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KR100196107B1 - 조직인자를 베이스로 하는 프로트롬빈시간 시약 및 그 제조방법 - Google Patents

조직인자를 베이스로 하는 프로트롬빈시간 시약 및 그 제조방법 Download PDF

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KR100196107B1
KR100196107B1 KR1019930701454A KR930701454A KR100196107B1 KR 100196107 B1 KR100196107 B1 KR 100196107B1 KR 1019930701454 A KR1019930701454 A KR 1019930701454A KR 930701454 A KR930701454 A KR 930701454A KR 100196107 B1 KR100196107 B1 KR 100196107B1
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tissue factor
phospholipid
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KR1019930701454A
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Inventor
마아틴 브라운 스콧트
Original Assignee
하워드 레이 소울
코르바스 인터내셔날 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 프로트롬빈시간 시약과 그 제조방법에 관한 것이며, 본 발명에 의한 프로트롬빈시간 시약은 리포좀의 인지질 이중층과 결합하여 이 이중층에 삽입된다.
리포좀 조성물은 외부 응고인자에 대한 최대의 응고활성 및 민감도를 제공하도록 조정될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
조직인자를 베이스로 하는 프로트롬빈시간 시약 및 그 제조방법
[기술분야]
본 발명은 정제 및 재구성된 천연 재조합의 인체조직인자(rTF)를 이용하는 프로트롬빈시간(PT)시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조직인자(TF)를 인지질 소포 또는 미셀(micelle)과 함께 재구성하여 조직인자를 베이스로 하는 PT시약을 생산하는 것에 관한 것이다. 이러한 시약으로 경구 항응고인자 요법 및 응고의 외부경로에 있어서의 결함을 특수하게 관찰할 수 있다.
[배경기술]
일반적으로, 리포좀은 액상의 공간을 포위하는 1개 또는 그 이상의 지질이중층으로 이루어지는 소포의 일반적인 카테고리의 하나이다. 이 카테고리 내에서는 단일 층상의 소포는 단일의 막 또는 지질 이중층으로 이루어지고, 다중층상의 소포는 다수의 동심막(또는 지질 이중층)으로 이루어진다. 리포좀은 통상 인지질로 만들어진다.
(Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467-508(1980)). 미셀은 리포좀과는 다른 것이다. 미셀은 세제와 같이 친수성 및 소수성을 모두 갖는 분자가 액상의 매체에 들어갔을 때 형성된다. 분자의 소수성 부분은 액상의 매체를 피하여 서로 응집한다. 가장 단순한 상태에서는 미셀은 구형을 이룬다.
그러나, 이들은 다양한 형상 및 크기의 응집체(이중층)를 형성할 수도 있다. 미셀은 내부가 액상이 아니고 소수성으로 이루어지는 점에서 리포좀과는 다른 것이다. 예를들면, 세제분자의 친수성의 머리부분은 물을 향해 외측으로 향하는 미셀표면을 이루고, 소수성의 꼬리부분은 다른 소수성 구조와 결합한다(David, B.D. and Dulbecco, R. Sterilization and Disinfection. Microbiology, 3rd Edition, p 1270, Harper Row(Davis B.D., et al., 1980) ; Mahler, H. R. and Cordes, E. H., Biological Chemistry Second Edition, Harper Row Publishers, pp. 712-714(1971)).
리포좀은 약물운반시스템으로 사용되어 왔다. 이로부터, 리포좀이 내부에 액상 공간을 포함할 수 있는 비교적 불투과성인 지질 이중층을 가지고 있어서 이 내부공간 내에 각종의 약물을 캡슐로 완전히 포위하는 방법을 제공한다는 것을 알았다(Szoka, supra, p. 468). 이러한 형태의 운반시스템의 중요한 특징은, 활성성분 약물이 목표지점에 도달하기 전에는 리포좀의 외부에 있는 액상의 매체에는 효용이 없다는 것이다.(Janoff et al., 미합중국 특허 제 4,880,636호 (1989)).
척추동물의 조직은 구연산 혈장에 가하여 재석회화되었을 때 응고시간이 매우 가속된다는 것을 알았다. 응집 프로테아제 캐스케이드를 활성화시키는 것으로 밝혀진 이 조직성분은 일반적으로 트롬보플라스틴 또는 조직인자(TF)라 칭한다.
트롬보플라스틴의 사용은 1935년 1단계 PT 시험에서 처음 설명되었다.(Quick, J. Biol. Chem., 109;73-74, 1935). 이 시험에서는 포유동물의 조직에서 추출한 트롬보플라스틴과 푸울(pool)시킨 정상인의 혈장의 희석액으로 작성한 표준곡선을 이용한다. 현재 이용되고 있는 이 시험은 행하기가 용이하며 자동화시킬 수 있다.
프로트롬빈시간(PT)시험은 응집실험실에서 가장 많이 행해지는 방법으로서, 이 시험을 변형시켜서 다양한 용도로 이용하고 있다.(White et al., Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman, et al., eds., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, pp. 1048-1060, 1987). 그중 한가지 용도는 응집의 외부 경로에 있어서의 결함을 평가하는 것이다(인자 Ⅶ,Ⅹ,V 및 프로트롬빈). 두번째 용도는 희귀성 정맥혈전증과 암 등의 질병에 대한 장기구강 항응고인자요법을 받아온 환자들을 관찰하는 것이다(Hirsh, J., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 12: 1-11, 1986). 세번째 용도는 간기능장애를 평가하는 것이다.
항응고인자요법의 치료범위는 출혈 및 혈전 합병증을 피하는 것에 기초를 두고있다. 구강항응인자요법을 관찰할때는 PT 시험에 의한 여러가지 다른 조건외에, 프로트롬빈시간을 2배 연장시키는 것이 장기치료에 가장 바람직하다(O'Reilly, Hemos t a sis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman, et al., eds., J. b. Lippencott Co., Philadelphia, pp. 1367-1372, 1987). 이 연장인자는 프로트롬빈 비(PR)로 정의하며, 환자 혈장의 PT를 정상인 혈장의 푸울의 PT로 나누어 계산한다. PR이 클수록 PT시약은 더욱 민감하게 된다. 항응고요법을 관찰하는 시약이 민감할수록 항응고인자 약물의 투여량이 적어지므로 유리하다. 이들의 투여량이 적어지면 출혈 합병증을 최소화시키면서 혈전색전증을 적절히 방어할 수 있다.
PT를 결정하는 몇가지 시약이 시판되고 있으며, 이 시판되고 있는 시약으로는 트롬보렐 S(Curtis Matheson Scientific, Inc., Yorba Linda, CA) 및 심플라스틴 (Organon Thknika Corp., Charlotte, NC). 이들 시약은 같은 환자의 플라즈마에 대하여 PT가 매우 다르게 나타나며, 트롬보렐 S 는 심플라스틴보다 긴 시간을 나타낸다. 심플라스틴 대신에 트롬보렐 S를 사용하여 PT를 관찰할 때 항응고인자 약물의 투여량이 낮으면 PT시간이 연장된다(즉 PR이 크다). 항응고인자요법 및 기타 상태를 관찰하는 데에는 보다 민감한 조직인자를 베이스로 하는 PT시약이 필요하다.
[발명의 개시]
본 발명은 매우 바람직한 PR을 가지는 민감한 시약을 제공한다.
본 발명은 인지질혼합물로 이루어지는 기질 이중층과 결합된 조직인자를 가지는 리포좀 조성물로 이루어지는 조직인자 시약과 이와같은 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 리포좀에 있는 인지질의 지질 이중층의 비는 얻어지는 조직인자 시약의 최대응고능을 제공하며, 따라서 외부 응고인자에 대한 시약의 민감도를 유리하게 평가할 수 있다.
다른 인자중에서, 본 발명은 본 발명의 조직인자 시약이 그 지질 이중층과 결합된 조직인자를 가지는 리포좀으로 이루어진다는 발견에 의거하여, 활성 프로코아귤런트 복합체로 된다는 것을 알아내었으며, 이 복합체는 프로효소인 인자 Ⅶ를 활성 응고 프로테아제인 인자 Ⅶa 로 변환시킬 수 있다. 용액내에 조직인자만 존재하거나 리포좀의 지질 이중층만을 형성하는 인지질 혼합물은 프로트롬빈시간 시약으로서의 활성이 없기 때문에 이와같은 발견은 놀랄만한 것이다. 본 발명자는 또한, 글리신을 더 포함하는 본 발명의 조성물은 인공의 인체 혈장으로 설계된 시판용의 대조물을 상당하는 정상인의 혈장에 대하여 프로트롬빈시간을 부여함으로써 PT방법에 있어서 상당히 향상된 효능을 나타낸다는 것을 알아내었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 프로트롬빈시간을 결정하는데 유용한 리포좀 조성물로 이루어지는 조직인자 시약에 관한 것이며, 상기 리포좀 조성물은 바람직하게는 저온보존제와 글리신을 포함하는 버터에서 리포좀(또는 인지질 소포)의 지질 이중층과 결합된 조직인자로 이루어진다. 다른 특징에 있어서, 본 발명은 이와같은 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 특징에 있어서, 리포좀의 제조방법은 임계 미셀농도가 상당히 큰 세재를 이용하며, 이 세제는 고도로 정제된 인지질을 용해시킨다. 특히 바람직한 세제는 양성(兩性)이온 세제인 3- [(3-콜아미도프로필)디메틸아모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS)이다. 조직인자는 마찬가지로 세제에 용해되는 것으로서, 캐리어 단백질이 첨가되면 세제는 제거된다. 이 세제는 투석, 수지처리 또는 세제를 함유하지 않는 용액에서의 희석 등과 같은 종래의 방법에 의하여 용이하게 제거될 수 있다. 주위용액의 세제농도가 낮아지는 즉시 지질의 이중층과 결합하여 이 이중층에 삽입되는 조직인자를 가지는 리포좀이 형성된다.
[용어의 정의]
BHT 는 부티레이티드 히드록시톨루엔, CHAPS는 3- [(3-콜아미도프로필)-디메틸아모니오]-1-프로판술포네이트, MOPS는 3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산, OTG는 옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드, 인지질은 글리세롤(가장 일반적임)또는 스핀고신으로 부터 유도된 유기 분자로서, 글리세롤(또는 포스포글리세라이드)로부터 유도되는 인지질은 글리세롤을 기본골격으로 글리세롤의 제 1 및 제 2탄소로 에스테르화된 2개의 지방산 사슬과 제 3탄소로 에스테르화된 인산으로 이루어지고, 선택적으로 알콜기가 인산에 에스테르화 되며, PC는 포스파티딜 콜린으로서, 콜린으로부터 유도되는 알콜기를 가지는 비충전된 포스포글리세라이드는 인산으로 에스테르화되고, PE는 포스파티딜 에탄올아민으로서, 에탄올아민으로부터 유도되는 알콜기를 가지는 양으로 충전된 포스포글리세라이드는 인산으로 에스테르화되고, PG는 포스파티딜 글리세롤로서, 글리세롤로부터 유도되는 알콜기를 가지는 음으로 충전된 포스포글리세라이드는 인산으로 에스테르화되고, PS는 세린으로 부터 유도되는 알콜기를 가지는 음으로 충전된 포스포글리세라이드는 인산으로 에스테르화되고, 프로트롬빈시간은 PT로 약칭하는 것으로서, 트롬보플라스틴 또는 프로트롬빈 시간 시약의 첨가와, 혈소판이 부족한 구연산 혈장에서의 응고의 개시와의 사이의 시간간격을 의미하고, 프로트롬빈 비(比)는 PR로 약칭하는 것으로서, 각 개인의 혈장(정상 또는 비정상)의 프로트롬빈시간을 정상인의 혈장의 푸울의 프로트롬빈시간으로 나눈값. rTF는 재조합 조직인자. TBS는 염화나트륨 150mm을 함유하는 20mM 트리스 (pH 7.5)를 나타낸다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 PT 시약, rTF PT 시약 및 트롬보렐 S의 프로트롬빈 비를 인자활성도 백분율의 함수로서 나타낸 도면.
제2도는 구강 항응고인자 요법을 받고 있는 환자로 부터의 혈장에 대한 PT의 상대적인 민감도를 나타낸 도면.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
1. 바람직한 조직인자 시약 조성물
본 발명은 리포좀의 지질 이중층과 결합된 조직인자를 가지는 리포좀으로 이루어지는 조직인자를 제공하며, 이 조직인자는 지질 이중층에 삽입된다.
리포좀의 지질 이중층은 인지질, 바람직하게는 포스포글리세라이드로 이루어진다.
또한 본 발명의 다른 특징에 따르면, 조직인자가 미셀에 삽입되도록 인지질 미셀과 결합된 조직인자를 가지는 인지질 미셀조성물로 이루어지는 조직인자 시약을 제공한다.
본 발명의 조직인자 시약은 인지질 혼합물 1mg 에 대하여 약 0.1μg-약3μg의 천연 또는 재조합 조직인자로 이루어진다. 인지질 혼합물에 대한 조직인자의 비는 얻어지는 조직인자 시약의 민감도를 결정하게 된다. 따라서, 인지질 혼합물 1mg에 대하여 약 1-2μg의 조직인자를 사용하면 ISI(International Sensitivity Index)가 약 0.1인 조직인자 시약에 적합하게 된다. 인지질 혼합물 1mg에 대하여 약 0.25-약 0.5μg의 조직인자를 사용하면 ISI가 약 1.6-2.0인 조직인자의 조제에 적합하게 된다. 조직인자는 약 0.5-약 1.5%(w/v)의 글리신을 부가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 경우에 따라서, 조직인자 시약을 냉동건조하여 보관하고 차후에 재구성하는데 사용할 수 있으며, 이 시약은 저온보존제, 바람직하게는 탄수화물 보존제, 더욱 바람직하게는 트레할로스를 함유한다.
[A. 바람직한 인지질 혼합물]
본 발명의 리포좀에 사용하기 적합한 인지질 은 12-20개의 탄소원자를 가지는 지방산을 함유하는 것을 포함하고, 상기 지방산은 포화 또는 불포화될 수 있다. 본 발명에 따른 용도에 바람직한 인지질로서는 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티일 에탄올아민(PE), 포스파티딜 글리세롤(PG), 포스파티딜 세린(PS)이 있다. 이들 인지질은 천연자원으로부터 얻어지며, 이와같은 인지질은 각종 지방산을 가지는 분자로 이루어 진다. 다양한 자원으로부터 얻어지는 인지질로 이루어지는 인지질 혼합물을 사용할수 있다, 예를들면, PC, PG 및 PE는 난황으로부터 얻어지고 PS는 동물의 뇌 또는 척수로부터 얻어진다. 이들 인지질은 합성자원으로 부터도 얻을 수 있다.
각종 인지질(PL)이 다양한 비로 혼합된 PL 혼합물을 사용할수 있다. 적합한 PL혼합물은(a)약 20-95mol%의 PC, (b)약 2.5-5mol%의PE, (c)약2.5-50mol%의 PS, 및 (d)약 0-40mol%의 PG로 이루어진다. 바람직하게는 PL혼합물은 약 5-15mol%의 PE, 약 3-20mol%의 PS, 약 10-25mol%의 PG 및 잔량의 PC로 이루어지고, 바람직하게는 PC함량은 약 50-90mol%이다. 특히 바람직하게는 PL혼합물은 약 8-12mol%의 PE, 약 3-10mol%의 PS, 약 14-20mol% 의 PG 및 약 58-75mol%의 PD로 이루어진다.
인지질은 다양한 비로 사용될 수 있지만, 본 발명자는 인지질 혼합물에 각각의 인지질이 특정한 양으로 함유될 때 조직인자시약이 유리한 활성 및 활성안정도를 가진 다는 것을 알았다. 각각의 인지질이 다양한 비로 사용될 수 있지만, 얻어지는 조직인자 시약의 유리한 활성 및 안정도를 얻기 위해서는 총 인지질 조성물에 PS가 특정한 양으로 존재하여야 한다. 바람직하게 존재하는 PS의 양은 어느 정도까지는 PL혼합물의 잔량의 성분과 총 PL 혼합물의 일부로서 존재하는 이들의 상대적인 양에 의해 결정된다. 예를 들면, 다량의 PG와 음으로 충전된 다른 인지지질을 약 10%이상의 양으로 사용하면 약 3%이하의 소량의 PS를 사용할 수 있다. 그러나, PL혼합물에 PS가 소량으로 사용되면 PE를 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%정도 포함시키는 것이 바람직하다.
인지질은 적당한 비로 용이하게 결합되어 본 발명의 조직인자 시약을 제조하는데 사용되는 PL혼합물이 제조된다. 바람직한 일실시예에 있어서, PL혼합물은 PC, PG, PE, PS의 mol비가 67:16:10:7로 이루어질 수 있다.
다른 바람직한 실시예에 있어서, PL혼합물은 PC, PG, PE, PS의 mol비가 7.5:0:1:1로 이루어질수 있다.
[B. 조직인자]
천연의 조직인자 또는 재조합 조직인자를 본 발명의 조직인자 시약에 사용할 수 있다. 각종의 종(種)으로부터 얻어지는 천연 또는 재조합 조직인자를 사용할 수 있다.
천연의 조직인자는 종래의 방법에 의해 분리할 수 있다(참고예 : Broze, Jr., G. J., et al., J. Biol. Chem, 260(20): 10917-10920(1985);Morrissey, J. H., et al., Thrombosis Reserch 50: 481-493(1988)).
재조합 조직인자는 이 기술분야에 공지된 방법 및 단백질 합성시스템을 이용한 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다(참고 : Morrissey, J. H., et al., Cell 50:129-135(1987) ; Summers, M. D., A Mannual of methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin 1555(1987)).
조직인자는 면역 친화 크로마토그래피 또는 특정한 단백질을 다른 단백질 오염물로 부터 분리하기 위한 기타의 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
[C. 바람직한 저온 보존제]
저온 보존은 취급하기 어려운 물질을 함유하는 액체가 냉동 및 탈수될 때 이 물질의 삽입체를 그대로 보존하는 것이다. 탄수화물을 리포좀 삽입체의 냉동 및 그 후속의 냉동건조시에 저온 보존제로거 사용하는 것이 보고되어 있다.(Racker, E., Membrane Biol., 10:221-235(1972): Sreter, F. et al., Biochem. Biophys. Acta., 203:254-257(1970); Crowe et al., Biochem. J., 242:1-10(1987):Crowe et al., Biochem. Biophys. Acta., 987:397-384(1988)).
조직인자 시약을 후에 사용하기 위해 저장하기 전에 냉동 건조시키는 경우, 냉동건조 및 후속의 재탈수시에 리포좀 조성물 중의 리포좀 삽입체를 보호하기 위하여 저온 보존제로서 단일 또는 복수와 탄수화물을 포함시키는 것이 바람직하다.
바람직한 탄수화물 저온보존제로서는 트레할로스, 말토스, 락토스, 글루코스, 만니톨이 있다. 본발명의 바람직한 특징에 따르면, 트레할로스는 냉동건조 전에 본 발명의 조직인자 시약의 제조에 사용되는 버퍼수용액에 함유되고, 그 농도범위는 약 50mM-250mM이 바람직하다.
[D. 글리신]
본 발명의 특히 바람직한 특징에 따르면, 글리신은 조직인자 시약의 첨가성분으로서 포함되고, 이들 조직인자 시약에 글리신이 포함되면 인공의 인체혈장으로 설계된 시판되는 대조용의 것에 상당하는 정상인의 혈장에 대한 프로트롬빈시간을 제공하는 PT방법에 있어서 상당히 향상된 효능을 나타내는 시약이 제조도이다. 따라서, 이들 바람직한 조직인자시약은 또한 약 0.5-1.5%(w/v)의 글리신, 특히 바람직하게는 약 0.6-1.2%의 글리신을 포함한다.
[2. 조직인자시약의 제조]
시판되는 유기용제로부터 얻을 수 있는 인지질을 적당한 비로 함께 혼합하여 특정한 조성물을 형성한다. 다음에, 인지질의 지방산부분의 알킬사슬 과산화를 줄이기 위하여 산화방지제를 가한다. 유기용제가 존재하면 증발에 의해 제거한다. 바람직한 산화방지제로서는 낙산 히드록시 톨루엔이 있다. 산화방지제는 약 0.1중량%로 사용하는 것이 바람직하다.
다음에, 건조(증발)된 인지질 혼합물을 세제수용액으로 분해시킨다.
적합한 세제로서는 CMC(critical micelle concentration)가 비교적 높은 것을 포함한다.
(Womack et al., Biochim. Biophys. Acta, 733;210(1983)). 이러한 세제는 CMC가 약 2mM이상인 세제를 포함한다. 바람직하게는, 세제의 CMC는 약 2-25mM 이다.
이러한 바람직한 세제로서는 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸-아모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS)와 옥틸 베타-D-글루코피라노사이드, 옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드 등과 같은 알킬글루코피라노사이드가 있다. 선택적으로, 세제용액은 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분으로서는 HEPES, 트리스, 인산염 등의 버퍼염과 NaCl, KCl 등의 기타 각종염과 트레할로스, 말토스, 글루코스등의 탄수화물 저온 보존제와, 글리신이 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 세제용액은 20mM의 트리스, pH7.5, 150mM의 NaCl, (TBS)함유 100mM의 CHAPS, 150mM의 트레 할로스 및 0.8%의 글리신으로 이루어진다. 본 바람직한 실시예에 따르면, 인지질이 이 용액에 재용해되어 최종농도가 약 20㎎/㎖로 된다.
조직인자 및 캐리어 단백질이 재용해된 인지질과 결합하여 얻어지는 혼합물의 체적을 버퍼를 사용하여 상기와 같이 조정하고, 저온 보존제(가장바람직하게는 트레할로스)와 글리신은 함유하지만 세제는 함유하지 않는 것이 바람직하다. 상기와 바와 같이, 본 발명의 조직인자 시약의 제조에 사용되는 조직인자는 천연 또는 제조합 자원으로부터 얻을수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 재조합 조직인자(rTF)가 사용된다. 조직인자를 가한후 소위 감마 글로불린 등의 캐리어 단백질을 가하고, 버퍼를 충분히 가아혀 조직 인자의 최종농도를 10㎍/㎖, 소의 감마글로불린을 1㎍/㎖, 인지질을 4㎍/㎖, 세제를 20mM로 조정한다. 적합한 버퍼로는 150mM의 트레할로스와 0.8%의 글리신을 함유하는 TBS가 있다. 얻어진 투명 무색의 용액을 상호 용해시키기 위하여 와동(渦動)이나 초음파 분해는 필요하지 않다.
지질-조직인자 혼합물중의 세제는 지질 이중층과 결합하여 이 이중층에 삽입된 조직인자를 가지는 안정된 리포좀 조성물을 얻는 여러 가지 방법에 의해 제거 될 수 있다. 세제를 제거하는 적합한 방법으로서는 투석, 접선류 투석여과, 교차류 중공(中空)섬유여과, 소수성 크로마토그래피 수지로의 처리 및 간단한 희석이 있다.
인지질-조직인자 혼합물로부터 세제를 제거하는 바람직한 한가지 방법으로서는, 150mM의 트레할로스, 0.8%의 글리신 및 0.05%의 NaN3를 함유하는 TBS 등의 버퍼에 대하여 투석막 배관에 실온에서 최소한 30시간 동안 투석하여 세제를 제거하는 방법이 있다. 세제를 제거하는 다른 바람직한 방법은 수지처리를 이용하는 것이다. 적합한 수지로서는 엠버라이트 XAD-2(Rohn and Hass Co., 펜실바니아주 필라델피아 소재) 또는 바이오-비드 SM-2(BioRad, 캘리포니아주 이치몬드 소재)등의 소수성 크로마토 그래피 수지가 있다. 이 수지는 인지질-조직인자 용액과 직접 접촉시키거나, 투성막에 위해 분리함으로써 세제를 제거하는데 사용될 수 있다. 인지질-조직인자용액으로부터 세제가 제거되는 속도는 용액중의 세제와 크로마토그리피 수지 비드와의 중량비에 의존한다. 세제제거단계에서 얻어진 리포좀 용액을 5mM의 CaCl2로 한다.
바람직한 일실시예에 있어서 완전 활성인 조직인자를 함유하는 리포좀 용액을 사용하기전에 50mM의 트리스, pH7.5의 트레할로스, 0.8%의 글리신 및 10-15mM의 CaCl2에 희석한다. 또는 희석된 시약을 냉동건조하여 프로트롬빈시간 시약으로서 효능특성을 장기간 보존하며, 후에 사용하기 전에 물에 현탁시켜 재구성시킬 수 있다.
세제제거의 다른 바람직한 실시예에서는 투석이나 수지처리를 사용하지 않고 활성 TE시약을 제조한다. 이 방법에 따르면, 세제에 용해되는 TE함유 인지질을 세제가 없는 버퍼에 희석시켜 TE를 함유하는 혼합 미셀을 제조하고, 이 TE는 CdCl2에 의해 완전히 활성화 될 수 있다. 본 발명의 이와같은 특징에 따르면, 인지질이 세제를 함유하는 버퍼, 바람직하게는 알킬 글루코 피라노사이드에 20㎎/㎖로 용해된다.
적합한 버퍼-세테용액은 50mm의 옥틸 베타-D-티오글로코피라노사이드(OTG)와 150mM의 NaCl을 함유하는 20mM의 HEPES(pH6)로 이루어진다. 다음에, 캐리어 단백질, TE, CdCl2를 첨가하여 이 희석된 혼합물을 세제를 함유하지 않는 버퍼에 더욱 희석시켜서, 최종농도를 TE는 10㎍/㎖, 캐리어 단백질(소의 감마글로부린)은 1㎎/㎖, CdCl2는 5mM, 인지질은 4㎎/㎖, OTG는 10mM로 한다.
시약을 상기한 바와같이 냉동건조하여 저장하거나 사용하기 전에 희석할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 의하면, 이 시약은 기계적인 수단에 의한 방법, 유기용제의 제거, 세제 및 크기변환(본 발명이 참고로 하는 문헌 : Lichtenberg, D. and BarenholZ, Y., Metyods of Biochemical Analysis, 33: 337-462(1988))에 의해 인지질로부터 세제-인지질 혼합미셀과 소포를 제조하는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 다음에 본 발명의 각 예를 설명하며, 이들 예는 각각 일련의 실험결과를 기술한 것이다. 본 발명에 관한 다음의 예는 예시적인 것이여, 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 또한 이전에 또는 이후에 설명하는 본 발명의 변형에는 이 기술분야에 술력된 자에게는 본 발명의 청구의 범위에 정의한 바와같은 범위내에서 가능하게 된다.
[실시예]
[실시예 1]
[항-rTF 친화성 겔의 제조]
TF, TF8-5G9에 대한 단클론 항체는 에징톤(Dr. T. S. Edgington)으로부터 구하고, 모리시(Morrissery)의 방법(J. H. et al., Thrombosis Reserch, 52:247-261(1988))에 의해 제조하였다. TF8-5G9 복수증(腹水症)을 문헌(Harlow, E and Lane, D., Antibodies: A Labortory Manual, pp 304-3052, Cold Spring harbor Laboratory(1988))에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 DEAE 크로마토그래피에 의해 IgG로 정제하였다.
정제된 항테를 애피젤(Affigel 10)(Biorad Laboratories, 캘리포니아주 리치몬드 소재)에 공유결합시켜서 면역친화수지를 제조하였다. 이와같이 하여, 200㎎의 DEAE로 정제된 단클론 항체를 0.1M의 MOPS(pH7.5)로 투석하여 10㎎/㎖의 용액을 얻었다. 이 항체용액중 20㎖를 애피젤 10-20㎖에 가하였다. 다음에, 이 혼합물을 하룻밤동안 인큐베이터에 2-8℃로 보관하고, 흔들어서 혼합시켰다.
16-28시간후에 0.1M 에탄올아민(pH8)20㎖를 가하여 미반응그룹과 결합시켜서 결합반응을 종결시켰다. 수지로부터 액체를 제거하고 0.1M MOPS(pH7.5)로 세척하고, 면역친화수지를 2-8℃로 저장하였다. 결합효율은 95%이상이었다.
[실시예 2]
[재조합 조직인자(rTF)의 제조]
재조합 조직인자(rTF)를 다음의 방법에 의해 세포용해물로부터 정제하였다. rTF를 생성하는 세포를 TBS로 세척하고, 0.25%의 트리톤 X100, 10㎍/㎖의 콩의 트립신 억제제, 1mM의 EDTA를 함유하는 TBS에 2 ×107/㎖로 현탁시켰다. 4℃에서 30분동안 혼합한 후, 약 5000 × g 로 20분동안 원심분리하여 세포찌꺼기를 제거하였다.
정제한 용해물을 TBS로 2.5배 희석하여 트리톤 농도를 0.1%로 감소시킨 후, TF에 대한 공유결합된 단클론 항체를 함유하는 면역친화수지(예 1에서 제조)를 통과시켰다. 수지베드를 먼저 베드용적의 2-3배의 TBS + 0.1%의 트리톤 X100으로, 그 후 베드용적의 2-3배의 20mM 트리스, pH7.5, 0.5M NaCl, 0.1%트리톤 X100으로, 마지막으로 베드용적의 2-3배의 0.5M NaCl, 0.1%트리톤 X100으로 세척하였다. 경계부분의 단백질을 0.1M 글리신, pH2.5, 0.1%트리톤 X100을 포함하는 수지로부터 용출시켰다. 버퍼를 글리신으로 바꾼 후에 수집한 파편을 적당한 부피의 1M 트리스, pH8로 즉시 중화시켰다. 칼럼유출물의 pH의 변하는 지점 주변의 세포 파편에서 rTF를 발견하였다.
rTF를 함유하는 파편을 푸울시키고, 20mM트리스, pH8, 0.1%트리톤 X100에 대하여 투석한 후, rTF를 소량의 DEAE 트리스아크릴콜럼(IBF Biotechniques, 메릴랜드주, 콜롬비아 소재)에 결합시켜서 농축하였다. 10mM CHAPS를 함유하는 배드용적의 최소한 10배의 트리스로 pH8에서 수지베드를 세척하여 트리톤 X100을 CHAPS로 치환하였다. rTF를 20mM트리스중의 0.5M NaCl, pH8, 10mM CHAPS에서 단일공정으로 용출시켰다.
[실시예 3]
[인지질의 제조]
밀봉유리 앰풀에 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아미(PE), 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜글리세롤(PG)을 시판(Avanti Polar Lipids, 알라바마주 알라바스터 소재, 또는 Calbiochem Corporation, 캘리포니아주 라졸라 소재)되는 클로로 포름용액으로부터 얻어서 -20℃에서 N2하에 보관하였다.
캘바이오켐(Calbiochem)으로부터 CHAPS, 기타 세제 및 소의 감마글로불린을 구입하였다. 트리스염과 글리신을 구입(BioRad Laboratories, 캘리포니아주 리치몬트 소재)하였다. 다른 화합물질과 생화학 물질도 구입(St. Louis, 미주리주 소재)하였다.
다음과 같은 방법으로 인지질을 제조하여 재용해시켰다. PC, PE, PS 및 PG를 실온으로 가온하고 적당한 튜브 또는 플라스크내에서 특정한 mol비로 결합시켰다.
항산화제인 BHT(butyated hydroxy-toluene)을 클로로포름에 용해하고 0.1%의 중량비(BHT : 인지질 총량)로 인지질 혼합물에 가하였다. 드라이 질소 기류하에, 또는 로타리 증발장치에서 감압하에 유기용제를 증발시켜서 제거하였다. 잔여의 유기용제는 진공펌프로 10㎛이하의 압력에서 실온에서 1시간 더 펌핑하여 제거하였다.
인지질 혼합물 100mM CHAPS를 함유하는 20mM 트리스, pH7.5, 150mM NaCl(TBS)에 20㎎/㎖로 재용해하였다.
[실시예 4]
[rTF프로트롬빈시간(rTF PT)의 제조]
[투석에 의한 시약]
인지질을 PC, PE, PS, PG의 특정한 mol비로 결합한 후, 예3에서와 같이 재용해하였다. 재용해된 인지질을 면역친화 정제된 rTF(예2에서 제조) 및 소의 감마글로불린과 결합시켰다. 150mM 트레할로스를 함유하는 TBS를 더 가하여 최종농도를 인지질 총량은 4㎎/㎖, rTF는 10㎍/㎖, 소의 감마글로불린은 1㎎/㎖, CHAPS는 20mM로 하였다. 이 투명무색의 용액을 투석막 배관(SpectraporeR, Spectrum Medical Industries, 절단분자량 12,000~14,000)에 놓고 실온에서 150mM의 트레할로스 및 0.05%의 NaN3를 함유하는 TBS에 대하여 최소한 30시간 동안 투석하였다. 투석 후에 투설물의 부피를 측정하고 필요에 따라 투석 버퍼를 사용하여 다시, 원래의 부피로 조정하였다. 최종농도가 5mM로 되도록 CdCl2를 가하고 이 용액을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이터에 보관하였다.
이 용액을 드라이아이스 상에서 냉동시킨 후, -40℃로 개시되고 실온으로 종결되는 48시간 동안의 사이클로 냉동 건조시켰다. 다음에, 리포좀을 재구성하여 0.1M 트리스, pH7.5, 150mM 트레할로스의 작업 농도로 하여, 약 1~2㎍/㎖의 rTF, 약 400~800㎍/㎖의 인지질, 50~100㎍/㎖의 소의 감마글로불린을 함유하는 용액을 얻었다.
상기와 같이, rTF RT 시약을 사용하여 트롬보스크린 대조용 혈장(Curtin Matheson scientific, 캘리포니아주 요바 린다 소재)과 정상인의 혈장 푸울의 프로트롬빈시간을 측정하였다. 즉, 100μl의 혈장과 100μ1의 희석된 리포좀을 코아귤로미터의 샘플 웰(well)에 놓고 기구를 사용하여 20mM의 CaCl2를 100μ1가 하여 프로트롬빈시간을 자동적으로 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
다양한 비로 구성된 인지질을 사용하여 투석에 의해 제조된 PT 시약의 프로트롬빈시간
a 인지질의 비는 각각 포스파티딜콜린:포스파티딜에탄올아민:포사스티딜 세린:포스파티딜글리세롤의 mol비의표시
b 정상인의 푸울(NHP)은 10명의 정상인으로부터 구해 푸울시킨 혈장으로 이루어지고 소량배수로 나누어 즉시 냉동시킨 것
c 레벨 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ은 트롬보스크린 대조용 혈장(Curtin Matheson Scientific, 캘리포니아주 요바 린다 소재)이고 구강 항응고인자용법을 받고 있는 레벨 즉 강도에 따라 3단계로 구분한 환자에 대하여 시뮬레이션하기 위해 설정한 것
d 이 시간은 300초 이상
이 데이터로부터, (1)rTF PT 시약중에서 광범위한 mol비의 인지질은 rTF를 통한 응고 메카니즘의 개시를 가능하게 하고, (2) 이 시약은 rTF유도 응고활성에 대하여 PS또는 PG등의 네트 음전하를 운반하는 인지질 조성물을 필요로 하고, 또 (3)이시약은 PS의 농도가 현저히 감소되면 PE 및 PG를 모두 필요로 한다는 것을 알수 있다.
표1에 사용된 대조용 혈장은 구강항응고인자 요법을 받고 있는 환자의 혈장을 시뮬레이션하기 위한 것이다. 이로부터 얻어진 프로트롬빈 시간을 응고인자중 어느것도 결함을 없었지만, 일부 인자의 활성도가 저하되었다.
rTF PT시약이 외부응고경로(인자Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ)에 포함된 이루 인자의 양이 감소함에 따라 반응하는 양상의 예가 제1도에 도시되어 있다. 프로트롬빈 시간(PT)은 다음과같이 측정하였다. 정상인의 혈장 푸울을 0.1M NaCl로 1:2, 1:4, 1:10, 1:20 및 1:40으로 희석하여 각각50, 25, 10, 5 및 2.5%의 인자활성도를 나타내도록 하였다.
응고인자가 부족한 혈장 샘플(트롬보스크린, curtis Matheson Scientific, Inc.)을 재탈수시키고, 희석하지 않고 사용하였다. 여기서 사용된 rTF PT시약은 인지질비가 10:1:1(PC:PE:PS)이고10mM CaCl를 함유한다. 트롬보렐S(Berhing Diagnostics, 뉴저지주 소머빌리소재)를 재탈수 하고 사용방법에 따라 처리하였다. 희석된 정상인 혈장(NHP)100μ1와 응고인자가 부족한 혈장100μl를 코아귤로미터 샘플에 놓았다.
기구를 사용하여 PT시약(200μl)을 가하고 PT자동적으로 측정하였다. 응고인자가 부족한 PT를 희석하지않은 NHP에서 얻는 PT로 나누어 프로트롬빈 비(PR)를 계산하고 NHP에서 얻은 PT로 나누어 프로트롬빈 비(PR)를 계산하고 NHP에 의해 공급된 인자의 백분율에 대하여 도시하였다.
제1도의 데이터로부터, rTF PT시약을 사용함으로써 시험한 모든 혈장희석액에 의한 PR이 높다는 것을 알 수 있다. 동일한 정상인 혈장 푸울 희석액에서 다른 PT시약보다 높은 PR시약은 더 민감한 시약이라고 말한다. 따라서 rTF PT시약은 시험된 특정한 응고인자의 소비에 대하여 트롬보렐 S보다 더 민감하다.
[실시예 5]
[rTF 프로트롬빈시간(rTF PT)의 제조]
[투석하지 않은 시약]
인지질을 다음과 같이 제조하여 재용해시켰다. PC, PE 및 PS를 실온으로 가온하고 적당한 튜브 또는 플라스크에서 PC, PE 및 PS의 몰비7.5:1:1로 결합시켰다. 황산화제인 BHT(butyrated hydroxytoluene)을 클로로포름에 용해시키고 중량비 0.1%(BHT : 인지질 총량)에서 인지질의 혼합물에 가하였다. 드라이 질소의 기류하에, 또는 로타리 증발기에서 감압하여 증발에 의해 유기용제를 제거하였다.
잔여의 유기용제는 진공펌프를 이용하여 10㎛이하의 압력에서 실온으로 1시간동안 펌핑하여 제거하였다.
인지질 혼합물을 20mM HEPES(pH6)증의 50mM옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드(OTG), 150mM NaCl에 재용해하여 최종 농도를 4㎎/㎖로 하였다. 예2로부터 rTF와 소의 감마글로블린을 재용해된 인지질과 혼합하였다. 20mM HEPE S ( pH6), 150mM NaCl을 가하여 최종농도를 rTF는 10㎍/㎖, 소의 감마글로블린 1㎎/㎖, 인지질은 4㎎/㎖, OTG는 10mM로 하였다. CaCl를 가하여 최종농도를 5mM로하여 활성화시켯다. rTF, OTG 및 인지질로 이루어지는 상기와 같이 얻어진 혼합미셀을 20mM HEPES, pH6, 150mM NaCl로 희석하여 0.5-1㎍/㎖의 rTF, 500-700㎍/㎖의 인지질, 25-50㎍/㎖의 소의 감마글로블린을 함유하는 용액을 제조하여 rTF PT시약을 얻었다.
본 예에서의 이 시약을 트롬보스크린 대조용 혈장과 정상인 혈장푸울의 PT를 측정하는데 사용하였다. 대조용 혈장은 활성도가 각기 다른 응고인자 Ⅱ, Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ를 함유하는 인공혈방으로 제조되었다. 대조Ⅰ은 거의 정상인 활성도 레벨을 나타내고, 대조 Ⅱ는 중간레벨을 나타내고, 대조Ⅲ은 가장 낮은 레벨을 나타낸다. 대조Ⅰ의 PT가 가장 짧고 대조Ⅲ의 PT가 가장 길게 될 것으로 판단된다. 이 결과를 표 2에 나타낸다.
a 정상인 혈장과 트름보스크린 대조용 혈장은 표 1의 각주에 기재되어 있음.
구강 항응고요법을 받고있는 환자의 혈장을 사용하여 본 rTF PT 시약과 시판되는 다른 PT시약에 대하여 그 민감도를 비교하였다. 시판되는 시약은 트럼보렐S(Berhing Diagnostics, 뉴저지주 소머빌리소재)와 심플라스틴(Organon Teknika Corpo r ation, 노스캘롤라이나 칼로테소재)이었다. 정상인과 구강항응고요법을 받고 있는 환자로부터 혈장 샘풀은 지역병원에서 냉동상태로 구하였다.
각 3개의 PT시약을 사용하여 각 혈장 샘플의 프로트롬빈시간을 측정하였다. 즉, 100μl의 rTF PT시약을 코아귤로미터의 샘플 웰에 놓았다. 기구를 사용하여 100μl의 20mM CaCl를 가하고 프로트롬빈 시간을 자동적으로 측정하였다. 트롬보렐S와 심플라스틴에 대하여 100μl의 혈장을 샘플웰에 놓고 기구를 이용하여 PT시약을 200μl가하였다. rTF PT시약과 심플라스틴을 이용하여 얻어진 각 환자의 샘플의 프로트롬빈시간의대수치를 구하여 트롬보렐 S를 이용한 것에 대하여 도시하였다. 제2도의 데이터로부터, rTF PT시약과 트롬보렐S에 대하여 경사도가 0.81인 것을 알 수 있다. 경사도 1.0은 2개의 PT시약의 성능이 동일한 것을 나타낸다. 즉, rTF PT시약은 트롬보렐S보다 민감도가 약 20%더 크다. 그러나, 심플라스틴과 트롬보렐S를 비교한 그래프에서 구한 선의 경사도는 1.62이며, 이는 심플라스틴의 트롬보렐S보다 민감도가 훨씬 낮다는 것을 뜻한다. 상기 데이터로부터, rTF PT의 시약이 응고인자 활성도의 감소에 민감하고 이 민감도는 실제 및 시뮬레이션한 환자의 혈장에서 모두 확인된다는 표 2의 결과를 뒷받침한다.
[실시예 6]
[rTF 프로트롬빈시간의 제조]
[투석여과에 의한 시약]
mol 비 7.5:1:1(PC:PE:PS)로 결합된 인지질을 건조시켜 유기용제를 제거한 후, 예3에서와 같이 재용해시켰다. 100mM CHAPS를 함유하는 TBS 중에 15㎎/㎖로 재용해된 인지질을 면역친화 정제된rTF(예 2에서 제조) 및 소의 감마글로불린과 결합시켰다. 150mM트레할로스를 함유하는 TBS를 더 첨가하여 최종농도를 인지질은 4㎎/㎖, rTF 는 10㎍/㎖, 소의 감마글로불린은 1㎎/㎖, CHAPS는 20mM로 하였다.
피로스타트 또는 울트라스타트 필터(Ssrtorius Corp., 뉴욕주 보헤미아 소재, 절단분자량 20,000)와 투석 버퍼로스 150mM트레할로스를 함유하는 TBS를 사용하여, 접선류 투석여과에 의해 세제(CHAPS)를 제거하였다.
장치에 10배 부피의 투석 버퍼를 통과시켜서 약95~100%의 CHAPS를 제거할 수 있다. 투석 여과후에 투석물의 부피를 측정하고, 다시 필요에 따라 150mM 트레할로스와 0.05% NaN3를 함유하는 TBS를 사용하여 원래의 부피로 조정하였다. CdCl를 가하여 최종농도를 5mM로 하고, 이 용액을 37℃에서 2시간동안 인큐베이터에 보관하였다.
이 용액은 드라이아이스 상에서 냉동시킨 후 -40℃로 개선하고 실온으로 종결하는 48시간 동안의 사이클을 이용하여 냉동건조시킬 수 있다. 얻어진 시약에 0.1M트리스, pH7.5, 150mM의 트레할로스를 첨가하여 작업농도를 재구성하여, 약 1-2㎍/㎖의 rTF, DIR 400-800㎍/㎖의 인지질, 50-100㎍/㎖의 소의 감마글로불린을 함유하는 용액을 얻을 수 있다. 이 시약의 효능은 표Ⅱ에서와 유사하다.
[실시예 7]
[XAD-수지의 첨가에 의한 rTF 프로트롬빈시간 시약의 제조]
인지질을 몰비 67:16:10:7(PC:PE:PS)로 결합하고, 건조시켜 유기용제를 제거하고, 예3에서와 같이 재용해시켰다. 100mM CHAPS 와 0.8%글리신을 함유하는 TBS 중에 15㎎/㎖로 재용해된 인지질을 면역친화 정제된 rTF(예2에서 제조) 및 소의 감마글로불린과 결합시켰다. 150mM의 트레할로스와 0.8%의 글리신을 함유하는 TBS를 더 첨가하여 최종농도를 인지질은 3㎎/㎖, rTF는 4.5㎍/㎖, 소의 감마글로불린은 1㎎/㎖, CHAPS는 20mM로 하였다.
앰버라이트 XAD-2(Rohm and Hass Co.)또는 바오이-비드 SM-2(BioRad)등과 같은 소수성 크로마토그래피 수지는 인지질 용액과 집접 접촉시키거나 투석막에 의해 분리함으로써 세제(CHAPS)를 제거하는데 사용될 수 있다. 제거속도는 용액중의 세제와 크로마토그래피 수지비드의 중량비에 비례한다. 실제로 제거속도는 가해진 수지량과 첨가속도에 비례한다. 세제를 전부 제거하는데 필요한 양은 수지(시판품)의 용량과 제거될 세제의 총 질량으로부터 구한다. 특히, 이 양의 수지가 가해지는 속도에 의존하여 30℃에서 1시간 또는 24시간안에 세제를 99.9%제거할 수 있다.
CdCl를 가하여 최종농도를 5mM로 하고 이 용액을 37℃에서 2시간동안 인큐베이터에 보관하였다. 다음에, 리포좀을 희석하여, 50mM트리스, pH7.5, 75mM트레할로스, 15mM CaCl, 0.8%글리신, 1%말토스 및 0.05% NaN의 작업농도로 하여 약 0.04-0.20㎍/㎖, 약 40-150㎍/㎖ 및 50-100㎍/㎖의 소의 감마글로불린을 함유하는 용액을 얻었다.
이 용액을 드라이아이스상에서 냉동시킨 후, -40℃에서 개시되고 실온에서 종료되는 48시간 동안에 걸친 사이클을 이용하여 냉동 건토시켰다. 냉동건조된 시약은 사용하기 전에 증류수로 재구성하였다.
rTF PT 시약의 효능을 측정하여 그 결과를 표 3에 나타낸다. 즉, 100μl의 rTF PT시약을 가하고 PT를 측정하였다.
정상인 푸울(NHP)은 10명의 정상인으로부터의 혈장 푸울로 이루어지는 것으로서, 소량배수로 분할하여 즉시 냉동시킨 것, 레벨 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ은 오르소 진단시스템 대조용 혈장(Raritan, 뉴저지 소재)이고, 구강 항응고요법을 받고 있는 레벨 즉 강도에 따라 3단계로 구분한 환자에 대하여 시뮬레이션하기 위해 설정한 것.
이 데이터로부터 rTF PT시약이 본 발명의 원하는 효능을 제공한다는 것을 알 수 있다. 첫째, 각종 대조용 PT는, 이들 대조용이 각각의 정도에 따라 항응고요법을 받고 있는 환자로부터의 혈장을 시뮬레이션하도록 설계되어 있으므로, 기대한 바와같은 변화를 나타내게 된다. 둘째, 정상인의 혈장에 대한 PT는 레벨 Ⅰ대조의 것과 부합한다. 이 후자의 효과는 시약에 글리신을 포함시키는 것에 기인 하는 것이다. 표 1과 표 3의 데이터를 비교하여 확인할 수 있다.

Claims (31)

  1. 리포좀 조성물로 이루어지고 조직인자를 베이스로 하는 프로트롬빈시간 시약에 있어서, (a) (i) 20-95mol%의 포스파티딜콜린, (ii) 2.5-50mol%의 포스파티딜에탄올아민, (ii) 2.5-50mol%의 포스파티딜세린, (iv) 0.40mol%의 포스파티딜글리세롤로 이루어지는 인지질 혼합물과, (b) 인지질 혼합물 1mg 당 0.1㎍-3㎍의 조식인자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  2. 제1항에 있어서, 또한 0.5-1.5%의 글리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 또한 트레할로스, 말토스, 락토스, 글루코스 및 만니톨로 이루어지는 군에서 선택되는 탄수화물 저온 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  4. 제3항에 있어서, 탄수화물 저온보존제는 50mM-250mM트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인지질 혼합물은 5-15mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 5-20mol%의 포스파티딜세린과, 10-25mol%의 포스파티딜글리세롤과, 잔량의 포스파티딜세린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  6. 제4항에 있어서, 상기 인지질 혼합물은 8-12mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 3-10mol%의 포스파티딜 세린과, 14-20mol%의 포스파티딜글리세롤과, 58-75mol%의 포스파티딜콜린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인지질 혼합물은 8-12mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 3-10mol%의 포스파티딜세린과, 14-20mol%의 포스파티딜글리세롤과, 58-75mol%의 포스파티딜콜린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조직인자는 재조합 조직인자인 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  9. 제4항에 있어서, 0.6-1.2%(w/v)의 글리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  10. 인지질 소포의 지질 이중층과 결합된 활성조직 인자를 함유하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법에 있어서, (a) 인지질 혼합물, 조직인자 및 캐리어단백질을 세제와 상호 용해시키고, (b)세제를 제거하고, (c)카드뮴염을 가하는 단계로 이로어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 인지질 혼합물은 20-95mol%의 포스파티딜콜린과, 2.5-50mol%의 포스파티딜에탄올아민과, 2.5-50mol%의 포스파티딜세린과, 0-40mol%의 포스파티딜글리세롤로 이루어지는 것을 특징으로하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 또한(a)단계는 0.5-1.5mol%의 글리신을 상호 용해 시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 조직인자는 제조합 조직인자인 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 세제는 CHAPS, 옥틸 베타-D-글루코피라노사이드 및 옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 세제는 투석, 접선류 투석여과 및 크로마토그래피 수단으로 이루어지는 군에서 선택되는 기술에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  16. 인지질 미셀 조성물로 이루어지고 조직인자를 베이스로 하는 프로트롬빈시간 시약에 있어서, (a) (i) 20-95mol%의 포스파티딜콜린과, (ii) 2.5-50mol%의 포스파티딜에탄올아민과, (ii) 2.5-50mol%의 포스파티딜세린과, (iv) 0.40mol%의 포스파티딜글리세롤로 이루어지는 인지질 혼합물과, (b) 인지질 혼합물 1mg 당 0.1㎍-3㎍의 조식인자와 (c) 세제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  17. 제16항에 있어서, 또한 0.5-1.5%의 글리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 또한 트레할로스, 말토스, 락토스, 글루코스 및 만니톨로 이루어지는 군에서 선택되는 탄수화물 저온 보존재를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  19. 제18항에 있어서, 탄수화물 저온보존제는 50mM-250mM트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인지질혼합물은 5-15mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 5-20mol%의 포스파티딜세린과, 10-25mol%의 포스파티딜글리세롤과, 잔량의 포스파티딜콜린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  21. 제19항에 있어서, 상기 인지질혼합물은 8-12mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 3-10mol%의 포스파티딜세린과, 14-20mol%의 포스파티딜글리세롤과, 58-75mol%의 포스파티딜콜린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  22. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 인지질혼합물은 8-12mol%의 포스파티딜 에탄올아민과, 3-10mol%의 포스파티딜세린과, 14-20mol%의 포스파티딜글리세롤과, 58-75mol%의 포스파티딜콜린으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조직인자는 재조합 조직 인자인 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  24. 제19항에 있어서, 0.6-1.2%(w/v)의 글리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  25. 제16항 또는 제17항에 있어서, 세제는 알킬 글루코피라노사이드인 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약.
  26. 인지질 미셀과 결합된 활성조직을 함유하는 프로트롬빈시간 시약의 제조 방법에 있어서,
    (a) 인지질 혼합물, 조직인자 및 캐리어 단백질을 세제와 상호용해시키는 단계와, (b) 카드뮴염을 가하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세제는 옥틸 베타-D-글루코피라노사이드와 옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 인지질 혼합물은 20-95mol%의 포스파티딜콜린과, 2.5-50mol%의 포스파티딜에탄올아민과, 2.5-50mol%의 포스파티딜세린과, 0-40mol%의 포스파티딜글리세롤로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 또한(a)단계는 0.5-1.5mol%의 글리신을 상호 용해 시키는 것을포함하는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  30. 제27항 또는 제29항에 있어서, 상기 세제는 알킬 글루코피라노사이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 세제는 옥틸 베타-D-글루코피라노사이드및 옥틸 베타-D-티오글루코피라노사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로트롬빈시간 시약의 제조 방법.
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