KR100186901B1

KR100186901B1 - 더머스 칼도필러스 지이케이-24로부터 생산되는 효소 풀루란아제

Info

Publication number: KR100186901B1
Application number: KR1019950043764A
Authority: KR
Inventors: 김철호; 고정헌; 이영춘; 이대실
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-11-25
Filing date: 1995-11-25
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2015-11-25
Also published as: KR970027301A

Abstract

본 발명은 극호열성 균주인 더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK-24로 부터 유래된 풀루란아제(pullulanase), 그의 제조방법과 탄수화물 가수분해효소로서의 용도에 관한 것이다.

Description

더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK-24로 부터 생산되는효소 풀루란아제(pullulanase)

제1도는 풀루란아제의 정제과정을 나타내는 크로마토그램이다.

a도는 세파크릴 S-200(Sephacryl S-200)겔여과 크로마토그래피.

b도는 DEAE-세파실(DEAE-Sephacel) 이온교환 크로마토그래피.

c도는 DEAE Toyopearl 5PW의 고속액체 크로마토그래피.

d도는 FPLC를 이용한 Mono-Q 크로마토그래피.

■ ; 효소활성도, ....... ; 단백질(OD_280nm)

― ; NaCl 농도 구배

제2도는 정제한 풀루란아제의 SDS-변성 폴리아크릴아미드겔전기영동 사진이다. 큰 화살표는 정제된 풀루란아제의 위치를 표시한 것이고 작은 화살표는 표준 단백질을 표시한 것이다.

레인 1 ; 정제된 풀루란아제(3㎍), 레인 2 ; 정제된 풀루란아제(4㎍), 제인 3 ; 정제된 풀루란아제(5㎍), 표준단백질 ; 미오신(200kDa), 포스포릴레이즈b(phosphorylase b, 97.4 kDa), 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin, 68 kDa), 오보알부민(ovalbumin, 43 kDa), 카르보닉 안하이드레이즈(carbonic anhydrase, 29 kDa), β-락토글로불린(β-lactoglobulin, 18.4 kDa).

제3도는 등전점을 확인하는 IEF의 결과 사진이다.

레인 1 ; 정제된 풀루란아제(5㎍), 레인 2 ; 등전점(pI) 계산 표준단백질.

제4도는 최적의 온도를 나타낸 그림이다.

■ ; 비교 활성도(%)

제5도는 최적의 pH를 나타낸 그림이다.

■ ; 효소의 활성도(OD_540nm)

제6도는 정제된 효소의 아미노 말단의 아미노산 서열과 다른 원핵 생물에 존재하는 효소의 아미노 말단의 서열을 비교 분석한 그림이다. 동일한 아미노산의 경우에는 검은색으로 칠하였다.

(a) T. caldophilus GK24, (b) T. saccharolyticum B6A-R1, (c) T. thermousulfurigens EM1, (d) Thermoanaerobacter ethanolicus 39E, (e) K. pneumoniae ATCC 1505, (f) B. flavocaldarius.

제7도는 정제된 풀루란아제에 의해 생성된 산물을 TLC 법으로 분석한 그림이다.

레인 1 ; 말토올리고사카라이드(maltooligosaccharides)를 포함하는 표준 시료, 레인 2 ; 파노스(panose), 레인 3 ; 풀루란을 넣지 않은 경우, 레인 4 ; 5분간 반응, 레인 5 ; 10분간 반응, 레인 6 ; 30분간 반응, 레인 7 ; 60분간 반응.

본 발명은 고온성 균주인 더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK-24로 부터 유래된 풀루란아제(pullulanase)에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 고온성 균주인 T. caldophilus GK-24로 부터 유래된 풀루란아제(pullulanase), 그의 제조방법 및 탄수화물가수분해효소로서의 용도에 관한 것이다.

최근 식료품산업 또는 의약품 산업등에서 당분 특히 시럽의 사용이 증가되어 그 수요가 급증하고 있는데, 녹말의 당화에는 다양한 탄수화물 가수분해효소가 사용되고 있다. 전분을 가수분해시키는 효소로서는 주로 아밀라아제가 사용되고 있으나, 전분의 당화를 증진시키기 위해서는 각종 전분을 가수분해시킬 수 있는 효소의 병용이 필요하다. 풀루란아제는 풀루란, 아밀로펙틴, 글리코겐 등의 α-1,6-글루코시딕 연결을 가수분해함으로써, 다양한 아밀라아제와 함께 녹말의 당화(saccharification)를 증진시켜 글루코오스, 말토오스 또는 높은 글루코오스를 함유하는 시럽을 만드는데 이용된다.

풀루란아제(pullulanase:pullulan-glucanohydrolase, EC 3.2.1.41)는 맨 처음으로 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 발견되었으며 [Bender, H. 등, (1961) Enzym. Biochem. Z. 334: 79-94] 풀루란에 있는 α-1,6-글루코시딕 연결을 가수분해하여 최종산물로 말토트리오스(maltotriose)를 만드는데 관여하는 효소로서[Abdullah, M. 등, (1966) Nature 210, 200], 풀루란 뿐만 아니라 아밀로펙틴, 글리코겐과 같은 가지를 지닌 다당류에서 α-1,6-글푸코시딕(α-1,6-glucosidic) 연결을 자르기도 한다.

한편 α-1,6-글루코시딕 연결을 자르는 효소에는 이소아밀라아제도 있으나, 이소아밀라아제는 α-D-글루칸스(α-D-glucans)의 α-1,6-글루코시딕 연결은 가수분해하나 풀루란의 α-1,6-글루코시딕 연결을 가수분해하지 못한다.

풀루란아제는 2가지 타입이 존재한다.

타입 I의 풀루란아제는 풀루란의 α-1,6-글루코시딕 연결만을 가수 분해하며 K. pneumoniae, Bacteroides thetaiotaomicron 96-1, 호 알칼리성의 Bacillus sp. KSM-1876, 호알칼리성의 Thermus aquaticus YT-1, 호알칼리성의 Bacillus sp. S-1, 호알칼리성의 Micrococcus sp. Y-1 그리고 Bacillus acidopullulyticus 등에서 발견되었다.

타입 II의 풀루란아제는 풀루란의 α-1,6-글루코시딕 연결뿐만 아니라 다른 다당류의 α-1,4-연결도 가수분해하며 대부분의 호열성 박테리아에 존재한다 [Bender, H. 등,(1961) Enzym. Biochem. Z. 334: 79-942; Kim, C. H. 등, (1993) J. Industrial Microbiol, 12: 48-57; Kim, C. H. 등, (1993) Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1632-1637].

K. pneumoniae에서 풀루란아제가 발견된 이후 수많은 내저온 또는 호열성 미생물 등에서 본 효소가 정제되고 그 특성이 규명되었으나, [Spreinat, A. 등, (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 511-518; Kim, C. H. 등, (1995) Eur. J. Biochem. 227: 687-693], 극호열성 박테리아의 경우, Thermus aquaticus 와 Thermus sp. AMD33을 제외하고는 풀루란아제의 생화학적 특성이나 기질특이성에 대하여 연구된 바가 없다 [Plant, A. R. 등, (1986) Enz. Microb. Technol. 8: 668-672; Nakamura, N. 등, (1989) Starch/Starke 41: 112-117].

탄수화물을 가수분해하여 당화시키는 반응은 가능하면 고온에서 행하는 것이 좋다. 고온에서 반응을 시키면 우선 기질로 사용하는 탄수화물의 용해도가 증가하고 기질이 분해가 잘되며, 탄수화물에 다른 세균이 작용하는 것을 막을 수 있다는 장점이 있다.

전부의 액화(liquefaction)와 당화(saccharification)에는 분지절단 효소인 풀루란아제(α-1,6-당결합절단)와 아밀라아제(α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제)의 동시반응이 필요하지만 내열성의 플루란아제는 아직 자세히 연구되지 않고 있다.

이에 본 발명자는 일상적으로 70-75℃의 온도에서 자라며, 몇몇종은 85℃에서 자라기도 하는 극호열성 박테리아에서 탄수화물 관련효소를 찾고자 노력한 결과, 극호열성 균주인 Thermus caldophilus GK-24로 부터 고온에서 최대의 활성을 나타내는 풀루란아제를 분리하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 Thermus 속의 박테리아에서 탄수화물 가수분해효소인 pullulanase를 분리하여 제공함을 그 목적으로 한다.

본 발명은 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

T. caldophilus GK-24를 공지의 방법으로 배양한 후 균체를 회수하고 파쇄한 후 풀루란아제 효소활성을 측정한다. 고온(75℃)에서 상기 세포 추출액을 사용하여 전분을 가수분해시켜 효소의 존재를 확인한 다음 통상의 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 이를 정제한다 [Taguchi, H., Hamaoki, M., Mastsuzawa, H. 와 Ohta, T., (1983) Heat stable extracellular proteolytic enzyme produced by Thermus caldophilus strain GK-24, an extremely thermophilic bacterium. J. Biochem. 3: 7-13].

상기와 같이 T. caldophlius GK-24로 부터 정제된 내열성 풀루란아제의 아미노산 서열은 통상의 아미노산 서열 결정방법, 예를 들면 에드만 분해 방법 [Edman, P., (1949) Arch. Biochem. Biophys. 22: 475-476]과 단백질 분해효소, 예를 들면 트립신과 같은 효소에 의한 절단과 절편의 분리에 의해 자동화된 아미노산 서열 결정기 등을 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명에서 사용된 효소 활성 측정방법 및 단백질 정량방법을 참고예로 나타내었다.

[참고예 1 ] 효소 활성 측정방법

풀루란아제나 아밀라아제의 활성은 풀루란이나 가용성 전분으로부터 유리되는 환원당의 양을 측정함으로서 알 수 있다 [Kim, C. H. 등, (1992) Biochim. Biophys. Acta 1122: 243-250]. 반응 혼합물(1.0ml)은 50ml Tris-HCl(pH7.0) 완충용액에 풀루란 또는 가용성 전분을 넣고(1%, w/v) 효소액(5-10㎍)을 가하여 만들며 73℃에서 30분 동안 반응시켰다.

생성된 환원당은 이미 공지된 방법인 디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid; DNS)법을 이용하여 측정하였다 [Roybyt, J. K. 등, (1972) Anal. Biochem. 45: 510-516; Bernfeld, P., (1955) Methods Enzymol. 1: 149-150]. 효소의 1단윈(unit)는 위에서 언급한 조건에서 단위 분에 생성되는 1μM의 환원당(글루코오스)으로 정하였다.

[참고예 2] 단백질 정량방법

단백질의 정량은 표준물질로서 소의 혈청 알부민(bovine serumalbumin)을 사용한 정량곡선을 이용하여, 널리 알려진 Lowry 등의 방법에 따라 실시하였다.

이하 Thermus caldophilus GK-24로 부터 풀루란아제를 생산 분리하는 방법과 이 효소의 특성 및 아미노산 서열에 관한 것을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것이 아니다.

[실시예 1] T. caldophilus GK-24 균주의 배양 및 조효소액(crude extract)의 제조

T. caldophilus GK-24 균주의 배양은 10리터의 배양액에 본 균주를 접종하여, 75℃에서 2시간 배양하고 원심분리하여 본 균체를 회수하였다.

T. caldophilus Gk-24 15g을 완충용액 A [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM β-mercaptoethanol, 0.5 M EDTA]에 녹인 후 전체 부피 100ml를 30ml씩 나누어 초음파 파쇄기(Ultrasonic Sonicator)를 이용하여 연속으로 세포를 완전히 파쇄하였다. 이를 원심분리(Sorvall SS-34 rotor, 15000×g, 20 min, 4℃)하여 얻은 상층액 100ml에 암모늄설페이트[(NH₄)₂SO₄]를 이용하여 30%에서 70% 사이를 분별 침전하고 원심분리(Sorvall SS-34 rotor, 15000×g, 20 min, 4℃)하여 침전물을 최소 부피로 회수하여 100배량의 완충용액 A에 대하여 4시간씩 3회 투석하였다. 이것을 다시 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후에 조효소액으로 사용하였다.

[실시예 2] T. caldophilus GK-24로 부터 풀루란아제 정제

모든 실험은 일반적인 효소의 정제에 많이 사용되는 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 방법을 이용하여 4℃에서 수행하였으며, 정제과정은 아래의 4단계의 크로마토그래피 과정을 거쳐서 완료했다.

[단계 1] 세파크릴 S-200(Sephacryl S-200)겔여과 크로마토그래피

완충용액 A [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM β-mercaptoethanol, 0.5 M EDTA)를 이용하여 세파크릴 S-200겔(2.5×120cm)을 평형화시켰다. 다음 투석한 암모늄 설페이트 침전의 조효소액을 장착하여 겔여과를 수행하였다. 분당 0.4ml 속도로 용출시켜 각각 8ml의 분획으로 나눈 다음 풀루란아제 활성 부분을 모았다(효소용액 1)(제1도 a 참조).

[단계 2] DEAE-Sephacel 이온교환 크로마토그래피

실시예1에서 사용한 완충용액 A[50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM β-mercaptoethanol, 0.5 M EDTA]로 DEAE-Sephacel 컬럼(1.5×20cm)을 평형화하여 단계1의 효소용액1을 흡착시킨 후 동일한 완충용액으로 흡광도가 280nm에서 0.01이 될 때까지 시간당 30ml 속도로 씻은 후, 0M에서 1M농도까지의 NaCl 선상농도구배(lineargradient)를 300ml의 양으로 수행하였다. ADP-glucose 합성효소의 활성부분(0.17-0.25 M KCl)을 모아(50ml) 완충용액 A에서 투석하였다(효소용액 2)(제1도의 b 참조).

[단계 3] DEAE Toyopearl 5PW 이온교환 고속액체 크로마토그래피

완충용액A으로 평형화되어 있는 고속액체 크로마토그래피의 DEAE Toyopear l 5PW(10×100mm; Tosoh Co., 도쿄, 일본)에 농출된 효소액(5ml)을 흡착시킨 후 동일한 완충용액A로 흡광도가 280nm에서 0.01이 될 때까지 시간당 30ml의 속도로 씻은 후 0M에서 0.5M농도까지의 NaCl 선상 농도 구배를 10ml의 양으로 수행하였다. 풀루란아제 효소의 활성부분(0.17∼0.19 M NaCl)을 모아 (5ml), 완충용액A에서 투석하였다(효소용액3)(제1도 c 참조).

[단계 4] Mono-Q FPLC 크로마토그래피

완충용액A로 이미 평형되어 있는 Mono-Q HR 10/10(10×100mm)위에 농축된 효소용액3(5ml)을 흡착시킨 후에 동일한 완충용액A로 시간당 30ml 속도로 씻어준 후 0M 에서 0.5M 농도까지의 NaCl 선상 농도 구배를 100ml의 양으로 수행하였다. 풀루란아제의 활성부분(0.11-0.13 M NaCl)을 모아(2ml) 최종적으로 정제된 효소를 확보하였다(제1도 d 참조).

조효소액으로부터 4단계의 컬럼 크로마토그래피 과정을 거쳐서 정제를 완료한 것을 표1에 정리하였다.

[실시예 3] 정제된 풀루란아제의 분자량 결정

잘 알려진 겔의 여과법을 이용하여 약 10㎍의 단백질을 각열에 넣고 전개하여 세파로즈 4B(Sepharose 4B)겔에서 확인한 결과 본 효소의 분자량이 63 kDa임을 확인하였다.

또한 이미 공지된 방법에 의해 [Laemmli, U. K., (1970) Nature 227: 680-685] 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고 분석한 결과, 표준 단백질 미오신(200kDa), 포스포릴레이즈 b(phosphorylase b, 97.4 kDa), 소의 혈장 알부민(bovine serum albumin, BSA, 68 kDa),

오보알부민(ovalbumin, 43 kDa), 카르보닉 안하이드레이즈(carbonicanhydrase, 29 kDa)와 라이소자임(lysozyme, 18.4 kDa)에 비추어 본 풀루란아제는 그 분자량이 64 kDa로 B. stearothermophilus(70 kDa)나 T. aquaticus YT-1(70 kDa)의 경우와 유사함을 보여주었다(제2도 참조).

[실시예 4] 정제된 풀루란아제의 등전점

풀루란아제의 등전점을 확인하기 위하여 이미 알려진 등전기 촛점 전기영동법(isoelectric focusing, IEF)을 이용하였다. pH의 구배를 3.5에서 9.0까지 형성시킨 PhastGels(Phamacia LKB Biotechnology Inc.)에서 표준 단백질 표시띠로 트립시노겐(trypsinogen, pI=9.0), 편두 렉틴 염기성띠(lentil lectin-basic band, pI=8.65), 편두 렉틴 중성띠(lentil lectin-middle band, pI=8.45), 편두 렉틴 산성띠(lentil lectin-acidic band, pI=8.15), 미오글로빈 염기성띠(myoglobin-basic band, pI=7.35), 미오글로빈 산성띠(myoglobin-acidic band, pI=6.85), 인간 카르보닉 안하이드레이즈 B(human carbonic anhydrase B, pI=6.56), 소의 카르보닉 안하이드레이즈 B(bovine carbonic anhydrase B, pI=5.86), β-락토글로불린 A(β-lactoglobulin A, pI=5.20), 콩의 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor, pI=4.60)에 비교하여 분석한 결과 이 풀루란아제의 등전점은 6.1임을 알 수 있었다(제3도 참조).

[실시예 5] 정제된 풀루란아제의 최적 온도

최대의 활성을 보여주는 온도를 찾아내기 위하여 20℃에서 100℃까지 2%의 풀루란과 0.087 단위(U)의 효소를 넣어 앞에서 언급한 활성 측정 방법으로 확인한 결과 pH 6.0에서 75℃의 경우 최대의 활성을 보여주었다. 또한 특정 온도에서의 안정성을 보기 위하여 다양한 온도에서 60분간 방치한 후 pH 6.0의 완충용액에서 반응시킨 결과 95℃에서 30분이 지나면 활성을 잃는 것을 확인하였다(제4도 참조).

[실시예 6] 정제된 풀루란아제의 최적 pH

활성에 미치는 pH의 영향을 보기 위하여 반응용액 [30mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 3.0-6.0), 30mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0-8.0), 30mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0-10.0), 30mM 글리신 완충용액(pH 9.0-12.0)]에 0.023 단위(U)의 풀루란아제를 넣고 활성을 조사하였다. pH 5.5에서 최대의 활성을 보여주었다(제5도 참조).

[실시예 7] 여러 시약들이 정제된 풀루란아제 효소의 활성에 미치는 영향

여러가지 양이온들이 효소의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 표2에서 보여주듯이 Ca, Mg그리고 Mn양이온은 효소활성을 강화하는 양상으로 Zn, Cu와 Fe양이온은 효소활성에 대하여 억제하는 양상을 보여주었다. 또한 금속과 배위결합을 이루는 EDTA의 경우는 효소의 활성에 아무런 영향을 미치지 않았다.

[실시예 8] 정제된 풀루란아제의 기질 특이성의 확인

탄수화물을 가질로 하여 분해 반응을 확인한 결과, 풀루란을 가장 잘 가수분해하였고, α,β-제한 덱스트린(α,β-limited dextrin), β-제한 덱스트린(β-limited dextrin), 가용성 녹말, 아밀로펙틴, 감자녹말 그리고 글리코겐은 어느 정도 분해하였다. 덱스트란이나 α-, β-, 나 γ-환덱스트린(α-,β-,γ-cyclodextrin)의 경우에는 실제로 이 효소에 의해서는 거의 분해되지 않았다. 본 효소의 분해반응을 풀루란을 기준으로 하여 측정한 상대적 활성도를 표3에 나타내었다.

[실시예 9] 정제된 풀루란아제의 아미노 말단(NH-terminal)의 아미노산 서열

T. caldophius GK-24의 균체로 부터 정제 과정을 거쳐서 제조된 풀루란아제의 아미노 말단의 아미노산 서열을 결정하기 위해 변성 폴리아크릴아미드겔에 전기영동한 후 PVDF 막에 전기로 흡착시킨 후 풀루란아제의 띠를 염색과 탈염을 통해 확인한 후 공지의 방법으로 아미노말단(NH-terminal)의 아미노산 서열을 결정하였다.

결정된 아미노 말단 서열은 Ala-Pro-Gln-Asp-Asn-Ser-Leu-Xaa-Ile-Gly-Ala-(Ser)이었다. 다른 원핵생물에 존재하는 풀루란아제의 아미노 말단의 아미노산 서열과 비교한 결과 아미노산 서열이 거의 다른 것을 알 수 있었다(제6도 참조).

[실시예 10] 정제된 풀루란아제에 의해 생선된 산물을 TLC법으로 분석

정제된 풀루란아제를 2% 풀루란(pullulan)과 50℃에서 반응시켰다(0.5ml). 반응용액을 10μl씩 TLC에 올려 전개하였는데 말토올리고 사카라이드를 포함한 시료를 표준으로 하여, 파노스(panose), 시료 넣지 않은것, 또한 5분, 10분, 30분, 60분 반응시킨 것을 차례로 올렸다(제7도 참조). 그 결과 정제된 풀루란아제는 반응 초기부터 말토트리오스(maltotriose) 단위를 비환원 말단에서부터 절단하는 효소이며 또한 α-1, 6-당결합을 절단하는 타입I 풀루란아제로 확인되었다.

상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 풀루란아제는 T caldophilus 에서 최초로 분리된 신규의 풀루란아제로서 고온에서 최대의 활성을 나타내며, 풀루란을 가장 잘 가수분해하였고, α,β-제한 덱스트린(α,β-limited dextrin), β-제한 덱스트린(β-limited dextrin), 가용성 녹말, 아밀로펙틴, 감자녹말 그리고 글리코겐에 대해서도 가수분해 활성을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 풀루란아제는 극호열성 균주인 T. caldopilus에서 새로이 분리된, 고온에서 전분의 α-1, 6 결함을 절단할 수 있어 전분의 액화(liquefaction)공정시 고온성 α-아밀라아제와 동시에 사용 할 수 있는 새로운 내열성 분지절단형 효소이다. 이는 70∼80℃의 고온에서 가수분해 반응을 진행시킬 수 있으므로, 기질로 사용하는 탄수화물의 용해도가 증가하고, 기질이 가수분해되기 좋은 상태로 되어 가수분해 산물의 수율이 높으며, 고온에서 반응이 진행되므로 다른 세균의 활성을 억제시킴으로써 잡균의 오염을 방지하는 우수한 효과를 나타낸다.

Claims

Thermus 속 유래의 아미노 말단이 Ala-Pro-Gln-Asp-Asn-Ser-Leu-Xaa-Ile-Gly-Ala-(Ser)의 서열을 가지는 고온성 효소 풀루란아제(pullulanase).
제1항에 있어서, 더머스 칼도필러스 GK-24(Thermus caldophilus GK-24)로 부터 생산되는 것을 특징으로 하는 효소 풀루란아제.
제1항 도는 제2항에 있어서, 풀푸란, α,β-제한 덱스트린(α,β-limited dextrin), β-제한 덱스트린(β-limited dextrin), 가용성 녹말, 아밀로펙틴, 감자녹말 그리고 글리코겐을 가수분해하는 것을 특징으로 하는 효소 풀루란아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 분자량이 64 kDa인 것을 특징으로 하는 효소 풀루란아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH 5.0∼60에서 최대의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 효소 풀루란아제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 70∼80℃에서 최대의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 플루란아제.