KR100208847B1 - 인간 리노바이러스 수용체 단백질의 다중형 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 리노바이러스에 효과적으로 결합하고 HRV 감염율을 효과적으로 감소시킬 수 있는 다중형 구조를 포함하는 세포내 접착 분자(ICAM)의 신규 형태 및 구조에 관한 것이다. 다중형 구조, 바람직하게는 다이머일 경우, 이 단백질들은 HRV의 결합을 증진시키는 역할을 하고 주요 군 인간 리노바이러스 수용체(HRR)에 결합하는 공지의 다른 바이러스의 감염율 뿐만 아니라 HRV 감염율을 감소시킬 수 있다. 다중형 단백질은 임파구 기능 관련 항체-1(LFA-1)과 상호 작용하는 tICAM을 차단하는데 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 인간 리노바이러스와 효과적으로 결합하여 HRV 감염을 효과적으로 감소시킬 수 있는 단백질들의 완전 길이형과 절단형을 포함하는 세포간 접착 분자(ICAM)의 신규 다중형 구조 및 형태에 관한 것이다.
인간 리노바이러스 수용체(HRR)라고도 공지된 완전 길이형 ICAM은 막투과 ICAM(tmICAM-1)으로 언급되고, 절단형 ICAM(tICAM)이라고도 알려진 비-막투과 ICAM 형태는 완전 길이형보다 짧다. 다중형 구조, 바람직하게는 다이머일 경우, 이 단백질들은 인간 리노바이러스(HRV)의 결합을 증가시키는 역할을 하며 HRV 감염을 감소시킬 수 있다. 게다가, 이 다중형 단백질들은 콕삭키(coxsackie) A 바이러스와 같은 주요 군 인간 리노바이러스 수용체(HRR)와 결합하는 것으로 공지된 다른 바이러스들의 감염을 감소시키는 데 이용될 수 있으며, 면역 반응에 포함된 많은 세포 접착 과정에 중요한 임파수 기능 관련 항원-1(LFA-1)과 막투과 세포내 접착분자(tmICAM)와의 상호 작용을 차단하는데 이용될 수 있다. 최근에, 이러한 다중 단백질들은 특히 상호 작용에 직접적으로 영향을 미치는 다른 약제들에 대하여 ICAM-1/HRV 상호작용을 연구하는데 이용될 수 있다.
인간 리노바이러스는 감기의 주요한 원인 물질이다. 그들은 피코르나바이러스족에 속하며 그들이 결합할 수 있는 숙주 세포 수용체에 따라 분류될 수 있다. 문헌 [토마시니(Tomasini) 등, J. Virol., 58 :제290페이지 (1986년)]에는 인간 리노바이러스의 세포 부착에 포함된 수용체 단백질의 단리 방법이 기재되어 있다. 콕삭키 A 바이러스의 여러 유형 뿐만 아니라 리노바이러스의 115 혈청형의 거의 90% 이상이 주요 인간 리노바이러스 수용체(HRR)로 언급되는 단일 공통 수용체에 결합하고, 나머지 10%는 하나이상의 기타 세포 수용체와 결합한다.
최근에, 문헌 [그레브 제이. (Greve, J.) 등, Cell 56 : 제839페이지 (1989년)]에는 95,000 돌턴의 겉보기 분자량을 갖고 세포간 접착 분자(ICAM-1)로 명명된 상기 기재한 세포 표면 단백질의 뉴클레오티드 배열로부터 추정된 것과 본질적으로 동일한 아미노산 배열을 가진 당단백질로서 주요 HRR의 동정이 기재되어 있다[사이몬(Simmons D.) 등의 Nature, 331 : 제624 페이지(1988년), 스턴톤(Staunton) 등의 Cell, 52 : 제925 내지 933 페이지 (1988년) 참조]. 이어서, 문헌 [스턴톤, 디.이.(Staunton, D.E.) 등, Cell, 56 : 제849페이지 (1989년)]에는 ICAM-1이 HRV에 대한 주요 표면 수용체라는 것이 확인되어 있다[Staunton 등의 Cell, 61 : 제243페이지 (1990년) 참조].
ICAM-1은 505 아미노산 길이의 완전한 막단백질이며, i)아미노 말단(아미노산 잔기 1-453)에 있는 5개의 면역글로불린형 세포외 도메인, ii)소수성 막투과 도메인(454-477), 및 iii)카르복시 말단(478-505)에 있는 짧은 세포질 도메인을 함유한다. ICAM-1은 면역글로불린 초유전자 군의 구성 요소이며, 전체 군의 구성 요소인 백혈구 분자, 임파구 기능 관련 분자-1(LFA-1)에 대한 리간드로서 작용한다. LFA-1과 ICAM-1의 헤테로형 결합은 다양한 세포형의 세포 접착을 매개하고 광범위한 면역 상호 작용에 중요하며, 염증 반응 동안의 세포질 분열에 의해 ICAM-1이 발현되면 염증부위에 백혈구가 편재하는 것을 조절할 수 있다. ICAM-1의 1차 구조는 두개의 세포 접착 분자, 즉, 신경세포 접착 분자(NCAM) 및 마일레인 연관 당단백질(MAG)과 상동성인 것으로 밝혀졌다.
일반적으로 바이러스, 특히 리노바이러스의 감염을 감소시키는 몇가지 방법은 다음과 같다. I)세포에의 바이러스 결합을 차단하는 데 이용되는 세포 표면 수용체에 대한 항체를 개발하는 방법, ii)숙주 세포의 항바이러스 상태를 증진시키는 인터페론을 이용하는 방법, iii)바이러스 복제를 억제하는 다양한 약제를 개발하는 방법, iv)바이러스 캡시드 단백질/펩티드에 대한 항체를 개발하는 방법, 및 v)단리된 세포 표면 수용체 단백질에 의한 바이러스 감염을 차단하는 방법, 특히 세포 표면 수용체의 바이러스 결합 도메인을 차단하는 방법.
문헌 [그레브 등, Cell, 56 : 제879페이지 (1989년)]에는 후자의 방법을 이용하여, 정제한 tmICAM-1이 시험관 내에서 리노바이러스 HRV3과 결합할 수 있다는 것이 기재되어 있다. 공개되지 않은 결과로 HRV2, HRV3 및 HRV14는 ICAM-1이 특이한 형태 및 구조로 제공되는 조건에서 결합 시험이 수행된다면 리노바이러스와의 결합 능력과 리노바이러스를 중화시키는 능력 사이의 양성적인 연관 관계가 있다는 것을 입증한다. HRV14 및 HRV2를 이용한 결과(공개되지 않음)는 바이러스의 수용체 군과 시험관 내의 tmICAM-1과의 결합 능력 사이의 양성적인 연관 관계를 입증한다.즉, 주요 수용체인 ICAM-1은 HRV3, HRV14 및 기타 주요 수용체 혈청형과 결합하여 중화시킬 수 있는 반면에, 부 수용체 혈청형인 HRV2와는 결합하거나 또는 중화시키지 않는다. 정제된 tmICAM-1을 이용한 또 다른 연구(공개되지 않음)는 그것이 리노바이러스를 tmICAM-1을 이용한 또 다른 연구(공개되지 않음)는 그것이 리노바이러스를 tmICAM-1 (10nM 수용체에서 역가의 50% 감소 및 100nM 수용체 단백질에서 역가의 log 감소)로 예비 처리할 경우 플라크 감소 분석에서 리노바이러스 감염을 효과적으로 억제한다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는 10nM의 명백한 해리 상수를 갖는 HeLa 세포의 ICAM-1에 대한 리노바이러스의 친화성과 일치하였으며 바이러스와의 결합력과 바이러스 중화력 사이의 직접적인 관계를 나타내었다.
tmICAM-1의 대규모 생산이 현재로서는 경제적으로 실행가능하지 않고 tmICAM-1을 활성형으로 유지하기 위해 계면활성제를 사용해야 하므로, 리노바이러스 억제제로서 사용하기 위해 수용체 단백질을 생산하는 또다른 방법이 바람직하다. 절단형 ICAM-1 분자를 생산하도록 유전적으로 변형시킨 tmICAM-1 cDNA 유전자형이 개발되었다(발현 산물을 생산하는 세포주와 함께 : 미합중국 특허 출원 제390,662호). 이러한 절단형의 ICAM-1(tICAM (453) 및 tICAM(185))은 막투과 영역이 부족하며 세포 배양 배지로 분비된다. 그들은 그레브 등의 문헌 [Cell, 56 제879페이지 (1989년)]에 기재된 분석에 의하면 tmICAM-1에 비해서는 상당히 감소된 정도이지만 리노바이러스와 결합한다. 그러므로, 리노바이러스 감염의 억제제로서 그들의 효과는 tmICAM-1에 비해 적은 것으로 나타났다[계류 중인 미합중국 특허 출원 제130,378호, 동 제239,570호, 동 제262,428호, 동 제239,571호 동 제390,662호 참조].
1988년 9월 1일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제239,571호 및 그의 CIP 출원인 동 제262,428호 및 동 제360,662호는 용액 중의 막투과 단백질을 유지하기 위하여 비이온성 계면활성제를 이용한 리노바이러스 감염의 억제제로서의 막투과 리노바이러스 수용체의 용도 및 막투과 세포간 접착 분자(tmICAM)의 세포외 도메인 1,2 및 3을 가지며 가용화를 위한 비이온성 계면활성제의 존재를 필요로 하지 않는 절단형 세포간 접착 분자(tICAM)에 관한 것이며;
1987년 12월 8일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제130,378호 및 그의 CIP 출원인 동 제262,570호는 주요 리노바이러스 수용체(HRR)를 발현하는 형질전환된 세포주 및 세포간 접착 분자로서 HRR의 동정에 관한 것이며;
1989년 1월 24일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제301,192호 및 그의 CIP 출원인 동 제449,356호는 막투과 영역 및 세포질 영역에 미치는 아미노산이 부족하고 C-말단에서 11 아미노산의 신규 배열을 가진, tmICAM 과 관련이 있으나 그와는 뚜렷이 구별되는 천연형의 가용성 ICAM(sICAM)에 관한 것이다.
이어서, 문헌 [말린, 에스.디.(Marlin, S.D.)등, Nature, 344 : 제70페이지(1990년)]에는 sICAM-1이라고 언급한 절단형 가용성의 막 결합형 ICAM-1 분자의 작제 및 정제에 관한 것이 기재되어 있다. 그것은 결실된 막투과 도메인 및 세포질 도메인 모두를 가지며, 카르복실 말단에서 단일 보존형 치환에 의해 야생형 아미노산 배열과 구별된다. 그것은 ICAM-1의 잔기 1-452 및 C-말단에서 신규 페닐알리닌 잔기로 이루어진다. 이것은 HRV14 바이러스가 세포에 결합하는 것을 방지하기 위하여 sICAM-1을 50㎍/ml 보다 많은 양으로 요구한다는 것을 입증한다. 그러나, 또한 배양배지에서 계속적으로 존재할 경우 1㎍/ml(18nM)에서 sICAM-1은 HRV54에 의한 감염의 진전을 50% 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 억제 활성은 수용체 군의 바이러스, 콕삭키 A13과는 연관이 있지만, 소아마비 바이러스 또는 HRV2는 억제되지 않았으며; HRV14에 대한 감염 데이터는 보고되지 않았다. 그러므로, 그들은 결합과 감염의 억제 사이의 직접적인 연관을 입증하지 않았다. 또한, 다음에 더욱 상세히 설명되겠지만, 말린 등에 의해 얻어진 결과를 재현하기 위한 시도는 성공되지 않았으며 바이러스 역가를 50% 감소시키기 위해 더 높은 농도의 절단형 ICAM (막투과 ICAM 의 10배 이상)이 필요하다는 것이 제안되었다.
지금까지, (단리된 세포 표면 수용체 단백질에 의한 바이러스 감염을 차단함으로써) tmICAM-1만큼 효과적으로 인간 리노바이러스와 결합하여 그의 감염을 감소시키는 시약은 발견되지 않았으며, 따라서 인간 리노바이러스에 효과적으로 결합하여 HRV 감염을 효과적으로 감소시킬 수 있는 ICAM-1 형이 이 분야에서 계속 요구되고 있다.
본 발명에 의해 다중형 구조의 막투과 ICAM(tmICAM-1) 및 다중형 구조의 비-막투과 ICAM(tICAM)이 제공된다. 비-막투과 ICAM은 또한 절단형 ICAM, 즉, 실질적으로 카르복실 세포내 도메인 및 소수성 막 도메인이 없는 ICAM으로서 공지되어 있으며 tICAM(453) 및 tICAM(185)의 형태에 제한되지는 않는다. 비-막투과 형태의 ICAM 은 ICAM의 관능성 유도체 및 커플링을 용이하게 하는 tICAM 의 뮤테인(Mutein) 형태를 포함할 수 있다. 절단형 ICAM 형태가 다중형 구조, 바람직하게는 다이머일 경우, 인간 리노바이러스와 결합이 증가하고 바이러스 감염을 감소시킬 수 있다. ICAM, 막투과 및 비-막투과의 다른 ICAM 형태는 지지체에 흡착됨으로써 다중형이 될 수 있다. 이 지지체는 아미노 덱스트란 뿐만 아니라 니트로셀룰로오스, PVDF, DEAE, 지질 중합체, 또는 스페이서 또는 링커가 있거나 없는 tICAM에 흡착되거나 또는 커플링될 수 있는 다양한 불활성 중합체들과 같은 물질들로 이루어질 수 있다.
다중형 ICAM은 또한 ICAM은 예를 들면 항체, 단백질 담체, 또는 가교결합제에 커플링시킴으로써 다중형이 될 수 있다. 항체의 예로는 항-ICAM 항체, CL 203을 들수 있고, 적당한 단백질 담체로는 알부민 및 프로테오글리칸을 들 수 있으며, 적당한 가교결합제로는 2관능성 N-히드록시숙신이미드에스테르, 이미도에스테르, 또는 비스-말레이미도헥산과 같은 헤테로 2관능성 및 호모 2관능성 가교결합제를 들 수 있다. 커플링을 용이하게 하기 위하여, ICAM은 리신, 시스테인, 또는 커플링을 용이하게 하는 부위(들)를 제공하는 다른 아미노산 잔기(들)와 같은 반응성 아미노산 잔기로 카르복실 말단 또는 아미노 말단에서 변형될 수 있다. 이러한 유형의 변형 ICAM을 뮤테인이라 한다. 또한, ICAM은 올리고머 마이셀의 형성을 증가시킬 수 있는 지질을 포함하도록 양 말단이 변형될 수 있다. 다중형 ICAM을 포함하는 ICAM은 완전 글리코실화 또는 부분 글리코실화되거나 또는 글리코실화 되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 ICAM 및 그의 관능성 유도체의 리간드, 즉, 인간 리노바이러스, 및 주요군 수용체 바이러스, 임파수 기능 관련 항원-1(LFA-1), 플라스모디움 팔시파륨(말라리아) 등에의 결합을 증진시키는 방법을 제공하는 것이며, 상기 ICAM은 리간드에 대한 ICAM의 결합이 증가되는 형태 및 구조로 제공된다. ICAM 형태는 막투과 또는 비-막투과(절단형)일 수 있다. 절단형 ICAM은 실질적으로 카르복실 세포내 도메인 및 소수성막 도메인이 없는 ICAM이다. ICAM의 바람직한 절단형은 tICAM(453) 및 tICAM(185)을 들 수 있다. ICAM은 다중형 ICAM 형성을 증진시키기 위해 카르복실 말단 또는 아미노 말단에서 변형될 수 있다. 이러한 변형으로는 리신, 시스테인, 또는 커플링을 용이하게하는 부위(들)를 제공하는 기타 아미노산 잔기와 같은 반응성 아미노산 잔기(들)의 첨가를 들 수 있다. 본 발명의 ICAM에 대한 뉴클레오티드 배열은 진핵 세포 또는 원핵 세포와 같은 숙주 세포에 도입될 수 있는 벡터(예를 들면, 플라스미드)에 포함될 수 있다. 바람직한 진핵 세포는 포유류 세포, 즉 챠이니즈 햄스터 난소 세포이고, 바람직한 원핵 세포는 대장균이다.
본 발명의 ICAM의 바람직한 구조는 다중형, 가장 바람직하기로는 다이머형이다. 다중형 구조는 제1 ICAM이 제2 ICAMDP 가교 결합되거나 또는 ICAM이 지지체에 흡착됨으로써 다중형 구조를 형성하는 것으로 이루어질 수 있다. 지지체는 니트로셀룰로오스, PVDF, DEAE, 지질 중합체 및 아미노 덱스트란과 같은 고분자량이며 실질적으로 불활성인 중합체들, 또는 스페이서 또는 링커가 있거나 없는, ICAM에 흡착되거나 커플링될 수 있는 여러 중합체들일 수 있다. 다중형 ICAM은 예를 들면 항체, 단백질 담체, 또는 가교결합제에 커플링함으로써 다중화될 수 있다. 바람직한 가교결합제로는 2관능성 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르, 비스-말레이미도헥산과 같은 헤테로 2관능성 및 호모 2관능성 가교 결합제를 들 수 있으며, 바람직한 담체로는 알부민 및 프로테오글리칸을 들 수 있고, 바람직한 항체의 예로는 CL 203 및 HRV 결합을 방해하지 않는 기타 항체들을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제약상 허용되는 용매, 희석제, 보조제 또는 담체, 및 활성 성분으로서 인간 리노바이러스 결합 활성을 가지며 바이러스 감염을 감소시키는 폴리펩티드 유효량을 함유하는 신규 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면과 잇점은 본 발명을 실시하는 다수의 실시예를 포함하는 하기의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.
상기에 설명된 바와 같이, 포유동물 세포로부터 단리된 tmICAM-1은 주요 수용체 군에 속하는 인간 리노바이러스를 증화시키는 능력을 갖지만, 계면활성제와 함께 용액 속에서만 유지될 수 있다. ICAM-1의 특정 가용성 단편은 바이러스 결합능이 저하되어 tmICAM-1만큼 효율적으로 감염을 감소시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 이제까지, 이러한 저하된 능력에 대한 이유를 아무도 규명할 수는 없었다.
다른 사람들에 의해서 리노바이러스 수용체는 펜타머 형태로 세포 상에 존재한다는 것이 제안되었다[토마시니, 제이.(Tomassini,J.) 및 콜로노, 알.(Colonno, R.), J.Virol., 58 : 제290내지 295페이지 (1986년) 참조]. 그러나, HeLa 세포에 결합하는 리노바이러스 및 항 ICAM-1 단일클론 항체의 정량분석(본 발명의 공동 발명자들의 미공개 결과)의 결과는 세포당 최대 30,000 비리온 결합(35S 메티오닌-표지된 HRV의 결합에 의해 측정) 및 세포 당 50,000-60,000 ICAM-1 분자(방사선 표지된 Mab을 ICAM-1에 결합 시킴으로써 측정)로 나타났다. 세포에 결합하는 HRV 입자 당 세포 표면상에 5개가 아닌 1 내지 2개의 ICAM-1 분자가 결합할 가능성을 시험하기 위하여 더욱 많은 연구를 시도하여 왔다.
절단형 ICAM-1의 유전 공학적 형태는 C-말단 막투과 도메인이 부족하며 재조합 유전자로 형질전환된 포유동물 세포의 배양 배지로 분비된다. 이러한 분비된 ICAM 분자들 중 2종, 즉, tICAM(453) 및 tICAM(185)을 그들의 유전자로 안정하게 형질전환된 세포의 소모 배양 배지로부터 정제하는 것은 다음에 설명될 것이다. 용액-HRV 결합 분석 및 HRV 중화 분석에서, tICAM(453)은 tmICAM-1에 비해 HRV에 대한 결합 활성이 사실상 감소(약200배)되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, tmICAM-1 또는 tICAM(453) 또는 tICAM(185)을 니트로셀룰로오스, PVDF (폴리비닐리덴 디플루오라이드), 또는 DEAE (디에틸아미노에틸) 막과 같은 많은 불용성 지지체 중의 어느 하나에 흡착하고, 방사성 HRV와 함께 배양할 경우, tICAM(453)의 바이러스 결합 활성은 tMICAM-1의 것과 비교할만 하게 된다. 다중형 tICAM(453) 또는 다중형 tICAM(185)의 HRV와의 이러한 결합은 HeLa 세포상의 HRV와 ICAM-1과의 결합과 동일한 성질을 갖는다. 즉, 이것은 항 ICAM-1 Mab에 의해 억제되고, 주요 수용체군의 리노바이러스에 대해 특이성을 가지며, 세포에 대한 리노바이러스의 결합과 동일한 온도 의존성(즉, 37℃에서 잘 결합하고 4℃에서 잘 검출되지 않음)을 갖는다.
본 명세서에 사용된 약어 및 용어는 다음과 같이 정의되지만 이에 한정될 필요는 없다.
다중화 및 다중형은 다이머화 및 다이머형에 제한되지는 않으며, ICAM-1 분자 또는 그의 단편의 바이러스 결합 및 감염을 감소시키는 데 효과적인 다중형 구조를 포함하며;
막투과는 일반적으로 소수성 막-스패닝(spanning) 배열을 가지며 막 경계인 ICAM-1 단백질 분자의 형태를 의미하며;
비-막투과는 일반적으로 비이온성 계면활성제에 세포를 용해시킴으로써 세포막으로부터 가용화되는 막투과 형태 뿐만 아니라, 막 경계라기 보다는 소위 단백질의 절단형을 포함하는 가용성 단백질로서 세포 배양 배지로 분비되는 ICAM-1 단백질의 가용성 형태를 의미하며;
절단형은 일반적으로 ICAM의 막투과 완전 길이형 보다 작은 단백질 형태를 포함하며;
형태는 일반적으로 완전 길이 및 부분 길이 ICAM 형태 사이를 구별하는 데 사용되는 반면에; 구조는 일반적으로 가능한 ICAM 형태의 단일형, 다이머형, 및 다중형 구조를 구분하는데 사용된다.
단일형 또는 다중형인 뮤테인을 포함하는 그의 완전 길이 또는 그의 단편인 ICAM-1 분자의 모든 형태 및 구조는 분자가 바이러스 결합 및 감염을 감소시키는 데 효과적으로 남아 있는 한 완전 또는 부분 글리코실화되거나 완전히 글리코실화 되지 않을 수 있으며;
리간드는 일반적으로 ICAM의 형태 및 구조들 중의 적어도 하나의 결합될 수 있는 것, 및 이에 제한되지는 않지만, 인간 리노바이러스, 주요 군 인간 리노바이러스 수용체에 결합되는 기타 바이러스, 임파구 기능 관련 항원-1, 및 플라스모디움 팔시파륨(말라리아)을 포함하며;
인간 리노바이러스는 일반적으로 인간 리노바이러스의 모든 인간 혈청형을 포함한다[함파리안, 브이.(Hamparian, V.)등의 Virol., 159 : 제191 내지 192페이지 (1987)].
하기 실시예들은 본 발명의 실시를 예시한다.
실시예 1은 리노바이러스의 성장, 정제 및 분석에 관한 것이며;
실시예 2는 ICAM-1에 대한 단일클론 항체의 생산 및 단리에 관한 것이며;
실시예 3은 완전 길이 ICAM-1 cDNA로부터 비-막투과 절단형의 ICAM cDNA의 작제에 관한 것이며;
실시예 4는 포유 동물 세포의 형질전환 및 비-막투과 절단형의 ICAM cDNA 의 발현에 관한 것이며;
실시예 5는 비-막투과 절단형의 ICAM-1의 단리 및 정제에 관한 것이며;
실시예 6은 tmICAM-1, tICAM(185) 및 tICAM(453)의 방사성 표지화 및 단일클론 항체에 대한 결합능의 증명에 관한 것이며:
실시예 7은 막투과 및 막투과 절단형의 ICAM-1의 인간 리노바이러스 결합 분석에 관한 것이며;
실시예 8은 tICAM(453)의 CL203 IgG 항체 매개된 가교결합에 관한 것이며;
실시예 9는 막투과 및 비-막투과 절단형의 ICAM-1의 다중화에 관한 것이며;
실시예 10은 다중형 막투과 및 다중형 비-막투과 절단형의 ICAM-1의 감염-중화 분석에 관한 것이며;
실시예 11은 ICAM/FLA-1 상호작용의 유효한 억제제로서의 다중형 막투과 및 절단형 ICAM-1의 이용에 관한 것이다.
[실시예 1]
[리노바이러스의 성장, 정제 및 분석]
문헌 [아브라함 지(Abraham, G.)등의 J. Virol., 51 : 제340페이지(1984년) 및 그레브 등의 Cell, 56 : 제839페이지 (1989년)]에 기재되어 있는 바와 같이 리노바이러스를 성장시키고, 정제하여 분석하였다. 이러한 연구를 위해 선택한 혈청형은 이 분야에서 표준물인 HRV14 및 ICAM에 대한 친화력이 HRV14에 비해 약 10배 높은 HRV3이 포함된다. 주요수용체보다는 부수용체에 결합하는 HRV2를 음성 대조 표준으로 사용하였다.
리노바이러스 HRV2(ATCC VR 482 및 ATCC VR 1112), HRV3(ATCC VR 482 및 ATCC VR 1113) 및 HRV 14(ATCC VR 284 및 ATCC VR 1124)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 얻어 플라크를 정제하고 감염된 HeLa-S3 세포의 용해물로부터 단리하였다. 정제된 리노바이러스를 폴리에틸렌 글리콜 침전 및 수크로오스 구배 침강으로 제조하였다. 바이러스 순도를 캡시드 단백질의 SDS-PAGE 분석 및 전자 현미경으로 측정하였다. 감염율은 문헌 [마이너 피.디.(Minor, P.D.)의 Growth, assay and purification of picornaviruses, Virology : A Practical Approach, B.W.J. Mahy, ed(옥스포드 : IRL 출판사), 25-41 페이지]에 기재되어 있는 바와 같이 세포 변성 효과를 수치화하는 한계 희석 감염 측정법으로 정량화하였다.
[실시예 2]
[ICAM-1에 대한 단일클론 항체의 생산 및 단리]
BALB/cByJ 암컷 생쥐를 인산염 완충 염수(PBS) 0.5ml중의 107무손상 HeLa 세포를 3주 간격으로 3회 복강내 주사하여 면역화시켰다. 2주 후 생쥐를 방혈시키고 혈청 분취물에 대해 HeLa 세포의 HRV 14 감염에 대한 예방 효과를 시험하였다. 양성을 나타낸 생쥐에 107HeLa 세포를 최종 주사함으로써 증강시키고, 3일 후 비장 세포를 P3X63-Ag8.653 골수종 세포[갤프레(Galfre) 등의 Nature, 266 : 제550 내지 552 페이지 (1977년)]에 융합시켜 총 약 700개의 하이브리도마 함유 웰을 생성시켰다. 각 웰을 96-웰 플레이트 중의 3x104HeLa 세포를 37℃에서 1시간 동안 상등액 100㎕와 함께 배양시킨 다음 세포를 PBS로 세척시키고 충분한 양의 HRV14를 첨가하여 24-36시간 동안 완전한 세포 변성 효과를 부여하여 시험하였다. 양성인 웰(감염으로부터 보호)을 36시간 후에 평가하였다.
제1 스크린에서 양성을 띤 웰로부터 세포를 수거하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 한계 희석법으로 클로닝하였다. 이들 웰의 상등액을 세포 보호 평가로 시험하고 양성 웰을 다시 동정하였다. 모든 하이브리도마 함유 웰이 클론개체군이 얻어졌음을 의미하는 양성이 될 때까지 클로닝을 더 행하였다. 4회 클로닝된 세포주 및 그의 대응하는 항체를 얻어 각각 c78.1A, c78,2A, c78.4A, c78.5A, c92.1A 및 c92.5A로 표시하였다.
c92.1A는 1987년 11월 19일에 미합중국 20852 매릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁번호 HB 9594로 기탁되어 있다.
[실시예 3]
[완전 길이 ICAM-1 cDNA로부터 비-막투과 절단형의 ICAM cDNA의 작제]
[A. ICAM-1 cDNA의 제조]
무작위로 프라임된 cDNA를 공급자가 추천한 조건들 하에서 HE1 세포의 폴리 A+RNA로부터 아메르샴(AmershamTM) cDNA 합성 키트를 사용하여 합성하였다. cDNA 100ng으로 25 사이클 동안 프라이머 PCR 5.1 : (ggaattcATGGCTCCCAGC AGCCCCCGGCCC) 및 PCR 3.1 : (ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTT)을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭 사이클은 94℃ 1분, 55℃ 2분 및 72℃ 4분으로 하였다. PCR 반응의 생성물을 EcoR1로 소화시키고 EcoR1 소화된 파지 벡터 λGT10(StratageneTM)으로 클로닝하였다. 재조합 파지 클론을 ICAM-1 특이적 올리고뉴클레오티드: GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGCCGCAGGTCCAGTTC (ICAM1) 및 CGCTGGCAGGACA AAGGTCTGGAGCT GGTAGGGGGCCGAG GT GTCT(ICAM3)를 사용하여 플라크 잡종형성함으로써 스크리닝하였다.
λHRR4로 표시된 양성 클론을 선별하여 정제하였다. 삽입물을 TM EcoR1 소화시켜 제거하고 블루스크립트(Bluescript) KS+의 EcoR1 부위로 서브클로닝하였다. 이 클론을 pHRR2로 표시하였다. 전체 삽입불을 서열화하여 A 1462가 G로 단일 치환된 PCR ICAM-1 서열 [시몬스(Simmons)등, Nature, 331 : 624페이지(1988년): 스턴톤 등, Cell, 52 : 제925 내지 933페이지 (1988)]로 표기되는, ATG 개시 코오돈으로 시작하고 TGA 중지 코오돈으로 끝나는 전체 ICAM-1 코오딩 서열을 함유하는 것을 발견하였다. 이러한 동일 변화는 몇 개의 개별적인 클론 중에서 동정되므로 이는 ICAM-1 유전자의 다형태성을 나타낸다.
[B. tICAM-1(453) 및 tICAM(185)의 작제]
ICAM-1 cDNA의 변형된 형을 완전 길이 ICMA-1 cDNA 클론 pHRR-2를 주형으로 사용하여 PCR 증폭 반응[사이키(Saiki)등, Science, 230 : 제1350 내지 1354 페이지(1985년)]에 의해 만들었다. 플라스미드 DNA를 EcoR1으로 소화시켜 ICAM-1 삽입물을 잘라내어 후속되는 리게이션 단계에서 벡터가 재환화되는 것을 막기 위해 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 주형 DNA 10ng을 tICAM-453의 경우 올리고뉴클레오티드 프라이머 PCR5.5 및 PCR3.3 및 tICAM-185의 경우 PCR5.5 및 3.10을 사용하여 하기 조건 하에서 10 사이클의 PCR 증폭을 수행하였다.
PCR5.5는 EcoR1 및 HindIII 부위, 12bp ICAM-15' 번역되지 않는 서열 및 신호 펩티드를 코오딩하는 처음의 24bp로 이루어지는 다음의 서열을 갖는다:
GGAATTCAAGCTTCTCAGCCTCGCTATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC PCR3.3은 EcoR1 및 Pst1 부위, 중지 코오돈 및 ICAM-1의 최종 8 세포의 아미노산(잔기 446-453)을 코오딩하는 염기에 대해 상보적인 24bp로 이루어지는 다음의 서열을 갖는다:
GGAATTCCTGCAGTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT
PCR3.10은 Xba1 및 BamH1 부위, 중지 코오돈 및 ICAM-1의 잔기 178-185를 코오딩하는 염기에 대해 상보적인 24bp로 이루어지는 다음의 서열을 갖는다:
TTCTAGAGGATCCTCAAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGG
PCR 반응 생성물을 EcoR1 (tICAM(453)) 또는 EcoR1 및 BamH1 (tICAM(185))로 소화시키고 블루스크립트TMSK+(Stratagene)의 폴리링커 부위로 클로닝시켰다. 목적하는 삽입물을 함유하는 클론을 제한 분석 및 DNA 서열화로 확인하였다. 삽입물을 블루스크립트TM로부터 HindIII 및 XbaI로 소화시켜 잘라내어 HindIII 및 Xbal 부위에서 발현 벡터 CDM8 [시드(Seed), Nature, 239 : 제840 페이지(1987년) 참조]에 삽입시켰다. pHRR-8.2로 표시되는 tICAM(453) 삽입물을 함유하는 클론 및 pHRR23-13으로 표시되는 tICAM(185) 삽입물을 함유하는 클론을 선별하여 확대 서열 분석하였다. 이것으로 목적하는 중지 코오돈의 존재와 ICAM-1 코오딩 서열의 선택된 영역의 통합성을 확인하였다.
이들 플라스미드를 DEAE-덱스트란 기법을 사용하여 COS 세포 내로 형질전환시키고 세포를 분석하기 전에 72시간 동안 배양하였다. 표면 발현을 간접 면역 형광 및 ICAM-1에 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 FACS로 모니터링하였다. COS 세포에서 일시적 발현 및 c78.4A Mab(단일클론 항체)에 의한 변형 표지시킨(35S 시스테인) 세포 상등액의 면역 침전은 pHRR23-13 및 pHRR8.2로부터 각각 45kd 및 80kd의 가용성 ICAM1
- 단편들이 생성되었음을 나타낸다. 안정한 챠이니즈 햄스터 난소 세포 형질전환체의 제조를 하기 실시예 4에 기재한다.
[C. 변형된 비글리코실화 막투과 ICAM-1 분자]
변형된 완전 길이형 ICAM-1을 N-103, N-118, N-156 및 N-173 의 각각 Q에 대한 동시 변이 유발에 의해 만들었다. 이것은 ICAM-1 분자의 세포의 D2 도메인으로부터 4개의 N-결합된 글리코실화 부위를 모두 제거시킨다. 비 글리코실화 막투과 ICAM이라고도 언급되는, 형성된 분자는 COS 세포의 표면 상에 발현되었고, 변형되지 않은 ICAM-1과 견줄 수 있는 정도로 방사 표지된 HRV3에 결합될 수 있었다. 이 결과는 바이러스가 ICAM-1에 결합하는데 도메인 2(처음의 184 아미노산)의 글리코실화가 필요하지 않다는 것을 나타낸다.
비-막투과 ICAM은 유사하게 변형되어 변형된 비-글리코실화 비-막투과 ICAM-1 분자를 생성시킬 것이라는 것이 예상된다.
[D. 멀티머를 형성하는 가교결합에 적합한 반응성 잔기를 함유하는 비-막투과(절단형) ICAM-1의 유전 공학적 형태의 작제]
C-말단부에 신규의 리신 잔기를 첨가한 ICAM-1의 453 아미노산 세포의 도메인으로 이루어진 분자를 상기한 바와 같이 pHRR-2 cDNA의 PCR 변형에 의해 작제하였다. 사용한 프라이머는 PCR5.5 (상기함) 및 XbaI 및 BamHI 부위, 중지 코오돈, Lys 코오돈 및 아미노산 잔기 446 내지 453을 코오딩하는 서열에 대해 상보적인 24 염기로 이루어지는 서열(TTCTAGAGGATCCTCACTTCTCATACCGGGGGGAGAGCACATT)을 갖는 PCR3.19이었다. CDM8 벡터 내로의 클로닝에 이이서 tICAM-453K의 생성을 COS 세포 중에서의 일시적 발현으로 확인하였다. 안정한 CHO 세포주를 상기한 바와 같이 pS2-DHFR로 동시 형질전환시킴으로써 생성하였다.
같은 방법으로 PCR 5.5 및 XbaI 및 BamHI 부위, 중지 코오돈, Lys 코오돈 및 잔기 178내지 185를 코오딩하는 서열에 대해 상보적인 24 염기로 이루어지는 서열(TTCTAGAGGATCCTCACTTAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGC)을 갖는 PCR3.20을 사용하여 tICAM(185)의 C-말단에 Lys 잔기를 첨가하였다. 일시적인 COS 세포 발현으로 tICAM-185의 생성을 확인하였고 안정한 CHO 세포주를 상기한 바와 같이 유도하였다.
각각 부가의 Cys 잔기를 함유하는 tICAM(1-452)의 3개의 변형된 형태를 완전길이 ICAM-1 cDNA를 부위 유래 변이(site directed mutagenesis)를 유발시켜 작제하였다. 각 작제에서 중지 코오돈은 E-453 GAG를 TAG 로 변화시켜 도입하였다. 따라서 C-말단은 Y-452이었다. 잔기 N-338, T-360 및 Q-387을 각각 분리하여 제2부위유래 변이 유발을 사용하여 Cys로 변이시켰다. 목적하는 변이체가 존재하는 것을 DNA 서열화로 확인하였다.
Cys로의 변이를 위해 선택한 잔기는 이들 영역의 표면 노출을 예상할 수 있는 표면 확률의 컴퓨터가 만든 플롯에 따라서 선택하였다. 또한, T-360은 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위인 N-358에 근접하였다. 3개의 Cys 변형체 각각을 발현시키고 형질전환된 COS 세포의 배지 내로 분비시켰다. 환원 및 비환원조건하에서의 단백질의 관찰은 다이머가 존재하지 않음을 보여준다. 술프히드릴기와 반응할 수 있는 가교 결합제를 Cys 변형된 tICAM 형을 가교결합시켜 다중형을 얻는데 사용할 수 있다.
[실시예 4]
[세포의 형질전환 및 비-막투과 절단형 ICAM cDNA의 발현]
[A. 진행 세포의 형질전환]
디히드로풀레이트 환원효소(DHFR)가 결핍된 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포들은 커터랩(Cutter Lab, 캘리포니아주 버클리 소재)으로부터 얻었다. 세포를 SV40 프로모터의 조절하에 생쥐 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자를 함유하는 플라스미드 pSV2 DHFR, 및 CDM8 벡터 중의 tICAM-453, 또는 tICAM-184 작제물로 동시 형질전환시켰다[Seed 및 Aruffo, PNAS, 84 : 제 3365 내지 3369 페이지(1987년) 참조].
형질전환은 일렉트로포레이션 및 인산칼슘법을 사용하여 수행하였다.
형질전환된 DHFR-양성 세포는 뉴클레오시드가 없는 배지에서 성장시켜 선택하고 형질전환체의 푸올은 한계 희석법에 의해 클로닝시켰다.
tICAM을 분비하는 세포주는 다음과 같은 Mab c78.4A 및 c78.5A를 사용하여 ICAM에 대한 2-부위 방사성 면역 검정법(RIA)으로 배양 상등액을 시험하여 동정하였다. ICAM 상의 1개의 에피톱에 대한 단일클론 항체(예, Mabc78.4A)는 플라스틱 96-웰 플레이트(Immunlon plates, Dynatech Inc.)에 흡착시키고 플레이트 상의 과량 결합 부위는 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단시킨 후 배양 상등액을 플레이트에서 배양시켰다. 플레이트를 세척한 후125I-Mab(ICAM 상의 제2 에피톱, 예를 들면 c78.5A 에 대한 것)으로 배양시키고, 세척한후 결합된125IgG의 양을 측정하였다. tICAM의 농도는 기지 농도의 tm-ICAM의 표준 곡선에 대하여 미지값으로부터 RIA 데이터를 비교하여 결정하였다. 양성 클론을 팽창시키고 tICAM 형태의 발현을 Mab c78.4A로 대사 표지된 세포 상등액의 면역 침전법에 의해 확인하였다.
또 다른 연구를 위해서 세포주 CT.2A (tICAM(453)) 및 CD12.1A (tICAM(185))를 선별하여 상기한 베빙톤(Bebbington) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 배지를 함유하는 메토트렉세이트 중에서 유전자 증식시켰다. 가용성 절단형 ICAM-1 단백질의 정제를 위해 100nM 메토트렉세이트에 내성인 CT.2A로부터 유도된 클론 및 I㎛ 메토트렉세이트에 내성인 CD 12.1A 클론을 사용하였다.
B. 원핵 세포의 형질전환
ICAM의 바이러스 결합 도메인의 글리코실화는 (실시예 3C 에 입증된 바와 같이) 바이러스 결합을 유지할 필요가 없기 때문에, 대장균과 같은 원핵세포는 성공적으로 형질전환되어 관능성 단백질을 생성시킬 수 있다는 것이 기대된다.
[실시예 5]
[비-막투과 절단형 ICAM-1의 단리 및 정제]
c78.4A-세파로오스TM를 사용한 단일클론 항체 친화력 크로마토그래피는 이미 문헌 [계류 중인 미합중국 특허 출원 제130,378호 및 그리브 등의 Cell, 56 : 제839 내지 847페이지(1989년)]에 기재되어 있다. 혈청 함유 배지로 분비된 tICAM은 혈청 중의 고농도의 오염 단백질로 인해서 추가의 정제 단계를 필요로 한다. Mab-친화력 컬럼으로부터 용출하기 전에, 컬럼을 1M NaCl 로 세척하여 느슨히 결합된 단백질을 제거하였다. tICAM(453)의 경우, C78.4-세파로오스TM컬럼으로부터 용출된 부분적으로 정제된 tICAM(453)을 10mM 트리스(pH6.0)에 투석시키고, 모노 QTM컬럼 (Pharmacia) 상에 흡착시킨 후, 0-0.3M NaCl 구배로 용출시켰다. tICAM184를 수퍼로오스-12TM컬럼상에 겔 여과함으로써 더 정제하였다.
비-막투과 절단형 ICAM-1은 단일클론 항체 친화력 크로마토그래피법을 사용하지 않고 표준 이온 교환법을 사용하여 정제할 수 있다는 것도 알 수 있다.
[실시예 6]
[tmICAM-1, tICAM185 및 tICAM453의 방사성 표지화 및 단일클론 항체에 대한 결합능의 증명]
단일클론 항체 c78.4A 및 c78.5A와 반응하는 에피톱은 입체 형태 의존성 에피톱이므로, 원래의 ICAM 구조의 유지를 확인하는 분석 프로브로 이용할 수 있다. 정제 ICAM의 공지량을 c78.4A 또는 TM c78.5A IgG-세파로오스TM로 배양하였으며 방사성 결합된 분획을 측정하였다. 이 실험은 정제 tmICAM-1, tICAM(185) 및 tICAM(453)이 이러한 단일 클론 항체에 대한 결합력을 완전히 유지한다는 것을 보여주었다.
형질변환체를35S 시스테인으로 대사 표지시키고 세포 용해물 (막투과 ICAM 의 경우) 또는 배양 상등액 (절단형 ICAM의 경우)을 제조하고 c78.4A IgG-세파로오스TM비이드로 배양시켰다. 이 비이드를 세척하고, 흡수된 단백질들을 SDS로 용출시키고 SDS-PAGE 로 분석하였다(문헌 [Greve 등의 Cell, 56 : 제839 내지847 페이지(1989년)] 참조). 단리된 단백질들은 c78.4A 및 c78.5A Mab에 정량적으로 결합하였다는 것을 발견하였다.
따라서, tICAM(185) 및 tICAM(453)은 모두 원래의 ICAM 구조를 유지하였다.
[실시예 7]
막투과 및 비-막투과 절단형 ICAM-1의 인간 리노바이러스 결합 분석 다음에 기재된 바와 같이 여러 형태의 ICAM의 결합능을 증명하는데 3가지의 결합 분석법을 이용하였다.
[A. 펠릿화 분석]
[35S] 시스테인-표지된 tmICAM-1 또는 tICAM을 10mM 헤페스(pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2, 0.1% 트리톤 X-100 100㎕ 중에서 HRV3과 혼합하였다. 이 혼합물을 37℃에서 30분동안 배양시키고, 얼음으로 냉각시키고, 10% 글리세롤, 0.2M 트리에탄올아민(pH7.5) 200㎕의 쿠숀의 최상부에 적층시키고, 4℃에서 베크만 공기 구동 원심 분리기로 134,000 xg에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상부의 275㎕를 제거하고, 펠릿을 SDS-PAGE 및 섬광 계수기로 분석하였다. 대조 실험의 SDS 겔을 은-염색하면 본질적으로 모든 HRV3은 이러한 조건 하에서 펠릿화되고 본질적으로 모든 ICAM은 상등액에 남아있었다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.
* 4번 실험의 평균; 이러한 수치들은 상대 친화력으로 직접 전환될 수는 없다.
이 데이터들은 ICAM의 양쪽 절단형이 리노바이러스와 결합하지만, tmICAM 에 비해 실질적으로 감소된 정도라는 것을 보여준다.
[B. 용액 결합 분석]
용액 중에서 tmICAM 및 tICAM 단편들의 상대 친화력에 대한 정량화 정보를 얻기 위하여, 가용성 tmICAM 또는 가용성 tICAM 단편들을 S HRV3과 미리 고정화된 ICAM-1과의 결합을 억제하는데 이용하고, 비이온성 계면활성제(트리톤 X-100)를 완충액 중에 포함시켜 다른 단백질들이 동일한 조건 하에서 비교될 수 있도록 하는 용액 경쟁 분석을 행하였다. 먼저, tmICAM-1(트리톤 X-100 대신에 0.1% 옥틸글루코시드의 존재 하에 단리시킴)을 트리스/NaCl 완충액으로 10배 희석하고 철야로 마이크로타이터 플레이트(Immunlon-4, Dynatech)의 웰에 흡착시켰다. 플레이트 상의 비특이적 결합 부위를 10mg/ml BSA로 차단시킨 후, 0.1% 트리톤 X-100/1mg/ml BSA/트리스/NaCl 중에서 결합 시험을 실시하였다. S HRV3 약 20,000 cpm을 37℃에서 1시간 동안 배양된 tmICAM, tICAM(453) 또는 tICAM(185)의 다양한 양의 ICAM과 혼합시킨 후, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가시키고 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 플레이트를 세척한 후 결합 방사능을 측정하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, tmICAM-1은 저농도(0.008㎛)에서 최대의 반 정도로 바이러스 결합을 억제하는 반면에 tICAM(453) 및 tICAM(185)는 더 높은 농도(각각 2.8㎛ 및 7.9㎛)에서 tmICAM 보다 350 내지 거의 1000 배 높은 정도로 억제 한다.
* IC은 HRV3 결합을 50% 억제하는데 필요한 가용성 ICAM의 농도이다.
이 데이터는 tICAM(453) 및 tICAM(185)이 tmICAM-1 보다는 친화력이 낮지만 리노바이러스와 결합한다는 초기의 관찰을 확인시켜 주는 것이며 ICAM-1의 두 개의 N-말단 도메인(185 잔기)내에 바이러스 결합 부위가 존재한다는 증거를 제공하는 것이다.
[C. 돗트-블로트분석]
tmICAM-1, tICAM(453) 또는 tICAM(185)를 니트로셀룰로오스 필터에 흡수시키고, 필터 상의 비특이적 결합 부위를 10mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단시키고 방사성 바이러스 또는 ICAM-1에 대한 I Mab을 37℃에서 60분 동안 필터로 배양시키는 다른 방법을 이용하여 결합 활성을 측정하였다. 필터를 완충액으로 세척하고 X-선 필름에 노출시켰다.
필터에 대한 방사능 결합량은 오토라디오그램의 점도계로 측정하고, 이들 데이터는 ICAM(블로트에 결합)에 결합한 Mab c78.4A 또는 c78.5A 양의 평행 측정에 의해 블로트에 결합한 ICAM의 양으로 표준화시킨 HRV3 결합(임의의 단위)으로서 나타내었다.
* 5회 실험의 평균치. 데이터는 S HRV3 결합/ I 항 ICAM Mab 결합의 임의의 점도 측정 단위로서 나타내었다.
tICAM 185로서 실시한 추가의 연구가 개시되었다. 결합 실험은 불명확한 결과를 나타냈다. 입체 장애가 그 역할을 하는 것으로 예상된다. 바이러스의 크기는 약 30 나노메터였다. tICAM(185)의 길이는 10 나노메터 미만이었다. 스페이서 또는 링커를 이용하면 더 양호한 결합이 이루어질 수 있을 것이다.
이 실험의 결과는 이러한 분석 조건하에 바이러스 결합량이 I Mab 결합량으로 표준화되었을 경우 tICAM(453)이 tmICAM-1 과 비교될 만한 정도로 리노바이러스를 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이 결과는 tICAM 형태가 리노바이러스와 결합할 수 있지만, 결합 활성은 tICAM의 구조에 의존한다는 것을 나타낸다. tmICAM-1은 작은 다중형(다이머로 추측)일 수 있고 다중형인 tICAM의 존재는 이러한 다중형 구조와 유사한 것이다.
이러한 가정을 뒷받침하는 증거는 정량적 결합 연구(공개되지 않음)에서 유래한 것이며, 상기 토의한 바와같이 세포에 결합할 수 있는 리노바이러스 입자들의 최대치와 항체 분자들의 최대치의비는 약 1.5이다. 이것은 결합하는데 필요한 5개 분자들의 복합체를 제안한 초기의 연구[Tomassini, J. 등의 J. Virol., 58: 제290페이지(1986년)]와는 대조적이다. 그들의 결론은 결합된 계면활성제 분자를 고려하지 않고 겔여과 데이터를 해석한 잘못으로 인한 것이다.
[실시예 8]
[tICAM(453)의 CL203 IgG 항체-매개된 가교결합]
tmICAM-1의 더 높은 상대 결합 활성이 단백질의 다중형에 기인한 것이라는 또 다른 증거를 제공하기 위하여, tICAM(453) 단백질을 CL203, 즉, ICAM-1에 결합하는 바이러스를 억제하지 않고 잔기 184의 C-말단 부위에 결합하는 ICAM-1에 대한 단일 클론 항체와 함께 미리 배양시켰다[Staunton 등의 Cell, 56 : 제849페이지(1989년) 및 Cell,61 : 제243 페이지(1990년)]. 따라서, 항체는 tICAM(453)의 두 분자 각각에 대한 바이러스-결합 부위를 차단시키지 않고 tICAM(453)의 두 분자를 효과적으로 가교 결합하여 tICAM(453)의 다이머를 생산할 수 있다. 중량비 4:1의 CL203 IgG 및 tICAM(453)의 혼합물을 경쟁 분석으로 실험하였고, 그것이 다이머 또는 작은 다중형이기 때문에 tmICAM-1이 리노바이러스와 더 높은 친화력으로 결합한다는 이론과 일치하여 항체 가교결합된 tICAM(453)이 tICAM(453)보다 7.4배 낮은 농도에서 HRV3 결합을 억제한다는 것을 발견하였다.
tICAM의 또 다른 다중형을 생산하기 위하여, ICAM의 또 다른 몇가지 변형된 절단형을 상기 실시예 3에 나타낸 바와 같이 작게 하였다. 이러한 형태는 다음 실시예 9에 기재된 바와 같이 다중형이 될 수 있다.
[실시예 9]
[막투과 및 비-막투과 절단형 ICAM-1의 다중화]
tICAM이 강화된 바이러스 결합 및 모노머 형태 상의 중화 활성을 갖는 다중형으로 전환될 수 있는 방법은 몇 가지가 있다. 예를 들면, 아미노 덱스트란 상의 아미노기 또는 tICAM 상의 아미노 또는 다른 기를 이용하는 호모 2관능성(예, N-히드록시 숙신이미드(NHS)에스테르)또는 헤테로 2관능성(예, NHS-에스테르 및 광활성화 또는 술프히드릴-반응성기) 가교 결합제를 이용하여 아미노 덱스트란(MW 40,000)과 같은 불활성 중합체에 tICAM(453)을 결합할 수 있다. 적합한 가교 결합제들의 많은 예는 문헌[Pierce Chemical Company catalog(Rockford, I11)]에서 찾을 수 있다.
tICAM이 NHS-에스테르 기재 화합물과 잘 반응하지 않기 때문에, 유전 공학적인 C-말단 리신 잔기를 갖는 tICAM(실시예 3 참조)은 호모 2관능성 시약에 의해 지지체에 대한 결합 효율이 개선되는 반면에 유전 공학적인 C-말단 시스테인 잔기는 술포말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)등의 헤테로 2관능성 시약에 의해 결합이 용이하게 될 것이다.
별법으로, 가용성 tICAM 멀티머는 tICAM의 C-말단에서 유전 공학적인 반응성 잔기에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 유리 시스테인 잔기는 (용매 노출되는 경향이 큰) tICAM의 C-말단 영역에 비교적 친수성 배열로 만들어질 수 있다. 이것은 동일 반응계 내에 다이머가 생성되도록 할 것이며, 별법으로, 모노머는 정제되고 다이머는 이황화물 교환에 의해 시험관 내에서 생성된다.
또 다른 접근 방법은 유사한 위치에서의 리신 잔기의 배치와 호모 2관능성 NHS-에스테르에 의한 정제된 시험관 내 단백질의 가교결합을 필요로 한다. 그러한 리신 잔기의 예로는 잔기 338, 387을 들 수 있다.
시스테인 잔기들 간의 가교 결합은 유리 시스테인기를 갖는 tICAM을 비스-말레이미도헥산(Pierce Chemical Co.) 또는 다른 비스-말레이미도-동족체와 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. tICAM 상의 유리 시스테인 잔기의 담체 분자 상에서의 아미노기에 대한 가교결합은 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르와의 반응에 의해 이루어질 수 있다. tICAM 분자 상의 아미노기 가교 결합은 호모 2관능성 N-히드록시숙신이미드 에스테르(예를 들면, Pierce Chemical Co.의 카다로그 참조)에 의해 이루어질 수 있다. 별법으로, tICAM 상의 탄수화물기들은 알데히드로 산화될 수 있고 담체 분자 상의 히드라진-활성화 아미노기와 결합될 수 있다.
[실시예 10]
[막투과 및 비-막투과 절단형 ICAM-1의 감염-중화 분석]
바이러스 감염에 대한 세가지 다른 분석법이 이용될 수 있다. 이러한 다른 분석법은 막투과 ICAM 및 비-막투과 용해도와의 차이점을 고려한 것이다.
[A. 계면 활성제 존재 하의 플라크-감소 분석]
이러한 분석의 결과는 죽은 세포 중에 유효하게 남아 있는 바이러스의 최대 희석을 나타낸다. 바이러스를 0.1% TX100의 존재 하에 막투과 ICAM 단백질로 미리 배양시키고, 이어서 배양 배지로 희석시키고, 10 세포/ml에서 HeLa 세포로 30분 동안 배양시키고, 10배 희석하고 다양하게 희석된 바이러스를 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 다중 웰에 플레이팅시킨다. 0.1% TX100을 양성 대조용으로 사용하였다. 5일 후, 감염된 정도로서 또는 세포 변성 효과(CPE)의 존재에 의해 웰을 평가하고, 역가를 원 바이러스의 플라크-형성 단위/ml(PEU/ml)로서 표시하였다. 이 분석법은 미합중국 특허 출원 제239,571호에 기재되어 있으며 tmICAM-1(용액 중에 잔류하기 위해 계면활성제가 필요)의 항 바이러스의 활성을 증명하는데 사용된다. 사용되는 ICAM 단백질의 농도는 예비-배양 혼합물 중의 초기 농도이지만, ICAM 단백질은 단백질이 연속으로 희석된다는 점에서 감염 동안에 계속적으로 존재하지 않는다. 계면활성제의 존재가 tmICAM을 가용화시키는데 필요한 반면, 계면활성제의 존재는 세포를 파괴시키므로 연속적인 희석이 필요하다.
[B. 계면활성제 부재 하의 플라크-감소 분석]
좀 더 전형적인 분석인 본 플라크-감소 분석에서, HeLa 세포를 계면 활성제가 존재하지는 않지만 상기한 바와 같이 연속 희석된 리노 바이러스로 감염시킨다. 그러므로 이 분석은 tmICAM 분석하는데 사용될 수 없다. 이 분석에서 tICAM은 지정된 농도로 배양 배지에 연속적으로 존재한다. (계면활성제의 존재를 필요로 하는) tmICAM-1은 필요한 계면 활성제의 첨가가 HeLa 세포를 파괴하기 때문에 이 시스템에서 분석될 수 없다.
[C. 바이러스와 ICAM이 계속 존재하는 상태에서 플라크-감소 분석]
이 분석은 말린 등에 의한 분석과 유사하며, 여기서 HeLa 세포의 배양액을 ICAM 단백질의 존재 또는 부재 하에 바이러스 100PFU로 감염시키고 세포 변성 효과(CPE)가 뚜렷할 때까지 약 4일 동안 배양한다. 배양물을 육안으로 CPE에 대해 평가한다. 이 분석 조건은 상기한 말린의 조건과 동일하였다. 평가는 결정 바이올렛을 사용한 염색 방법에 의한 것보다는 육안으로 하였다.
이 분석에서, 계면활성제는 존재하지 않고 ICAM은 연속적으로 존재하며, 이 분석은 임의의 시점에서 바이러스 복제/전파의 감소를 측정한다.
바이러스 감염에 대한 이러한 세가지 다른 분석 데이터는 표 4에 요약하였다.
* IC 50%는 HRV3 감염을 50% 억제하는 데 필요한 ICAM 단백질의 농도로서 정의된다.
이들 데이터는 상이한 분석 시스템에서 비교할 때에도 tmICAM-1이 절단형 ICAM 단백질보다는 바이러스감염율을 감소시키는데 상당히 더 활성이라는 것을 나타낸다. 분석(A) 및 분석(B)에서 tICAM(453)의 중화 활성의 차이점은 tICAM(453)에 의해 매개되는 중화가 배양 배지 중의 tICAM(453)의 연속적인 존재를 필요로 하며 가역적이라는 것을 나타낸다. 중화가 가역적이라는 것은 분석(A)에서 관찰된 중화의 부족에 의해 나타내어진다. 반대로, tmICAM-1의 중화 활성은 분석(A) 중의 tICAM(453) 및 tICAM(185) 보다 667배 높고 tmICAM-1이 계면 활성제의 부재 하에 배지 중에서 연속적으로 존재하는 것이 가능하다면 분석(B)에서 보다 더 높을 수 있다.
이 결과들을 말린 등에 의한 결과와 비교하기 위하여, 그들의 분석 조건을 재현하려고 시도하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, tICAM(453)의 IC50%가 말린 등에 의해 알려진 것보다 10배 더 크긴 하지만 분석(B) 및 분석(C)결과 사이에는 양호한 상호 관계가 있다. 이것이 사용된 리노바이러스의 혈청형의 차이점에 기인한 것인지를 결정하기 위하여, HRV14 및 HRV54 (말린 등에 의해 사용된 혈청형)를 사용하여 분석을 반복하였다. 이들 양쪽 혈청형에 대한 IC50%는 0.2㎛ tICAM(453)이었으며, 이것은 HRV14, HRV54, 및 HRV3 사이의 혈청형 민감도에는 차이점이 없다는 것을 나타낸다.
이러한 모순을 해결하기 위하여, 말린 등이 사용한 것과 같은 완충액을 사용하여 그들이 분석(C)에서 리노바이러스의 감염율에 영향을 미치는 지를 확인하였다. 말린 등은 50mM 트리에탄올아민 (TEA)/20mM 트리스를 함유하는 완충액 중에 그들의 sICAM-1 단백질을 제조하였다. 이 완충액 만을 HRV3 및 HRV14의 감염을 억제하기 위하여(1/10 부피, 최종 농도 5mMTEA/2mM 트리스) 첨가할 경우, CPE의 완전한 억제가 실제로 관찰되었다. 따라서, 완충액은 임의 형태의 ICAM의 존재에 무관하게 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있는 것이 가능하다.
[실시예 11]
[ICAM/FLA-1 상호 작용의 효과적인 억제제로서 막투과 다중형 및 절단형 ICAM-1의 이용]
정상 기능의 ICAM-1은 백혈구 인테그린 LFA-1의 리간드로서 작용하며, 이들 두 분자들 사이의 상호 작용이 백혈구와 다양한 다른 세포들 사이에 접착하게 한다. tICAM(453)의 세포 상 ICAM-1 및 LFA-1 사이의 접착 억제능은 다음과 같이 시험하였다. ICAM-1을 실시예 7C에 기재된 바와 같이 마이크로타이터 플레이트에 흡착시켰다. LFA-1을 발현하는 JY 세포들을 ICAM-발현 세포 또는 ICAM-1-코팅된 배양 디쉬(Staunton 등, JCB)에 부착시킨다. JY 세포들을 tICAM(453)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 30분 동안 예비 배양한 후, ICAM-1-코팅된 플레이트에 첨가하고 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 마이크로타이터 플레이트를 세척한 후 플레이트에 부착된 세포수를 계수하였다.
* ICAM-1-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합; 10㎍/ml 항 LFA-1 또는 항 ICAM-1 Mab은 결합을 1%로 억제하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 고농도의 tICAM(453) (0.6mg/ml)에서도, JY 세포 결합은 최소 억제 작용이 관찰되었다. 이것은 세포들 사이의 접착이 수천개의 분자들을 포함하는 공통 과정이고, tICAM(453)의 친화력이 낮다는 사실에 기인한 것일 것이다. 다중형 구조의 tICAM(453) 또는 tICAM(185)의 제공은 세포에 대한 tICAM의 친화력을 증가시키고 염증 또는 자동 면역 질병에서 효율적인 항접착제로서 작용할 수 있다.
상기한 실시예는 tICAM-1 결합 및 중화 활성을 실질적으로 증가시키는 가용성, 다중형 tICAM의 제조를 설명한 것이다.
본 발명은 특정 방법 및 조성물을 사용하여 설명하였으나, 본 발명을 고려하여 당 업계의 숙련자들은 변화 및 변형을 할 수 있을 것으로 이해된다.
예를 들면, 바이러스 결합 부위를 함유하는 ICAM-1로부터 유도된 작은 단백질 단편 및 펩티드는 또한 다중형 구조에 효과적일 것으로 예상된다. 두 분자들 사이의 친화력이 아주 낮고 이들 두 분자에 의해 매개된 세포-세포 결합이 매우 공동적이기 때문에, 다중형 ICAM이 ICAM-1/LFA-1 상호작용의 효율적인 억제제일 수 있다는 것으로 예상된다.
바람직한 형태 및 구조는 다이머 구조의 비-막투과(절단형) ICAM이지만, 본 발명의 영역에 속하는 바이러스 결합에 효과적이고 바이러스 활성 중화에 효과적인 다른 형태 및 구조를 배재하지는 않는다.
또한, 불용성, 정상적인 막결합 수용체 단백질로부터 가용성 단백질 형태를 제조하는 본 발명의 일반적인 방법은 주요 그룹 수용체에 결합하는 것 이외의 바이러스에 결합하여 그의 감염율을 감소시키는데 유용한 다른 수용체 단백질의 가용성 다중형을 제조하는데 이용될 수 있다. 이러한 다른 바이러스의 예로는 소아마비, 단순 포진 및 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스를 들 수 있다.
상기의 예시적인 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명에 대한 수 많은 변형 및 변화가 첨부되는 특허 청구 범위에 기재된 범위 내에서 당업계의 숙련자에 의해서 수행될 수 있다.
따라서 첨부되는 특허 청구의 범위는 청구되는 본 발명 영역 내에 상기와 같은 동등한 변형을 포함할 수 있는 것이다.
Claims (38)
- 각 단량체는 같거나 다를 수 있고, 막투과 세포간 접착 분자-1(tmICAM-1) 및 절단형 세포간 접착 분자-1(tICAMs)로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며, 단량체간에 서로 내부 결합을 통하여 직접 연결되거나 외부 링커를 통하여 간접적으로 연결되는 2개 이상의 단량체로 이루어지고, 인간 리노바이러스(HRV)에 결합하여 그의 감염을 감소시키는 다중형 항바이러스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 ICAM이 비-막투과 ICAM임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제2항에 있어서, 상기 비-막투과 ICAM이 실질적으로 카르복실 세포내 도메인 및 소수성 막 도메인을 갖지 않음을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제2항에 있어서, 상기 비-막투과 ICAM이 tICAM(453) 및 tICAM(184)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 ICAM이 지지체에 흡착됨으로써 다중화됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제5항에 있어서, 상기 지지체가 불활성 중합체이며, 니트로 셀룰로오스, PVDF, DEAE, 지질 중합체 및 아미노 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성 물질임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 다중형 ICAM이 구성 물질에 결합됨으로써 다중화됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 ICAM이 한쪽 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제8항에 있어서, 상기한 ICAM이 카르복실 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제8항에 있어서, 상기 ICAM이 반응성 아미노산 잔기를 포함하는 카르복실 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제10항에 있어서, 상기 반응성 아미노산이 리신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제8항에 있어서, 상기 ICAM이 아미노 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제8항에 있어서, 상기 ICAM이 반응성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 반응성 아미노산이 리신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제8항에 있어서, 상기 ICAM이 올리고머 마이셀의 형성을 증진시킬 수 있는 지질을 포함하는 한쪽 말단에서 변형됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제7항에 있어서, 상기 구성 물질이 항체, 단백질 담체 및 가교결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제16항에 있어서, 상기 항체가 항 ICAM 항체 CL203임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제16항에 있어서, 상기 가교결합제가 헤테로 2관능성 및 호모 2관능성 가교결합제로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제18항에 있어서, 상기 가교결합제가 2관능성 N-히드록시 숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르 및 비스-말레이미도-헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제7항에있어서, 상기 단백질 담체가 알부민 및 프로테오글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 ICAM이 완전 글리코실화된 ICAM, 부분 글리코실화된 ICAM 또는 비-글리코실화된 ICAM으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 다중형 항바이러스 제제.
- ICAM을 제1항에 따른 다중형 항바이러스 제제 형태로 제공하는 단계로 이루어지는, 인간 리노바이러스(HRV)에 대한 ICAM의 결합을 증진시키는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 비-막투과 ICAM이 실질적으로 카르복실 세포내 도메인 및 소수성 막 도메인을 갖지 않는 ICAM임을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 비-막투과 ICAM이 tICAM(453) 및 tICAM(185)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 ICAM이 카르복실 말단 또는 아미노 말단에서 변형되고 다중형 ICAM 형성이 증진됨을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 변형이 카르복실 말단에서 리신의 첨가로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 변형이 카르복실 말단에서 유리 시스테인의 첨가로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 다중형 구조가 다이머 구조임을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 다중형 구조가 제2 ICAM에 가교결합된 제1 ICAM임을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 다중형 구조가 다중형 구조를 형성하는 지지체에 흡착된 ICAM임을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 지지체가 고분자량이고 실질적으로 불활성인 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 중합체가 불활성 중합체이고 니트로 셀룰로오스, PVDF, DEAE, 지질 중합체 및 아미노 덱스트란으로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성 물질임을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 다중형 ICAM이 구성 물질에 결합됨으로써 다중화됨을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 구성 물질이 항체, 단백질 담체 및 가교결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 가교결합제가 헤테로 2관능성 및 호모 2관능성 가교결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 단백질 담체가 알부민 및 프로테오글리칸으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 항체가 항 ICAM 항체 CL203임을 특징으로 하는 방법.
- 제약상 허용 가능한 용매, 희석제, 보조제 또는 담체, 및 유효 성분으로서 제1항에 따른 다중형 항바이러스 제제의 유효량을 포함하는 제약 조성물.
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