다. 그러나, C-말단 동족체는 이. 콜라이 및 에스. 에피더미스에 있어서 활성이 결여된 N-말단 동족체와 상반되게 얼마간의 종간 선택성을 나타낸다. 따라서, 이. 콜라이는 마가이닌 I 및 마가이닌 II의 C-말단 영역에서 생략 동족체에 노출시 에스. 에피더미스보다 더 민감하였다.

마가이닌 II에서의 소수성 잔기 페닐알라닌(아미노산 잔기 16번) 또는 발린(아미노산 잔기 17번)의 생략은 이. 콜라이 및 에스. 에피더미스에 있어서의 항미생물 활성을 감소시키는 가장 중요한 변형으로 여겨진다. 합성 마가이닌 I의 이소로이신 20번 생략 동족체를 시험할 경우, 에스. 에피더미스에 대해서는 활성을 발견할 수 없었으며, 이. 콜라이의 성장을 완전히 억제시키기 위해서는 이소로이신 20번 생략 동족체 75㎍/ml가 필요하였다. 마가이닌 I 및 마가이닌 II에 있어서, 상기 위치에서 소수성 잔기를 보존할 필요가 있었다. 페닐알라닌 16번, 발린 17번 또는 이소로이신 20번의 생략시 항미생물 활성의 저하 또는 완전한 손실은, 본 발명의 범위를 상기 근거에 제한시키고자 함은 아니나, 마가이닌 펩타이드가 세균막의 지다당류와 상호작용하기 위해 상기의 아미노산에 의해 제공되는 소수성 특성을 필요로 한다는 것을 제시할 수 있다. 카복시-말단 영역에 있어서의 마가이닌 I과 마가이닌 II간의 유일한 차이는 22번 위치에 보다 소수성인 N(아스파라긴) 대신 K(리신)가 존재한다는 것이므로, 앞서의 결론이 마가이닌 II가 마가이닌 I보다 더욱 활성을 나타내는 이유를 설명하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 결론을 뒷받침하는 또다른 관측은 C-말단 아미드를 갖는 마가이닌의 실질적으로 높은 활성이다.

마가이닌 I 및 마가이닌 II의 전체 서열과 비교시 글리신 18번 및 글루탐산 19번이 생략된 동족체는, 적혈구의 용혈작용이 낮고 항미생물 활성이 높으므로, 이들 두 동족체는 임상 적용을 위한 우수한 후보대상물이다. 두 마가이닌에 있어서 18번 글리신 생략 동족체에 의해 나타나는 강한 항미생물 효능은, 글리신의 생략이 나선형 형성에 대한 잠재력이 낮다는 것으로 설명될 수 있다. 한편, 압도적으로 양전하된 펩타이드로부터 음전하된 아미노산 잔기인 글루탐산 19번의 생략이 문제가 된다. 아마도 음전하된 아미노산 잔기의 제거로 세균의 음전하된 지다당류층과의 상호작용이 용이해질 것이다. 최초 마가이닌 서열과 비교시, 활성의 증가 및 적혈구 세포용해의 감소는 이러한 생략 동족체가 임상적용시 잠재적으로 중요함을 강조한다.

또한 펩타이드에 대한 보다 우수한 안정성 및 보다 나은 저장 기간이 메티오닌이 생략된 결실 동족체에서 얻어진다는 것을 발견하였다.

본 발명의 수많은 변형 및 변화가 상기 교시에 비추어 가능하며, 따라서 첨부된 청구범위내에서 본 발명은 특정하게 기술된 사항 이상으로 실시할 수 있다.

Claims (29)

1. 단일문자의 아미노산 코드를 사용한 하기의 서열식으로 표시되고, 각각의 아미노산 잔기 아래에 있는 숫자가 펩타이드내의 잔기의 위치를 나타내며, 아미노산 15 내지 23번 중 하나 이상의 아미노산이 생략된, 아미드 또는 카복시 말단화된 마가이닌 I의 결실 동족체를 포함하는 화합물.
2. 제1항에 있어서, 아미노산 15, 16, 18, 19, 21, 22 및 23번 중 하나 이상이 생략된 화합물.
3. 제2항에 있어서, 적어도 아미노산 18번이 생략된 화합물.
4. 제2항에 있어서, 적어도 아미노산 19번이 생략된 화합물.
5. 제2항에 있어서, 적어도 아미노산 21번이 생략된 화합물.
6. 제2항에 있어서, 적어도 아미노산 22번이 생략된 화합물.
7. 제2항에 있어서, 적어도 아미노산 23번이 생략된 화합물.
8. 제3항에 있어서, 아미노산 18번만이 생략된 화합물.
9. 제4항에 있어서, 아미노산 19번만이 생략된 화합물.
10. 제5항에 있어서, 아미노산 21번만이 생략된 화합물.
11. 제1항에 있어서, 아미드 말단화된 마가이닌 I의 결실 동족체인 화합물.
12. 제1항에 있어서, 카복시 말단화된 마가이닌 I의 결실 동족체인 화합물.
13. 제2항에 있어서, 아미노산 21, 22 및 23번이 생략된 화합물.
14. 제1항에 있어서, 아미노산 19, 20, 21, 22 및 23번이 생략된 화합물.
15. 제1항에 있어서, 아미노산 18, 19, 20, 21, 22 및 23번이 생략된 화합물.
16. 제1항에 있어서, 아미노산 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23번이 생략된 화합물.
17. 단일문자의 아미노산 코드를 사용한 하기의 서열식으로 표시되고, 각각의 아미노산 잔기 아래에 있는 숫자가 펩타이드내의 잔기의 위치를 나타내며, 아미노산 15 내지 22번 중 하나 이상의 아미노산이 생략된 아미드 또는 카복시 말단화된 마가이닌 II의 결실 동족체를 포함하는 화합물.
18. 제17항에 있어서, 아미노산 15, 18, 19, 20, 21 및 22번 중 하나 이상이 생략된 화합물.
19. 제18항에 있어서, 적어도 아미노산 18번이 생략된 화합물.
20. 제18항에 있어서, 적어도 아미노산 19번이 생략된 화합물.
21. 제18항에 있어서, 적어도 아미노산 21번이 생략된 화합물.
22. 제18항에 있어서, 적어도 아미노산 22번이 생략된 화합물.
23. 제19항에 있어서, 아미노산 18번만이 생략된 화합물.
24. 제20항에 있어서, 아미노산 19번만이 생략된 화합물.
25. 제21항에 있어서, 아미노산 21번만이 생략된 화합물.
26. 제22항에 있어서, 아미노산 22번만이 생략된 화합물.
27. 제17항에 있어서, 아미드 말단화된 마가이닌 II의 결실 동족체인 화합물.
28. 제1항의 화합물 및 무독성 약제학적 담체 또는 비히클을 포함하는 항미생물 조성물.
29. 제17항의 화합물 및 무독성 약제학적 담체 또는 비히클을 포함하는 항미생물 조성물.