KR100206459B1 - 생분해 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726, 및 55727의 미생물로 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 같은 화합물의 호기성 분해에 관한 것이다. 더 특히, 본 발명은 유체 또는 고체상내 유기 화합물의 호기적 분해되어 본 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함한 생성물로 바이오개선되는 것에 관한 것이다.

Description

생분해 시스템 및 방법

본 발명은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 같은 화합물의 호기성 분해에 관한 것이다. 이러한 화합물은 다양한 방법을 사용하여 신규한 미생물에 의해 CO₂및 H₂O를 포함한 생성물로 호기적으로 분해된다. 본 미생물은 또한 이러한 화합물을 포함한 조성물을 호기적으로 바이오개선할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 미생물은 유독성 중간체 또는 부산물의 생성없이 니트로- 및 할로- 치환된 방향족 화합물을 CO₂및 H₂O를 포함한 생성물로 호기적으로 바이오개선할 수 있다.

본 발명은 또한 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 같은 화합물의 호기적 반응을 위한 유체상 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 이러한 화합물을 포함한 엘라스토머성 고체 또는 슬러지가 호기성 반응에 적당한 유동화된 조성물로 전환된다. 특정 양태에서, 유동화된 조성물은 유기 화합물 또는 이의 혼합물을 함유한 폐기물의 호기성 바이오개선을 위한 슬러리를 포함한다.

본 발명은 또한 고체, 슬러지 또는 토양내 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 같은 화합물의 호기적 분해를 위한 고체상 시스템 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 다량으로 할로겐화된 유기 화합물, 예를 들면, 다염소화 비페닐, 다브롬화 비페닐 등, 다량으로 니트로화된 화합물, 예를들면 트리니트로톨루엔 등, 및 니트로화 및 가교결합된 중합성 화합물, 예를 들면, 니트로셀룰로스 등으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유한 폐기물의 바이오개선을 위한 2 단계 방법에 관한 것이다. 본 양태에 따라서, 폐기물은 폐기물중의 화합물을 적어도 부분적으로 분해할 수 있는 시약과 먼저 배합시키고 이어서 처리된 폐기물에 존재하는 임의의 방향족, 치환된 방향족 또는 지방족 화합물을 호기적으로 분해시키는 신규한 미생물과 접촉시킨다.

본 발명은 또한 고체 지지체상에서 고정된 신규한 미생물을 사용하는 가스, 에어로졸, 및 액체를 포함하는 유체의 바이오개선을 위한 시스템에 관한 것이다.

폐기물 또는 오염된 폐기물 처리를 위한 미생물의 사용이 잘 문서화되어 있다. 1990년 2월의,“EPA-Industry Meeting on Environmental Applications of Biotechnology”에 선행된 심포지움에서 EPA는 생물공학이 다중 및 다양한 기원으로부터의 오염물을 포함한 슈퍼펀드 장소로부터 토양 및 슬러지를 처리하는데 성공적으로 이용되어 왔음에 주목하였다. 경제적 및 환경적 고려는 바이오프로세싱 기술이 폐기물 또는 오염된 폐기물의 개선 및 처리를 위한 중요한 가능성을 제공하는 것을 나타낸다. 소각 또는 화학적 고정 및 캡슐화 같은 궁극적 폐기 기술의 사용은 이러한 물질의 취급 및 폐기 장소로 운반과 관련된 부담에 추가로 많은 자본 지출을 초래한다. 생분해 방법은 현장에서 수행되고 덜 복잡한 장비를 사용하기 때문에 대부분의 다른 방법에 비해 적은 비용이 든다. 또한, 생분해는 전체 처리 접근을 위해 지상 및 현장 처리를 병용하여 수행될 수 있다.

화합물의 미생물 분해 또는 처리의 예가 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 4,843,007 호 및 제 4,876,201 호는 다염소화 비페닐(PCBs) 및 아세토페논을 알칼라진스(Alcaligenes)로의 호기적 처리를 기재하고 있지만, 방향족 환분해에 대해서는 기재되어 있지 않으며 이는 화합물이 미네랄화의 시점까지 분해되지 않았음을 나타낸다. 또한, 미국 특허 제 5,009,999 호 및 제 4,876,201 호는 슈도모나스(Pseudomonas)로 PCBs의 호기적 처리를 기재하고 있지만, 환 분해의 증거는 없다. 미국 특허 제 4,493,895 호는 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia)로 할로겐화된 유기 화합물의 호기적 처리가 기재되어 있고, 미국 특허 제 5,100,800 호는 슈도모나스 퓨티다(P. putida)균주 UNK-1로 동일한 화합물의 처리를 기재하고 있다.

트리클로로에틸렌 또는 디메틸암모늄 클로라이드 같은 할로-지방족 화합물은 또한 호기적으로 분해되는 것으로 나타났다. 특정 예는 미국 특허 제 4,713,343 호(트리클로로에틸렌), 제 4,492,756 호(디메틸암모늄 클로라이드), 및 제 5,079,166 호(트리클로로에틸렌)에서 찾을 수 있다.

Funk et al.[참조문헌: 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:7, pp. 2171-2177]은 2,4,6-트리니트로톨루엔, 헥사하이드로-1,3,5-트리니트로-1,3,5-트리아진 및 옥타하이드로-1,3,5,7-테트라니트로-1,3,5,7-테트라아조신으로 오염된 토양을 위한 2 단계 현장 처리를 기술한다. 토양을 먼저 박테리아의 활성을 증진시키기 위해 수성 완충액 및 녹말로 범람시킨다. 토양내 또는 접종물로서 첨가된 호기적 타력영양균은 토양으로부터 산소를 빨리 제거하여 혐기성 조건을 창조한다. 혐기상태하에서 오염 화합물은 미생물에 의해 부분적으로 분해된다. 그러나, 치환된 니트로 그룹만 환원되고 방향족 환이 분쇄되지 않기 때문에 CO₂및 H₂O로 분해되지 않는다.

산업적 매립지 침출물 중의 오염물을 호기적으로 분해하기 위한 하수 처리 공장으로부터 순응된 박테리아의 사용이 문헌[참조: Venkataramani and Ahlert, 1984, J. WPCF, 56:11, pp. 1178-1184]에 기재되어 있다.

생분해에 대해 발행된 참고문헌의 대부분이 순수 배양에 의한 단일 순수 화학 물질의 분해에 중점을 두고 혼합 배양 또는 미생물 집합체에 의해 유기 오염물의 복합 혼합물의 분해에 중점을 두지 않는다. 순수 화학약품으로의 작업의 대부분이 또한 통상적으로 산업 폐기물에 의해 직면하는 것보다 낮은 정도의 농도에서 수행된다. 예를 들면 Speitel et al.[참조문헌: 1989, Environ. Sci. Technol. 23:68-74]은 매우 낮은 수준 즉, 1 내지 100 ppb에서 순수한 화학약품을 사용하여 페놀(예를 들면, p-니트로페놀, 2,4-디니트로페놀, 및 펜타클로로페놀)의 분해를 시험했다. 유사하게는, 문헌[참조: Arcangeli and Arvin, 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37:510-517]은 바이오반응기에서 매우 낮은 톨루엔 농도, 1 ppm 내지 6 ppm이하를 사용하였다.

통제된 마이크로코즘 연구에서, 문헌[참조: Heitkamp, et al., 1987, Appl. Environ. Microbiol. 53:129-136]은 나프탈렌이 1 ppm이하의 수준에서 선택된 토양 마이크로코즘에 첨가될 때, 17 내지 31일 내에 효과적으로 미네랄화될 수 있다는 것을 보여주었다.

자연에서 메틸-치환된 방향족의 분해는 일반적으로 메타-분해 경로를 통해 일어난다. 그러나, 예를 들면, 클로로벤조에이트 같은 할로-유기물의 분해는 오르토-분해 경로를 통해 가장 잘 진행된다. Knackmuss [참조문헌: Taeger, et al., 1988, Appl. Microbiol. Biotechnol. 28:603-608; Romanov, et al., 1993, Microbiology 62:887-896] 및 Pierce[참조문헌: Pierce, et al., 1983, Dev. Ind. Microbiol. 24:499-507; Pierce, et al., 1984, Dev. Ind. Microbiol. 25:597-602]는 오르토-경로를 통해 메틸- 및 클로로-방향족 화합물 모두를 분해할 수 있는 미생물이 농축될 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 문헌[참조: Oltmanns, et al., 1988, Appl. Microbiol. Biotechnol. 28:609-616]은 야생형 균주에는 존재하지 않는 변형된 오르토-경로를 통해 1,4-디클로로벤젠 분해할 수 있는 자연으로부터 농축된 박테리아가 작제될 수 있음을 보여 주었다.

Boronin과 공동연구자들은[참조문헌: Boronin et al., 1993, FEMS Microbiol. Letters. 113:303-308] 슈도모나스 퓨티다에서 제조된 다양한 나프탈렌 플라스미드 작제물이 나프탈렌이 유일한 탄소 및 에너지원일 때, 최고 특이 성장율은 메타-경로 오르토-경로 젠티세이트-경로로 관찰됨을 보여 주었다.

혼합 유기성 기질 및 혼합, 치환된 방향족 화합물의 분해는 특히, 분해의 생화학적 복잡성 및 이러한 분해 과정의 조절 및 생리적 제어를 상당히 증가시킨다. 특히 경로가 유도가능한 혼합 유기성 기질의 분해에서 중요 요인은 어떻게 배양을 처음으로 성장시키는가(이어서, 유도하는)이다.

문헌[참조: Hollander, et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:2330-2338]은 코마모나스 테스토스테로니(Commamonas testosteroni)(이전에는 슈도모나스 테스토스테로니로 분류)가 4-클로로페놀 및 4-메틸페놀을 동시가 아닌 순차적으로 분해함이 주목되어 있다. 이 분해는 메타-경로를 통해 일어난다.

그러나, 단지 메타-경로를 통해서만 분해되는 다중 유기 화합물이 공급되는 경우 분해는 동시성이다. 메타-경로의 앞선 유도때문에, 오르토-경로를 통해 진행하는 화합물의 분해는 추가 처리 시간을 필요로 하는데, 왜냐하면 적당한 효소가 이러한 화합물의 분해의 적당한 수준을 성취하기 위해 유도되야 하기 때문이다. 이러한 경우에, 증가된 처리 시간에 대한 요구는 처리 경제학에 직접적인 부정적 영향을 가진다.

최근에, Grifoll et al.[참조문헌: 1994. Appln. Environ. Microbiol. 60:2438-2449]은 플루오렌을 대사할 수 있고, p-하이드록시벤조에이트의 존재하에서 성장되었을 때, 오르토-경로를 통해 p-하이드록시벤조에이트를 분해하는 슈도모나스 종(균주 F274)을 분리해 내었다. 그러나, 이 균주는 톨루엔, 나프탈렌 또는 벤젠은 이용할 수 없다.

동일한 상황이 슈도모나스 균주에 의한 클로로벤젠 및 톨루엔의 분해로 메타-경로가 억제되거나/변형될 때까지 메타-경로 및 오르토-경로를 통해 대사된 유기물의 동시 분해가 가능하지 않음이 관찰되었다[참조문헌: Pettigrew et al., 1991, Appl. Environ. Mocrobiol. 57:157-162].

문헌[참조: Viliesid and Lilly, 1992, Enz. Microb. Technol. 14:561-565]은 카테콜 1,2-디옥시제나아제(오르토-경로의 주요 효소)의 기제 또는 유도 수준이 용존 산소 장력에 의해 직접적으로 영향을 받는다는 것을 보여 주었다. 이의 관찰을 기준으로, 산소 장력이 활성 오르토-경로 분해를 유지하기 위해 (분해의 개시에서) 4%이상의 포화도인 것이 필요하다.

최근 문헌에서, 고농도(1000 ppm)의 페놀 또는 크실렌이 수용액에서 성공적으로 분해되는 경우가 문헌[참조: Brown et al., 1993, Critical Review and Case Study on Biotechnology for Pollution Prevention, United States EPA; Hinteragger, et al., 1992, Wolfram et al., 1990, NTIS Report No. EGG-M-90407, p. 17]에 나와 있다.

그러나, 1차 대사 및 공대사 또는 휴지 세포 대사 사이의 구별을 하기 위해 주의가 필요하다. 예를 들면, 톨루엔 성장 세포에 의한 니트로페놀의 휴지기 세포 대사를 문헌[참조: Spain and Gibson, 1988, Appln. Environ. Microbiol. 54:1399-1404]이 보여주고 문헌[참조: Taylor and Amador, 1988, Appln. Environ. Microbiol. 54:2342-2344]은 프탈레이트 성장 세포에 의한 피리딘의 휴지기 세포 대사를 보여준다.

정의에 의해, 타력영양 박테리아는 탄소 및 에너지원으로서 다양한 형태의 유기 탄소를 이용한다. 탄소원에 더하여, 타력영양 박테리아는 또한 성장을 위해 질소 및 인을 필요로 한다. 가장 통상적으로는, 아미노산 형태의 유기 질소(아미노 질소)의 사용이 또한 역사적으로 사용되어 왔지만, 무기 형태의 질소 및 인이 이러한 요구를 만족시키기 위해 공급되었다. 문헌[참조: Wackett, et al., 1987, J. Bacteriol 169:710-717; Schowanek and Verstraete, 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56:895-903]에 문서화되어 있지만, 질소를 함유한 탄화수소 예를 들면, 헤테로사이클 또는 니트로페놀의 사용 또는 유기 인 화합물 예를 들면, 포스피네이트의 사용을 통한 질소 필요 충족이 덜 실용적이다. 자연에서의 글리포세이트 분해는 성장 및 에너지를 위한 본 살충제의 유기 탄소뿐만이 아니라 인원으로서 글리포세이트의 유기 인을 이용하는 박테리아에 의해 수행된다. 사실, 자연에서 글리포세이트 분해는 다른 유용한 형태의 무기 인이 존재하면, 억제된다.

TCE 같은 선택된 유기 폐기물을 분해시키기 위한 공대사성 활성에 상당한 관심이 있지만, 혼합 폐기물 처리를 위한 공대사성 방법의 사용이 비효과적이고 따라서, 궁극적으로 더 고비용이다. 문헌[참조: Klecka and Maier, 1988, Biotechnol. Bioeng. 31:328-335]은 분해성 비사용성 탄소원을 펜타클로로페놀 분해 박테리아의 혼합 집단에 첨가될 때, 펜타클로로페놀 분해 속도가 감소한다는 것을 보여 주었다. 그러나, 이용가능한 형태의 탄화수소가 혼합물에 첨가될 때, 총 제거 속도는 증가한다. 이러한 증가는 분해에서 전체 향상을 초래하는 생물량 증가에 기인한다.

선택된 방향족 및 폴리방향족 탄화수소(PAHS)의 호기성 분해는 잘 문서화되어 있다. 그러나, 본 발명자가 알고있는 한도내에서는 엘라스토머성 또는 타르질 조성물에 존재하는 화합물의 호기성 분해는 보고되어있지 않다. 혐기성 호흡(즉 질산염 환원/탈질소반응)의 조건하에서 말단 전자 수용체로서 질산염을 사용한 이러한 동일한 선택된 화합물의 산화적 분해가 문헌[참조: Bossert and Young, 1986, Appl. Environ. Microbiol. 52:1117-1122; Bouwer and McCarty, 1983, Appl. Environ. Microbiol., 45:1295-1299]에 보고되었다. 그러나, 나프탈렌 같은 화합물의 분해는 질산염 호흡하에서 빠르지 않다. 문헌[참조: Mihelcic and Luthy, 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54:1188-1198]은 약 63일이 탈질소화 조건하에서 1 ppm의 농도에서 나프탈렌의 분해를 위해 필요하다는 것을 증명했다.

문헌[참조: Fries et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol., 60:2802-2810]은 산소의 낮은 수중 용해도와 토양 및 침전물내 낮은 이동 속도때문에 산소의 이용성이 종종 속도 제한이 되지만, 일반적으로 호기성 조건하에서 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 및 크실렌의 생분해가 익히 공지되어 있음을 예시하고 있다. Fries는 ≤ 0.5 ppm 톨루엔을 사용하여 자연에서부터 분리된 미생물에 의한 톨루엔의 혐기성 호흡을 기술한다. 미생물은 25 ppm 톨루엔에서 성장시키고 50 ppm 톨루엔을 공급한다. 이러한 미생물이 더 높은 농도의 톨루엔을 분해할 수 있다는 증거는 아직 없었다.

문헌[참조: Ortega-Calvo and Alexander, 1994, Appln. Environ. Microbiol. 60:2643-2646]은 하나는 자유-유영 및 다른 하나는 유기 경계에 있는 2개의 생리학적으로 상이한 집단이 나프탈렌(0.1 내지 1.0 ppm의 농도에서 공급될 때) 같은 화합물의 분해에 관계된다는 것을 서술했다. 그들의 관찰로부터, 개시 활성이 수성상에 대한 나프탈렌의 분배에 따라 자유-유영 박테리아에 의해 수행된다는 것을 알 수 있다.

최근에, 문헌[참조: Hack, et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:495-499]은 글루코오스에서 성장될 때 슈도모나스 퓨티다의 세포가 4℃에서 보관될 때 90시간내에 이의 활성 50%이상을 잃는다는 것을 보여주었다.

톨루엔에서 성장될 때 재조합 균주 슈도모나스 세파시아 G4에 의한 트리클로로에틸렌, TCE의 공대사에 관한 상당한 관심이 최근에 일어나고 있다. 최근 논문[참조: Landa et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol., 60:3368-3374]으로부터, 몇 개의 결론이 나올 수 있다. 소량의 TCE 분해를 위해 상당한 양의 톨루엔이 필요하다는 것이다. 약 64 ppm의 톨루엔이 3.2 ppm의 TCE(분해되는 TCE의 각 부분을 위해 분해되는 톨루엔 20부의 비율) 대사에 필요하다. 또한, TCE 농도가 19 ppm을 초과할때, 톨루엔 분해의 경쟁적 억제가 TCE 공대사의 손실 및 톨루엔 분해의 중지를 초래한다.

부동화 및 고정된 박테리아 방법이 다년간 확립되어 왔다.[참조문헌: Atkinson and Movituna, 1991, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook: 2nd Ed. Stockton Press, NY] 이러한 방법은 미생물의 조야성 향상에 대한 추가의 잇점을 제공하는 것으로 주장하고 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Dickman, et al., 1990, Bioprocess Eng'r 5:13-17]은 자유 유영 박테리아에 대한 부동성 연속 배양 반응기내 산소 박탈 및 pH 쇼크에 대한 향상된 안전성을 보여주었다. 문헌[참조: Westmeier and Rehm, 1985, Appl. Microbiol. Biotechnol. 22:301-305]은 알칼리진스 종(Alcaligenes sp.)의 부동성 세포는 4-클로로페놀을 낮은 농도(즉, ≤ 19 ppm)로 공급할 때 자유-유영 세포가 분해하는 것보다 더 빠른 속도로 4-클로로페놀을 분해한다.

문헌[참조: Haigler, et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol., 60:3466-3469]은 유일한 탄소, 에너지 및 질소원으로서 2-니트로톨루엔(2-NT)을 분해하고 이용하는 능력을 기준으로 한 슈도모나스(균주 JS42)의 균주의 분리를 기술한다. 본 참고문헌이 이 균주가 2-니트로톨루엔을 이용할 수 있음을 보여주는 반면에, Haigler는 슈도모나스 균주 JS42가 니트로베젠을 이용할 수 없음을 구체적으로 명시하고 있다. 추가로, Haigler은 아닐린 또는 나프탈렌을 분해하거나 이용하는 능력에 관해서는 언급하지 않았다. 2-NT 에서 성장한 균주 JS42의 세척된 세포가 니트로벤젠을 산화시킬 수 있지만, 참고문헌은 세포가 니트로벤젠을 이용할 수 없음을 구체적으로 명확히 하고 있다. 따라서, 본 바이오전환 활성은 공대사로서 더 정확하게 정의된다.

해로운 유기 폐기물의 퇴비화는 생물처리 기술의 비교적 신규한 적용을 대표한다. 가장 주목할 만한 것은 클로로페놀의 퇴비화 예이다[문헌참조: Valo and Salkinoja-Salonen, 1986, Appl. Environ. Microbiol. 25:68-75]. 그러나, 이 기술을 사용하여 오염된 토양을 처리하는 데 필요한 시간이 빠르지 않다(4 개월). 클로로페놀에 대한 퇴비화를 사용하는 데 따른 문제점의 일부는 활성 클로로페놀 분해자의 상당 수준의 개발이다. 이러한 문제점이 미생물 토양 개량제의 첨가를 통해 부분적으로 Valo and Salkinoja-Salonen(상동, 1986)에 의해 표명되었지만, 토양이 토착 미생물총을 없애기 위해 미리 살균됐을 때만 가능하다.

미국 특허 제 1,375,394 호는 일반적으로 슈도모나스 속, 미코박테륨 속(Mycobacterium), 플라보박테륨 속(Flavobacterium) 또는 사르나 속(Sarcina)의 미생물이 호기적으로 니트로-방향족 화합물을 분해하는 것을 언급한다. 본 참고문헌은 미생물이 반드시 이러한 분해성 활성을 위한 능력을 가지도록 유도되어야 함을 언급하고 있다. 그러나, 니트로-방향족의 농도가 유도를 위해 사용되어야 하는지, 어떠한 배양 조건이 사용되야 하는지에 관한 교시에 대한 지침이 없다. 또한, 본 참고문헌에는 임의의 언급된 속의 어떤 특정 종이 원하는 분해 활성을 가지도록 유도될 수 있고 어디에서 이러한 미생물이 발견될 수 있는 지에 대한 어떠한 지침도 없다.

유럽 특허 공보 제 0278296 호는 일반적으로 유기 폐기물을 함유한 고체 및 유체의 동시적 화학 및 생물학적 처리를 위한 방법을 기술한다.

따라서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물의 빠르고 효과적인 호기성 분해에 유용한 미생물과 시스템 및 방법의 실제적 요구가 남아있다. 또한 엘라스토머성 또는 타르질 물질에 존재할 때 이러한 화합물 중 일부 또는 분해를 위한 실제적 요구가 있다.

본 출원의 섹션 2에서 임의의 인용 또는 확인은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대해 종래 기술로서 유용하다는 승인으로서 해석되어서는 안된다.

발명의 개요

방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이들의 혼합물의 호기적 분해에 유용한 신규 분리된 미생물이 순수 또는 혼합 배양균으로서 제공된다. 본 미생물은 엘라스토머성 및/또는 타르질 고체, 슬러지, 또는 토양에서 함유할 때와 비-엘라스토머성 조성물에서 함유할 때 전술한 화합물의 호기적 분해에 유리하게 유용하다. 본 미생물은 또한 가스, 에어로졸 또는 액체를 포함하는 유체의 형태에서 이러한 화합물 또는 이들의 혼합물의 분해에 유용하다. 본 미생물을 포함한 바이오필터가 제공된다.

본 미생물은 연장된 기간, 예를 들면, 적어도 4개월 동안 분해 활성의 손실없이 저장될 수 있다. 또한, 본 미생물은 상당히 고농도의 상기 화합물 또는 이의 혼합물을 빠르고 효과적으로 분해할 수 있다. 추가로, 본 미생물은 상기 화합물의 광범위한 농도를 취급할 수 있다. 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 적어도 하나의 화합물을 사용할 수 있다. 특정 미생물은 유일한 탄소 및 질소원으로서 적어도 하나의 화합물을 사용할 수 있다.

화합물의 호기적 반응에 유리하게 유용한 유체상 및 고체 시스템을 위한 신규한 방법이 제공된다.

유체상 시스템의 특히 유리한 양태에서, 엘라스토머성 및/또는 타르질 고체, 슬러지, 또는 토양에 함유된 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물의 빠르고 효과적인 분해를 위한 신규한 방법이 제공된다.

고체상 시스템의 특히 유리한 양태에서, 엘라스토머성 및/또는 타르질 고체, 슬러지, 또는 토양에 함유된 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물의 빠르고 효과적인 분해를 위한 신규한 방법이 제공된다.

유체상 및 고체상 시스템은 방향족 및/또는 지방족 화합물의 생분해를 위해 사용된 통상적인 방법보다 확실히 짧은 기간에 광범위한 종류의 유입된 유출공급을 효과적으로 다루기 위해 확대될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 방향족 및/또는 치환된 방향족 화합물의 호기적 분해를 위한 방법이 제공된다. 일반적으로, 본 방법은 방향족 화합물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725인 미생물의 혼합 또는 순수 배양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 본 양태의 한 양식에서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물이 호기적으로 분해된다. 본 양태의 다른 양식에서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 2종의 화합물이 호기적으로 분해된다. 본 방법은 상기 화합물(들)과 접촉하는 본 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있어서 방향족 화합물 또는 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해된다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 화합물의 호기적 반응을 위한 유체상 시스템 및 방법이 제공된다. 가장 일반적으로, 유체상 시스템이 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 엘라스토머성 고체 또는 슬러지에 함유된 유기 화합물의 호기적 반응을 위해 적당한 유동화된 조성물로 전환시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 호기적 조건하에서 일어나는 합성 및 분해 반응을 포함하는 유동화된 조성물을 위한 호기적 반응이 유용하다.

호기적 반응에 적당한 유동화된 조성물 제조를 위한 방법은

(a) 유기 화합물-함유 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 미립화하고 (b) 용기내 미립화된 고체 또는 슬러지를 산소, 산소 함유 가스, 공기, 물 및 수용액으로 이루어진 그룹 중에서, 선택된 유체류와 접촉시켜 미립화된 고체 또는 슬러지가 유체류에 현탁되거나 분산되어 고체 또는 슬러지내 함유된 유기 화합물의 호기적 반응을 위해 적당한 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.

본 방법은 엘라스토머성 고체 또는 슬러지와 점착방지제를 단계 (a)와 동시에 또는 후속하여 배합하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따라서, 미생물을 이용한 화합물의 호기적 분해를 위한 유체상 시스템 및 방법이 제공된다. 예를 들면, 고체, 토양, 및/또는 슬러지로부터 형성된 슬러리인 유체상이 생성된다.

슬러리인 유체상은 비-엘라스토머성 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 형성될 수 있다. 이러한 슬러리는 고체, 슬러지 또는 토양에 함유된 방향족 또는 지방족 화합물 또는 이들의 혼합물을 호기적으로 분해하기 위해 사용된다.

본 방법은 (a) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수성 용액과 배합하고 (b) 에너지를 용기내 고체 또는 슬러지/수성 배합물에 부여하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키는 것을 포함한다.

예를 들면, 에너지는 혼합 같은 기계적 에너지 부여; 슬러리 물질내 정상음파 셋업에 의한 에너지 부여; 또는 전기 또는 전자기장 부여에 의해 부여될 수 있다.

하나의 대안적 양태에서, 본 방법은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 용기내 엘라스토머성 고체 또는 슬러지/물 배합물에 분배하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화하며 (c) 슬러리를 임의의 잔류 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 분리하는 것을 포함한다.

대안적으로, 본 방법은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 배합하여 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물을 형성하고 (b) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하여 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 배합물을 형성하며 (c) 에너지를 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 배합물에 부여하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 슬러리내에서 유동화시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제 및 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 단계 (a)에서 형성된 혼합물에 부여하여 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 슬러리내에서 유동시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따라서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 슬러리상 생분해를 위한 방법은 (a) 필요하다면, 중성으로 슬러리의 pH를 조절하고 (b) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 미생물을 슬러리와 배양하는 것을 추가로 포함한다.

방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 고체상 바이오개선을 위한 방법은 (a) 유체, 예를 들면, 공기가 증량된 혼합물을 통해 쉽게 통과할 수 있도록 고체, 슬러지 또는 토양을 증량제와 혼합하고 (b) 필요하다면, 중성으로 증량된 혼합물의 pH를 조절하며 (c) 증량된 혼합물을 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 미생물을 증량된 고체, 슬러지 또는 토양과 배양하는 것을 추가로 포함한다.

고체, 슬러지 또는 토양이 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양인, 고체상 바이오개선을 위한 본 방법은 (a) 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 타르질 또는 엘라스토머성 슬러지 또는 타르질 또는 엘라스토머성 토양을 점착방지제와 혼합하여 고체 토양 또는 슬러지가 특정화된 타르질 및/또는 엘라스토머성 혼합물을 형성한다.

본 발명의 다른 양태는 바이오필터 및 이의 사용을 위한 방법이다. 바이오필터는 공기, 증기, 에어로졸, 및 물 또는 수용액 같은 유출물내 화합물의 바이오개선에서 사용된다.

본 발명의 다른 양태에 따라서, 다염소화된 비페닐, 다브롬화된 비페닐등과 같은 다량으로 할로겐화된 유기 화합물, 트리니트로톨루엔 같은 다량으로 질소화된 화합물 및 예를 들면, 니트로셀룰로스등과 같은 가교결합된 중합성 화합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유한 폐기물의 호기적 분해를 위한 2 단계 방법이 제공된다. 폐기물은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이러한 화합물의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 (a) 폐기물내 적어도 부분적으로, 다량으로 할로겐화된, 다량으로 질소화된 또는 다량으로 질소화된 가교결합 화합물을 화학적으로 분해할 수 있는 시약을 배합하여 예비처리된 조성물을 형성하고 (b) 예비처리된 조성물을 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 본 방법은 적어도 하나의 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 제공된 속도 및 효율은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물(들)의 단독 또는 혼합물을 함유한 타르질 또는 엘라스토머성 조성물의 바이오개선에 대해 이전에는 성취된 적이 없었다.

본 발명은 다음 정의, 본 발명의 자세한 설명, 본 발명의 특정 양태의 예시적 실시예 및 첨부된 도면을 참고로 더 자세히 이해될 것이다.

본 발명은: 모두 1994년 12월 16일자로 출원되고 본원에서 모두 참고로 인용되는 동시 계류중인 출원 제 08/357,822 호; 출원 제 08/357,686 호; 출원 제 08/357,700 호; 및 출원 제 08/357, 821 호의 부분-연속 출원이다

도 1a-c는 대표적 유체상 시스템의 개략도. 도 1a는 슬러리 형성 시스템을 도시; 도 1b는 유체상 바이오개선 시스템을 도시; 도 1c는 처리된 물질의 여과 및 탈수를 도시한다.

도 2는 슬러리상 형성을 위한 개략도. 도 2a는 비-엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 슬러리상의 형성. 도 2b는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 슬러리상 형성.

도 3은 탄화수소 화합물의 감소 수준과 방출된 CO₂의 증가 수준 사이의 상관관계를 나타내는 그래프. □ 나프탈렌; ● 톨루엔; ○ 벤젠; ▽ CO₂.

도 4는 순차적 배취 바이오반응기내에서 30 일에 걸친 나프탈렌 분해를 나타내는 그래프. ■ 나프탈렌.

도 5는 연속 배취 바이오반응기내에서 30 일에 걸친 나프탈렌 및 벤젠의 분해를 나타내는 그래프. ■ 나프탈렌; ▲ 벤젠.

정의

본 발명에서 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 다음의 내용을 포함한다.

호기성 : 산소 장력이 0.1% 내지 100% 포화(여기서, 100% 포화는 25℃에서 수중 산소를 기준으로 40 ㎎ O₂/ℓ에 상응한다), 바람직하게는 4% 내지 80%, 더 바람직하게는 10% 내지 20%인 산소에 관계하거나 필요로 하는 상태.

알킬 : 메틸, 에틸 또는 프로필 그룹.

지방족 : 메탄의 유도체로 간주될 수 있고 시클릭 공액 6원 탄소(벤젠)환이 결핍된 비환성 또는 지환성 유기 탄화수소 화합물.

방향족 : 적어도 하나의 사이클릭 완전 공액 6원 탄소(벤젠) 환 또는 하나 이상의 환 탄소(들)가 질소 원자(들)로 치환된 하나의 사이클릭 완전 공액 헤테로-6원 환의 존재를 특징으로 하는 유기 화합물. 여기에는 비-치환 방향족 화합물 및 수소 원자(들) 대신에 하이드록실, 아민, 알킬, 카복실, 또는 치환 또는 비치환된 지방족 그룹(치환된 지방족 그룹은 수소 원자(들) 대신 카보닐 또는 카복실 그룹을 함유)중에서 하나 이상을 함유하는 방향족 화합물이 포함된다.

증량제 : 고체, 슬러지 또는 토양에 첨가될 때 고체, 슬러지 또는 토양을 통한 유체의 유동을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물.

퇴비작용성 : 고체 조성물내 유기 탄화수소 화합물이 통상적으로 밀폐 또는 제한된 지역에서 미생물에 의해 분해되는 과정.

점착방지제 : 엘라스토머성 또는 타르질 물질과 혼합될 때 물질을 덜 엘라스토머성 또는 타르질이 되게 하는 화합물. 슬러리 형성 과정과 함께 사용될 때, 점착방지제는 조성물이 유동성이 되는 데 도움을 준다.

엘라스토머성 : 고체 물질이 반대 힘의 작용하에서 형태 및 크기가 변하지만 반대 힘이 제거됐을 때 원래의 형태로 회복되는 성질, 단 반대 힘이 고체 물질의 탄성율을 초과하지 않는다.

할로-지방족 : 수소 원자(들) 대신에 예를 들면, 염소, 브롬 또는 요오드 또는 이들의 혼합물 같은 하나 이상의 할로겐 원자를 함유한 지방족 탄화수소 화합물.

할로-방향족 : 수소 원자(들) 대신에 예를 들면, 염소, 브롬 또는 요오드 또는 이들의 혼합물 같은 하나 이상의 할로겐 원자를 함유한 방향족 탄화수소 화합물.

할로-니트로-방향족 : 수소 원자(들) 대신에 예를 들면, 염소, 브롬 또는 요오드 또는 이들의 혼합물 같은 하나 이상의 할로겐 원자를 함유하고 수소 원자(들) 대신에 하나 이상의 니트로 그룹을 함유한 방향족 탄화수소 화합물.

유동화 : 예를 들면, 기계적 에너지 같은 에너지가 부여되어 미세하게 분할되거나 미립화된 고체를 예를 들면, 공기, 물 또는 수성 용액 같은 유체 중에 현탁시키는 과정.

니트로-방향족 : 수소 원자(들) 대신에 하나 이상의 니트로 그룹을 함유한 방향족 탄화수소 화합물.

슬러지 : 현탁액으로부터 침전된 예를 들면, 정지상 하부 물질 같은 고체의 집합체.

슬러리 : 예를 들면 기계적 에너지 같은 에너지가 미립화된 고체의 분산을 유지하도록 부여될 수 있는 유체 또는 액체 중의 미세하게 분할되거나 미립화된 고체의 현탁액.

타르질 : 주도 및 옥근 타르의 외양을 가질 수 있는 점착성 탄화수소.

TCL : 표적 화합물 목록, EPA, SW-846에 규정된 바와 같이 용매 추출을 사용하여 분석된 화합물의 지정된 목록. 현재 사용되는 바와 같이, 추출 용매는 메틸렌 클로라이드 : 메탄올(90 : 10)이다.

TCLP : 독성 용탈 과정, EPA, SW-846, 방법 제 1311로 정의된 수성 추출.

6.1. 신규 분리된 미생물

신규 미생물을 토양으로부터 분리하여 유일한 질소 및/또는 탄소 및 에너지원으로서 방향족, 치환된 방향족 및/또는 지방족 화합물 같은 특정 화합물을 이용하는 능력에 대해 선별한다. 본 미생물은 적어도 이러한 화합물의 호기적 분해를 위해 유용하다. 선별 방법은 미생물의 생화학적 활성이 적어도 하나의 이러한 화합물의 분쇄 처리에 대한 것이고 미생물은 유일한 영양원으로서 적어도 하나의 화합물을 이용할 수 있다는 것을 확실히 했다. 본 발명자(들)가 작용의 특정 메카니즘에 제한되는 것을 원하지 않았지만, 이러한 이용이 공-대사가 아닌 제 1 대사를 통해 화합물(들)의 미네랄화를 초래하는 것으로 알려졌다. 원하는 미생물의 선택에서 중요한 요소는 선별 방법이 분리된 미생물이 원하는 화합물 또는 이의 혼합물을 호기적으로 분해하도록 하는 호기적 조건하에서 수행하는 것이다. 추가로, 미생물은 혼합물을 순차적이 아닌, 동시에 분해할 수 있다.

또한, 본 발명자(들)가 작용의 특정 메카니즘에 제한되는 것을 바라지 않지만, 분해의 대부분이 오르토- 또는 변형된 오르토-경로를 통해 일어난다. 오르토- 또는 변형된 오르토-경로는 특히 중요하여 매우 유독한 할로-산 및/또는 비-대사성 중간체가 할로-방향족 화합물 또는 하나 이상의 메틸 그룹(들)으로 치환된 방향족 화합물의 분해중 중간체 또는 최종 생성물로서 생성되지 않는다. 예를 들면, 2 종의 미생물 즉, DAP 66 및 DAP 70은 메타-분해를 사용하는 능력을 나타내는 카테콜 2,3-디옥시제나아제 활성을 갖는다.

추가로, 본 미생물은 분리되어 높은 및/또는 다양한 농도의 화합물을 견딜 수 있다. 또한, 미생물은 혼합된 유기 화합물, 예를 들면, ≥ 1%(10,000 ppm)의 높은 총 또는 조성 농도를 분해할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물의“고”농도는 다음을 포괄한다: (1) 방향족 화합물: 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠: ≥ 5,000 ppm; 페놀: ≥ 6,000 ppm, 크레졸, 디메틸페놀: ≥ 1,000 ppm; 안트라센: ≥ 300 ppm; 스티렌: ≥ 5,000 ppm; 아닐린: ≥ 150 ppm; 나프탈렌: ≥ 1,000 ppm; 1- 또는 2-메틸나프탈렌: ≥ 200 ppm; (2) 니트로-방향족 화합물: 예를 들면, 니트로벤젠: ≥ 150 ppm; (3) 할로-방향족 화합물: 예를 들면, 클로로벤젠, 2-클로로나프탈렌: ≥ 200 ppm.

본 발명의 미생물은 또한 적어도 1000 ppm의 농도에서 다음 화합물을 분해할 수 있다: 피렌, 아세나프탈렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신아밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 2-, 3-, 또는 4-클로로톨루엔, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-디니트로벤젠, 멜아민, 시아누르산, 헥사데칸, 및 δ-(-)-리모넨.

고체 표면 상 성장/대사가 가능한 미생물 및 고체 표면으로 화학주성적으로 이동하는 미생물에 대한 선별과정이 선호된다.

일반적으로, 분리된 미생물은 원하는 화합물의 분해를 위해 필요한 대사성 단백질을 구조적으로 발현하지 않지만 관계된 화합물 또는 이의 혼합물을 함유한 배지에 또는 관련된 화합물(들)의 분해에 특이적인 경로의 효소를 유도하는 화합물을 함유한 배지에 배양함으로써 유도되야 한다. 특정 양태에서, 배지는 적어도 하나의 니트로벤젠, 아닐린, 멜라민 및 시아누르산; 및 적어도 하나의 나프탈렌, 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 및 크실렌을 함유한다.

또한, 모든 미생물 분리체는 천연 균주이며, 즉 어떠한 균주도 재조합적으로 변형되지 않는다.

본 발명의 신규한 미생물의 순수 및 혼합 배양은 BACTO^TMR2A 배지(Difco, Detroit, Michigan)를 사용하여 유지될 수 있다. 유지 배지로서 BACTO^TMR2A 배지의 사용은 본 발명에 따른 순수 또는 혼합 배양균으로 BACTO^TMR2A 배지의 접종 및 실온, 즉, 약 25 내지 27℃에서 약 48 시간 동안 미생물의 배양을 포함한다. 이어서, 배양은 공기 및 습기 통과의 장벽을 형성하는 물질, 예를 들면, 파라필름으로 덮을 수 있고 냉장하에서, 예를 들면, 약 4℃에서 보관한다. 대안적으로, 본 발명의 미생물의 순수 및 혼합 배양액은 5 내지 10 mM의 바람직한 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이들의 혼합물로 보충된 Stanier's 최소 배지[참조문헌: Stanier et al., 1966, J. Gen. Microbiol. 43:159-271]를 사용한 배양으로써 유지될 수 있다. 본 양태의 바람직한 양식에 따라서 약 10 : 1 내지 25 : 1 의 C : N 비율이 보충된 Stanier's 배지에서 유지된다. 배양액은 통기, 예를 들면, 100 내지 400 ㎖/분에서 순수한 산소와 교반을 사용하여 유지시킨다. 보충된 Stanier's 상에서 약 24 시간 배양한 후에, 박테리아 세포를 원심분리로 배지로부터 제거하고, Stanier's monomal 배지(SMM) 또는 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁시키고, 원심분리로 재현탁 세척으로부터 제거한다. 세포 펠렛은 약 4℃에서 보관할 수 있다.

대안적으로는, 혼합 배양액이 다음과 같이 유지될 수 있다. 혼합 배양액은 (1) 나프탈렌, 바람직하게는 약 1000 내지 4000 ppm; (2) 각각 약 400 내지 500 ppm에서 하나 이상의 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 및 크실렌; (3) 각각 약 200 ppm에서 클로로나프탈렌 및/또는 메틸나프탈렌 하나 또는 두개; 및 (4) 각각 약 30 내지 300 ppm에서 아닐린 및/또는 니트로벤젠을 함유한 조성물을 접종시킬 수 있고 다음의 섹션 6.3에 기술된 바와 같이 유체상 또는 고체상 시스템을 사용하여 처리한다. 바람직하게는 C : N : P 비율이 약 25 : 1 : 0.1이고 배양액은 약 실온에서 처리 사이클 동안 유지시킨다. 처리의 끝에서, 슬러리상 처리의 함유물을 예를 들면, 와트만 1 필터 또는 상응하는 다른 것을 사용하여 여과시키고, “필터 케이크”함유한 유도된 미생물로 명명된 탈수된 잔류 고체는 본 발명에 따른 사용에 적당한 배양액을 유지시키기 위해 사용될 수 있다.

아래에 기술된 어떤 미생물은 유일한 탄소, 질소 및 에너지원으로서 호기적으로 니트로벤젠을 사용할 수 있는 것이다. 특히, DAP 111, DAP 119, DAP 622, DAP 623, DAP 626, DAP 629, DAP 632, DAP 115, DAP 120로 명명된 미생물 및 DAP-2로 명명된 혼합 배양액은 호기적으로 니트로벤젠을 분해할 수 있다. DAP 70, DAP 73, DAP 111, DAP 119 및 DAP 622로 명명된 미생물과 혼합 배양액 DAP 2는 호기적으로 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센을 분해할 수 있다. DAP 111, DAP 119 및 DAP 622, DAP 623, DAP 626, DAP 629, DAP 632, DAP 115, DAP 120로 명명된 미생물과 혼합 배양액 DAP 2는 호기적으로 아닐린을 분해할 수 있다. 또한, 다음 기술된 미생물은 광범위한 치환 및 비-치환된 방향족 화합물, 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 아닐린, 페놀 및 에틸벤젠을 유일한 탄소 및/또는 질소 및 에너지원으로서 호기적으로 사용할 수 있다. 다음에 기재된 모든 순수 배양액의 미생물은 이러한 화합물을 호기적으로 이용한다. 작용의 단일 메카니즘에 제한되는 것을 바라지 않지만, 본 발명자(들)는 화합물이 대부분 오르토- 또는 변형된 오르토-경로를 통해 호기적으로 분해된다고 생각한다. 순수 및 혼합 배양액은 CO₂및 H₂O를 포함한 생성물로 호기적으로 분해될 수 있다.

다음 기재된 미생물은 또한 광범위한 치환 및 비-치환 지방족 화합물, 예를 들면, δ-(-)-리모넨, 포름알데히드, 클로로포름 및 메탄올을 호기적으로 이용할 수 있다. 또한, 임의의 미생물은 또한 장쇄 지방족 화합물을 분해할 수 있다. 장쇄를 분해시키는 능력은 예를 들면, 유일한 탄소 및 에너지원으로서 헥사데칸의 이용에 의해 증명될 수 있다.

다음 설명된 모든 미생물은 낮은 농도 한천 배지에서 배양될 때, 즉, 약 3 내지 10 gm한천/배지 ℓ, 바람직하게는 약 3 gm 한천/배지 ℓ에서 더 잘 성장하는 것으로, 즉 세포가 더 큰 콜로니로 더 빨리 발달하는 것이 관찰되었다. 다음 설명된 미생물은 통상의 농도 한천 배지에서 배양될 수 있지만, 성장은 덜 빠르다.

다음 설명된 운동성 미생물은 다양한 화합물에 의한 화학주성을 나타내기 위해 유도된다. 화학주성은 2가지 운동방식, 즉, 편모성 및 연축성에 의해 성취된다. 성장 조건은 미생물이 2 운동방식 중 하나를 나타낸다. 예를 들면, 편모 운동을 관찰하기 위해서는 미생물은 다소 점성인 조건, 예를 들면, 액체 배지 또는 한천의 퍼센트가 약 1%이하, 바람직하게는 0.3%인 한천 평판 배지 하에서 성장시킨다. 연축 운동을 관찰하기 위해서는 미생물을 한천의 퍼센트가 약 1%인 한천 평판 배지 같은 고체 배지에서 성장시킨다. 만약 한천의 퍼센트가 너무 높으면, 예를 들면, 약 2%이상, 화학주성의 두 가지 표현형이 관찰되지 않을 수 있다. DAP 111 및 DAP 119를 포함한 특정 운동성 미생물은 적당한 조건하에서 두 가지 운동 양식을 나타낸다.

다음 섹션 6.1.1 - 6.1.5(서브 섹션 6.1.5.1 포함)에 기술된 각각의 순수 배양액 및 혼합 배양액은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(섹션 10 참조)에 수탁되어 있다.

6.1.1 니트로벤젠을 사용하여 분리된 미생물

다음 미생물은 유일한 탄소, 질소 및 에너지원으로서 니트로벤젠만을 함유한 최소 배지에서 호기성 배양을 사용하여 토양으로부터 분리된 것이다.

미생물 DAP 622:

DAP 622는 때때로 쌍으로 나타나는 슈도모나스 종 그람 음성인 운동성 간상균이며, 영양 한천에서 성장시킬 때 콜로니가 백색 내지 크림색을 나타낸다. 플록 형성이 나타나고 운동성은 미생물이 편모성 평판에서 성장될 때 편모 운동성으로 나타난다. 본 미생물은 슈도모나스 F 한천(Difco)에서 성장시킬 때 황색 색소를 생산할 수 있다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, 에틸벤젠, 살리실레이트, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 622는 표 1에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

6.1.2. 클로로벤젠을 이용하여 분리된 미생물

다음 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 클로로벤젠만을 함유한 최소 배지에서 호기적 배양을 이용하여 토양으로부터 분리된다.

미생물 DAP 631:

DAP 631은 종종 쌍으로 발견되는 슈도모나스 종 그람 음성의 가느다란 운동성 간상균이며, 미생물의 콜로니는 BACTO^TMR2A 배지에서 백색으로 나타난다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, 및 에틸벤젠을 사용할 수 있다.

미생물 DAP 68:

DAP 68은 종종 쌍으로 발견되는 에어로모나스 종 그람 음성의 운동성 간상균이며, BACTO^TMR2A 배지에서 백색 내지 크림색을 나타낸다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, 에틸벤젠, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 68은 표 3에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

미생물 DAP 66:

DAP 66은 단독으로 및 연쇄상으로 발견되는 코리네박테륨 종 그람 변이성의 대형 비-운동성 간상균이다. 일부 연쇄는 크기가 필라멘트에 접근하고 일부 단일 간상균은 운동성이다. 플록 형성이 존재하고 세포가 캡슐을 가진다. 경련 평판에서 성장은 분명치 않다. 콜로니는 BACTO^TMR2A 배지에서 성장시 경질이고 왁스질이다. 본 미생물은 문헌[참조: Bayly and Wigmore, 1973, J. Bacteriol. 113:1112-1120]에 의한 방법에 따라, 메타-경로의 제 1 효소인, 카테콜-2,3-디옥시제나아제(C230)에 대해 양성이다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, m-톨루산, 에틸벤젠, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 66은 표 4에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

6.1.3. 나프탈렌을 이용하여 분리된 미생물

다음 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 나프탈렌만을 함유한 최소 배지에서 호기적 배양을 이용하여 토양으로부터 분리된다.

미생물 DAP 70:

DAP 70은 단독으로 및 연쇄상으로 발견되는 슈도모나스 종 그람 음성 운동성 간상균이다. 일부 연쇄는 크기가 필라멘트에 접근한다. 편모 평판에서 성장시 운동성이 편모성으로 나타나고 BACTO^TMR2A 배지에서 성장시 콜로니가 백색을 나타낸다. 본 미생물은 문헌[참조: Bayly and Wigmore, 1973, J. Bacteriol. 113:1112-1120]에 의한 방법에 따라, 메타-경로의 제 1 효소인, 카테콜-2,3-디옥시제나아제(C230)에 대해 양성이다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, 에틸벤젠, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 70은 표 5에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

미생물 DAP 73

DAP 73은 단독으로 및 연쇄상으로 발견되는 주글로에아(Zoogloea) 종 그람 변이성 운동성 간상균이다. 운동성 평판에서 성장은 운동성을 나타낸다. 플록 형성은 많은 손가락형 돌출로 나타난다. 본 미생물은 슈도모나스 F 한천(Difco)에서 성장시 황색 색소를 생성할 수 있다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 클로로벤젠, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 73은 표 6에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

6.1.4. 니트로벤젠 및 나프탈렌을 이용하여 분리된 미생물

다음 미생물은 토양으로부터 처음으로 분리되고 호기적으로 배양되어 순수 미생물 분리체로 된다. 이러한 순수 미생물 분리체는 호기적으로 예를 들면, 나프탈렌, 바람직하게는 약 1000 내지 4000 ppm; 각각 약 400 내지 500 ppm에서 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 및 크실렌; 각각 약 200 ppm에서 클로로나프탈렌 및 메틸나프탈렌; 각각 약 30 내지 300 ppm에서 아닐린 및 니트로벤젠 화합물의 혼합물을 함유한 슬러지/폐기물과 함께 연속적으로 배양된다. 또한, 치환 및 비치환 지방족 화합물도 혼합물내에 존재한다. 순수 미생물 분리체는 유일한 탄소, 질소 및 에너지원으로서 150 ppm 니트로벤젠 및 150 ppm 나프탈렌을 함유한 최소 배지상 호기적 배양을 이용하여 배양된 물질로부터 회수된다.

미생물 DAP 111;

DAP 111은 쌍으로 및 단독으로 발견되는 슈도모나스 종 그람 음성의 운동성 간상균이다. 콜로니가 BACTO^TMR2A 배지에서 백색을 나타내고 임의의 플록 형성이 나타난다. 연축성 및 편모성 평판에서 운동성이 관찰된다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 바닐린, 클로로벤젠, 에틸벤젠, 시아누르산, 살리실에이트, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 111은 표 7에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

미생물 DAP 119:

DAP 119는 에어로모나스 종 그람 음성의 운동성 간상균이다. 콜로니는 BACTO^TMR2A배지에서 백색을 나타내고 본 미생물은 영양 육즙에서 성장시 황색을 나타낸다. 연축 운동성이 연축 평판에서 증명되고 편모성 운동성이 편모성 평판에서 관찰된다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 락테이트, 바닐린, 클로로벤젠, 에틸벤젠, 시아누르산, 살리실에이트, 및 숙시네이트를 이용할 수 있다. DAP 119는 표 8에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워진다.

6.1.5 혼합 미생물 배양

200개 이상의 분리된 순수 미생물 분리물을 토양으로부터 수집 장소에서 배양시킨다. 상기 기술된 섹션 6.1.1 에서 6.1.4를 포함한 이러한 순수 분리물 모두를 합하여 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물을 함유한 슬러지/폐기물과 호기적으로 배양시킨다. 미생물의 혼합 배양액을 배양된 물질로부터 회수하고 BACTO^TMR2A 배지(Difco, Detroit, Michigan)에서 보존한다.

DAP-2로 명명된 혼합 배양액은 적어도 다음 화합물 및 이들의 혼합물을 호기적으로 분해한다: 클로로벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3- 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 멜아민, 시아누르산, δ-(-)-리모넨, 헥사데칸, 메탄올, 포름알데히드, 및 클로로포름.

6.1.5.1. 혼합 배양액으로부터 순수 분리물

다음 순수 배양액을 분리시키고 각각 150 ppm의 니트로벤젠, 나프탈렌, 및 톨루엔이 보충된 BACTO^TMR2A 배지에서 단일 콜로니를 분리시킴으로써 DAP 2로 명명된 혼합 배양액으로부터 동정된다.

미생물 DAP 623:

DAP 623은 그람 음성의 운동성이고, 쌍으로 발견되기도 하지만, 일반적으로 작은 단일 간상균이다. 염색이 고르지 않을 수 있고 약간의 플록 형성이 있다. 콜로니가 BACTO^TMR2A 배지에서 백색 내지 크림색으로 나타난다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 메시틸렌, 락테이트, 숙시네이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 살리실레이트, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 623은 표 8A에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

미생물 DAP 626:

DAP 626은 단독으로 및 쌍으로 발견되는 크기가 다양한 그람 변형성 간상균이다. 편모성 평판에서 성장은 편모 운동성을 나타낸다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 메시틸렌, 락테이트, 숙시네이트, 리모넨, 신나밀 아세테이트, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 626은 표 8B에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

미생물 DAP 629:

DAP 629는 그람 음성의 작은 운동성 간상균, 즉 거의 간상구균성이다. 콜로니는 BACTO^TMR2A 배지에서 성장시킬 때 약간 형광을 띤 백색으로 나타난다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 플루오란트렌, 메시틸렌, 락테이트, 숙시네이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 626은 표 8C에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

미생물 DAP 632:

DAP 632는 단독으로 및 쌍으로 발견되는 그람 변형성 운동성 가느다란 간상균이다. BACTO^TMR2A 한천에서 성장되었을 때 크림색 내지 황색을 나타낸다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 플루오란트렌, 아세나프탈렌, 메시틸렌, 락테이트, 리모넨, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 632는 표 8D에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

미생물 DAP 115:

DAP 115는 그람 음성의 운동성 간상균이다. 성장은 편모성 평판에서 관찰되고, 이는 운동성이 편모성임을 나타낸다. 콜로니는 BACTO^TMR2A 배지에서 성장시킬 때 백색을 나타내지만, 영양 육즙에서는 황색으로 나타난다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 벤조-(b)-플루오란트렌, 플루오란트렌,디벤조퓨란, 아세나프탈렌, 살리실레이트, 락테이트, 숙시네이트, 글리옥시레이트, 메시틸렌, 바닐린, 리모넨, 신나밀 아세테이트, 카테콜, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 115는 표 8E에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

미생물 DAP 120:

DAP 120은 그람 음성의 운동성 간상균이다. 성장은 편모성 평판에서 관찰되고, 이는 운동성이 편모성임을 나타낸다. 또한, 본 미생물은 유일한 탄소 및 에너지원으로서 크리센, 피렌, 락테이트, 숙시네이트, 글리옥시레이트, 살리실레이트, 메시틸렌, 바닐린, 리모넨, 신나밀 아세테이트, 카테콜, m-톨루산, 클로로벤젠, 2-, 3-, 및 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 및 4-클로로벤젠산, 및 1,3-디클로로벤젠을 이용할 수 있다. DAP 120은 표 8F에 나타낸 바와 같이 추가로 특징지워 진다.

다음 표 8G는 DAP 2로 명명된 혼합 배양액으로부터 분리된 상기 설명된 순수 배양액이 150 ppm 각각의 니트로벤젠, 나프탈렌, 및 톨루엔으로 보충된 Stanier's 최소 배지에서 성장시킬 수 있다. 25 내지 27℃에서 성장시킨 배양액은 콜로니 크기는 14일 후에 결정된다. 값은 각 결정을 위해 5번 반복된 콜로니의 평균을 나타낸다.

다음 표 8H는 DAP 2로 명명된 혼합된 배양액으로부터 분리된 전술한 순수 배양액은 배양액의 콜로니 사이즈에 의해 결정된 것과 같이 유일한 질소원으로서 멜라민을 이용할 수 있다. 배양액은 유일한 질소원 또는 황산암모늄, (NH₄)₂SO₄로 보충된 각각 150 ppm의 나프탈렌 및 톨루엔과 25 ppm의 멜라민으로 보충된 Stanier's 최소 배지에서 성장시킨다. 배양액을 25 내지 27℃에서 성장시키고, 콜로니 크기는 7일 후에 결정된다. 값은 각 결정을 위해 5번 반복된 콜로니의 평균을 나타낸다.

6.1.6 니트로벤젠을 분해하지 못하는 미생물

많은 미생물이 니트로벤젠을 함유한 슬러지 또는 토양으로부터 분리되고 이 화합물을 호기적으로 분리하는 능력을 시험한다. 다음 균주는 니트로벤젠을 분해할 수 없는 것으로 판명되었다: (1) 슈도모나스 종 DN-1081; (2) 슈도모나스 종 DN-1101-1; (3) 슈도모나스 종 DN-1018; (4) 슈도모나스 종 DN-1019; (5) 슈도모나스 종 DN-1111-1; 및 (6) 슈도모나스 종 DN-1111-2.

6.2. 화합물의 호기적 분해를 위한 방법

본 발명의 양태에 따라서, 방향족 및/또는 치환된 방향족 화합물의 호기적 분해를 위한 방법이 제공된다. 일반적으로, 본 방법은 방향족 화합물을 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물의 혼합 또는 순수 배양액과 접촉을 포함한다. 본 양태의 한 양식에서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물이 호기적으로 분해된다. 본 양태의 다른 양식에서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 2종의 화합물의 혼합물을 호기적으로 분해한다. 본 방법은 미생물이 상기 화합물(들)과 접촉하여 배양되어서 방향족 화합물 또는 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해된다. 본 발명의 다른 양태에 따라서, 본 방법은 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물을 사용하여 약 2 내지 72 시간 동안 CO₂및 H₂O를 함유한 생성물로 총 농도의 약 10 ppm 내지 100,000 ppm에서 적어도 하나의 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 및/또는 할로-니트로-방향족 화합물을 분리한다.

예를 든다면, 바람직한 양태에서, 질소 함유 방향족 화합물이 존재하고, 이들은 CO₂및 H₂O를 함유한 생성물 및 생물권에 거의 위협을 주지 않는 질소 함유 화합물로 분해된다.

본원에서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 분해되는 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 클레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3- 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 멜라민, 시아누르산, 메시틸렌, 및 살리실레이트 같은 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 지방족 화합물의 호기적 분해를 위한 방법이 제공된다. 이러한 지방족 화합물은 δ-(-)-리모넨, 헥사데칸, 메탄올, 포름알데히드 및 클로로포름을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 본 방법은 지방족 또는 할로-지방족 화합물 또는 상기 화합물의 혼합물과 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 구성된 그룹으로부터 선택된 미생물의 멤버인 미생물의 접촉을 포함한다. 본 방법은 상기 미생물을 상기 화합물 또는 화합물의 혼합물과 접촉하여 배양하는 것을 포함하여 상기 화합물 및 이의 혼합물이 CO₂및 H₂O를 함유한 생성물로 분해된다.

본 미생물은 분해될 화합물의 높은 정도를 분해할 수 있어서, 이러한 높은 정도는 실제 분해를 방해하지 않는다.

이러한 방법은 방향족 또는 지방족 화합물 또는 원하는 화합물의 제거를 모니터하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 산소 흡수 또는 일산화탄소 발생의 측정이 본 화합물 또는 원하는 화합물의 분해를 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 또한, pH 및/또는 완충력은 생물학적 활성의 정도를 평가하는데 유용하다.

분해될 화합물은 고체, 액체, 및/또는 가스 형태일 수 있다. 화합물이 가스 및/또는 액체 형태일때, 화합물은 고체 같은 물질에 흡수될 수 있다.

이상적으로는, 본 방법이 미생물의 배양을 포함할 때, 배양 조건은 박테리아 성장이 지지되도록, 예를 들면, pH 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0; 온도 4℃ 내지 41℃, 바람직하게는 15℃ 내지 37℃; 용존 산소 장력 0.1% 내지 100%, 바람직하게는 4% 내지 80%, 더 바람직하게는 4% 내지 40% 포화(여기서 산소는 산소 함유 또는 산소 방출 조성물의 사용에 의해 공급될 수 있다)이어야 한다. 산소 함유 또는 산소 방출 조성물은 공기, 순수 산소, 퍼옥사이드, 또는 산소나 이들의 혼합물을 방출하는 기타 퍼옥시 화합물일 수 있다.

또한, 배양 배지는 양성 용해 산소 장력이 제공되거나 제공되지 않고 교반되거나 교반되지 않을 수 있고, 보충 영양분이 최적의 탄소 : 질소 : 인 비율이 10 : 1 : 0.1 내지 50 : 1 : 1, 바람직하게는 25 : 1 : 0.1을 유지하기 위해 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다. 바람직한 양식에서, 단지 탄소만이 박테리아 성장을 제한한다.

미생물과 임의의 하나 이상의 전술한 화합물 또는 이의 혼합물을 함유한 조성물의 접촉을 위한 임의의 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 접촉을 위한 이러한 방법은 예를 들면, 이러한 화합물 또는 이의 혼합물로 오염된 부위에서의 현장 접촉, 밀폐 용기 또는 컨테이너에서 접촉 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

6.3. 화합물의 호기성 반응을 위한 유체상 시스템

본 발명의 다른 양태에 따라, 화합물의 호기적 반응을 위한 유체상 시스템 및 방법이 제공된다. 가장 바람직하게는, 유체상 시스템은 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 엘라스토머성 고체 또는 슬러지내 함유된 유기 화합물이 호기적 반응을 위해 적당한 유동화된 조성물로 전환시키는 것을 포함한다. 유동화된 조성물을 위한 호기적 반응은 유용하고 유동화된 조성물은 바람직하게는 호기적 조건하에서 일어나는 합성 및 분해 반응을 포함한다.

호기적 반응을 위해 적당한 유동화된 조성물을 제조하기 위한 방법은 (a) 유기 화합물을 함유한 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 미립화하고 (b) 용기내 미립화된 고체 또는 슬러지를 산소, 산소 함유 가스, 공기, 물 및 수용액으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유체의 유동과 접촉하여 미립화된 고체 또는 슬러지가 유체의 유동에 현탁되거나 분산되어 고체 또는 슬러지내 함유된 유기 화합물의 호기적 반응을 위해 적당한 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.

본 엘라스토머성 고체 또는 슬러지는 예를 들면, 퍼그 밀, 플로우-블레이드 믹서 또는 스크류 믹서내에서 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 혼합함으로써 특수화될 수 있다. 특수화된 물질의 크기는 밀 또는 믹서의 블레이드의 크기, 블레이드와 밀 또는 믹서 벽 사이의 청결, 점착방지제의 양, 더한다면, 혼합의 정도 및 속도 같은 다양한 요인에 따라 다양하다.

본 방법은 엘라스토머성 고체 또는 슬러지와 점착방지제를 단계 (a)와 동시에 또는 후속하여 배합하는 것을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 점착방지제는 점토, 저민, 얇게 썬 또는 다르게 미세하게 분리된 유기 물질, 분말상 무기 염 또는 암석 분진으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 대안적 양태에서, 점착방지제는 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 사용될 수 있는 점착방지제의 범위는 약 2 내지 100%(w/w)이다.

본 발명의 양태의 특정 방법에서, 유동화 조성물은 부분적으로 방향족 화합물을 유용한 중합체의 제조에 유용한 시스-시스 무코네이트로 전환시키기 위해 사용된다. 본 발명의 양태의 대안적 방법에서, 유동화 조성물은 해군 군수품 같은 탄화수소, 예를 들면, α-피넨 및/또는 β-피넨, 및 점착방지제를 함유한 조성물을 포함한다. 유동화 조성물은 유리하게 클리너 버닝 연료를 생성하는 산소화된 연료로서 사용된다.

본 발명의 양태의 상이한 특정 방법에서, 유동화 조성물은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 유기 화합물의 호기적 분해를 포함하는 반응을 위해 사용된다. 예를 들면, 호기적 조건하에서 물 또는 수용액내 분산된 니트로벤젠을 함유한, 미립화된 슬러지를 포함하는 유동화 조성물이 ATCC 수탁 번호 제 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 구성된 그룹으로부터 선택된 미생물과 접촉하여 유동화 조성물내 니트로벤젠이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해된다. 도 1b는 본 발명의 방법을 위해 유용한 하나의 유체상 시스템의 개략도이다. 이것은 슬러리를 형성하기 위한 기계적 에너지의 형성에서 에너지를 부여하기 위한 시스템을 도시한다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 화합물의 호기적 분해를 위한 유체상 시스템 및 방법이 제공된다. 예를 들면, 고체, 토양, 및/또는 슬러지로부터 형성된 슬러리인 유체상이 생성된다. 본 슬러리가 고체, 토양 및/또는 슬러지내 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물의 처리를 위해 이러한 화합물과 반응할 수 있는 미생물과 사용된다.

슬러리인 유체상은 비-엘라스토머성 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 생성될 수 있다. 이러한 슬러리는 고체, 슬러지 또는 토양내 함유된 방향족 또는 지방족 화합물 또는 이들의 혼합물을 호기적으로 분해하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따라서, 엘라스토머성 고체, 슬러지 및/또는 토양을 이용한 슬러리의 제조 방법은 본 출원에 기재된 미생물을 이용한 이러한 조성물내 함유된 방향족 또는 지방족 화합물의 호기적 분해를 위해 특히 유리하다.

미생물에 의해 호기적 분해를 위한 슬러리의 제조 방법과 시스템 및 방법은 다음 서브-섹션에 기재된 슬러리를 사용한다.

6.3.1. 슬러리상의 형성

본 양태에 따른 유용한 슬러리상의 형성은 도 2a-b에 개략적으로 도시되어 있다. 도 2a는 비-엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양을 사용한 슬러리의 형성을 도시한다. 본 방법은 (a) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 용기내 고체 또는 슬러지/수성 배합물에 에너지를 부여하여 고체 또는 슬러지가 슬러리로 유동화되는 것을 포함한다.

에너지는 예를 들면, 기계적 에너지 부여, 예를 들면, 혼합; 음향 에너지 부여; 슬러리 물질내 정상 음파 셋업; 또는 전기 또는 자기장 부여에 의해 분배될 수 있다. 도 1a는 또한 기계적 에너지가 부여된 예를 들면, 혼합에 의해 본 발명의 실시 방법을 도시한다.

도 2a에 도시된 바와 같이, 슬러리의 pH는 필요하다면, 예를 들면, 슬러리가 슬러리내 화합물 또는 화합물의 혼합물을 분해시키기 위해 미생물과 접촉된다면, 중성으로 조절될 수 있다.

도 2b는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 슬러리의 형성을 도시한다. 대안적 방법에서, 본 방법은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 용기내 엘라스토머성 고체 또는 슬러지/물 배합물에 분배하여 고체 또는 슬러지를 슬러리로 유동화하며 (c) 슬러리를 임의의 잔류 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 분리하는 것을 포함한다. 대안적으로, 본 방법은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 배합하여 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물을 형성하고 (b) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하여 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 배합물을 형성하며 (c) 에너지를 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 배합물에 부여하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 슬러리내에서 액화시키는 것을 포함한다. 본 방법은 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물을 혼합하여 점착방지 고체 또는 슬러지를 형성하는 것을 추가로 포함한다. 다른 대안에서, 본 발명은 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제 및 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 단계 (a)에서 형성된 혼합물에 부여하여 일래스토모성 고체 또는 슬러지를 슬러리내에서 유동화시키는 것을 포함한다.

에너지는 예를 들면, 기계적 에너지 분배, 예를 들면, 혼합; 수 에너지 부여; 슬러리 물질내 정상 음파 셋업; 또는 전기 또는 자기장 부여에 의해 부여될 수 있다. 도 1a는 또한 기계적 에너지가 분배된 예를 들면, 혼합에 의해 본 발명의 실시 방법을 도시한다.

본 발명에 따라서 슬러리를 생성하기 위해 적당한 점착방지제는 점토, 저민, 얇게 썬 또는 다르게 미세하게 분리된 유기 물질, 분말상 무기 염 또는 암석 분진을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가로 적당한 점착방지제는 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 슬러리를 제조하기 위해 사용된 수성 용액은 전술한 바와 같이 미리 수행된 슬러리상 바이오개선으로부터 여과액일 수 있다.

도 2b에 도시된 바와 같이, 전술된 임의의 대안적 양태는 원한다면, 중성으로 슬러리의 pH를 조절하는 것을 포함한다.

방향족 또는 지방족 화합물 또는 이의 혼합물을 함유한 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양으로부터 슬러리상을 형성하기 위해 전술된 방법은 이러한 슬러리가 상기 화합물 또는 이의 혼합물의 호기적 분해를 위한 유체상 방법에서 유용한 원 엘라스토머성 고체 또는 슬러지의 약 45%(w/w)를 포함할 수 있기 때문에 특히 유리하다. 본 발명의 종래 기술은 이러한 엘라스토머성 물질의 슬러리상 처리가 불가능했다.

따라서, 본 슬러리는 호기적으로 처리될 고체, 슬러지, 토양 또는 기타 폐기물내 함유된 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물 또는 이들의 혼합물에서 바이오개선 방법을 위해 유용하다.

고체, 슬러지, 토양 또는 기타 폐기물내 휘발성 화합물이 존재하면, 이들은 점착방지제와 혼합되는 동안 물질로부터 스트립핑될 것이다. 따라서, 이러한 단계는 휘발물이 트랩된 방법, 예를 들면, 바이오필터내에서 수행되야 한다. 바이오필터에서 일단 트랩되면, 휘발물은 섹션 6.5. 에서 후술되는 바와 같이 미생물로 처리될 수 있다.

6.3.2. 슬러리상 분해를 위한 미생물/접종물

미생물의 순수 배양 또는 섹션 6.1에 기재된 것으로부터 선택된 미생물의 혼합 배양이 슬러리상 방법을 위한 접종물로서 사용된다. 본 미생물은 원하는 화합물 또는 특정 슬러리내 존재하는 화합물의 혼합물을 호기적으로 분해하는 능력을 기준으로 선택된다.

본 미생물은 섹션 6.1에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 유일한 영양원으로서 분해시키기를 원하는 화합물을 함유한 배지에서 이들을 배양함으로써 유도된다.

대안적으로는, 앞서 수행된 슬러리상 바이오개선으로부터 잔류 고체는 이미 유도된 미생물을 함유하고, 슬러리상 방법을 위한 접종으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 슬러리가 바이오개선된 후에, 여과될 수 있다. 여과액은 슬러리를 더 생성하기 위해 사용될 수 있고 이미 유도된 미생물을 함유한“필터 케이크”로 명명된 탈수된 잔류 고체가 바이오개선된 슬러리에 첨가된다.

혼합 배양 접종물원으로서 필터 케이크가 사용될 때, 예를 들면, 4ℓ 배취를 시작하기 위해 필터 케이크의 200 내지 600 g, 바람직하게는 350 내지 450 g이 사용된다. 일단 방향족 또는 지방족 화합물 또는 이의 혼합물이 분해되면, 4ℓ 배취의 함유물이 10 갤론 배취를 위한 접종원으로서 사용될 수 있고, 이것은 차례로 150 갤론 배취를 개시하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 증가된 큰 반응기를 위한 접종물을 확립하기 위해 확대 및 외삽할 수 있다.

필터 케이크가 가능하지 않으면, 접종물은 보존된 배양액당 몇 개의 평판을 접종하기 위해 섹션 6.1.1.에서 6.1.4.에 기재된 미생물을 사용하여 재확립할 수 있다. 이어서 적당한 탄화수소(들)가 보충된 Stanier'의 최소 배지를 함유한 평판이 25℃에서 배양된다. 배양액이 성장되었을 때, 평판을 5 내지 10 ㎖의 Stanier'의 최소 배지로 세척한다. 세척물을 담그고 한천과 적당한 탄화수소(들), 및 50 ㎖의 동일한 조성물의 액체 배지로 보충된 2상 플라스크의 연속물을 접종하기 위해 사용된다. 2상 플라스크에서 미생물이 접종된 후 성장하고, 한천 층의 표면은 세포를 제거하기 위해 스크랩된다. 4개의 플라스크로부터의 액체층은 4ℓ 용기를 접종시키기 위해 사용될 수 있다. 또한 이 시점에서, 추가 확대는 필터 케이크가 접종물원으로서 사용될 때 사용된 것과 동일하다.

6.3.3. 슬러리상 방법 및 바이오개선 파라미터

본 발명에 따라서, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종의 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 슬러리상 바이오개선을 위한 방법은 (a) 필요하다면, 슬러리의 pH를 중성으로 조절하고 (b) ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리로 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 본 방법은 바이오반응기 같은 용기에서 성취될 수 있다.

방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종의 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 슬러리상 바이오개선을 위한 다른 방법은 (a) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 용기내 고체 또는 슬러지/수성 배합물에 부여하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며 (c) 필요하다면 슬러리의 pH를 조절하며 (d) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리로 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다.

고체, 슬러지 또는 토양이 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양이면, 본 방법은 (a) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고 (b) 에너지를 용기내 고체 또는 슬러지/수성 배합물에 부여하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며 (c) 슬러리를 임의의 잔류 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 분리하며 (d) 필요하다면 슬러리의 pH를 조절하며 (d) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 에너지는 슬러리를 형성하기 위해 섹션 6.3.1에서 전술한 임의의 방법을 사용하여 부여될 수 있다. 추가로, 본 방법은 단계 (e)에서 미생물과 접촉하는 중성 슬러리에 잔류 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점차적으로 첨가하는 것을 또한 포함한다.

슬러리내 처리된 고체, 슬러지 또는 토양이 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 화합물의 혼합물을 함유한 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양이면, 본 방법은 대안적으로 (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 배합하고 (b) 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물과 혼합하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 형성하며 (c) 점착방지된 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합시키며 (d) 에너지를 점착방지된 고체 또는 슬러지로 부여하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며 (e) 필요하다면 슬러리의 pH를 중성으로 조절하며 (f) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 에너지는 슬러리를 형성하기 위해 섹션 6.3.1에서 전술한 임의의 방법을 사용하여 부여될 수 있다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리로 미생물을 배양하는 것을 것을 추가로 포함한다.

전술한 임의의 방법에서, 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양은 본 발명의 본 방법에 따라 기술된 바와 형성된 잔류 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양일 수 있다. 각 경우에서 잔류 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양는 매우 높은 농도의 본 발명의 방법에 따라 효과적으로 분해될 수 있는 화합물을 함유할 수 있다.

한 양태에서, 고체, 슬러지, 토양 또는 기타 폐기물을 함유한 화합물은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 멜아민, 시아누르산, δ-(-)-리모넨, 헥사데칸, 메탄올, 포름알데히드, 및 클로로포름 또는 상기 화합물의 혼합물 중에서 선택된다.

적당한 점착방지제는 점토, 저민, 얇게 썬 또는 다르게 미세하게 분리된 유기 물질, 분말상 무기 염 또는 암석 분진 중에서 선택된다. 대안적으로, 점착방지제는 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이의 혼합물 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 본 화합물은 메탄올, 포름알데히드 또는 클로로포름 중에서 선택된다.

바람직한 양태에 따라서, 점착방지제는 암석 분진, 규조토등과 같은 무기염으로부터 선택된다.

슬러리/미생물 혼합물은 박테리아의 성장 및 원하는 화합물(들)의 생분해에 유리한 조건하에서 보존된다. 일반적으로는, 본 조건은 박테리아 성장이 지지되는, 예를 들면, pH 약 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0; 및 온도 4℃ 내지 41℃, 바람직하게는 15℃ 내지 37℃이어야 한다. 용존 산소 장력은 약 0.1% 내지 100%, 바람직하게는 4% 내지 80%, 더 바람직하게는 4% 내지 30% 이어야 한다. 용존 산소 장력은 공기, 순수 산소, 퍼옥사이드, 및/또는 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 화합물에서 산소를 공급함으로써 원하는 범위에서 모니터 및 보존될 수 있다. 혼합물은 양성 용존 산소 장력이 제공되거나 제공되지 않고 교반되거나 교반되지 않을 수 있고, 보충의 영양이 최적의 탄소 : 질소 : 인 비율이 10 : 1 : 0.1 내지 50 : 1 : 1, 바람직하게는 25 : 1 : 0.1을 유지하기 위해 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있고, 단지 탄소만이 박테리아 성장을 제한한다. 추가로, MAGNIFLOC 591C같은 수용성, 중합성 응결제/응집제, 약 300 kD 내지 500 kD의 분자량을 갖는 4급 암모늄 양이온성 중합체(Cytec Industries, West Paterson, NJ)가 여과성 및 슬러리상 바이오반응기내 고체의 침강 특성을 개선시키기 위해 첨가될 수 있다. 침강된 고체는 후속의 바이오개선 과정을 위한 접종물로서 사용될 수 있다.

상이한 시간 시점에서 고체 또는 액체를 제거할 수 있고, 예를 들면, 메틸렌 : 메탄올 (90 : 10) 또는 TCLP 또는 TCL를 위해 EPA 승인된 방법에 의해 추출하고 가스-액체 크로마토그래피에 의해 선택된 화합물(들)의 농도를 측정할 수 있다.

6.3.4. 작동 양식

본 발명의 화합물의 호기적 반응을 위한 유체상 방법은 다양한 양식, 배취 식, 순차적 배취식 및 연속 또는 반-연속 양식에서 작동될 수 있다. 3가지 작동 양식이 방향족 또는 지방족 화합물 또는 이의 혼합물의 호기적 분해의 슬러리상 방법을 위한 작동 양식의 용어로 하기에 설명되어 있지만, 하기에 설명된 작동 양식은 또한 전술한 바와 같은 유동화 조성물에서 유기 화합물을 호기적으로 반응하기 위한 방법을 위해 사용될 수 있다.

3가지 모든 작동 양식에서, 함유물의 샘플은 원하는 화합물(들)의 분해를 모니터하기 위해 주기적으로 제거될 수 있다. 추가로, 반응기 함유물의 교반 및/또는 혼합은 발포를 유도한다. 이러한 경우에, 소포제가 발포를 방지하기 위해 첨가될 수 있다. 적당한 소포제는 소포 에멀션(예를 들면, Dow ANTIFOAM-A; 실리콘 기제 소포제)을 함유한 실리콘을 포함된다.

6.3.4.1. 배취식 작동

배취식 작동은 화합물 또는 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 2종의 화합물의 혼합물을 함유한 슬러리를 바이오반응기 같은 용기내에 배치, 섹션 6.1.1 에서 6.1.4에 설명된 유도된 미생물로 접종 및 미생물을 배양하기 위한 혼합물을 배양하는 것을 포함하여 방향족 또는 지방족 화합물(들)이 분해된다. 예비측정된 시간이 지난 후, 배양을 중지시키고 함유물을 제거시키고 고체는 여과에 의해 액체로부터 분리한다. 이어서 샘플을 고체 및 액체 상 모두에서 취할 수 있고, 예를 들면, 화합물(들)이 분해된 것을 확인하기 위해 화합물(들)의 정도를 측정하기 위한 TCLP 또는 가스-액체 크로마토그래피에 의해 측정한다. 반응기 고체는 연속적으로 탈수되고 추가로, 예를 들면, 매립 또는 다음 배취식을 위한 박테리아 접종액으로서 사용될 수 있다. 배취식에서 탈수된 고체 잔류물은 중량 또는 부피로 약 2% 내지 40%, 바람직하게는 약 5% 내지 20%에서 재-첨가된다.(예를 들면 도 1c 참조)

6.3.4.2. 연속 배취식 작동

연속 배취식은 배취식과 배양 기간 후, 반응기를 잠시, 통상적으로 약 15분 동안 침강하도록 하여, 반응기 함유물의 상단 60% 내지 95%를 제거하여, 다음 배취의 중화된 슬러리를 위한 접종물로서 하단에서 침강된 고체를 제거하는 것만 제외하고는 거의 동일하다. 바람직하게는 70% 내지 90%의 함유물이 제거된다. 연속 배취식이 슬러리상 호기적 분해를 위한 바람직한 양태인데, 왜냐하면 래그 또는 순화상이 감소되고, 높은 정도의 생물량이 반응기에서 유지되고, 폐기물 공급의 조성물에서 변이성이 더 잘 적응되고, 바이오처리 후 남은 잔류 고체가 잠재적으로 감소되기 때문이다.

연속 배취 및 배취식 모두에서 연속 실행을 위한 접종물원으로서 잔류 고체를 사용하고 미사용 슬러리를 제조하기 위해 잔류 유체 또는 여과액을 사용하여 방법은 물의 실제 손실에서 작동한다. 따라서, 이것은 수성 유출액이 생성되지 않는 결과를 초래한다.

6.3.4.3 반-연속 양식

반-연속 양식은 배취 및 연속 배취식과 유사하다. 그러나, 예비측정된 시간 후에 배양을 중지하는 것보다 미사용 슬러리를 처리된 슬러리가 바이오반응기로부터 나오는 주어진 시간 동안 고정된 양으로 바이오반응기내로 펌프된다. 이것은 생분해 과정의 중지없이 슬러리의 연속 처리를 위해 제공된다.

6.4. 고체상 분해

본 발명의 다른 양태는 물질의 고체상 호기적 분해를 위한 방법에 대한 것이다. 본 양태는 타르질 및/또는 천연적으로 엘라스토머성인 고체, 슬러지와 토양, 침전물, 및 흡수 물질, 과립화된 활성 탄소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않고, 물질은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종 화합물의 혼합물을 함유한다.

6.4.1. 고체상 방법 및 바이오처리 파라미터

본 방법은 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 적어도 2종 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 고체상 바이오개선을 위한 방법은 (a) 고체, 슬러지 또는 토양을 공기 같이 쉽게 벌키한 혼합물을 통과하는 증량제와 배합하고 (b) 필요하다면 벌키한 혼합물을 pH를 중성으로 조절하며 (c) 벌키한 혼합물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 벌키한 고체, 슬러지 또는 토양으로 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 고체, 슬러지, 토양 또는 기타 폐기물을 함유한 화합물은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신아밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 멜아민, 시아누르산 또는 상기 화합물의 혼합물 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 고체, 슬러지, 토양을 함유한 화합물은 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, δ-(-)-리모넨, 및 헥사데칸, 또는 상기 화합물의 혼합물 중에서 선택된다.

고체, 슬러지 또는 토양이 적어도 하나의 화합물 또는 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물중에서 선택된 화합물의 혼합물을 함유한 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양인 본 방법은 (a) 타르질 또는 엘라스토머성 고체 또는 타르질 또는 엘라스토머성 슬러지 또는 타르질 또는 엘라스토머성 토양을 점착방지제와 혼합하여 미립화된 혼합물이 덜 타르성 및/또는 엘라스토머성인 고체 토양 또는 슬러지를 형성하고 (b) 필요하다면 혼합물의 pH를 중성으로 조절하며 (c) 혼합물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물과 접촉하는 것을 포함한다. 본 방법은 추가로 특수화된 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 타르질 또는 엘라스토머성 슬러지 또는 타르질 또는 엘라스토머성 토양을 증량제와 동시에 또는 단계 (a) 다음에 배합하는 것을 포함한다.

적당한 점착방지제는 점토, 저민, 얇게 썬 또는 다르게 미세하게 분리된 유기 물질, 분말상 무기 염 또는 암석 분진 중에서 선택된다. 대안적으로, 점착방지제는 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이의 혼합물 중에서 선택된다.

적당한 증량제는 저민, 얇게 썬 또는 다르게 미세하게 분리된 유기 물질, 분말상 무기 염 중에서 선택된다. 더욱 특히, 증량제는 목재 조각, 톱밥, 콘 속, 및 이의 혼합물 중에서 선택된다.

바람직한 양태에 따라서, 증량제는 점착방지제로서 또한 작용할 수 있고,예를 들면, 목재 조각, 톱밥, 콘 속, 및 이의 혼합물이 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

6.4.2. 고체상 분해를 위한 미생물/접종물

미생물의 순수 배양 또는 섹션 6.1에 설명된 것으로부터 선택된 미생물의 혼합 배양이 고체상 방법을 위한 접종물로서 사용된다. 사용된 미생물은 특정 고체에 호기적으로 존재하는 원하는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 분해시키는 능력을 기준으로 선택된다.

미생물은 섹션 6.1에서 설명된 바와 같이, 예를 들면, 유일한 영양원으로서 분해하고자 하는 화합물(들)을 함유한 배지에서 성장시킴으로서 유도된다.

대안적으로, 이미 유도된 미생물을 함유한 앞서 수행한 고체상 바이오개선으로부터 잔류 고체는 고체상 방법을 위한 접종물로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 고체의 파일이 바이오개선된 후, 이미 유도된 미생물을 함유하고, 바이오개선될 다른 파일에 첨가될 수 있다.

만약 바이오개선 파일이 시판되지 않으면, 접종물은 보존된 배양액당 몇 개의 접종하기 위해 섹션 6.1.1에서 6.1.4에 설명된 미생물의 보존된 배양액을 사용하여 재확립될 수 있다. 이어서 적당한 탄화수소(들)로 보충된 Stanier's 최소 배지를 함유한 평판은 25℃에서 배양된다. 배양액이 성장되었을 때, 평판을 5 내지 10 ㎖의 Stanier's 최소 배지로 세척한다. 세척물을 담그고 한천 및 적당한 탄화수소(들), 및 50 ㎖의 동일한 조성물의 액체 매질로 보충된 배지로 2상 플라스크의 시리즈를 접종하기 위해 사용한다. 접종된 미생물이 2상 플라스크에서 성장한 후, 한천 층의 표면이 세포를 제거하기 위해 스크랩된다. 4 플라스크로부터 액체층은 파일을 접종하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 섹션 6.3.2에 기재된 바와 같이 필요한 임의의 크기로 확대될 수 있다.

6.4.3. 고체의 처리

벌키한, 중성화된, 및 접종된 고체가 퇴비형 파일 바이오반응기 또는 용기에 배치된 후, 예비측정된 시간, 예를 들면, 산소, 공기 또는 이의 혼합물이 화합물(들)의 호기적 분해를 확실히 하는 물질을 통과하는 동안 배양된다. 고체 물질은 때때로 혼합될 수 있지만, 이것은 고체가 높은 정도의 휘발성 화합물을 가짐을 반대로 나타낸다. 추가로, 전술한 바와 같이, 고체는 파일 바이오반응기 또는 용기로부터 제거될 수 있고, 예를 들면, 염화메틸렌 : 메탄올(90 : 10)로 추출될 수 있으며, 가스-액체 크로마토그래피 또는 TCLP 과정에 의해 선택된 화합물(들)의 농도를 측정한다.

6.5. 바이오 필터

본 발명의 다른 양태는 바이오필터 및 이의 사용을 위한 방법이다. 바이오필터는 공기, 증기, 에어로졸, 및 물 또는 수성 용액 같은 유출물에서 화합물의 바이오개선에 사용된다.

본 발명의 바이오필터는 고체 지지체상 고정된 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물을 가진 장치를 포함한다. 적당한 고체 지지체는 과립형 활성 탄소, 목재 조각, 알루미나, 루테늄, 산화철, 세라믹 또는 알기네이트를 포함하지마, 이에 제한되지는 않는다. 본 기구는 유입 및 배출 오리피스를 가질 수 있어서, 처리될 물질이 기구를 통해 유동될 수 있다.

예를 들면, 바이오필터는 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 함유한 유출물의 바이오개선을 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 고체 지지체상 고정된 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물을 가진 장치를 포함하는 바이오필터를 통해 유동하는 유출액을 포함한다. 본 방법은 실제로 분해된 화합물(들)을 측정하기 위해 유출물을 모니터하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

6.6. 분해를 위한 2-단계 방법

본 발명의 다른 양태에 따라서, 다염소화된 비페닐, 다브롬화된 비페닐등과 같이 다량으로 할로겐화된 유기 화합물, 트리니트로톨루엔등과 같은 다량으로 니트로화된 유기 화합물과 다량으로 니트로화 및 가교결합된 중합성 화합물, 예를 들면, 니트로셀룰로스등 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유한 폐기물의 호기적 분해를 위한 2단계 방법이 제공된다. 폐기물은 추가로 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 포함한다. 본 방법은 (a) 폐기물내에서 적어도 부분적으로, 다량으로 할로겐화된, 다량으로 니트로화된 또는 다량으로 니트로화된 가교결합된 화합물을 화학적으로 분해할 수 있는 시약과 배합하여 예비처리된 조성물을 형성하고 (b) 예비처리된 조성물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55726, 55727, 55724, 및 55725의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 방법은 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 미생물을 배양하는 것을 추가로 포함한다. 본 양태의 한 양식에서, 적어도 하나의 화합물 또는 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 또는 4-클로로벤조에이트, 1,3-디클로로벤조에이트, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-디니트로벤젠, 1-클로로-3-니트로벤젠, 1-클로로-4-니트로벤젠, 1- 또는 2-메틸나프탈렌, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 멜아민, 시아누르산, 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, δ-(-)-리모넨, 및 헥사데칸으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물의 혼합물을 함유한 폐기물이 분해된다. 본 시약은 황산 제 1 철 및 과산화수소의 혼합물인 Fenton's 시약일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시예는 유리 라디칼, UV 광, 금속성 철, 리그닌 및 리그닌형 효소 같은 퍼옥시다아제 효소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 시약은 분해되기 힘든 화합물(들) 내지 미생물이 분해할 수 있는 화합물을 부분적으로 분해하여 미생물이 본 화합물(들)이 분해를 끝내게할 수 있다.

7. 실시예 : 미생물의 저장 및 유도

분리된 미생물의 혼합 배양액은 4.0 ㎖ Wheaton 바이알내 1.5 내지 2.0 ㎖의 BACTO^TMR2A 배지에서 보존된다. 유지 배지상 접종된 배양액은 25 내지 27 ℃에서 배양된다. 본 배양 후, 본 미생물을 파라필름으로 싸서 4℃에서 보관한다.

한 셋트의 실시예에서, 혼합 배양액은 저장된 배양액을 대기 온도로 되돌림 및 혼합 배양액을 1000 내지 4000 ppm 나프탈렌, 30 내지 300 ppm 니트로벤젠, 400 내지 500 ppm 벤젠, 400 내지 500 ppm 톨루엔, 400 내지 500 ppm 크실렌, 30 내지 300 ppm 아닐린, 400 내지 500 ppm 에틸벤젠, 50 내지 300 ppm 클로로벤젠, 200 ppm 2-메틸나프탈렌 및 약 200 ppm 2-클로로나프탈렌으로 보충된 미사용 BACTO^TMR2A배지로 1% 한천 박테리아성 평판으로 전달함으로써 유도된다. 평판을 25 내지 27℃에서 48 내지 96 시간 동안 배양시킨다. 이어서 배양액을 전술한 것과 같이 동일한 탄화수소 화합물로 보충된 Stanier's 최소 배지[참조문헌: Stanier et al., 1996, J. Gen. Microbiol. 43:159-271]로 박테리아 평판에 전달하고 25 내지 27℃에서 추가로 48시간 동안 배양시킨다. 배양 후, 평판을 5 내지 10 ㎖ Stanier's 최소 배지로 세척하고, 세척물을 담그고 배양하기 위해 2상 플라스크를 사용한다. 2상 플라스크는 상층내 75 ㎖의 Stanier's 최소 배지(액체) 및 2% 한천인 50 ㎖의 Stanier's 최소 배지를 함유한다. 상층 및 하층 모두 전술한 탄화수소로 보충된다. 플라스크를 25내지 27℃에서 48 내지 96시간 동안 배양시킨다.

이제 도입된 세포를 아가의 표면으로부터 취하여 접종물로서 사용한다.

실험의 다른 세트에서, 회수된 배양물을 주위 온도로 회복하고, 혼합된 배양물을 혼합된 배양물을 1000-40000 ppm 나프탈렌, 30-300 ppm 니트로벤젠, 400-500 ppm 벤젠, 400-500 ppm 톨루엔, 400-500 ppm 크실렌, 30-300 ppm 아닐린, 400-500 ppm 에틸벤젠, 50-300 ppm 클로로벤젠, 200 ppm 2-메틸나프탈렌 및 약 200 ppm 2-클로로나프탈렌으로 보충된 미사용 BACTOTM의 0.3 % 한천 세균 평판으로 전달 함으로써 도입한다. 평판을 25 내지 27 ℃에서 48 내지 96 시간 동안 접종한다. 이어서 배양물을 상기에 기재된 바와 동일한 탄화수소 화합물로 보충된 Stanier's 최소 배지[참조문헌: Stanier et al., 1966, J. Gen. Microbiol. 43: 159-271]의 세균 평판에 전달하고, 25 내지 27 ℃에서 48 내지 96 시간 동안 접종한다. 접종 후, 평판을 5 내지 10 ㎖의 Stanier's 최소 배지와 2상 플라스크를 접종하는 데에 사용되고 모아진 세척액으로 연속적으로 세척한다. 2상 플라스크는 상층에 75 ㎖의 Stanier's 최소 배지(액체)와 50 ㎖의 2% 한천을 지닌 Stanier's 최소 배지를 함유한다. 상층과 하층 모두 상기에 기재된 탄화수소로 보충된다. 플라스크를 25 내지 27 ℃에서 48 내지 96 시간 동안 접종한다. 이제 도입된 세포를 한천의 표면으로부터 취하여 접종물로서 사용한다.

8. 실시예 : 슬러리상 분해

8.1 실시예 : 배치식 분해

높은 수준의 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지향족 및 할로 지향족 화합물을 함유하는 엘라스토머성 중합체성 슬러지를 상기의 6.3 장에 기재된 바와 같이 엘라스토머성 중합체성 슬러지를 물과 혼합함으로써 유동화한다.

표 9는 본래의 엘라스토머성 중합체성 슬러지에서 발견된 선택된 화합물에 대한 평균 농도를 ppm으로 나타낸다.

혼합 후, 슬러리를 약 30% (w/w) 슬러리를 형성하기 위해서 잔류 탄성 중합체성 슬러지로부터 통상적으로 교반된 탱크 용기 (B. Braun, Allentown, PA)로 가만히 옮긴다. 슬러리를 NaOH(2N)를 첨가함으로써 약 pH 7로 중화하고, 유도된 미생물의 10%(v/v) 혼합 배양물로 접종한다. 탄성 중합체성 슬러지에 존재하는 이러한 탄화수소 화합물은 미생물의 유일한 탄소원 및 에너지원이다.

접종된 중화된 슬러리를 함유하는 4 ℓ 용기를 약 200-700 rpm으로 교반하고, 실온에서 24 시간 동안 약 15 Psi, 250 ㎖/분으로 통기한다. 슬러리는 슬러리에 존재하는 화합물의 농도를 측정하기 위해 24 시간의 생물학적 처리 전후에 샘플링된다. 슬러리는 독성 용탈 프로토콜 (Toxicity Characteristic Leaching Protocol, TCLP)을 사용하여 추출하고, EPA SW-846에 의해 개괄된 바와 같이 가스-액체 크로마토그래피에 의해 분석한다. 표 10에 제시된 바와 같이, 분석된 슬러리에 존재하는 화합물은 성공적으로 바이오개선된다.

스트립핑 VOC 및 CO₂를 함유하는 유출 가스는 각각 2 개의 입자 활성화된 탄소 트랩과 2 개의 알칼리 (2N KOH) 트랩에 수집된다. 24 시간의 배양기에 걸쳐서, 존재하는 2% 이하의 총 휘발성 유기 화합물이 스트립핑으로 인해 손실된다.

또한 도 3은 존재하는 화합물의 양의 감소와 미생물에 의해 생성된 CO₂량의 증가 사이의 관계를 나타낸다. 용기가 순수 산소로 통기되므로, 일부 CO₂의 생성은 슬러리에 존재하는 화합물의 미생물 호기성 이용의 직접적인 결과이다. 그러므로, 도 3은 또한 미생물이 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 본래의 슬러지에 존재하는 화합물을 이용할 수 있다는 것과 이러한 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 산물로 분해된다는 것을 나타낸다.

8.2 순차적 배치식 분해 : 실시예 1

섹션 8.1 장에 사용된 것과 동일한 엘라스토머성 중합체성 슬러지가 유동화되고, 중화되고, 혼합 배양 접종과 동일한 방법으로 접종된다. 그러나, 바이오개선의 미사용 둥근 용기를 비우고 완전히 재-충진시키기 위해 매 24 시간마다 화합물의 분해를 중지시키는 것보다 반응기의 일부의 내용물만을 비운다. 30 일의 기간 동안, 매 24 시간의 배양 후, 주말을 제외하고, 용기의 내용물을 15분 동안 침강시킨다. 일단 용기의 고체 내용물이 침강되면, 80% 바이오개선 슬러리를 용기의 상단으로부터 제거한다. 동일한 최초 공급으로부터 미사용 비-바이오개선 30% 슬러리(v/v)의 동량을 용기에 첨가한다. 이어서 용기 내용물을 교반하고 섹션 8.1에 기재된 바와 같이 다른 24 시간 동안 산소로 통기시킨다.

용기 내용물의 40 ㎖ 샘플을 각각 24 시간 배양기 전후에 취하고, 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 (90 : 10)로 추출하고, 섹션 8.1에 기재된 바와 같이 가스-액체 크로마토그래피에 의해 나프탈렌에 대해 분석한다. 도 4는 30일의 기간에 걸쳐 순차적 배치식을 사용한 나프탈렌의 호기성 분해가 신속하고 지속적이라는 것과 존재하는 미생물은 700 내지 4,700 ppm의 나프탈렌의 대단한 변이를 묵인한다는 것 및 이러한 대단한 변이는 나프탈렌을 호기적으로 이용하고 이를 CO₂와 H₂O를 포함하는 산물로 분해하는 미생물의 능력에 대해 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.

8.3 순차적 배치식 분해 : 실시예 2

비-엘라스토머성 중합체성 고체를 물로 유동화하여 30%(w/w) 슬러리를 형성한다. 표 11은 본래의 고체에서 발견된 다양한 선택된 화합물의 농도를 ppm으로 나타내었다.

생성된 30% (w/w) 슬러리는 알칼리 pH이고, 8.1 장의 탄성 중합체성 슬러리로부터 1 : 1의 비로 생성된 산성 pH의 30% (w/w) 슬러리로 중화한다. 연속적으로, 2 N H₂SO₄산을 두 슬러리의 결합된 혼합물의 pH에 첨가하여 중화한다. 도입된 미생물 5-20% (w/v), 바람직하게는 약 10%의 혼합된 배양물을 중화된 슬러리에 첨가하고, 혼합물을 교반하고, 24 시간 동안 순수 산소에 통기한다. 접종 후, 내용물을 15분 동안 고정시키도록 하고, 이어서 80%의 내용물을 윗부분에서 취한다. 상기에 기재된 바와 같이 생성된 미사용 중화된 슬러리를 첨가하고 용기의 내용물을 재교반하고 통기시킨다. 용기 내용물의 샘플을 각각 24 시간 접종 전후에 제거하고 벤젠과 나프탈렌에 대해서 분석한다. 도 5는 30일에 걸쳐서 슬러리에 존재하는 벤젠과 나프탈렌의 성공적인 바이오개선을 나타낸다.

8.4 실시예 : 배치식 분해

엘라스토머성 중합체성 슬러지로부터 생성된 30% (w/w) 중화된 슬러리 및 다른 탄성 중합체성 슬러지로부터 생성된 33% (w/w) 중화된 슬러리를 1 : 1의 비로 혼합한다. 상기 표 9 및 표 12는 각각의 개별적인 엘라스토머성 중합체성 슬러지에 일부 선택된 화합물의 평균 농도를 ppm으로 나타내었다.

슬러리 혼합물을 교반된 탱크 용기에 첨가하고, 미생물의 도입되고 혼합된 배양물로 접종한다. 용기 내용물을 교반하고 40 시간 동안 실온에서 순수 산소에 통기시킨다. 접종 전에 취해진 용기 내용물의 샘플을 16 시간과 40 시간에 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 (90 : 10)으로 추출하고 기재된 바와 같이 가스-액체 크로마토그래피에 의해 분석한다. 표 13은 분석된 화합물에 대해, 화합물이 미생물에 의해 성공적으로 바이오개선된다는 것을 보여 준다.

9. 실시예 : 퇴비작용-유사 고체 상 분해

고체 상 분해를 챔버, 제조된 파일, 힙 등에서 수행할 수 있다.

9.1 실시예 : 휘발성 유기 화합물의 손실

고농도의 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 방족 및 할로-지방족 화합물의 혼합물을 함유한 5개의 개별적인 엘라스토머성 중합체성 슬러지를 본 발명의 방법에 따른 물질내 화합물의 호기성 분해에 대한 물질의 제조 동안 스트립핑에 기인한 예를 들면 벤젠과 같은 휘발성 유기 화합물 (VOC)의 손실에 대한 포텐셜을 측정하기 위해서 톱밥과 함께 퍼그 분쇄기에서 혼합함으로써 개별적으로 벌킹된다.

탄성 중합체성 슬러지 및 증량제, 즉 톱밥을 퍼그 분쇄기에 첨가한다. 슬러지 1-3 및 5에 있어서, 증량제는 20%의 혼합물을 포함하고, 반면에 슬러지 4에서 증량제는 25%의 혼합물을 포함한다. 혼합하는 동안 질소 가스가 퍼그 분쇄기의 윗부분을 통과하여 존재하는 어떠한 가연성 물질의 연소도 방지한다. 분석을 위한 샘플을 혼합 전후에 취하고 벤젠과 클로로벤젠의 상대적인 양은 가스-액체 크로마토그래피에 의해 측정한다.

표 14에서 제시하는 바와 같이, 시험된 5개의 슬러지 중에서 4에 있어서, 스트립핑으로 인한 벤젠의 손실은 단지 6 내지 26%이다. 그러나, 시험된 슬러지 1에 있어서, 손실된 벤젠의 양은 존재하는 벤젠의 본래의 양의 70 내지 90%이다. 클로로벤젠은 전반적으로 적은 정도로 스트립핑되지만, 대부분의 벤젠을 손실한 슬러지는 또한 대부분의 클로로벤젠을 손실한다. 이러한 슬러지는 10.5 이상의 pH를 지닌다는 점에서 독특하지만 기타 슬러지는 다소 산성이다. 이러한 결과는 특정 슬러지 또는 고체의 ph가 휘발성 유기 화합물이 처리 동안 손실된다는 것을 나타낸다.

9.2 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 1

예를 들면 벤젠, 톨루엔, 니트로벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 클로로포름, 크실렌, 아닐린 및 에틸벤젠과 같은 유기 화합물의 혼합물을 함유하는 토양을 증량제, 즉 톱밥과 함께 퍼그 분쇄기에서 섞는다. 80% 토양/20% 톱밥 혼합물을 NaOH를 첨가함으로써 중화한다. 중화된 혼합물을 도입되고 액체 혼합된 미생물의 배양물로 접종된 용기에 넣고, 혼합물을 파일로서 14일 동안 처리한다. 밀봉된 용기를 혼합물을 통하여 공기를 빼기 위해 진공 상태에서 작동시킨다. 혼합물을 통한 적합한 공기 확산이 혼합물 아래에 위치된 구멍뚫린 관의 네트워크에 의해 수행된다. 유출 공기는 두개의 입자화 활성화된 탄소(GAC) 트랩을 통과하여 휘발성 유기 화합물(VOC)을 수집한다. 습기 함량 및 공기 유동은 혼합 동안 일정하게 유지된다. 혼합 전후에 토양의 샘플을 취하고 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 (90:10) 또는 TCLP에 의해 추출하고, 선택된 혼합물, 예를 들어 벤젠 및 니트로벤젠에 대해서 가스-액체 크로마토그래피에 의해 분석한다. 용매 추출(메틸렌 클로라이드 : 메탄올)과 TCLP, 및 잔류 물질과 스트립핑되고 GAC 트랩에 트랩핑된 것들에서의 VOC의 퍼센티지에 의해 분석된 혼합 전후에 벌킹된 토양에서 발견된 선택된 화합물의 농도를 나타낸다. 고체상 생처리는 분석된 화합물의 농도를 TCPL 한계로 감소시킬 수 있다.

토양 상태 : 접종됨, 30-45% 습기, 0.25 slpm 공기 유동

9.3 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 2

유기 화합물을 함유하는 타르질 토양을 벌킹제, 즉 톱밥과 퍼그 분쇄기에서 혼합한다. 타르질 토양/ 톱밥 혼합물 (80:20)을 NaOH를 첨가하여 중화하고, 용기에 넣는다. 중화된 혼합물을 도입되고 액체 혼합된 배양물로 접종하고 용기를 밀봉한다. 혼합물을 섹션 9.2에 기재된 바와 같이 처리하고 분석한다. 표 16은 타르질 토양의 2개의 독립적인 성공적인 생처리를 보여 준다. 벌킹 물질을 TCLP에 의해 측정된 바와 같이 벤젠과 클로로벤젠에 대해 성공적으로 처리한다.

주목할만한 퍼센티지의 벤젠(63%)과 클로로벤젠(35.5%)를 처리의 처음 2일 동안 스트립핑함으로써 신속하게 제거하고, 순차적으로 제거를 좀더 천천히 수행한다. 40% 이상의 나프탈렌이 제거가 주로 존재하는 미생물에 의한 화합물의 예정된 호기성 분해라는 것을 나타내는 매우 적은 스트립핑(4%)의 처리 동안 제거된다.

9.4 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 3

타르질 토양을 퍼그 분쇄기에서 토양을 톱밥과 혼합시킴으로써 점착 방지하고 벌킹한다. 이러한 혼합물을 NaOH로 중화하고, 용기에 넣는다. 혼합물을 도입되고 액체 혼합된 배양물로 접종하고, 용기를 밀봉한다. 접종된 혼합물을 섹션 9.2에 기재된 바와 같이 처리한다. 표 17에서 나타내는 바와 같이, 타르질 토양의 두개의 독립적인 바이오처리가 수행된다.

타르질 토양 상태 : 접종됨, 30-50% 습기, 0.25 slpm 공기 유동

타르질 토양은 매우 고농도의 벤젠 (25,000 ppm)과 적은 양의 클로로벤젠과 니트로벤젠을 함유한다. 고체상 바이오처리는 이러한 화합물의 농도를 TLCP 한계로 감소시킬 수 있다. 최종 벤젠 농도는 10 ppm 이하이다. 미생물에 의한 화합물의 신속한 제거는 처음 48 시간에 일어나고, TCLP 한계로의 제거는 1주 이내에 수행된다. 그러나, 나프탈렌은 20 내지 25%만이 14일후에 미생물에 의해 제거된다.

9.5 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 4

탄성 중합체성 슬러지를 엘라스토머성 중합체성 슬러지와 톱밥을 함께 퍼그 분쇄기에서 혼합시킴으로써 점착방지하고 벌킹한다. 혼합하는 동안, 질소 가스가 윗부분을 통과하여 가연성 물질의 연소를 방지한다. 벌킹되고 점착방지된 슬러지를 용기에 용기에 넣고 NaOH를 참가하여 중화한다. 슬러지와 톱밥의 중화된 혼합물을 도입되고 액체 혼합된 배양물로 접종하고, 용기를 밀봉한다. 물질을 섹션 9.2에 기재된 바와 같이 14일 동안 파일로서 처리한다. 표 18은 엘라스토머성 중합체성 슬러지의 2개의 성공적인 독립적 생처리를 보여 준다.

슬러지 상태 : 접종됨, 30-50% 습기, 0.25 slpm 공기 유동

엘라스토머성 중합체성 슬러지를 벤젠과 니트로벤젠에 대해 성공적으로 처리한다. 두 화합물의 최종 농도는 10 ppm 이하이다. 또한, 나프탈렌을 초기에 13,000 내지 15,000 pm으로부터 330 ppm 이하로 분해한다. 그러나, 이러한 화합물의 모든 제거가 호기성 바이오개선 때문만은 아니다. (90%) 이상의 벤젠과 약 (15%)의 니트로벤젠을 처음 2일 동안 혼합물로부터 스트립핑한다. 한편, 스트립핑은 이들의 제거가 주로 첨가된 미생물에 의한 화합물의 호기성 분해때문이라는 것을 나타내는 나프탈렌과 클로로벤젠에 대한 주된 제거 메카니즘은 아니다.

9.6 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 5

높은 수준의 벤젠, 클로로벤젠, 니트로벤젠 및 나프탈렌의 혼합물을 함유하는 타르질 슬러지를 벌킹하고, 타르질 슬러지를 톱밥(25% w/w)과 혼합시킴으로써 더욱 소량의 타르질인 것을 제조한다. 벌킹된 슬러지를 NaOH로 중화하고, 용기에 넣는다. 중화되고 벌킹된 술러지를 미생물(2-10% w/v)의 액체 혼합 배양물로 접종하고, 용기를 밀봉한다. 슬러지, 톱밥 및 미생물의 혼합물을 14일 동안 파일로서 처리한다. 혼합물을 시험될 화합물의 제거 동안 성공적으로 처리한다. 표 19는 TCLP에 의해 측정된 벤젠, 클로로벤젠, 니트로벤젠, 및 나프탈렌의 성공적인 호기성 바이오개선을 나타낸다. 17% 이하의 니트로벤젠을 제외하고, 30 내지 60%의 클로로벤젠과 10 내지 30%의 벤젠이 스트립핑으로 인하여 손실된다. 이것은 이러한 화합물의 주된 제거 방법이 이러한 화합물의 세균성 호기성 분해에 의한 것이라는 것을 나타낸다.

타르질 슬러지 상태 : 접종됨, 30-35% 습기, 0.25 slpm 공기 유동

9.7 퇴비작용-유사 고체 상 분해 : 실시예 6

비-엘라스토머성 공중합체 슬러지를 상기에 기재된 바와 같이 톱밥(20% w/w)와 벌킹한다. 알칼리 pH를 지닌 벌킹된 슬러지를 H₂SO₄로 중화한다. 중화되고 벌킹된 슬러지를 용기에 넣고, 액체 혼합 배양물로 접종하고, 14일 동안 처리한다. 표 20은 동일한 개시 물질의 2개의 성공적인 개별적인 바이오처리를 보여 준다.

슬러지

상태 : 접종됨, 50-55% 습기, 250 slpm 공기 유동

주목할만한 양의 벤젠과 클로로벤젠을 스트립핑하고 GAC 트랩에 트랩핑한다. 스트립핑된 벤젠과 클로로벤젠 중에서, 95% 이상의 벤젠과 90% 이상의 클로로벤젠을 처음 48 시간 후에 스트립핑한다. 이러한 신속한 제거다음 잉여 시간에 걸쳐 천천히 감소한다.

10. 미생물의 수탁

하기의 미생물을 1994년 12월 13일, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC), Rockville, MD에 수탁하였고, 표시된 수탁 번호가 임명되었다.

하기의 미생물을 1995년 11월 30일, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC), Rockville, MD에 수탁하였고, 표시된 수탁 번호가 임명되었다.

본원에 기재된 특정 실시예가 본 발명의 여러 양태를 제시하려는 의도이므로 본원에 기재되고 청구된 발명은 이러한 양태에 의해 제한되지 않는다. 여타의 동등한 실시예는 본 발명의 범주에 포함되도록 의도된다. 사실상, 또한 본원에서 제시되고 기재된 본 발명의 다양한 변형은 전술한 기재로부터 당분야 전문가들에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범주내에 포함되도록 의도된다.

다수의 참고문헌이 본원에 언급되어 있고, 전체 명세서는 참고문헌에 의해 완전히 본원에 포함된다.

국제 출원 번호 : PCT/ /

PCT/RO/134(cont.)

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션

미국

메릴랜드 20852 록크빌

파크론 드라이브 12301

Claims (96)

1. 하기 균주로부터 선택된 미생물의 생물학적 순수 배양액:

   [표]

   
2. ATCC 수탁 번호 55644의 미생물 DAP 2의 생물학적 혼합 배양액.
3. 화합물의 혼합물을 미생물 배양액과 접촉시키는 것을 포함하는, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 호기적으로 분해하기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른, 화합물 또는 미생물 배양액의 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되는 용도.
5. 제 3 항에 있어서, ATCC 수탁 번호 제 55644의 미생물의 용도.
6. 제 3 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 방향족, 니트로-방향족, 또는 할로-방향족 화합물 또는 이의 혼합물이고, 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644인 방법.
7. 제 3 항에 있어서, 화합물이 방향족, 니트로-방향족, 또는 할로-방향족 화합물인 용도.
8. 제 3 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 클레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 살리실레이트, 1,4-디니트로벤젠, 클로로톨루엔, 클로로벤조에이트, 클로로-니트로-벤젠, 멜라민, 시아누르산, 헥사데칸, 리모넨, 또는 상기 화합물의 적어도 2개의 혼합물인 용도.
9. 제 3 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물의 배양액이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55722, 55723, 55725, 55726 및 55727의 미생물로부터 선택되는 용도.
10. 제 3 항에 있어서, 화합물이 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센이고 미생물의 배양액이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55646, 55649, 55645, 55641 및 55648의 미생물로부터 선택되는 용도.
11. 제 3 항에 있어서, 화합물이 아닐린이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55645, 55641, 55648, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물로부터 선택되는 용도.
12. 제 3 항에 있어서, 화합물이 메시틸렌, 리모넨, 클로로벤젠, 2-, 3- 또는 4-클로로톨루엔, 2-, 3-, 또는 4-클로로벤조산, 1,3-디클로로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55722, 55723, 55726, 55727 및 55724의 미생물로부터 선택되는 용도.
13. 제 3 항에 있어서, 화합물이 멜라민이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55722, 55723, 55726, 55727 및 55724의 미생물로부터 선택되는 용도.
14. 제 3 항에 있어서, 화합물이 시아누르산이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55645 및 55641 중에서 선택되는 용도.
15. 제 3 항에 있어서, 방향족, 니트로-방향족 및 할로-방향족 화합물의 혼합물이 화합물의 총 농도 범위의 약 10 ppm 내지 100,000 ppm에서 약 2 내지 72시간내에 CO₂및 H₂O를 포함하는 화합물로 분해되는 용도.
16. 제 3 항에 있어서, 화합물이 pH값이 약 3 내지 11인 배지에서 미생물과 접촉하는 용도.
17. 제 16 항에 있어서, pH값이 약 6 내지 8인 용도.
18. 제 3 항에 있어서, 산소 함유 또는 산소 방출 조성물을 첨가함으로써 산소를 공급하는 것을 추가로 포함하는 용도.
19. 제 18 항에 있어서, 산소 함유 또는 방출 조성물이 공기, 순수 산소, 퍼옥사이드, 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 화학제 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
20. 제 18 항에 있어서, 산소가 용존 산소 장력이 약 0.1% 내지 100%의 포화로 공급되는 용도.
21. 제 20 항에 있어서, 용존 산소 장력이 약 4% 내지 80%의 포화인 방법.
22. (a) 유기 화합물을 함유한 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 미립화하고

    (b) 미립화된 고체 또는 슬러지를 산소, 산소 함유 가스, 물 및 수용액으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유체의 유동과 접촉시켜서, 미립화된 고체 또는 슬러지가 유체의 유동에 현탁되어 고체 또는 슬러지내 함유된 유기 화합물의 호기적 반응을 위해 적당한 유동화된 조성물을 형성하는 것을 포함하는 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 호기적 반응에 적당한 유동화된 조성물을 생성하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 산소 함유 가스가 공기인 방법.
24. 제 22 항에 있어서, 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 동시에 또는 단계 (a)전에 배합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
25. (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고

    (b) 에너지를 고체 또는 슬러지/물 배합물에 부여하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며

    (c) 슬러리를 임의의 잔류 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 분리하는 것을 포함하는 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 슬러리를 생성하기 위한 방법.
26. (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 배합하여 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물을 형성하고

    (b) 고체 또는 슬러지 점착방지제를 물 또는 수용액과 배합시키며

    (c) 에너지를 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 혼합물에 부여하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키는 것을 포함하는 엘라스토머성 고체 또는 슬러지로부터 슬러리를 생성하기 위한 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물이 단계 (b)전에 점착방지된 고체 또는 슬러지를 형성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 단계 (a) 및 (c)가 동시에 수행되는 방법.
29. 제 24, 26 또는 28 항에 있어서, 점착방지제가 점토, 분말 무기 염 및 암석 분진으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
30. 제 24, 26 또는 28 항에 있어서, 점착방지제가 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
31. 제 26 항 또는 제 28 항에 따라 생성된 슬러리를 포함하는 조성물.
32. (a) 필요하다면 슬러리의 pH를 중성으로 조절하고

    (b) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 포함하는 슬러리의 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
33. 제 32 항에 있어서,

    (c) 미생물을 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리와 배양하는 것을 추가로 포함하는 용도.
34. 제 33 항에 있어서, 화합물이 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족 화합물인 용도.
35. 제 32 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 및 55641의 미생물로부터 선택되는 용도.
36. 제 32 항에 있어서, 화합물 또는 이의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 스티렌, 메탄올, 포름알데히드 또는 클로로포름, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 1,4-디니트로벤젠, 클로로톨루엔, 클로로벤조에이트, 클로로-니트로-벤젠, 멜라민, 시아누르산, 헥사데칸, 리모넨, 또는 상기 화합물의 적어도 2개의 혼합물인 용도.
37. (a) 고체 또는 슬러지를 물 또는 수용액과 배합하고,

    (b) 에너지를 용기내 고체 또는 슬러지/수성 배합물에 부여하여 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며,

    (c) 필요하다면 슬러리의 pH를 중성으로 조절한 다음,

    (d) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하는 것을 포함하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 함유한 고체 또는 슬러지의 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
38. 제 37 항에 있어서,

    (e) 미생물을 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리와 배양하는 것을 추가로 포함하는 용도.
39. 제 37 항에 있어서, 고체 또는 슬러지가 엘라스토머성 고체 또는 슬러지이고 잔류 엘라스토머성 고체 내지 슬러지를 단계 (c)전에 분리하는 것을 추가로 포함하는 용도.
40. 제 39 항에 있어서, 단계 (d)에서 미생물과 접촉된 중성 슬러리에 잔류 고체 또는 슬러지를 점차적으로 첨가하는 것을 추가로 포함하는 용도.
41. 제 37 항에 있어서, 화합물 또는 혼합물이 방향족, 니트로-방향족, 할로-니트로-방향족, 또는 할로-방향족 화합물 또는 이의 혼합물인 용도.
42. (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제와 배합하고,

    (b) 고체 또는 슬러지/점착방지제 배합물을 물 또는 수용액과 배합시키며,

    (c) 에너지를 고체 또는 슬러지/점착방지제 수성 혼합물에 부여하여 점착방지된 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며,

    (d) 필요하다면 슬러리의 pH를 중성으로 조절한 다음,

    (e) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 함유한 엘라스토머성 고체 또는 슬러지의 유체상 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
43. 제 42 항에 있어서, 점착방지된 고체 또는 슬러지를 형성하기 위해 단계 (b)전에 고체 또는 슬러지/점척방지제 배합물을 혼합하는 것을 추가로 포함하는 용도.
44. (a) 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 점착방지제 및 물 또는 수용액과 배합하여 혼합물을 형성하고,

    (b) 에너지를 단계 (a)에서 형성된 혼합물에 부여하여 엘라스토머성 고체 또는 슬러지를 슬러리내로 유동화시키며,

    (c) 필요하다면 슬러리의 pH를 중성으로 조절한 다음,

    (d) 중성 슬러리를 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하는 것을 포함하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 함유한 엘라스토머성 고체 또는 슬러지의 유체상 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
45. 제 40 항에 있어서,

    (e) 미생물을 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 슬러리와 배양하여 것을 추가로 포함하는 용도.
46. 제 44 항에 있어서, 화합물이 또는 혼합물이 방향족, 니트로-방향족 또는 할로-방향족 화합물 또는 이의 혼합물인 용도.
47. 제 42 항 또는 제 44 항에 있어서, 점착방지제가 점토, 분말 무기 염 및 암석 분진으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
48. 제 42 항 또는 제 44 항에 있어서, 점착방지제가 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 톱밥, 규조토, 분말 콘 속, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
49. 제 37, 42 또는 44 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드 또는 클로로포름, 또는 이의 혼합물인 용도.
50. 제 32, 37, 42 또는 44 항에 있어서, 슬러리로부터 화합물 또는 화합물의 혼합물의 소실을 모니터하는 것을 추가로 포함하는 용도.
51. 제 32, 37, 42 또는 44 항에 있어서, 산소 함유 또는 산소 방출 조성물을 첨가함으로써 산소를 공급하는 것을 추가로 포함하는 용도.
52. 제 51 항에 있어서, 산소 함유 또는 방출 조성물이 공기, 순수 산소, 퍼옥사이드, 산소를 방출하는 기타 퍼옥시 화학제 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
53. 제 51 항에 있어서, 산소가 용존 산소 장력이 약 0.1% 내지 100%의 포화로 공급되는 용도.
54. 제 53 항에 있어서, 용종 산소 장력이 약 4% 내지 80%의 포화인 방법.
55. 제 33, 38, 또는 45 항에 있어서, 배양이 10 : 1 : 0.1 내지 50 : 1 : 1의 비율에서 탄소, 질소, 인의 존재하에서 발생하는 용도.
56. 제 55 항에 있어서, 비율이 약 25 : 1 : 0.1인 용도.
57. 제 42, 43, 44 또는 47 항에 있어서, 점착방지제가 약 2 내지 100% (w/w)의 원 고체 또는 슬러지인 방법.
58. 제 32, 33, 42 또는 44 항에 있어서, 슬러리가 약 20 내지 100% (w/w)의 원 고체 또는 슬러지인 방법.
59. 제 58 항에 있어서, 슬러리가 약 62 내지 100% (w/w)의 원 고체 또는 슬러지인 방법.
60. 제 32, 37, 42 또는 44 항에 있어서, 바이오개선 방법이 배취식 작동, 순차적 배취식 작동 또는 연속식 작동으로서 수행되는 방법.
61. (a) 고체, 슬러지 또는 토양을 증량제와 혼합하여 액체가 벌키한 혼합물을 쉽게 통과하고,

    (b) 필요하다면 벌키한 혼합물의 pH를 중성으로 조절하며,

    (c) 벌키한 혼합물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하는 것을 포함하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 함유한 고체, 슬러지 또는 토양의 고체상 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
62. 제 62 항에 있어서,

    (d) 미생물을 화합물이 CO₂및 H₂O를 포함하도록 벌키한 고체, 슬러지 또는 토양과 배양하여 생성물로 분해되는 것을 추가로 포함하는 용도.
63. 제 61 항에 있어서, 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644를 가진 용도.
64. 제 61 항에 있어서, 화합물 또는 혼합물이 방향족, 니트로-방향족 또는 할로-방향족 화합물 또는 이의 혼합물인 용도.
65. 제 62 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 1,4-디니트로벤젠, 클로로톨루엔, 클로로벤조에이트, 클로로-니트로-벤젠, 멜라민, 시아누르산, 헥사데칸, 리모넨, 또는 화합물의 혼합물인 용도.
66. 제 61 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 및 55641의 미생물로부터 선택되는 용도.
67. 제 61 항에 있어서, 화합물이 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55646, 55649 및 55645의 미생물로부터 선택되는 용도.
68. 제 61 항에 있어서, 화합물이 아닐린이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55645, 55641 및 55648의 미생물로부터 선택되는 용도.
69. (a) 엘라스토머성 고체, 타르질 또는 엘라스토머성 슬러지 또는 타르질 또는 엘라스토머성 토양을 점착방지제와 혼합하여 고체, 토양 또는 슬러지가 덜 타르질 및/또는 엘라스토머성인 미립화된 혼합물을 형성하고,

    (b) 필요하다면 혼합물의 pH를 중성으로 조절하며,

    (c) 혼합물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726 및 55727의 미생물과 접촉하는 것을 포함하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 이들 화합물의 혼합물을 함유한 타르질 및/또는 엘라스토머성 고체, 슬러지 또는 토양의 고체상 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
70. 제 69 항에 있어서,

    (d) 미생물을 화합물 또는 화합물의 혼합물이 CO₂및 H₂O를 포함하는 생성물로 분해되도록 화합물 또는 화합물의 혼합물과 배양하여 것을 추가로 포함하는 용도.
71. 제 69 항에 있어서, 미립화된 타르질 또는 엘라스토머성 고체, 타르질 또는 엘라스토머성 슬러지 또는 타르질 또는 엘라스토머성 토양을 증량제와 동시에 또는 단계 (a)후에 배합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
72. 제 69 항에 있어서, 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644인 용도.
73. 제 69 항에 있어서, 화합물 또는 혼합물이 방향족, 니트로-방향족 또는 할로-방향족 화합물 또는 화합물의 혼합물인 용도.
74. 제 69 항에 있어서, 화합물 또는 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 1,4-디니트로벤젠, 클로로톨루엔, 클로로벤조에이트, 클로로-니트로-벤젠, 멜라민, 시아누르산, 헥사데칸, 리모넨, 또는 화합물의 적어도 2개의 혼합물인 용도.
75. 제 69 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 및 55641의 미생물로부터 선택되는 용도.
76. 제 69 항에 있어서, 화합물이 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55646, 55649 및 55645의 미생물로부터 선택되는 용도.
77. 제 69 항에 있어서, 화합물이 아닐린이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55645, 55641 및 55648의 미생물로부터 선택되는 용도.
78. 제 61 항 또는 제 71 항에 있어서, 증량제가 잘게 썬 유기 물질 및 무기 염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
79. 제 61 항 또는 제 71 항에 있어서, 증량제가 목재 조각, 톱밥, 콘 속, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
80. 제 69 항에 있어서, 점착방지제가 분말 석회, 포오틀랜트 시멘트, 벤토나이트 점토, 규조토, 톱밥, 분말 콘 속 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
81. 제 61 항 또는 71 항에 있어서,

    (d) 벌키한 혼합물로부터 화합물 또는 화합물의 혼합물의 소실을 모니터하는 것을 추가로 포함하는 용도.
82. (a) 폐기물내에서 다량으로 할로겐화된 유기 화합물, 다량으로 니트로화된 유기 화합물 또는 다량으로 니트로화 및 가교결합된 중합성 화합물을 화학적으로 전환할 수 있는 시약과 배합하여 예비처리된 조성물을 형성하고,

    (b) 예비처리된 조성물을 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726, 및 55727의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물과 접촉시키는 것을 포함하고, 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유한 폐기물의 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
83. 제 82 항에 있어서,

    (c) 화합물 또는 화합물의 혼합물을 CO₂및 H₂O를 포함하도록 미생물과 배양하여 생성물로 분해하는 것을 추가로 포함하는 용도.
84. 제 82 항에 있어서, 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644인 용도.
85. 제 82 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드, 클로로포름, 피렌, 아세나프탈렌, 플루오로란텐, 페난트렌, 벤조-(b)-플루오란텐, 디벤조퓨란, 크리센, 카테콜, m-톨루산, 신나밀 아세테이트, 바닐린, 트랜스-신남알데히드, 메시틸렌, 살리실레이트, 1,4-디니트로벤젠, 클로로톨루엔, 클로로벤조에이트, 클로로-니트로-벤젠, 멜라민, 시아누르산, 헥사데칸, 리모넨, 또는 이의 혼합물인 용도.
86. 제 82 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 및 55641의 미생물로부터 선택되는 용도.
87. 제 82 항에 있어서, 화합물이 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55646, 55649 및 55645의 미생물로부터 선택되는 용도.
88. 제 82 항에 있어서, 화합물이 아닐린이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55645, 55641 및 55648의 미생물로부터 선택되는 용도.
89. 제 82 항에 있어서, 시약이 Fenton's 시약 또는 금속성 철인 용도.
90. 고체 지지체상 고정된 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726, 및 55727의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물의 배양을 가진 장치를 포함하는 바이오필터.
91. 고체 지지체상 고정된 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 55641, 55647, 55642, 55643, 55646, 55649, 55722, 55723, 55724, 55725, 55726, 및 55727의 미생물로 이루어진 그룹의 멤버인 미생물을 가진 장치를 포함하는 바이오필터를 통하여 유출물의 유동을 포함하는 방향족, 니트로-방향족, 할로-방향족, 할로-니트로-방향족, 지방족 및 할로-지방족 화합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물 또는 화합물의 혼합물을 함유한 유출물의 바이오개선을 위한 방법에서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 미생물 배양액의 용도.
92. 제 91 항에 있어서, 미생물이 ATCC 수탁 번호 55645인 용도.
93. 제 91 항에 있어서, 화합물 또는 화합물의 혼합물이 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠, 나프탈렌, 클로로벤젠, 페놀, 크레졸, 니트로벤젠, 아닐린, 안트라센, 디메틸페놀, 스티렌, 할로나프탈렌, 메틸나프탈렌, 메탄올, 포름알데히드, 또는 클로로포름인 용도.
94. 제 91 항에 있어서, 화합물이 니트로벤젠이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55645, 및 55641의 미생물로부터 선택되는 용도.
95. 제 91 항에 있어서, 화합물이 나프탈렌, 메틸나프탈렌, 클로로나프탈렌 또는 안트라센이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55648, 55646, 55649 및 55645의 미생물로부터 선택되는 용도.
96. 제 91 항에 있어서, 화합물이 아닐린이고 미생물이 ATCC 수탁 번호 55644, 55645, 55641 및 55648의 미생물로부터 선택되는 용도.

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