KR0174528B1

KR0174528B1 - 암과 관련된 헵토글로빈

Info

Publication number: KR0174528B1
Application number: KR1019900702093A
Authority: KR
Inventors: 프랑시스 피. 푸하자; 터낵 게리 알. 패스
Original assignee: 마이클 이. 존스; 더 죤스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1990-01-05
Publication date: 1999-05-15
Anticipated expiration: 2010-01-05
Also published as: EP0454782A1; WO1990008324A1; JPH04504110A; ATE151882T1; AU632535B2; DK0454782T3; CA2045552A1; KR910700463A; JP2959837B2; AU5040690A; ES2101695T3; DE69030494D1; CA2045552C; DE69030494T2; EP0454782B1

Abstract

본 발명은 hpr 유전자의 뉴클레오티드 서열과 일치한 아미노산 서열을 가지며 hpr 유전자 생성물에서는 발견되지만 헵토글로빈 1또는 2에서는 발견되지 않는 에피토프에 면역반응성을 갖는 포유류에 있어서 항체 생성을 촉진하는 작용을 갖는 거의 정제된 폴리펩타이드 제제, Hpr 단백질과 면역 반응성을 갖지만 헵토글로빈 1 또는 2와는 그렇지 않은 항체제제 및 Hp1 과 Hp2로부터 거의 정제한 Hpr 단백질 제제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 인체세포로부터 Hpr 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

또한 유방암 징후용 키트 및 방법을 제공하며, 고형의 종양을 갖는 환자의 예후를 결정하는 방법을 제공하며, 생물학적 유체중에서 Hpr 단백질을 분석하는 방법을 제공하며, 환자의 종양세포 증식을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

[발명의 명칭]

암과 관련된 헵토글로빈

[발명의 상세한 설명]

본 연구는 국제 보건소(NIH)로부터 하기된 것이다. 미국 정부는 본 발명의 권리를 보유하고 있다.

[본 발명의 기술적 분야]

본 발명은 신생 조직에 의해서 발현되며 대부분의 정상 조직에 의해서는 발현되지 않는 인체 단백질과 관련된다.

[본 발명의 배경]

통상적인 인체 헵토글로빈이 많이 연구되어 왔다: 이것은 40년전에 발견되었으며, 그것의 역할은 헤모글로빈의 혈장 이동에 관계되는 것으로 고려되었다. 헵토글로빈 합성은 주로 간에서 일어나지만, 어떤 경우에는 임파구 배양물과 뇌에서도 헵토글로빈이 합성되는 것으로 보도되었다.

모든 헵토글로빈은 두 유형의 폴리펩타이드 사슬, 즉 베타 사슬과 알파 사슬을 포함한다. 베타 사슬은 모든 헵토글로빈의 경우 거의 동일하지만 알파 사슬은 3가지 형태가 발견되어 왔다. 그중 2개의 알파 사슬 형태(Hp1^f와 Hp1^s)는 54위치의 아미노산 잔기만이 상이하며, 세 번째 형태(Hp2)는 다른 2개의 알파 사슬보다 더 길며, 불균등한 유전자 교차가 발생하여 알파 사슬을 부분적으로 복제한다.

1985년에, 마에다(J. Biol. Chem., vol. 260, pp. 6698-6709, 참고 자료임)는 통상적인 헵토글로빈 부위로부터 2.2 kb 다운 스트림에 위치한 DNA 단편을 기술하였다. 이 DNA 서열은 통상적인 헵토글로빈과 알파 및 베타 사슬이 구별되지만, 고도의 동족물인 이론상의 단백질을 코딩하는 본래 유전자 부위를 나타내었다. 마에다는 이 부위를 헵토글로빈 관련인 점에서 Hpr로 명칭했다. 이 유전자의 형질 발현을 검출하기 위한 연구들은 실패했다(오, 등., Cancer Research, vol, 47, pp. 5120-5126, 1987: 마에다, Journal of Biological Chemistry, vol, 260, pp. 6698-6709, 1985; 및 벤지 등., The EMBO Journal, Vol. 4, pp. 119-126. 1985).

[발명의 요약]

본 발명의 목적은 hpr 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지며, hpr 유전자 생성물에서는 발견되지만 헵토글로빈 1 또는 2에서는 발견되지 않는 에피토프에 면역 반응성을 갖는 항체의 생성을 포유류에서 촉진하는 작용을 갖는 거의 정제된 폴리펩티드 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Hpr 단백질과 면역 반응성을 갖지만 헵토글로빈 1 또는 2와는 그렇지 않은 항체 제제를 제공하는 것이다.

또한 Hp1과 Hp2로부터 거의 정제한 Hpr단백질 제제를 제공한다.

그리고 본 발명의 목적은 인체 세포로부터 Hpr 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한 유방암 예측용 키트 및 방법을 제공하며, 고형의 종양을 갖는 환자의 예후를 결정하는 방법을 제공하며, 생물학적 유체중에서 Hpr 단백질을 분석하는 방법을 제공하며, 환자의 종양 세포 증식을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적과 기타 목적은 이하에서 하나 이상의 구체예에 의해 제시하였다. hpr 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 아미노산 서열을 제공하는 거의 순수한 폴리펩타이드 제제가 한 구체예에서 제시되었다. 이 폴리펩타이드 제제를 포유류에게 투여하는 경우, hpr 유전자 생성물에서는 발견되지만 헵토글로빈 1 또는 2에서는 발견되지 않는 에피토프에 면역 반응성을 갖는 항체 생성을 촉진한다.

또한 본 발명의 한 태양에서는, Hpr 단백질에 면역 반응성이 있지만 헵토글로빈 1 또는 2에는 그렇지 아니한 항체 제제를 제시하며, 그리고, Hp1과 Hp2로부터 거의 정제한 Hpr 단백질 제제를 제시하며, 그리고, Hpr 제제의 생성 방법을 제시한다. 인체의 유방암 세포를 Hpr에 존재하지만 Hpr 또는 2에는 존재하지 않는 에피토프에 반응성이 있는 항체와의 면역 반응성에 대해 시험한다. 면역 반응이 있는 유방암 세포를 배양하여 Hpr을 함유한 세포질 분획을 배양 세포로부터 모은다. 또 다른 태양에 있어서, 인체의 탈락막 또는 태반 조직을 수거한다. Hpr 단백질을 함유한 세포질 분획을 탈락막 또는 태반 조직으로부터 모아서 Hpr 제제를 제공한다.

그리고 또 다른 태양에 있어서, 유방암의 진단용 키트를 제공한다. 상기의 키트는 Hpr 단백질에는 존재하지만 헵토글로빈 1 또는 2에는 존재하지 않는 에피토프에 면역 반응성이 있는 항체 제제와 항체의 검출 수단을 포함한다. 고형 종양의 경과를 예후하는 방법이 제시되었는 데 Hpr 단백질에 면역 반응성이 있으나 헵토글로빈 1 또는 2에는 그렇지 않은 항체 제제와 조직 단편물을 접촉시켜서 단편물에 결합한 항체를 측정한다.

또 다른 태양에 있어서, 생물학적 유체중의 Hpr을 분석하는 방법을 제시한다. Hpr상에서 발견되며 Hp1 및 Hp2상에서는 발견되지 않는 에피토프와 면역 반응성이 있는 항체를 고형 지지체에 부착시키고, 이를 항체-항원 복합체를 형성하며 그것이 안정한 조건하에서 미정량의 Hpr을 함유한 생물학적 유체와 접촉시킨다.

그후 고체 지지체를, 항체-항원 복합체를 형성하고, 그것이 안정한 조건하에서, Hp1 및 2와는 아니며 Hpr과 에피토프를 공유한 폴리펩타이드와 접촉시킨다. 이 폴리펩타이드 역시 검출 가능 부위를 함유하고 있어서 검출 가능 부위를 검출 및 정량함으로써 고형 지지체에 결합된 폴리펩타이드의 양은 정량할 수 있다. 대조군은 비생물학적 유체를 고형 지지체와 접촉시켜서 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 100%로 규정한다. 생물학적 유체의 존재하에 관찰되는 감소된 결합양은 생물학적 유체내의 Hpr의 양에 비례한다.

또한 본 발명의 한 태양에서, 환자의 종양 세포 증식을 검출하는 방법이 제시된다. 생물학적 유체를 종양이 있는 환자로부터 수거한다. 유체중의 Hpr의 양을 정량한다. 유체내의 Hpr 양은 종양이 없는 환자의 유체 대조군에서의 양과 비교한다. 종양 환자의 유체중에 있는 Hpr의 증가량은 종양 세포의 증가량을 나타낸다. 상기의 구체예 및 기타 구체예는 이하 본 발명의 설명에서 기술하고 있다.

헵토글로빈과는 달리, Hpr 합성이 간에서는 발견되지 않는다는 사실에도 불구하고, 본 발명은 Hpr을 함유한 4개의 상이한 공급원을 제공한다. 인체의 유방암 세포, 탈락막, 태반 및 임신부의 혈청이 Hpr-특이성 항체와 특이적으로 교차-반응하는 물질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한, Hpr은 종양의 침투 및 초기의 전이 경향을 검출하기 위해 인체의 고형 종양에 대한 특히 유용한 진단 마커로 밝혀졌다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 Hpr 단백질의 점진적인 정제를 나타내고 있다. 폴리아크릴아미드겔 전기 영동과 웨스턴 블롯은 항-PAPP-A와 반응성이 있는 혈장 단백질의 순차적인 크로마토그래피 정제를 나타내고 있다.

제2도는 그래디언트 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 면역 반응성 중쇄 및 경쇄의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분리를 나타내고 있다.

제3도는 각각 임신부 혈청으로부터 분리한 단백질의 베타 쇄의 N-말단 서열로 정열한 하기의 (1), (2) 및 (3)의 서열을 도식했다:

(1) 유전자 서열로부터 예상되는 Hpr 단백질;

(2) 헵토글로빈 1; 및

(3) 헵토글로빈 2.

제4도는 헵토글로빈 1, 2 및 정제한 임신부의 Hpr의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분리와 항-헵토글로빈과 항-PAPPA를 이용한 상응하는 면역 블롯을 나타내고 있다.

제5도는 헵토글로빈 1, Hpr, 헵토글로빈 2 및 헵토글로빈의 혼합물의 알파쇄의 트립신 분해 펩타이드 지도를 나타내고 있다.

제6도는 헵토글로빈 1과 Hpr 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 나타내고 있다. 패널 B-E는 여러 가지 항체 제제를 이용한 동일 단백질의 면역 블롯이다.

제7도에서 패널 A는 hpr 유전자에 상응하는 서열을 갖는 합성 펩타이드에 대한 항체를 사용하여 인체의 유방암 세포를 면역 조직 화학적 염색한 것이다. 패널 B는 항체를 임신부의 혈청으로부터 정제한 Hpr과 함께 예비 배양하는 점 이외에 동일한 실험을 한 것이다. 패널 C는 Hpr과 예비 배양함으로써 제거되지 않은 항-CEA로 염색한 것이다(패널 D).

제8도는 유방암의 재발과 암 관련의 헵토글로빈 염색의 관계를 나타내고 있다.

제9도는 hpr 유전자의 서열에 따라 제조된 합성 펩타이드에 대한 항체에 의한 유방암 세포의 염색을 나타내고 있다.

제10도는 hpr 유전자로부터 예측된 서열에 따라 제조된 합성 펩타이드에 대한 항체에 의한 탈락막의 염색을 나타내고 있다.

제11도는 hpr 유전자로부터 예측된 서열에 따라 제조된 합성 펩타이드에 대한 항체를 사용하여 인체 탈락막중의 반응성 있는 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도식하고 있다.

지금까지 검출되지 않았던 Hpr 단백질이 여러 인체 세포 및 조직에서 발견될 수 있음을 본 발명이 지적하고 있다. 상기의 세포 및 조직은 다음과 같다; 인체의 유방암 조직, 탈락막 및 태반, 임신부의 혈청 및 배양한 인체 유방암 세포주 임신부 혈청중의 Hpr 단백질은 생리화학적 방법을 사용하여 Hp1 과 Hp2를 거의 제거할 수 있다. 뉴클레오티드 서열로부터 예측된 Hpr 단백질은 헵토글로빈 1 및 2와 거의 유사하며, 단 알파 쇄의 N-말단의 다수의 아미노산이 상이하다.

합성 폴리펩타이드는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖도록 합성했다:

leu-tyr-ser-gly-asn-asp-val-thr-asp-ile-ser-asp-asp-arg-phe-pro-lys-pro-pro-glu-ile ala-asn-gly-tyr-val-glu-lys-leu-phe-arg-tyr-gln-cys. 이 폴리펩타이드는 일반적으로 마에다에 의해 확인된 Hpr 유전자의 뉴클레오티드 서열과 34개 N-말단의 아미노산이 일치한다. 이 펩타이드는 포유류에서 항체 생성을 촉진하며 이 항체는 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않지만 Hpr 유전자 생성물에서 발견되는 에피토프에 면역 반응을 갖는다. 상기의 항체들은 면역 친화성 기법을 사용하여 Hpr을 정제할 뿐만 아니라 임의의 인체 조직 내에서의 Hpr 형질 발현을 신빙성 있게 검출하는 데 사용할 수 있으며 이 기술은 잘 공지되었다. hpr 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 거의 정제된 폴리펩타이드 제제는 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 메리필드 법(Journal of American Chemical Society, vol. 85, pp.2149-2154, 1968)을 사용할 수 있다. 거의 정제한 것이란 헵토글로빈 1과 2가 거의 완전히 없는 제제를 의미한다. 예상되는 Hpr 단백질의 34 N-말단 아미노산에 해당하는 서열을 사용하지만, 다른 폴리펩타이드도 또한 사용할 수 있다. 기타 폴리펩타이드는 더 길거나 더 짧거나 또는 Hp1이나 Hp2에서 발견되지 않지만 Hpr에서 발견되는 에피토프(들)을 변경시키지 않는 보유 아미노산 변형을 가질 수도 있다. 폴리펩타이드는 Hpr, 헵토글로빈 1 및 헵토글로빈 2의 아미노산 서열을 비교하고 상이한 서열이 최대인 서열 부위를 사용함으로써 고안한다. Hpr 서열은 마에다의 자료로부터 알 수 있으며 (Journal of Biological Chemistry, vol. 260, pp.6698-6709, 1985) 헵토글로빈 1과 2 서열은 National Biomedical Research Foundation의 자료집 및 구로스키, Proceedings of a National Academy of Sciences USA, vol. 77, pp.3388-3392, 1980; 블랙 등., Nature, vol. 218, pp. 736-741, 1968; 블랙 등. Canadian Journal of Biochemistry, vol. 48, pp.123-132, 및 pp.133-146, 1970에서 알 수 있다. 폴리펩타이드는 Hp1이나 2에서는 발견되지 않지만 Hpr에서는 발견되는 에피토프에 면역 반응성이 있는 항체를 생성하도록 포유류를 촉진시키는지를 결정하기 위해 시험할 수 있다. 항체 생성을 촉진시키기 위해 포유류를 면역시키는 방법은 기술이 잘 알려졌다. 공지된 항원에 대한 항체의 면역 반응성을 시험하는 방법 또한 잘 알려졌다.

거의 정제한 본 발명의 제제는 Hpr 단백질에 대한 특이성이 있는 항체를 친화 정제하는 데 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩타이드 제제는 본 제제로 포유류를 면역시킴으로써 포유류 중의 항체 생성을 촉진시키는 데 사용할 수 있다.

대개, 상기의 제제는 구멍난 소라의 헤모시아닌 같은 큰 면역원 물질에 폴리펩타이드를 결합시키는 면역법을 사용한다. 친화도 정제법의 경우, 폴리펩타이드를 불활성 매트릭스(예, 아가로즈 구슬)에 결합시킬 수 있다. 이러한 결합 기법은 잘 공지되어 있다. 상기 폴리펩타이드 제제는 또한 항체 제제에서 Hpr-특이 항체를 정량하는 데 사용할 수도 있다. 이 경우, 합성 펩타이드는 대개 큰 불활성 단백질 물질(예, BSA)에 결합시킨다. 상기 매트릭스에 폴리펩타이드를 결합시키는 기법도 기술이 잘 알려졌다.

전술한 바와 같이, 헵토글로빈 1 또는 2와 면역 반응성이 없으나 Hpr 단백질과는 반응성이 있는 Hpr 단백질에 특이성이 있는 항체는 본 발명의 합성 폴리펩타이드를 사용하여 제조할 수 있다. 항체를 생성할 수 있는 포유류(예, 토끼, 마우스, 염소 등)의 면역은 기술이 잘 알려져 있다. 상기의 폴리클로날 항체 제제는 본 발명의 합성 폴리펩타이드를 사용하는 면역 친화성 방법에 의해 부분적으로 정제할 수 있다. 상기의 정제법도 기술이 잘 알려져 있다. 모노클로날 항체들은 Hpr 에피토프에 대해 특이성이 있으며 헵토글로빈 1이나 2와 교차-반응성이 없는 것으로 나타났다. 일반적으로, 랫트나 마우스는 본 발명의 합성 폴리펩타이드(또는 Hpr 단백질)로 면역될 것이며 나중에 이들 설치류를 죽여서, 골수 세포와 융합하기 위해 지라세포를 회수하였다. 혼성(hybrid) 세포는 두 개의 표현형(각 부모 세포중 하나)의 상보성으로 선택하는 등의 기법으로 선택될 수 있다. 각 하이브리드 세포의 항체 생성은 각각 스크린 할 수 있다.

Hp1이나 Hp2가 아니고 Hpr상의 에피토프에 결합하는 항체는 Hpr이나 상기의 에피토프를 형질 발현하는 다른 임의의 단백질에 결합할 수 있다.

Hp1이나 Hp2에서 발견되지 않지만 Hpr 유전자 생성물에서 발견되는 에피토프와 면역 반응성이 있는 항체를 스크린하기 위하여, 간단한 일련의 시험을 실시할 수 있다. 항체는, 거의 정제한 Hpr 제제를 사용하여 Hpr과의 면역 반응성에 대해, 또는 BSA과 같은 큰 부위에 결합시킨 본 발명의 폴리펩타이드 제제와의 면역 반응성에 대해 시험할 수 있다. 바람직한 특이적 항체는 상기 시험 둘다나 또는 적어도 하나에 양성을 나타낸다. 또한 상기 항체는 Hp1과 Hp2에 대한 면역 반응성을 시험할 수 있다. Hpr에 대한 절대적인 특이성을 갖는 바람직한 항체들은 상기의 두 시험에 대해 음성이어야 한다. 또한 이 항체는 Hp1과 Hp2에 비해 Hpr에 대한 상당한 특이성을 갖는 일련의 시험으로 검출할 수 있다. 즉, 몇가지 모노클로날 항체들이 Hp1과 Hp2보다 Hpr에 더 강하게 반응하는 것을 알 수 있다. Hpr에 대한 상당한 특이성을 갖는 상기의 항체들도 유용할 수 있으며, 이것을 사용하는 수단은 이하에서 논하고자 한다.

Hp1이나 Hp2에는 반응성이 없지만 Hpr에는 반응성이 있는 단일 특이성 폴리클로날 항체를 정제하기 위하여 면역 친화법을 사용할 수 있다. 상기한 모노클로날 항체를 위해 기술된 시험에서와 유사한 결합 성질을 이용한다. 즉 Hpr과 면역 반응을 하는 항체는 양성 반응으로 선택하는 반면, Hp1과 Hp2와 면역 반응을 하는 것을 항체 제제로부터 제거한다.

Hp1과 Hp2에 비해 Hpr에 상당히 또는 우선적인 특이성을 나타내는 항체들은 면역 반응성을 분석하는 조건을 변경시킴으로써 절대적 특이성을 갖게할 수 있다. 제한되는 것은 아니나, 변경 가능한 분석용 배지의 조건은 다음과 같다: 이온 강도; 디터전트 농도; 케이오트로픽(chaotropic) 제제의 농도(예, 우레아, 구아니딘, 및 포타슘 티오시아네이트); 및 pH. 이러한 조건을 변화시키면 항체-항원 결합에 기여하는 여러 가지 결합력을 불안정화시킨다. 상기의 각 조건을 변경시키는 시약의 역가는 상당히 또는 우선적 특이성을 갖는 항체가 Hp1 또는 Hp2과는 아니고 Hpr과 면역 반응을 하는 조건을 결정할 수 있도록 한다. 불안정화제 농도가 변할 수 있는 적당한 범위는 쉽게 결정할 수 있다. 예컨대, 이온 강도를 변화시키기 위하여, 염화 칼륨을 약 0.05M 내지 2 M로 적정할 수 있다. 이온성 또는 비이온성 디터전트는 약 0.05% 내지 2%로 적정할 수 있다. 케이오트픽 제제는 약 0.5 M 내지 8 M로 적정할 수 있다. pH의 범위는 약 2 내지 10으로 적정할 수 있다. 상기의 조건들은 Hpr과 면역 반응성이 있는 모노클로날 항체를 스크린하고 여러 생물원을 Hpr을 분석하는 데 유용하다. 상술한 여러 가지 불안정화제의 적정 방법은 반응의 특이성을 향상시키기 위해 다른 항체-항원쌍에 사용할 수도 있다.

4가지 다른 인체의 세포 유형에서 Hpr이 발견되었다.

상기의 세포 유형중 세가지는 생리적 조건하에서 Hpr의 생물학적 영향을 조사하는 연구 뿐만 아니라 생화학 연구에 요구되는 Hpr의 양을 생성하는 데 실제 사용될 수 있다. 특히 유용한 공급원은 인체의 유방암 세포주로서, 이것은 미국, 매릴랜드의 록크빌에 위치한 미국 모식균 수집소에서 얻을 수 있으며, 일명, MDA-MB-231이고 에스트로겐 수용체 음성의 세포주이다. Hpr 에피토프는 상기의 유방암 세포주의 약 50%의 세포질에서 검출되었다. 이 세포주는 전술한 34아미노산 폴리펩타이드에 면역 반응성이 있는 항체를 사용함으로써 쉽게 확인할 수 있다.

Hpr 제제의 한 제조 방법은 공지된 배양 조건을 사용하여 Hpr 단백질을 생성하는 인체 유방암 세포를 배양하는 것이다. 그후 세포를 수거하고 세포막을 파괴하여 세포 분해물을 수득한다. 핵과 막 분회물을 제거하고 Hpr을 함유한 세포질을 획득한다. 차등 원심분리 등 각종의 세포 분획물 분리 방법은 기술이 이미 공지되어 있다.

다른 Hpr 단백질의 공급원은 인체의 탈락막 조직과 태반으로 알려졌다. 다른 공급원으로부터 상기의 조직을 수거하여 공지된 기술에 따라 균질화시켰다. 균질화된 조직 세포의 세포막을 분해하여 Hpr 단백질을 함유한 원형질 분획물을 얻는다. 임신부의 혈청도 회수 가능양의 Hpr을 포함하는 것으로 나타났다. 유사하게, 유방암의 조직 단편물도 Hpr 단백질을 함유하지만, 그러나 이것은 Hpr의 정제를 가능하게 하는 방법 및 양으로 얻기에는 어려운 조직 공급원이다.

Hpr을 함유한 세포질 분획을 얻으면, 공지된 단백질 정제법에 따라 Hpr 정제를 실시한다. 예를 들면, 여러 종류의 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 특히 유용한 칼럼은 Cibacron F3GA 세파로즈 칼럼, DEAE 샐룰로즈 칼럼, 음이온 교환 칼럼 및 겔 투과 칼럼이다.

Hpr은 면역 친화법으로 정제할 수 있다. Hpr 에피토프에 특이성이 있는 항체가 제공됨에 따라, Hpr 단백질은 많은 단백질 혼합물로부터 양성적으로 선별할 수 있다. 단백질을 정제하기 위해 본 발명의 항체를 사용하면 대부분의 Hpr 유사 단백질(즉 Hp1 및 Hp2)로부터 양호하게 분리할 수 있다. 물론 다른 공지된 정제법을 사용하여 Hpr을 정제할 수 있다.

본 발명에 의해 수득된 Hpr 제제는 거의 순수하며 균일하다. 이러한 결론은 Hp2가 검출되지 않는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분리시 나타나는 단백질을 근거로 한다. 일반적으로, 거의 정제된 제제는 Hp1 및 Hp2가 없으며 존재하는 헵토글로빈형 단백질의 75% 이상이 Hpr 단백질이다. 더 바람직하게는, 헵토글로빈형 단백질의 90% 이상을 Hpr로 포함한다.

본 발명의 항체들은 유방암 조직뿐만 아니라 다른 고형 종양, 즉, 폐암 조직, 성뇨기 종양 조직 및 위장의 종양 조직의 조직 분획내에 존재하는 Hpr 에피토프를 검출하는 데 사용한다. 유방암 조직의 Hpr 에피토프 존재는 악화된 예후와 관계된다는 것이 밝혀졌다; 즉 이것은 Hpr 음성인 조직에 비해 암이 더 일찍 재발하고 전이됨을 나타낸다. Hpr 에피토프가 발견된 유방 조직은 3가지 특성을 갖는다: 침투하는 유방암에 면역 반응성이 존재함; 핵 염색 없이 세포질 면역 반응이 관찰됨; 및 염색이 이종임, 즉, 세포-세포 또는 부위-부위 변이성이 있음.

방사능 표지 또는 염색 등의 공지된 검출 수단으로 조직 분획에의 항체 결합을 확인할 수 있다. 특히 유용한 염색은 퍼옥시다제, 과산화수소 및 색소원 물질(예, 아미노에틸 카바졸)이 사용된다. 퍼옥시다제(많은 공급원으로부터 수득 가능한 공지된 효소임)는 항- Hpr 항체에 결합할 수 있거나 하나 이상의 항체를 통해 그것과 복합체가 될 수 있다. 예컨대, 염소의 항-퍼옥시다제 항체와 염소의 항- Hpr 항체는 항-염소 IgG를 통해 복합체가 될 수 있다. 상기의 기술은 공지되어 있다. 다른 색소원 물질 및 효소도 사용할 수 있다. 또한 항체의 방사능 표지도 분획에 결합한 항체를 검출하는 데 사용할 수 있다. 표지된 항체는 항- Hpr이거나 항- Hpr 항체와 면역 반응한 제2의 항체이다. 상기 기술도 공지되었다. 유방암 환자에 있어서 Hpr을 검출하는 정확한 방법은 본 발명에서 중요하지 않다. 면역 조직 화학을 사용하지 않는 생화학이나 면역학기법이 현재 사용되는 데, 이것은 본 발명의 바람직한 방법이다.

공지된 단백질 검출 수단을 사용하여, 생물학적 유체, 즉, 혈청, 혈장, 삼출액, 복수, 대뇌척 수액 및 난소액 내의 Hpr을 정량할 수 있다. 바람직한 방법은 면역학적 검출 수단을 사용한다. 이것은 다음과 같다: 방사능 면역 분석법, 효소가 결합된 면역 흡착제 분석법, 보체 고정법, 비탁법 분석, 면역 확산법 또는 면역 전기 영동법. 혈장은 공지된 바와 같이, 사용 전에 항-응고시켜야 한다. 세포 성분 및 지질은 원심 분리로 유체에서 제거한다. 희석 유체(예, 뇨)의 경우, 초-여과법 또는 염석법으로 농축시켜야 한다.

유체 샘플중의 Hpr 검출 및/또는 정량에 가장 바람직한 방법은 경쟁적 분석법을 사용하는 것이다. Hp1과 Hp2에서는 발견되지 않으나 Hpr에서 발견되는 에피토프와 면역 반응성이 있는 항체를 공지된 기법을 사용하여 폴리스티렌 미세 적정판이나 니트로셀룰로즈 용지 등의 고형 지지체에 부착시킨다. 그 후 고형 지지체를 분석할 유체 존재하에서 항체-항원 복합체가 안정하게 형성되는 조건하에 배양한다. 과량의 유체 및 미결합 성분을 제거하고 고형 지지체를 세척하여 항체-항원 복합체가 고형 지지체 상에 체류하도록 한다. 이어서, Hp1 또는 Hp2에서는 발견되지 않지만 Hpr에서 발견되는 에피토프를 함유한 고정량의 폴리펩타이드를 고형 지지체와 함께 배양한다. 폴리펩타이드는 고형 지지체에 부착된, Hpr과 면역 반응을 하는 항체에 결합한다. 이 폴리펩타이드는 공지된 수단에 의해 검출 가능 부위, 즉 비오틴, 퍼옥시다제 또는 방사능 표지에 결합된 것이다. 과량 및 미결합된 폴리펩타이드를 제거하고, 상기와 바와 같이 고형 지지체를 세척한다. Hpr과 폴리펩타이드는 동일한 항체 결합 부위에서 경쟁하기 때문에 유체 중의 Hpr은 고형 지지체에의 폴리펩타이드 결합을 뺌으로써 정량할 수 있다. 본 분석법에 사용한 항체는 Hp1이나 Hp2와는 아니고 Hpr과 면역 반응성이 있다. 또한 Hp1과 Hp2와의 면역 반응성이 불안정화된 조건하에 상당히 특이성 있는 항체를 사용할 수 있다. Hp1 또는 Hp2가 아니라 Hpr 상의 에피토프와 면역 반응을 하는 항체류를 함유하는 폴리클로날 항체도 사용할 수 있다.

상기의 분석은 Hpr 시스템에 특징적으로 기술되었지만, 생물학적 유체중의 다른 단백질 분해물을 정량하는데 사용할 수도 있다. 즉, 단백질 분해물과 에피토프가 공유하는 측정 가능하게 표지화된 폴리펩타이드는 분해물을 정량하는데 사용할 수 있다.

단일 특이성 항체는 폴리펩타이드로 분석시 제공되는 특이성이 필요치 않다.

환자의 혈액이나 기타 생물학적 유체중의 Hpr 증가량은 유방암 뿐만 아니라 기타 고형의 종양의 증식 및 전이와 관계가 있다.

Hpr 증가량의 측정은 검출할수 있는 고형 종양을 갖지 않은 환자에 대해 행해진다. 이것은 동일 환자 또는 다른 환자일 수 있다. 예컨대, 고형의 종양을 수술로 제거한 직후 제1 샘플로 취했다. 그후 종양 성장 및/또는 종양 세포 증식의 상태를 모니터했다. 또한 생물학적 유체중의 Hpr 분석은 환자의 신생 및 비신생유체 축적물 사이를 비교하여 악성 종양 진단을 할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며 단지 사용할 수 있는 구체적인 태양을 제공한다.

[실시예 1]

본 실시예는 임신부 혈장으로부터 Hpr 단백질을 분리 정제하고 2개의 서브 유니트를 분리하는 것을 기술하고 있다.

3개월된 임신부의 혈장은 EDTA-항 응고 처리를 한 전체 혈액 샘플로부터 수득했다. 사용전에 혈장은 -70℃에서 보관했다.

임신-관련 혈장 단백질 A(PAPP-A)에 대한 토끼 항혈청의 전체 IgG 분획과 반응한 단백질(Dako Laboratories, Santa Barbara, Ca)를 연속적인 크로마토그래피 단계로 정제한다. 정제는 크로마토그래피 삼출액의 광학밀도를 280nm에서 모니터하고 쿠마시-염색된 램리 겔 및 웨스톤 블롯팅을 사용하여 단편물을 분석한다. 초기에, 80ml의 혈장을 50mM 인산나트륨(pH 6.8, 4℃)로 평형화시킨 2.5×10cm의 DE-52 DEAE-셀룰로즈 컬럼(Pierce Chemical Co)에 가했다.

면역반응 물질은 출발 완충액중의 0.2M NaCI로 용출시켰다. 용출액은 0.15M NaCI, 1mM 베타-메캅토에탄올 및 1mM NaN₃를 함유한 20mM Tris-HCI(pH 8.5, 4℃)로 투석한 후, 동일한 완충액으로 평형시킨 2.5×60cm의 고속 Q-세파로즈 컬럼(Pharmacia, Piscataway, N.J.)에 로드시켰다. 이 컬럼을 유속 100ml/시간(4℃)으로 150mM 내지 500mM NaCI의 500ml 선형 그래디언트로 용출시켰다. 면역 반응성 단백질류는 0.25 내지 0.28M NaCI 범위에서 용출되었다. 면역반응성 단백질을 함유한 분획을 모아서 1mM 베타-메트캡토에탄올과 1mM NaN₃를 함유한 200mM Tris-아세테이트, (pH 7.5, 4℃)에 대해 투석하고 5×90cm 세파로즈 CL-4B(파마시아) 컬럼에 가했다.

제1도는 다특이성 항-PAPP-A(Dako)에 의해 인지되는 중요 면역반응 밴드의 정제를 요약하였다. 이 도면은 쿠마시 블루 염색된 10-15% 램리겔(Nature, vol 227, pp. 680-685, 1970) 및 상응하는 웨스턴 블롯을 나타내고 있다. 웨스턴 블롯은 공지된 방법에 따라 실시했다. NaDodSO₄폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후, 단백질은 6시간 동안 4℃, 40V, 250-300mA에서 96mM 글리신, 12.5mM Tris, 0.1% NaDodSO₄및 20% 메탄올 내의 0.45u 니트로셀룰로즈시트(Schleicher Schuell)에 전이된다. 폰소 S 염색으로 전이효과를 측정한 후, 3% BSA으로 막을 차단한 후, 2시간 동안 항-PAPP-A 항체와 함께 그리고 1시간 동안¹²⁵I로 표지된 단백질 A와 함께 차례로 배양했다(Gershoni, 등, Analyt, Biochem., vol. 131, pp 1-15, 1983) 각 단계후 1 mM NaN₃를 함유한 Tris-염수로 세척했다.

그후, 일련의 크로마토그래피 단계가 관계되는데 Cibacron Blue F3GA 세파로즈상에서의 알부민과 부가의 단백질류의 제거(레인 a), DEAE 셀룰로즈 컬럼으로부터 단계 용출(레인 b), 고속 Q 세파로즈 음이온 교환 컬럼으로부터 그래디언트 용출(레인 C), 및 세파로즈 CL-4B 상에서의 겔투과 크로마토그래피(레인 d)를 한다. 겔 여과법은 면역 반응 단백질을 다음 3가지의 연속적으로 용출되는 단백질로 불완전하게 분리하며, 이것은 약하게 반응하는 20KDa 류와 함께 공 용출된 40kDa, 약한 면역반응성이 있는 16.5kDa 류와 함께 공 용출되는 40kDa 밴드, 및 최종적으로, 피크가 겹치지만 별도로 강한 면역반응성이 있는 16.5kDa 밴드가 함께 공용출된 40kDa류가 있다.

변성 조건하에서 각 면역반응 쇄를 분리하기 위하여, 면역반응 단백질을 함유한 분획을 모아서, 20mM, Tris-HCI, 6M 우레아, 10mM 베타-메르캅토 에탄올, pH8.5 4℃로 투석했다(온도는 4℃이며, 이 온도에서 pH는 8.5로 조절했다). 최종 정제 단계는 280mm에서 모니터하는 5×50mm Mono Q HR5/5(파마시아) 컬럼으로 Waters system의 HPLC를 사용했다. Tris-우레아-메르캅토에탄올 출발 완충액중의 샘플을 주입한 후, 2ml/분의 이소크레틱 유속으로 10ml를, 15분 동안 30ml의 선형 크래디언트로 0.5M NaCI의 출발 완충액의 최종조건에 가했다.

쿠마시 블루 염색된 10% 램리겔은 HPLC를 사용한 Mono Q HR5/5상의 그래디언트 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 면역반응성 쇄 및 경쇄의 분리를 나타냈다(제2도). 레인 a는 100㎍의 정제된 면역반응성 단백질이며 레인 b는 공극을 통해 이동하는 알파 쇄를 포함하며, 레인 C는 0.85M NaCI에서 용출되는 면역 반응성 40kDa 쇄를 포한한다. 40kDa류를 함유한 분획을 모아서 0.2M NH₂HCO₃완충액으로 투석하고 냉동건조하였다.

[실시예 2]

본 실시예는 Hpr 증쇄(베타 쇄)의 20-아미노산 실이가 Hp1과 Hp2의 베타 쇄와 100% 동일함을 입증하고 있다.

실시예 1에 따라 제조된 40kDa류의 냉동건조한 후 HPLC용 물로 3회 재냉동건조하였다. 가스상의 서열분석을 실시했다. 일반적으로 본래 단백질 사슬의 샘플은 로우리 분석에 의해 결정한바에 의하면 100㎍의 단백질로 구성된다(J. Biol. Chem., vol. 193.pp 265-275, 1951) 일반적으로 펩타이드 샘플은 시퀀서에 의하여 정량한 바에 의하면 0.5-2nmole로 구성된다. 이 단백질은 규정 프로그램 03RPIH를 사용하는 온-라인 페닐티오히단토인(PTH) 분석기가 장치된 Applied Biosystems Model 470A 시퀀서로 서열분석을 했다. PTH 유도체는 Applied Bio system 200× 21mm C-18 컬럼으로 역상 HPLC에 의해 분리했다.

N-말단의 서열은 20개 잔기로 나타났다(제3도). 내쇼날 바이오 메디칼 리서어치 파운데이숀의 단백질 서열 자료집과 DFASTP 배열 프로그램을 사용하여, 3개의 단백질 서열이 20개 아미노산 길이 전체에 있어서 100% 동일함을 알았다; 인체 Hp1의 베타 쇄; 인체 Hp2의 베타 쇄; 및 Hpr 전구체의 예상 베타-쇄.

[실시예 3]

본 실시예는 실시예 1에 의해 임신부 혈청에서 분리한 헵토글로빈이 16.5kDa 쇄로 Hp1 및 2와 상이함을 입증하고 있다.

서열분석은 임신부혈장 단백질을 명백하게 Hp 유전자류내에 위치시키지만, 모든 종의 베타 쇄의 N-말단 서열이 동일하기 때문에 더 구체적인 지정은 할 수 없었다. 제4도는 정제된 Hp1과 2표준, 임신부 혈청으로부터 정제한 헵토글로빈, 토끼의 항-헵토글로빈 및 항-PAPP-A로 실시한 면역분석 결과를 나타내고 있다. 패널 A는 임신부 혈청에서 정제한 Hp1, Hp2 및 헵토글로빈의 10-15% 쿠마시 블루 염색한 램리 겔을 나타내고 있다(각각 레인 a-c), 패널 B는 항-헵토글로빈으로 행한 상응하는 면역블롯(1:50)이며, 패널 C는 항-PAPP-A로 행한 면역블롯(1:50)이다.

항-헵토글로빈은 모든 40kDa 베타 쇄, Hp1 및 2 알파 쇄와 강하게 반응하

며; 정제 단백질을 함유한 레인 C의 16.5kDa 밴드만 약하게 반응한다. 대조적으로, 항-PAPP-A는 40kDa 베타 쇄를 강하게 표지화하는 반면, Hp2 알파 쇄와 약하게 반응하며 Hp1 알파 쇄와는 다소 반응한다. 레인 C의 정제 단백질로부터의 16.5kDa 밴드는 쿠마시 염색에 비해, 특히 레인 a에 나타난 Hp1 알파 쇄의 비균형적으로 약한 면역반응성에 비교할 때 비균형적 강도를 갖는다. 따라서, 임신부 혈장으로부터 분리한 알파 쇄는 면역학적으로 독특하며, Hp1 또는 Hp2 알파 쇄중 하나에도 존재하지 않는, 항-PAPP-A에 의해 제시된 에피토프를 함유한다.

[실시예 4]

본 실시예는 Hpr의 알파 쇄와 Hp1 및 Hp2의 알파 쇄 간의 서열차이를 입증하고 있다. 또한, 그 차이점은 임신부 혈청으로부터의 헵토글로빈을 hpr 유전자 생성물로 지정한 것과 일치했다.

펩타이드 지도는 엘더법을 사용하여 실시했다(스파이커, 등., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol 77, pp 5673-5677, 1980; 및 엘더, 등., J. Biol. Chem., vol. 252, pp 6510-6515, 1977). 간단하게, 필요한 단백질을 함유한 조각을 쿠마시 염색겔에서 떼어내고, 완전히 방사능 요오드화시키고, 트립신으로 효소 절단을 하였다. 수득한 제안 펩타이드를 셀룰로즈의 한단면을 따라서 고전압 전기 영동처리한 후, 수직면으로 분할 TLC를 올린다.

이 방법에 의한 펩타이드 지도는 단지 트립신-함유 펩타이드만을 검출한다. 공지된 아미노산 서열을 사용하면, Hp1과 2쇄의 트립틱 펩타이드가 각각 유사하며, 그 이유는 Hp2가 Hp1의 부분복제에 의해 산출되기 때문이다(제5a도 및 제5c도). Hpr, Hp1 및 Hp2 사이의 아미노산 서열에 큰 차이점은 알파 쇄에 있다. 즉 알파 쇄의 N-말단에 모여 있다. 펩타이드 지도를 참고로, 추론한 Hpr 알파 쇄 서열을 사용하여 Hp1에서 수득한 것과 동일한 트립틱 펩타이드 ＋ 부가의 티로신-함유 펩타이드를 예상할 수 있다. 제5b도에서는 실험적으로 수득한 부가의 펩타이드를 화살표시한, 정제 단백질 알파 쇄의 펩타이드 지도를 나타내고 있다. 이 결과 임신부 혈장에서 정제한 독특한 헵토글로빈이 Hpr 유전자 생성물임이 제시된다. 제5d도는 지도화하기 이전에 Hp2 과 정제단백질의 알파 쇄를 혼합한 혼합실험이다. 매우 약한 강도지만 역시 부가의 펩타이드가 존재하며, 함께 이동한다.

[실시예 5]

본 실시예는 임신부 혈청의 헵토글로빈 알파 쇄가 Hpr 예상 서열로 제조된 합성 펩타이드와 에피토프를 공유함을 입증한다.

예상 Hpr 유전자 생성물의 34 N-말단 잔기에 해당하는 합성 펩타이드(마에다 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83pp. 7395-7399, 1986)을 메리필드의 고형상 방법에 의해 Applied Biosystems Model 43A 펩타이드 합성기에서 합성한다(J. Am. Chem. Soc., vol. 85, pp, 2149-2154, 1986). 히스티딘 결합이 불충분할 수 있기 때문에, 28 위치에서 히스티딘 대신에 리신이 치환된다.

헵토글로빈 1과 34-mer 합성 펩타이드에 결합하는 비드를 사용하여 2개의 개별 컬럼을 제조했다. Hp1과 Hp2 합성 펩타이드는 1,1-카르보닐디이미다졸(Reacti-Gel 6X, Pierce)에서 파생된 아가로즈 비드를 사용하여 고정시키며 그 결과 안정한 N-알킬카르바메이트 결합이 형성된다. 5ml의 겔을 0.1M 보레이트와 0.15M NaCI(pH 8.5,실온)으로 세척하여 아세톤을 제거하고 4mg의 Hp1(Sigma)를 보레이트 완충액으로 1mg/ml로 희석하여 50mg Hpr 합성 펩타이드는 보레이트 완충액으로 12.5mg/ml로 희석하여 각각 5ml의 겔에 가하고, 4℃에서 30시간 동안 교반하면서 각각 5ml의 겔에 가하고, 4℃에서 30시간 동안 교반하면서 배양했다. 배양후, 상층액을 따르고 동량(부피)의 0.2M Tris를 첨가하여 남아있는 반응성을 중단시킨다. 상기의 겔을 Tris-염수 완충액으로 완전히 세척하며 Hpr 펩타이드 컬럼은 Tris-염수 완충액중의 0.1% NaDodSO₄, 100ml으로 변성시켰다.

Hpr 펩타이드와 반응성이 있는 항- Hpr 항체를 연속적인 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 미정제 항-PAPP-A 혈청으로부터 분리했다. 먼저, 10ml Tris-염수 완충액중의 미정제 항-PAPP-A 항체 100μl를 4℃에서 하룻밤 동안 교반하면서 Hp1 겔과 함께 배양했다. 그후 Tris-염수로 겔을 완전히 세척하고 5ml 히드록시아파라이트 컬럼을 통해 유출액을 수거하였다. Hp1 컬럼에 반응하는 항체들을 20ml의 아세테이트를 완충액(0.05M 소듐아세테이트, 0.15M NaCI, pH3.5, 실온)으로 용출시켰다. 컬럼을 통과한 항체를 20ml의 0.4M 인산 나트륨으로 히드록시아파타이트 컬럼으로부터 용출시켰다. 두가지 항체 셋트를 21의 Tris-염수 완충액에 대해 투석하였다.

Hp1 컬럼에 반응하지 않은 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 교반하면서 변성된 Hpr 펩타이드겔과 함께 배양했다. Hpr 펩타이드와 반응한 항체는 20ml의 아세테이트 완충액으로 용출시키고 Tris-염수에 대해 투석하였다. 상기의 각 항체 분획은 Hp1의 서브 유니트와 Hpr이 전기 영동에 의해 분리되어 있는 10-15% 그래디언트 램리 겔의 면역 블롯의 표지에 사용했다.

제6도에서, 패널 A는 왼쪽 레인에 25μg Hp1이 쿠마시 염색된 10-15% 그래디언트 램리 겔이 나타나며, 오른쪽 레인에는 100μg의 Hpr이 나타났다. 패널 B-E는 동일한 단백질 로드의 면역 블롯이다. 패널 B는 미흡착된 항-PAPP-A항체(1:50)과 함께 배양했다. 패널 C는 고정 Hp1에 결합한 항-PAPP-A의 서브 셋트와 함께 배양했다; 패널 C는 통과될 미반응 항체와 함께 배양했다. 패널 C의 Hp1 겔에 결합한 40kDa 베타 쇄에 대한 항체가 많음을 주지해야 한다; 반면 독특한 면역 반응의 알파 쇄에 대한 항체는 고정된 Hp1과 반응하지 않으며 통과한다(패널 D), 패널 E는 패널 D에 나타난 항체의 서브 셋트와 함께 배양했으며, 상기 항체는 고정, 변성 및 합성 Hpr 펩타이드와 반응했다. 합성 Hpr 펩타이드에 결합한 상기 항체들은 임신부의 헵토글로빈의 16.5kDa 알파 쇄와만 반응한다. 이 헵토글로빈의 독특한 알파-쇄는 Hpr 에피토프를 포함하는 것이 입증되었다.

[실시예 6]

본 실시예는 인체 유방암의 세포질에서 Hpr 에피토프가 존재함을 나타내고 있다.

파라핀에 묻힌 인체 유방암 견본을 존스 홉킨스 호스피탈의 병리실에서 수득했다. 완충된 10% 포르말린으로 고정하고, 파리핀에 넣은 6μ의 조직 단편을 크실렌으로 파라핀을 제거하고 알코올-물 배스에서 재수화시키며 Tris-염수(pH7.6)중에서 배양한 후 15분 동안 3% H₂O₂로 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다.

Tris-염수로 세척한 후, 1/100로 희석한 정상의 돼지 혈청(Dako)로 30분 동안 차단하고 4℃에서 하룻밤 동안 특이적항체 또는 비면역 혈청과 함께 배양했다. Tris-염수로 세척한 후, 0.5M 트리스 완충액으로 1/100 희석한 돼지-항-토끼 면역 글로빈 IgG 분획(Dako)을 30분 동안 가한 후 퍼옥시다제-토끼-항-퍼옥시다제 복합체(Dako)를 가했다. 최종 세척 이후, 슬라이드를 6분 동안 디아미노벤지딘(sigma) 기질과 함께 배양하고, Mayer's 헤마톡시빈으로 역염색시키고, 덮개 유리로 덮고, 조사하였다.

실시예 5에서 전술한 34-mer 합성 펩타이드로 토끼를 면역시킴으로써 Hpr에 대한 항체가 생성되었다. 면역 목적을 위해, 상기 펩타이드는 전술한 구멍난 림펫트 헤모시아닌(KLH)(Boehringer Mannheim)에 결합시켰다(Lerner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, nol. 78, pp. 3403-3407, 1981).디메틸 포롬아미드중의 8.75mM 말레미도벤조일-n-히드록시-숙신이미드(MBS)(Pierce Chemical Co.) 용액 8μl를 인산-완충염수중의 KLH 14.8mg에 가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. KLH-MBS 결합물을 Pharmacia PD-10 컬럼으로 겔 여과시켜서 미반응 MBS와 분리했다. Hpr 펩타이드 1.2mg을 KLH-MBS에 직접 가하고 실온에서 30분 더 배양했다. 결합능을 측정하기 위하여, 미분리한 3.0ml 반응 부피중의 35μl 샘플을 Waters HPLC를 사용한 Pharmacia Superose 12컬럼상에서 PBS 1ml/분으로 크로마토그래피하며 용출액은 214nm에서 모니터했다. 미반응 펩타이드는 피크 통합과 펩타이드 기준치와의 비교에 의해 정량하였다. 이 방법은 KLH 분자당 4.6 펩타이드의 치환 비율을 나타내었다.

파스퇴렐라가 없는 뉴질랜드산 화이트 토끼(네덜란드) 두 마리를 동량의 PBS(인산완충염수)와 완전한 프로인트 보조제로 구성된 유제 1ml 중의 항원 200㎍으로 0일에 각각 접종하였다; 접종액은 3-4의 피하 및 근육내 부위로 나누어졌다. 14일째에, 불완전한 프로인트 보조제내의 유사량의 항원을 두 번째 주사했다. 32일에 토끼에 혈액 검사를 했다. 양성 토끼의 혈청을 1달에 걸쳐 수거하였다.

BSA을 전술한 바와 같이 합성 Hpr 펩타이드로 유도했다. 효소-결합 면역 흡착 분석은 웰마다 2㎍의 BSA-펩타이드를 사용하여 제시된 방법(Voller etal., J. Clin. Pathol., vol. 31, pp. 570-520, 1978)에 따라 시행하였으며, 토끼 혈청 희석액으로 시험하고 단백질 A-서양 고추냉이 퍼옥시다제 배합체와 o-페닐렌 디아민 기질로 전개되었다.

항체를 정제하기 위하여, 10cm × 5mm Selectispher-10 활성 트레실 컬럼 HPLC 친화 크로마토그래피(Pierce Chemicel Co.)를 Hpr 합성 펩타이드로 유도하였다. 상기 컬럼을 유속 2ml/분으로 30ml PBS로 세척한 후, 4.5ml PBS중에 용해된 27mg의 펩타이드를 유속 1ml/분으로 컬럼을 통과시켰다. 미반응한 트레실 기를 30ml의 0.2M Tris HCI(pH 8.0을 컬럼에 통과시켜 캐핑시켰다. 항체를 정제하기 위하여, 실온에서 300mM NaCl, 20mM 인산나트륨(pH 7.5)로 컬럼에 로드시켰다. 그후 280nm에서 용출액의 광학밀도가 0이 될 때까지 완충액으로 컬럼을 세척했다. 동일 완충액내의 6M 우레아로 항체를 용출시키고 항체-함유분힉을 1mM NaN₃를 함유한 트리스-완충염수로 즉시 투석시켰다.

제7도는 항-Hpr 항체(패널 7a)와 항-CEA 항체(패널 7c) 둘다로 초기 유방선암을 면역퍼옥시다제로 염색한 것을 나타내고 있다; 항-Hpr 염색의 세포질 양성 반응을 주지할 것.

항-Hpr 항체를 본래의 Hpr과 함께 4℃에서 2시간 동안 배양하는 경우, 양성의 세포질 염색이 사라진다(7b). 면역 흡수도의 특이성을 관찰하기 위하여 항-태생기 암 항원(CEA) 항체를 음성 Hpr과 유사한 조건하에 배양했다. 세포질 CEA 양성은 Hpr과 예비배양 함으로써 제거되지 않는다(7d). Hp1과 Hp2가 염색을 억제하지 못하여, 이것은 Hpr 유전자 생성물의 예상 알파 쇄의 N-말단에서 유도된 에피토프가 인체의 유방암에서 검출될 수 있음을 입증한다. 따라서 Hpr, Hpr의 변형 또는 고도의 교차 반응 단백질이 인체의 유방암 세포에 틀림없이 존재한다.

[실시예 7]

본 실시예는 인체 유방암에 의한 Hpr의 형질 발현과 환자가 질병이 없는 상태로 있는 시간 간격사이의 상관 관계를 나타내고 있다.

61 케이스의 인체 유방암이 암과 관련된 헵토글로빈 형질발현 및 항-PAPP-A 항 혈청과의 면역작용을 동시 평가하는데 이용되었다. 암-Hpr 형질발현은 암-관련헵토글로빈 서열에서 유도된 서열을 갖는 합성 펩타이드에 대한 친화성-정제된 폴리클로날 항체를 사용하여 파라핀에 잠긴 물질을 면역조직 화학적 염색을 함으로써 측정할수 있다. PAPP-A 양성은 항-PAPP-A항 혈청을 사용하여 유사하게 평가된다. 61명의 환자중 40명이 제1단계 질환이며(종양크기 5cm 이하, 음성 림프돌기) 21명이 제2단계 질환(종양크기 5cm 이하, 겨드랑이 림프돌기) 이다. BMDP 통계 프로그램을 사용하여 생존표 양식으로 자료를 분석했다. 2가지 통계시험, 즉 Generalized Wilcoxon(Breslow)와 Generalized Savage (Mantel-Cox)를 사용하여 곡선간의 현저한 차이를 결정하는데 사용한다.

결과는 제8도에 나타내었다. 종축은 질병이 없는 상태의 환자의 백분율이며 횡축은 진단후 시간간격이다. 곡선간의 차이가 크게 나타나며, p〈.0005(Wilcoxon)과 p〈.0003(Savage)였다.

[실시예 8]

본 실시예는 배양한 유방암 세포가 Hpr을 형질발현하는 것을 입증하고 있다.

신선한 인체 유방암이 Hpr 단백질의 공급원으로 사용할 수 있지만 그 양은 일반적으로 작고 이동성도 불규칙하다. 이러한 이유 때문에, 일련의 인체 유방암 세포주를 미합중국 모식균 수집소(매릴랜드, 록크빌 소재)에서 입수하여 면역세포 화학 방법에 의해 Hpr 형질 발현을 스크린했다. 제9도는 상기 세포주 MDA-MB-231 즉 에스트로겐 수용체 음성 세포주에서의 접근 결과를 나타내고 있다. (Anddrson, J. Submicroscop. Cytol. vo. 16, pp 673-690, 1984).

간단하게, 세포를 10% 태아 BSA 및 항체를 보충한 L-15 배지중의 챔버 슬라이드상에서 증식하고 파라포름알데히드중에 고정시키며 Triton X-100으로 투과시키고, 항-Hpr 40㎍/ml 또는 대조군과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하며, 비오틴화 제2 항체, 아비딘-퍼옥시다제 및 아미노에틸-카바졸-퍼옥사이드 기질 용액으로 계속 전개시켰다.

왼쪽은 특이적 항체로 염색한 입자 세포질 염색을 나타내며 오른쪽은 제1 항체가 없는 대조군을 나타내고 있다; 이 방법에서는 무관한 양성 주 항체 대조군으로서 사용하는 경우 적당한 분포도의 무관한 친화-정제된 항체. 따라서, 상기의 배양 세포들은 Hpr을 생성할 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다.

[실시예 9]

본 실시예는 생리적인 조건하에서 탈락막 조직이 Hpr을 합성함을 나타내고 있다.

Hpr을 임신부 혈청으로부터 정제하기 때문에, 임신부-특정 조직을 형질발현 시키기 위해 면역조직화학적 방법으로 스크린했다. 신선한 탈락막을 선택적 낙태 이후에 버려지는 조직으로부터 수득하여 포르말린으로 고정하였다. 완충된 10% 포르말린으로 고정되고 파라핀에 감긴 6u 조직 단편을 크실렌중에서 파라핀을 제거하고 알코올-물 배스에서 재수화시키며 Tris-염수(pH 7.6)중에서 배양한 후 15분 동안 3% H₂O₂로 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. Tris-염수로 세척한 후, 1/1000로 희석한 정상 돼지 혈청(Dako)로 30분 동안 차단하고 4℃에서 하룻밤 동안, 실시예 6에서 전술한 대로 제조된 특이항체 또는 대조군의 경우 비 면역 혈청과 함께 배양했다. 그후 비오틴화된 제2 항체, 아비딘-퍼옥시다제, 및 아미노에틸-카바졸-퍼옥사이드 기질용액으로 차례로 전개했다. 상기 슬라이드를 60분 동안 디아미노벤지딘(시그마)기질과 함께 배양하고 Mayer's 헤마톡시린으로 역염색하여 덮개 유리로 덮고 조사하였다.

탈락막 염색의 결과는 제10도에 도시하였다. 왼쪽은 항-Hpr 항체로 염색한 주 세포질을 나타내며, 오른쪽은 제1 항체가 누락된 대조군을 나타내고 있다. 기타 태반조직은 음성 반응이었다(자료는 제시하지 않음). 본 실험은 생리조건하에서 탈락막이 Hpr을 합성함을 제시하고 있다.

[실시예 10]

본 실시예는 탈락막에 의해 형질발현된 Hpr이 임신부의 혈청에서 분리한 Hpr보다 더 큰 폴리펩타이드를 합성함을 입증하고 있다.

제11도는 항-Hpr이 탈락막의 분해물 중에 있는 비 바람직한 알파 중쇄를 인지함을 나타내고 있다. 간단하게, 1g의 냉동 탈락막을 10ml의 분해 완충액(10mM Tris HCl, pH 7.5, 4× 1mM EDTA, 1% Tritton X-100m 0.5mM 디이소프로필플루오로포스페이트)중에서 브림크만 폴리트론을 사용하여 균질화시켰다. 불용성 물질은 4℃에서 5분 동안 1200 × g로 원심분리하여 제거하고 상층액은 램리 가용성 완충액과 혼합하였다. 50㎕ 분획을 10-15% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기 영동시킨 후 반 건조 블롯팅 장치를 사용하여 니트로셀룰로즈로 전이 시켰다(Polyblot, American Bionetics). 이 블롯을 2시간 동안 실온에서 Tris-염수중의 3% BSA로 차단시킨 후, Tris-염수중의 항-Hpr 40㎍/ml 내에서 하룻밤 배양했다. 그후, 블롯을 0.05% Triton X-100으로 PBS중에서 세척하고 비오틴화 염소-항-토끼 IgG로 배양하고 세척하며, 아비딘-서양 고추냉이 퍼옥시다제 복합체로 배양하고, 새척하며, 아미노에틸카바졸 기질용액중에서 배양했다.

탈락막 분해물이 특정한 알파 쇄류를 포함하는 것으로 블롯이 나타났다. 왼쪽 레인은 Hp2 로 감염된 부분 정제 Hpr 제제를 나타내며; 본 실험에서 사용된 항-Hpr는 Hp2 알파 쇄와 교차 반응하며(최상단 밴드), 그러나 Hp1 알파 쇄와 반응하지 않는다. 왼쪽 레인의 하단밴드는 Hpr 알파 쇄를 나타낸다. 오른쪽 레인은 탈락막 분해물이 약 30kDa 범위의 주요 면역반응 밴드를 포함하는 것으로 나타내고 있다.

간에서, 헵토글로빈은 단백질분해 효소로 절단되어 알파 및 베타 쇄를 형성하는 단일의, 연속성 폴리펩타이드 사슬로서 형성된다. 다가의 항 헵토글로빈 항체와의 블롯 반응은 유일한 45kDa를 검출했다. 성숙한 알파 또는 베타 쇄는 검출되지 않았다.

Claims

다음의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 : leu tyr ser gly asn asp val thr asp ile ser asp asp arg phe pro lys pro pro glu ile ala asn gly tyr val glu lys leu phe arg tyr gln cys.
거의 순수한 폴리펩티드 제제로서, 상기 폴리펩티드에 의해 면역화된 포유류가 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않지만 제25항의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 면역학적으로 가교 반응성인 단백질에서는 발견되는 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 폴리펩티드 제제.
제2항에 있어서, 그 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열을 포함하는 제제.
제1항의 폴리펩티드와는 면역학적으로 가교 반응성이 헵토글로빈 1 또는 2 와는 면역학적으로 가교 반응성이 아닌 단백질에서 발견되는 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 함유한 제제.
제4항에 있어서, 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 제제.
제3항의 폴리펩티드에는 특이적으로 결합하지만 헵토글로빈 1 또는 2에는 특이적으로 결합하지 않는 항체를 함유하는 제제.
제4항에 있어서, 그 항체는 모노클로날 항체인 항체 함유 제제.
a) 헵토글로빈 1 또는 2에서는 발견되지 않지만 제25항의 폴리펩티드와 면역학적으로 가교 반응성인 단백질에서 발견되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 제제에 결합할 수 있는 능력을 인체 유방암 세포주에 대해 시험하는 단계, b) 상기 항체 제제에 결합할 수 있는 능력을 가진 사람의 유방암 세포주를 배양하는 단계 및 c) 상기 세포주의 상기 단백질을 함유하고 있는 세포질 분획물로부터 상기 단백질을 수거하는 단계를 포함하는, 제25항의 폴리펩티드와 면역학적으로 가교 반응성인 단백질 제제의 제조 방법.
a) 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않지만 제25항의 폴리펩티드에 면역학적으로 가교 반응성인 단백질에서는 발견되는 에피토프와 면역 반응성인 항체 제제 및 b) 상기 제제의 항체 검출 수단을 포함하는, 유방암 예후 판단용 키트.
a) 제5항의 항체 제제 및 b)상기 제제의 항체 검출 수단을 포함하는 유방암 예후 판단용 키트.
a) 제6항의 항체 제제 및 b) 상기 제제의 항체 검출 수단을 포함하는 유방암 예후 판단용 키트.
제9항에 있어서, 그 검출 수단이 a) 상기 제제의 항체와 면역 반응성인 항-Ig 항체, b) 퍼옥시다제 효소 및 c) 퍼옥시다제 및 과산화수소 존재하에 색상을 변화시키는 색소원 물질을 포함하는 키트.
제12항에 있어서, 그 색소원 물질은 아미노에틸카바졸인 키트.
제9항에 있어서, 그 검출 수단은 방사능 표지를 포함하는 키트.
제12항에 있어서, 그 퍼옥시다제 효소는 상기 제제의 항체에 면역 반응성인 항-Ig 항체에 결합된 키트.
제12항에 있어서, 퍼옥시다제 효소가 항-퍼옥시다제 항체에 결합하며, 상기 항-퍼옥시다제 항체는 상기 제제의 항체에 면역 반응성이 있는 항-Ig 항체에 면역 반응성인 키트.
a) 헵토글로빈 1 또는 2에 결합하지는 않지만 제25항의 폴리펩티드에 면역학적으로 가교 반응성인 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제제와 고형 종양의 조직 단편을 접촉시키는 단계 및 b) 고형 종양의 악화된 예후와 관련된, 상기 제제의 항체의 조직 단편에의 결합 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 고형 종양의 예후 판단 방법.
a) 제5항의 항체 제제와 고형 종양의 조직 단편을 접촉시키는 단계 및 b) 고형 종양의 악화된 예후와 관련된, 상기 제제의 항체의 조직 단편에의 결합 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 고형 종양의 예후 판단 방법.
a) 제6항의 항체 제제와 고형 종양의 조직 단편을 접촉시키는 단계 및 b) 고형 종양의 악화된 예후와 관련된, 상기 제제의 항체의 조직 단편에의 결합 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 고형 종양 예후 판단 방법.
제17항에 있어서, 고형 종양은 유방암인 방법.
a) 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않지만 제25항의 폴리펩티드와 면역학적으로 가교반응성인 단백질에서 발견되는 에피토프와 면역 반응성인 항체를 고형 지지체에 부착 제공하는 단계, b) 상기 항체와 상기 단백질 사이에 안정한 항체-항원 복합체가 형성되는 조건 및 상기 항체가 헵토글로빈 1 또는 2 와 반응하지 않는 조건하에서 미정량의 상기 단백질을 함유하는 생물학적 유체와 상기 고형 지지체를 접촉시켜 항체-단백질 복합체를 형성하는 단계, c) 헵토글로빈 1 또는 2에서 발견되지 않지만 상기 단백질에서 발견되는 에피토프를 함유하며 검출 가능한 부위를 지닌 폴리펩티드와 단계(b)에서 얻은 상기 고형 지지체를 상기 조건하에서 추가로 접촉시켜 항체-폴리펩티드 복합체를 형성하는 단계, d) 단계 (c)에서 항체-항원 복합체에 의해 고형 지지체에 결합된 검출 가능한 부위를 지닌 상기 폴리펩티드를 검출 및 정량하는 단계 및 e) 단계 (a)에서 (d)까지에서 고형 지지체에 결합된 폴리펩티드의 양(1)과 단계(b)가 생략된 경우에 결합된 폴리펩티드의 양(2)을 비교하는 단계(여기서 상기 결합량(2)에 비해 상기 결합량(1)이 감소하는 것은 생물학적 유체중의 상기 단백질양과 상관 관계가 있음)를 포함하는, 생물학적 유체중의 제25항의 폴리펩티드와 면역학적으로 가교 반응성인 단백질을 분석하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 항체는 상기 단백질과는 특이적으로 면역 반응성이나 헵토글로빈 1 또는 2와는 특이적으로 면역 반응성이 아닌 방법.
a) 고형 종양을 지닌 환자의 생물학적 유체중에서, 헵토글로빈 1 또는 2에는 특이적으로 결합하지 않지만 제25항의 폴리펩티드와 면역학적으로 가교반응성인 단백질에는 특이적으로 결합하는 항체에 면역학적으로 결합된 단백질의 양을 정량하는 단계 및 b) 상기 (a) 환자의 유체중의 상기 단백질양을 고형 종양이 검출되지 않은 환자로부터 수거한 대조군 유체에서 발견된 양과 비교하는 단계(여기서 단백질의 증가된 양은 종양 세포의 증식을 나타냄)를 포함하는, 환자의 종양 세포 증식을 검출하는 방법.
a) 고형 종양을 지닌 환자의 생물학적 유체중에서, 제28항의 항체에 의해 면역학적으로 결합된 단백질의 양을 정량하는 단계 및 b) 상기 (a) 환자의 유체중의 상기 단백질양을 고형 종양이 검출되지 않은 환자로부터 수거한 대조군 유체에서 발견된 양과 비교하는 단계(여기서 단백질의 증가된 양은 종양 세포의 증식을 나타냄)를 포함하는, 환자의 종양 세포 증식을 검출하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 정량 단계는 상기 단백질과 특이적으로 반응하는 항체 제제에 의해 상기 단백질을 결합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 그 대조군 유체는 초기에 수거된 고형 종양을 지닌 환자로부터 유래하는 방법.
제23항에 있어서, 그 생물학적 유체는 혈장 또는 혈청인 방법.
제23항에 있어서, 그 고형 종양은 유방암인 방법.
a) 고형 종양을 갖는 환자의 종양 세포에서 얻은 세포 용균물중에서, 헵토글로빈 1 또는 2에는 특이적으로 결합하지 않지만 제25항의 폴리 펩티드에 면역학적으로 가교 반응성인 단백질에는 특이적으로 결합하는 항체에 의해 면역학적으로 결합된 단백질양을 정량하는 단계 및 b) 상기 (a) 환자로부터 얻은 상기 용균물중의 단백질양을 고형 종양이 검출되지 않는 환자로부터 수거한 대조군 세포 용균물에서 발견된 양과 비교하는 단계(여기서 상기 단백질의 증가된 양은 종양 세포의 증식을 나타냄)를 포함하는, 환자의 종양 세포 증식을 검출하는 방법.
제29항에 있어서, 그 대조군 세포 용균물은 초기에 수거된 고형 종양을 갖는 환자로부터 유래하는 방법.
제29항에 있어서, 그 고형 종양은 유방암인 방법.