KR100316212B1

KR100316212B1 - 생체적합성히드로겔

Info

Publication number: KR100316212B1
Application number: KR1019970700490A
Authority: KR
Inventors: 보리스 이바노비치 파블리크
Original assignee: 흐레비니크 미콜라 미콜라요비치; 말로에 브네드렌체스코에 프레드프리야티에 "인터폴"
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1994-08-12
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2014-08-12
Also published as: NO970330D0; CZ22497A3; PT742022E; US5798096A; FI970315A0; EP0742022B1; ES2145841T3; HU9603434D0; BG101251A; CN1058639C; RU95100525A; WO1996004943A1; DE69423520D1; EP0742022A4; BR9408609A; CA2195957C; JPH10503950A; BG62915B1; ATE190508T1; NO310446B1

Abstract

생체적합성 히드로겔은 미용적 및 기능적 결함에 대한 인간의 치료에서(예컨대, 유방, 성대, 성기등에서 내보철로서), 연장-작용 의약제제용 조직내 저장부위의 제공에서, 전기전도성 액침매체로서의 다양한 용도에서, 그리고 수명이 긴 공동의 전색에서 사용하기 위해 제공된다. 그것은 분산매체로서 무발열성 물에서 라디칼 중합 개시제의 존재하에 생성된 아크릴아미드-기제 폴리머를 함유한다. 주로 내보철 용도에서 탄력성, 형상유지능력 및 큰부피 이식편의 안정성의 증가 뿐만아니라 대응하는 치료적 및 미용적 효험은 메틸렌-비스-아크릴아미드 같은 생체적합성 가교제와 중합 개시제로서 바람직하게는 과황산암모늄 및 테트라메틸에틸렌디아민의 혼합물을 사용하여 생성된 가교 폴리아크릴아미드를 함유하는 히드로겔로 인해 성취된다. 히드로겔중 신규 폴리머의 바람직한 농도는 3.5 내지 9중량%이다.

Description

생체적합성 히드로겔{BIOCOMPATIBLE HYDROGEL}

본 발명은 의료용 생체적합성 히드로겔의 제제에 관한 것이며, 이것은 다음 용도에 사용될 수 있다:

형상(shape) 및 치수(dimensions)의 외상성, 선천성 또는 노화성 왜곡으로 인한 또는 연조직으로 구성된 일부 기관의 형태 안정성의 상실로 인한 인간의 결함을 바람직하게 치료하기 위한 의도적 주사방식에 의한 내보철(endoprosthesis) 진료, 예컨대:

- 얼굴 및 신체의 다른 부분의 형태 및 치수를 교정하기 위한 성형술, 특히 유방성형술(바람직하게는 유방발육부전 또는 유방왜소증의 경우),

- 탄성매체를 성기의 해면혈관조직에 주사함으로써 정력을 향상시키기 위한 남성학(발기저하의 경우);

상기 및 다른 유사한 경우의 신체 형상 및 기능의 개선을 위한 요구가 널리 퍼져 있으며 단순한 환자의 희망에 의해 자주 논의되었다.

이것이 상기 용도를 위한 생체적합성 물질이 거의 일치되기 어려운 요건들을 만족시켜야 하는 이유이다. 가장 중요한 요건들 중에 다음과 같은 것들이 있다:

환자가 수술되는 나이에 관계없이 내보철이 위치된 기관의 형상 및 치수를 장기간(바람직하게는 평생) 유지;

최소 외상발생 및 특히 다량-투여(1000㎖까지) 용도에서 생체적합성 물질의 가능한한 최단시간 도입.

이것이 상기 용도의 요건을 만족시키는 이유이고, 겔화(gelling) 생체적합성 물질을 사용하는 것이 실용적이다.

사실상 최소 외상발생 및 생체적합성 물질의 최단 도입, 발암성의 부재 및 최소 알레르기 반응은 소(bovine) 콜라겐의 수용액을 사용하여 성취되며, 이것은 매우 정제되고 부분적으로 해중합된 생성물이고 형상 및 치수를 위해 처치된 기관에 주사시 37℃ 이하의 온도에서 탄성이고 기계적으로 안정한 히드로겔로 전환한다(Ford Ch., Martin D. M., Warner Th. F. Injectable collagen in laryngeal rehabilitation//LARYNGOSCOPE. 1984, 94, pp. 513-518 참조).

그러나 단백질인 콜라겐은 상당히 단기간(반년 미만)내에 환자의 체내로 완전히 재흡수 될 것이다.

그러므로 주로 결합조직 대신 내보철로의 완전한 치환이 허용가능한 경우 또는 의료 지시에 따라 환자가 정확하게 일시적인 내보철을 필요로 하는 경우 내보철 진료에 사용하기 적합하다.

소 콜라겐 용액은 그것의 재흡수능력과 조직내 및 조직간 이동으로 인해 효소 공격을 받기 쉬운 한편 장기간 내보철을 위한 물질로서 이용하기에 실제적으로 부적합하다는 것을 또한 알아야 한다.

상기를 고려하면, 합성폴리머에 기초한 겔화생체적합성물질이 더 바람직하다.

따라서 폴리글리콜 및 메타크릴산의 친수성 에스테르 형태의 생체적합성 겔화물질이 내보철 진료에 이용된다고 알려진다 (Kresa L., Rems T., Wichterle O. Hydrogel implant in vocal cord//Otolaryngol. Head Neck Surg. -1988, V. 98, No 3, pp. 242-245).

그러한 건조물질의 필요 투여량이 미용적 또는 기능적 치료 영역에 절개술을 통해 이식된 다음, 수술 상처가 침윤된다. 그후에 물질이 주변조직으로부터 수분을 흡수함으로써 팽창하여 교정기관의 부피를 국소적으로 증대시킨다.

이 생체적합성 물질은 높은 생화학적 안정성을 특징으로 한다.

그러나 사용할 때 영속적 치료효과는 부종 및 무균염증과 관련된 외상적 외과 개입의 비용 부담하에 성취된다.

그러므로 내보철 진료 및 다른 용도를 위해 가장 유망한 것은 상업적으로 이용가능한 주사용 액체 생체적합성 겔화 물질이다.

수불용성 폴리머, 그 가운에 비가교 아크릴로니트릴 폴리머 또는 그것들의 공중합체, 폴리비닐아세테이트, 2-히드록시에틸-아크릴레이트 및 메틸-아크릴레이트의 선형 또는 저분지형 폴리머 또는 공중합체, 폴리-n-비닐이미노카르보닐 및 디메틸술폭시드 또는 물 유기용매와 쉽게 혼화성인 다른 극성물질을 함유하는 용액으로서의 생체적합성 겔화 물질이 예시될 수 있다(Stoy V., Chvapil M., 미국특허번호 4,631,188; 1986). 공중합체를 얻는데 있어 아크릴아미드(N-치환체 포함), 아크릴히드라지드(N-치환체 포함), 아크릴산 및 아크릴레이트, 글루타르이미드 및 비닐술폰과 같은 추가적 모노머가 사용될 수 있으며; 글리세롤 및 그것의 모노-또는 디아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이조프로판올, 디메틸포름아미드, 글리콜 및 다른 적합한 용매와 같은 물용매와 쉽게 혼화성인 극성물질이 사용될 수 있다.

이 물질은 작은 미용적 또는 기능적 결함, 특히 입술 및 얼굴의 다른 부분의 치료에 매우 효율적이다.

그러나, 내보철로 유방형태 및 치수를 교정하는데 있어 최고 1리터 까지의 물질이 요구될 수 있다. 그러한 경우에 겔화 폴리머와 함께 주사된 유기용매의 양은 실질적으로 생리학적 허용가능한 최소치를 초과하여 홍반 및 몇몇 경우에 알레르기 쇼크를 초래한다. 또한 사용된 겔화 폴리머의 선형 구조로 인해 내보철은 낮은 형태 안정성, 큰부피, 낮은 품질을 가진다고 관찰되었다.

이것이 알레르겐(allergen)을 함유하지 않는 상업적으로 이용가능한 히드로겔이 가장 바람직한 이유이다.

그들 중에서 본 발명에 가장 밀접한 것은 무발열성(apyrogenic) 이증류수(bidistilled water)와 같은 분산매체에서 자유라디칼 중합 개시제(특히, 과황산암모늄)의 사용에 의해 생성된 아크릴아미드 기제 폴리머 3.0중량%를 함유하는 생체적합성 히드로겔이다 (USSR 발명자증 35 1,697,756).

이 히드로겔은 사실상, 상기 모든 측면에서 인간의 조직 및 액체와 완전히 생체적합성이고, 그러므로 발현된 부정적 생화학적 및 생물학적 후유증을 유발하지 않고 상당한 양(1리터 까지)으로 사용될 수 있다. 주사의 영역에서 그것은 물, 이온, 산소 뿐만아니라 저분자 대사물질에 의해서도 쉽게 투과가능한 구조를 형성한다. 히드로겔 이식조직은 수용자의 젊은 섬유조직으로 상당히 높은 속도(5-6개월)로 침입된다.

그러나 이 히드로겔은 낮은 점성과 그로 인한 낮은 탄성 및 높은 이동성을 가진다. 히드로겔에 함유된 수분은 폴리아크릴아미드의 거대분자와 느슨하게 결합하고, 이식편으로부터 쉽게 제거되어 그것의 현성 수축과 미용적 또는 치료적 효과의 상당한 감소를 초래한다. 이것은 큰 부피의 (예컨대, 유방내) 내보철을 삽입하는 경우에 이식편이 외부 변형부하에 낮은 내성과 그들의 최초 부피 만큼의 수축을 보이는 이유이다.

그것의 높은 유동성으로 인해, 이 히드로겔은 낮은 효율성을 가진다.

그러므로 본발명의 목적은 내보철 용도에서 폴리아크릴아미드 조성을 개선함으로써 탄성, 형상유지 및 큰 부피 이식편의 안정성을 보장하고 더 나은 치료적 및 미용적 효과를 제공하는 생체적합성 히드로겔을 제공하는 것이다.

상기 문제점은 분산매체로서 무발열성 물에서 라디칼 중합반응의 개시제를 사용하여 생성된 아크릴아미드 기제 폴리머를 함유하는 생체적합성 히드로겔을 제공함으로써 해결되었고, 여기서 본 발명에 따라 상기 폴리머는 생체적합성 가교제를 사용하여 생성된 가교 폴리아크릴아미드이다.

물, 이온, 산소 및 저분자 대사물질에 여과성이고 주사용으로 적합한 본 발명의 히드로겔은 더 규칙적이고 더 유리한 수분-결합 구조이므로 극히 낮은 속도(수개월 내지 수년)로 연질 고도-혈관화된 결합조직으로 침입된 부피가 큰 고탄성의 형태-유지 이식편(예컨대, 유방내 내보철 및 성기의 해면혈관조직내 지지로드)을제공한다. 상기와 같은 구조적, 생화학적, 해부학적 및 생리학적 이점으로 인해, 실질적인 미용적 및/또는 치료적 효과가 있을 뿐만아니라 내보철 용도에서 그러한 효과의 영속성도 증가한다.

본 발명의 한가지 양태에 따르면, 생체적합성 히드로겔은 가교제로서 메틸렌-비스-아크릴아미드와 중합 개시제로서 과황산암모늄 및 테트라메틸렌디아민의 혼합물을 사용하여 생성된 가교 폴리아크릴아미드를 함유한다. 메틸렌-비스-아크릴아미드는 그것의 조성 및 생체적합성 둘다에 의해 기초 모노머(아크릴아미드)에 유사한 반면, 중합 개시제의 상기 혼합물의 사용은 히드로겔의 주사에 적합한 탄성 공간 네트워크를 제공하는 폴리아크릴아미드 사슬 거대분자의 매우 규칙적 가교결합에 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 생체적합성 히드로겔은 3.5 내지 9.0중량%의 상기 가교 폴리아크릴아미드를 함유한다. 이 범위의 농도는 주사 내보철 진료 또는 전색에서 최대 치료적 또는 미용적 효과를 제공한다. 3.5% 이하의 농도는 히드로겔을 불안정하게 하여 오직 의약 연고용 기제 또는 심장-또는 대뇌촬영용 전기전도성 액침매체로서만 사용되는 반면, 9.0% 이상의 농도는 히드로겔의 유동성을 실질적으로 제로까지 감소시켜 그러한 내보철의 삽입영역으로 접근하기 위한 외과적 방법을 필요로 하는 비교적 견고하게 형태-유지된 미리 성형된 내보철을 제조하는데 실용적이다.

이하 본 발명은 다음에 의해 개시된다:

개시시약, 신규 생체적합성 히드로겔의 제조방법, 그 방법의 실시예 및 상기히드로겔의 실험실 검사 결과의 설명;

생체적합성 히드로겔의 제제의 예;

신규 생체적합성 히드로겔에 대한 화학적, 생화학적 및 의학적 연구의 방법 및 결과의 설명;

신규 생체적합성 히드로겔의 의도적 주사에 의해 인체의 미용적 및 기능적 결함을 교정하는 방법의 설명; 및

그것의 실용적 용도에 대한 정보.

신규 생체적합성 히드로겔을 제조하기 위해 표 1에 나타낸 시약들을 사용한다.

신규 생체적합성 히드로겔을 제조하기 위한 시약

시약 및 실험식	100g의 히드로겔당 투입량, g	제어변수 단위 및 한계
1	2	3
아크릴아미드 C₃H₅NO	3.5-9.0	융점, ℃, 84.5+/-0.5 밀도, g/입방 ㎝, 1.122 기초성분, wt%, 98이상
메틸렌-비스-아크릴아미드 C₅H₁₀N₂O₂	0.01-1.00	융점, ℃, 184+/-1.0 기초성분, wt%, 96이상
TMED-테트라메틸-에틸렌디아민 C₆H₁₆N₂	0.001-1.00	밀도, g/입방 ㎝, 0.78 기초성분, wt%, 98이상
과황산암모늄(NH₄)₂S₂O₈	0.001-1.00	밀도, g/입방 ㎝, 1.98 분해점, ℃, 120 기초성분, wt%, 98이상
무발열성 이증류수	나머지	굴절지수, 1.3329

이 증류수와 별도로 상표명 REANAL (헝가리)하에 상업적으로 구입가능한 시약, 즉 백색 결정형태의 아크릴아미드 및 메틸렌-비스-아크릴아미드, 백색 유성 액체로서의 테트라메틸에틸렌디아민과 무색결정형태의 과황산암모늄이 실험에 사용되었다.

통상적으로 신규 생체적합성 겔은 다음 방법에 의해 제조된다:

무균 실험실 조건하에 계산된 양의 아크릴아미드와 가교제(메틸-비스-아크릴아미드) 및 중합 개시제(과황산암모늄 및 TMED)의 희석 수용액을 멸균 유리용기에 넣는다. 이들 시약을 철저히 교반한 다음, 물(선택적으로 생리학적용액, 선택적으로 다른 생리학적 중성 염 예컨대 아세트산나트륨의 희석 수용액)로 희석하고; 그 다음 혼합물을 여과하고, 여액을 가교 폴리아크릴아미드(이하 CL PAA)의 히드로겔이 얻어질 때까지 방치한다.

제조된 CL PAA 히드로겔은 다음 특성에 대해 제어된다:

시각에 의한 외양(히드로겔은 투명, 무색, 불순물이 없어야 한다);

굴절지수(1.334 내지 1.350의 범위내);

pH (7.0-9.0의 범위내);

중금속 함량(0.001중량% 이상); 및

안정성.

도 1은 기형 및 크기 교정을 위한 치료후 좌측 유방을 나타낸다;

도 2는 우측유방의 유사한 형태 및 크기 교정을 나타낸다.

도면에서 볼수 있듯이, 양쪽 유방은 치료의 결과로서 정상위치와 정규형태를 가지는 것으로 밝혀진다. 피부 두께는 2.0㎜를 초과하지 않고, 유두 및 유륜도 정상이다 (변형되거나 수축되지 않음). 양쪽 유방의 형성부전 선조직은 유선뒤 공간으로 주사된 CL PAA 히드로겔(조직에 비해 밀도가 다름)에 의해 복부쪽으로 이동한다(선조직의 밀도는 +3.0 내지 +4.0이고, 히드로겔의 밀도는 +4.6 내지 +7.2이고, 피하 지방세포 조직의 밀도는 -73 내지 -95단위 Hu이다).

치료후 유선치수는 다음과 같다:

오른쪽 7.4㎝ 및 왼쪽 8.0㎝의 횡방향;

오른쪽 및 왼쪽 약 5.0㎝의 전후방향.

국부 림프절은 확대되지 않고, 흉골 및 갈비뼈의 골조직은 정상적으로 구성된다.

실험실, 실험적 및 임상적 데이터에 의해 신규 CL PAA 히드로겔이 화학적 및 생물학적으로 안정, 불활성, 생체적합성이고, 공동의 전색과 연장-작용의약제제용 조직내 저장 부위의 형성을 위해 내보철로서의 이식에 완벽하게 적합하다는 결론을 내렸다.

신규 생체적합성 히드로겔은 4.0-8.0% 범위의 CL PAA 농도를 가지고 염화나트륨 및 아세트산나트륨의 0.9% 수용액상에서 제조된 샘플상에서 장기간 심장- 및 뇌조영술을 위한 매체로서 시험되었다.

시험은 다음을 포함한다:

주석-, 구리- 또는 알루미늄- 도금된 접촉면을 갖는 직경 9㎜ 및 두께 3㎜의 디스크형 전기기록 전극(유형 EKMK-6) 사이에 1㎜ 층으로 배열된 히드로겔의 전기 저항율의 측정;

그것의 24시간 안정성에 대해 전기 저항율의 측정; 그리고

두 남자 및 두 여자를 포함하는 의료 지원자의 팔꿈치 근처의 전완 피부영역에 대한 연장된 (1, 7 및 15일 관찰) 이용성을 가지는 능력의 결정.

전기 저항율은 BCH6 및 BCH7 샘플의 8.0 내지 9.0kOhm/㎝이었고 BCH8 및 BCH9 샘플의 10.0 내지 20.0kOhm 이었다; 그것을 24시간 동안 각 샘플에 대해 변화시키지 않았고, 3시간마다 반복하여 측정하였다. 이에 비해, SIEMENS AG에서 상업적으로 구입가능한 전극 페이스트는 약 8.0kOhm/㎝의 전기 저항율을 가진다.

모든 시험에서, 주석- 도금된 전극의 분극률은 약 450㎷, 구리-도금된 전극의 분극률은 150㎷, 알루미늄-도금된 전극의 분극률은 약 700㎷ 이었다. 전기 저항율의 측정시 기생 분극화는 감지되지 않았다.

시각 관찰시, 피부적용부위중 어느 부분도 상기 기간도중 가시적 과민(발적 또는 소양증) 및 더욱이 피부손상(침연)을 보이지 않았다. 한 경우에서 15일째에 히드로겔 도포를 덮는 경고(plaster) 주위의 피부가 한 여성 지원자에게서 분홍색으로 바뀌었다.

10-11푸아즈의 점도를 갖는 CL PAA 히드로겔이 수평 배열된 측정전극들 사이의 공간으로부터 또는 경고의 아래로부터 자발적으로 흘러나오는 것은 관찰되지 않았다.

이들 데이터는 신규 CL PAA 히드로겔이 인간 유기체의 전기생리학적 매개변수를 모니터링하기 위한 그리고 피부를 통해 전기영동적으로 약제를 주사하기 위한 액침매체로서 이용가능하다는 것을 나타내었다.

본 발명은 다음 실시예를 읽음으로써 쉽게 이해될 것이다.

[실시예 1]

저농도 생체적합성 히드로겔의 제조

20.3g의 아크릴아미드, 8.7㎖의 2% 메틸-비스-아크릴아미드 수용액, 7.5㎖의 1% TMED 수용액 및 15㎖의 4% 과황산암모늄 수용액을 1리터 용량 유리용기에서 혼합하였다. 그 다음 물을 첨가하여 580㎖의 총부피를 얻고, 혼합물을 유리필터를 통해 여과하고, 여액을 3.5% CL PAA 히드로겔이 형성될 때까지 적어도 20분간 방치하였다.

[실시예 2]

고농도 생체적합성 히드로겔의 제조

34.2g의 아크릴아미드, 60㎖의 1% 메틸-비스-아크릴아미드 수용액, 6㎖의 1% TMED수용액 및 25㎖의 0.48% 과황산암모늄 수용액을 1리터 용량 유리용기에서 혼합하였다. 그 다음 물을 첨가하여 380㎖의 총부피를 얻고, 혼합물을 유리필터를 통해 여과하고, 여액을 9% CL PAA 히드로겔이 형성될때까지 적어도 20분간 방치하였다.

[실시예 3]

중간농도 생체적합성 히드로겔의 제조

24g의 아크릴아미드, 50㎖의 1% 메틸-비스-아크릴아미드 수용액, 25㎖의 1% TMED 수용액 및 50㎖의 1.3% 과황산암모늄 수용액을 1리터 용량 유리용기에서 혼합하였다. 그 다음 물을 첨가하여 380㎖의 총부피를 얻고, 혼합물을 유리필터를 통해 여과하고, 여액을 5% CL PAA 히드로겔이 형성될 때까지 적어도 20분간 방치하였다.

[실시예 4]

저농도 전기전도성 생체적합성 히드로겔의 제조

CL PAA 히드로겔을 생리학적용액이 물 대신에 사용된 것을 제외하고 실시예 1에서와 같이 제조하였다.

[실시예 5]

고농도 전기전도성 생체적합성 히드로겔의 제조

CL PAA 히드로겔을 9% 아세트산나트륨 수용액이 물 대신에 사용된 것을 제외하고 실시예 2에서와 같이 제조하였다.

실험에서, CL PAA 생체적합성 히드로겔(이하 BCH)의 제제는 표 2에서 나타낸 바와 같이 사용되었다.

신규 CL PAA 생체적합성 히드로겔의 특정제제의 예

성 분	제제 및 농도, 중량%
성 분	BCH1	BCH2	BCH3	BCH4	BCH5	BCH6	BCH7	BCH8	BCH9
CL PAA	3.0	3.5	6.0	9.0	9.5	4.0	7.0	5.0	8.0
염화나트륨	-	-	-	-	-	-	-	0.9	0.9
아세트산나트륨	-	-	-	-	-	0.9	0.9	-	-
수분	나 머 지

표 2에 보여지듯이, BCH2, BCH3 및 BCH4, BCH6, BCH7, BCH8 및 BCH9 제제는 히드로겔중 바람직한 농도의 CL PAA를 가지고, BCH2 및 BCH4는 히드로겔중 CL PAA의 바람직한 농도 한계와 일치하는 반면, 모든 다른 제제는 중간농도를 반영하고, 가장 바람직한 것들이다. 대조적으로 BCH1 및 BCH5 제제는 매우 한정된 수의 용도에 유용한 히드로겔중 CL PAA 농도의 대표적인 것이다.

신규 히드로겔의 실험실 연구는 화학적, 생화학적 및 의학적 및 생물학적 성질의 관점에서 수행하였다. 이들 연구는 엄격히 한계를 정하지 않고, 실제적으로 종래의 방법 및 기술에 의거하고 있다.

그래서 건조 잔류물을 연구하여 진성 또는 콜로이드 용액중 물질의 정확한 농도를 통상적으로 결정하였다.

그 다음 "Methods of analysis of acrylates and methacrylates", KHIMIA 발행인, 모스크바, 1972(러시아어)로 표지된 실용안내서에 개시된 기술에 따라 USSR State Standard GOST 15. 013-86 "Medical devices"와 일치하게 건조 잔류물을 연구하였다.

히드로겔중 CL PAA의 정확한 농도는 건조 잔류물로부터 일반적으로 결정된다. 이 방법은 히드로겔 샘플을 칭량하고, 그것을 일정한 중량으로 건조시키고(약 20시간 동안 35℃에서 12 내지 15㎜Hg의 잔류압력), 이어서 히드로겔중 CL PAA 퍼센트를 통상적으로 계산하는 것을 포함한다.

이 방법은 신규 히드로겔의 화학 안정성을 평가하기 위해 이용되었다.

이 목적으로, 히드로겔이 비교적 느슨한 가교결합된 (아크릴아미드중 0.25중량%의 메틸렌-비스-아크릴아미드를 도입함으로써) CL PAA 약 5% 계산된 농도를 함유하도록 제조되었다.

각각 약 20㎖의 그러한 히드로겔의 5개 샘플을 다음과 같은 4가지 연속적 시험을 거치도록하였다:

시험 1. 샘플을 칭량하고, 35℃ 및 잔류압력 12-15㎜Hg에서 일정한 중량에 도달할때까지 (약 20시간) 건조시켰다;

시험 2. 샘플을 칭량하고, 이증류수에 액침시키고, 15분간 비등시킨 후, 상기와 같이 건조시켰다;

시험 3. 샘플을 칭량하고, 이증류수에 액침시키고, 각 경우 200㎖로 레벨을 올리고, 7일간 매일 바뀌는 물에 침지시킨후, 상기와 같이 건조시켰다;

시험 4. 샘플을 칭량하고, 시험 3에서와 같이 7일간 물에 침지시키고, 시험 2에서와 같이 15분간 비등시킨 후, 상기와 같이 건조시켰다.

히드로겔 총량중 폴리머의 퍼센트는 모든 샘플에 대해 종래의 방법에 의해 계산하였다. 결과는 표 3에 보여진다.

신규 CL PAA 생체적합성 히드로겔의 건조 잔류물에 의거한 화학 안정성 평가

시험	샘플 평균중량, g (평균+/-SD)
시험	처리전	처리후
1	20.84+/-0.96	0.983+/-0.0048
2	20.15+/-0.87	0.951+/-0.0076
3	20.65+/-0.83	0.923+/-0.0065
4	20.41+/-0.63	0.913+/-0.0095

표 3에서 보여지듯이, 침지후 비등에 의해서도 히드로겔중 CL PAA의 파괴를 유발하지 않아서 그것이 가열살균될 수 있고 (필요시 언제나) 느슨한 가교결합을 통해 안정성을 나타낸다는 것을 가리킨다.

그 다음 아크릴아미드가 수성매체에서 본 발명의 (CL PAA) 히드로겔의 기제의 안정성으로부터 생체조직내로 이동할 수 있는 능력에 대해 "Guidance on toxicological and hygienic examination of polymeric materials and devices for endoprostheses", USSR 공중보건부, 1987, p. 18-25(러시아어)와 일치하게 시험하였다.

이 능력은 LIQUOCHROM 크로마토그래피(헝가리)를 사용하여 모노머에 전형적인 190-210㎚ 범위에서 UV 방사흡수를 검출하는 것을 포함하는 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 결정되었다.

이 목적으로, 그것의 샘플을 14 내지 30일간 40℃의 온도에서 100㎖ 추출제(이증류수) 대 1㎖ 히드로겔의 비율로 침지함으로써 신규 히드로겔로부터의 추출물을 얻었다. 5㎖의 추출물 분액을 실온 및 잔류압력 12-15㎜Hg에서 건조시키고, Separon C18 흡착제로 충전된 길이 150㎜ 직경 4㎜의 칼럼에서 물 및 메탄올의 1:1 혼합물 2㎖로 0.2㎖/분의 속도로 잔류물을 한번 용출함으로써, 그리고 20미크로리터의 용출물을 주사기 루프에 공급함으로써 HPLC용 샘플을 제조하였다.

HPLC에 의한 아크릴아미드의 최소 검출농도는 0.000001㎎/ℓ인 반면, 이식편의 물질로부터 수성 추출물중 그것의 최대 허용농도는 0.02㎎/ℓ이었다.

아크릴아미드는 여기 기술된 방법에 의해 제조된 히드로겔로부터의 수성 추출물에서 HPLC에 의해 검출되지 않았으며, 이는 전체적으로 본 발명의 CL PAA 및 생체적합성 히드로겔 둘다가 화학적으로 안정하다는 것을 가리킨다.

의학적 및 생물학적 성질의 관점에서, 여기 기술된 방법에 의해 제조된 CL PAA 히드로겔의 샘플을 다음에 대해 실험실 조건하에 시험하였다:

생화학적 및 용혈(hemolitic)활성,

배독성(embriotoxic) 활성,

돌연변이유발 활성 및

발암 활성.

CL PAA 히드로겔의 생화학적 및 용혈 활성은 각각 16마리의 시험 및 대조군으로부터 300-350g 체중의 Wistar혈통의 알비노 래트 수컷에서 혈장 및 혈액세포 조성의 화학조성 변이로부터 평가하였다.

실험전에 본 발명의 5% 히드로겔의 5㎖ 투여량을 시험군으로부터의 마취된 각 래트로 복강내 주사하였다.

래트는 정규 기초에 의거하여 먹이가 공급되었다.

2주 후에 혈액 샘플을 래트로부터 뽑고, KORNING 생화학분석기(스웨덴)를 사용하여 Na, K, Ca 및 Cℓ이온; 요소, 혈중 요소 질소 및 요산; 크레아틴 및 효소아밀라제, 알칼리성 포스파타제, 알라닌- 및 아스파르테이트-아미노트랜스퍼라제, 이하 각각 AlAT 및 AsAT, 락테이트탈수소효소, 이하 LDG, 및 크레아틴 포스포키나제)의 함량에 대해 시험하였다. 이 경우에 칼륨 및 요소의 함량은 LACHEMA 비오-테스트(체코공화국)에 의해 결정하였다. 결과는 표 4에 보여진다.

래트에서 혈장의 생화학적 조성에 대한 생체적합성 CL PAA 히드로겔로부터의 이식의 효과

생화학특성 및 단위	시험결과
생화학특성 및 단위	대조	시험
1	2	3
나트륨, ㎜ol/ℓ	151	148
칼륨, ㎜ol/ℓ	8.20	6.82
칼슘, ㎜ol/ℓ	0.97	0.90
염화물, ㎜ol/ℓ	97.5	102.1
요소, ㎜ol/ℓ	4.8	4.8
혈중요소질소, ㎜ol/ℓ	2.2	2.2
크레아틴, ㎜ol/ℓ	0.05	0.05
아밀라제, ㎎%	89.1	83.33
알칼리성 포스파타제, ㎜ol/ℓ	84.5	55.9
AsAT, ㎜ol/ℓ	133	130
AlAT, ㎜ol/ℓ	41	51.7
LDG (총), ㎜ol/ℓ	217	189
크레아틴 포스포키나제, 유니트	5960	5685
요산, ㎜ol/ℓ	0.14	0.10

표 4에서 보여지듯이, 이온교환의 주된 특성은 세포막에 현성 손상이 없다는것을 증명한다. ATPase 활성도 정상이다.

질소교환의 특성의 안정성은 퓨린교환을 포함하는 정상 물질대사와 크레아틴 안정성과 함께 인체중 CL PAA의 존재하에 비뇨생식기 시스템의 기능 안정성을 증명한다.

AlAT 및 AsAT의 정상활성은 간세포의 안정성과, 정상인 크레아틴 포스포키나제의 활성으로부터 판단시 감지할 만한 과부하를 받지않는 심장수축의 정상상태를 나타낸다.

알칼리성 포스파타제의 충분한 활성은 담즙관의 내피에 염증이 없다는 증거이다.

또한 동일 래트에서 혈액세포 계수(count)를 수행하여 표 5에 나타낸다.

래트에서 혈액조성에 대한 생체적합성 CL PAA 히드로겔로부터의 이식의 효과

혈액세포 조성의 특성 및 그 단위	측정결과
혈액세포 조성의 특성 및 그 단위	대조	시험
1	2	3
백혈구, thsd/mcl	3.5+0.2	5.4
적혈구, mln/mcl	6.86+0.43	7.02+0.31
헤모글로빈, g/ℓ	125+12	139+9
헤마토크릿, %	35.0+1.5	36.5+1.3
적혈구 평균 직경, ㎚	51.0+0.2	52.0+1.5
적혈구당 헤모글로빈 평균 함량, pg	35.7+0.3	38.1+0.5
전구, thsd/mcl	992+12	694+50
전구 평균 직경, ㎚	8+1.5	14.25+1.6

표 5에서 보여지듯이, 실험에서 백혈구는 입방 ㎜ 당 4.5*1000의 정상함량을 비본질적으로 초과하는 반면, 적혈구 및 적혈구내 헤모글로빈은 정상 혈액 산소화를 가리킨다. 헤마토크릿의 견지에서 유체-및-전해질 균형은 대략 정상에 가깝다고 주장할 수 있다.

간접적으로 구할 수 있는 데이터는 CL PAA의 생화학적 안정성 및 생체적합성이 상당히 허용가능하다는 것을 가리킨다.

CL PAA 히드로겔의 배독성 활성은 "Guidance on experimental and clinical studies of novel drugs", 모스크바, USSR 공중보건부, 1975, p. 42-48 및 "Guidance on toxicological and hygienic examination of polymeric materials and devices for endoprostheses", 모스크바, USSR 공중보건부, 1987(두 문서 모두 러시아어)에 따라 결정하였다.

180-200g 체중의 잡종 알비노 암컷 래트의 3군을 실험에서 사용하였고, 각 군은 16마리를 포함한다.

제1군의 래트를 2㎖의 신규 5% 히드로겔로 복강내 주사하여 1주일내에 결합시켰다.

제2군의 래트를 또한 임신 3일째에 2㎖의 신규 5% 히드로겔로 복강내 주사하였다.

임신한 무손상의 래트는 제3군을 구성하였다.

제1군내 2래트가 임신이 되지 않았다. 제1군내 14래트와 제2군 및 제3군의 모든 16래트는 정상의 건강한 새끼를 출산하여 신규 히드로겔이 배독성이 아니라는 것을 증명하였다.

CL PAA 히드로겔의 돌연변이유발 활성은 USSR 공중보건부의 안내서 "Evaluation of mutagenic activity of chemicals by micronucleous method, Moscow," 1984, 14페이지(러시아어)에 따라 각각 10마리의 2개 군에서 두달 나이의C3H1-혈통 마우스(양쪽 성)로부터의 골수의 망적혈구에 대해 시험하였다.

실험 동물을 9% CL PAA 히드로겔로부터의 겔 1g당 100㎖ 추출제의 비율로 40℃의 온도에서 얻어진 30일 수성추출물 0.01 체중%로 주사하였다.

24시간 이내에 실험 및 무손상의 마우스는 척수의 전위에 의해 죽었다. 더욱이 군 AB(Ⅳ)의 신선한 비안정화된 인간 혈액의 혈청으로 희석된 대퇴(femoral)골수의 도포표본(smear)을 통상적으로 제조한 후 Pappenheim 염색하였다.

도포표본에서 소핵을 갖는 망적혈구를 현미경하에 계수하였다. 각각 1000세포를 함유하는 20시야에서 실험 및 무손상의 마우스 둘다의 대퇴수 도포표본중 망적혈구 계수의 편차는 2.3%를 초과하지 않는 것으로 밝혀졌다. 그것은 CL PAA 히드로겔이 어떤 돌연변이유발 효과도 가지지 않는다는 증거이다.

CL PAA 히드로겔의 발암 활성은 잠재적 종양-관련 항원의 면역검출법에 의해 평가하였다.

이러한 유형의 평가는 횡문근육종의 종양-관련 항원에 그리고 추가적으로 잠재 배자 항원에 (후자는 EPM-시험이 양성일 때 종양 발달 성장의 지시자이다) 감작된 안정화되고 탄닌-처리된 적혈구의 전기영동적 이동치(EPM)의 결정을 포함한다. 일반적으로 세포-지시자의 전기영동적 이동치가 20%이상 감소하면 EPM-시험은 양성이다.

180-200g 체중의 12비선형 알비노 수컷 래트를 실험에 사용하였으며, 각각 6마리로 이루어지는 시험군 및 대조군을 구성한다.

시험군의 래트를 국소 마취하에 대퇴 근육내로 4㎖의 6% CL PAA 히드로겔로주사하였다. 그 다음 양쪽 군의 래트를 18개월 동안 일반 식사로 키웠다. 그후 모든 동물에서 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하고, 샘플로부터 적혈구를 분리하고, 상기 항원으로 감작시켜 EPM-시험을 수행하였다.

감작되지 않은 것들에 비해 감작된 적혈구의 EPM 감소를 다음과 같이 관찰하였다:

시험 동물에서 횡문근육종 항원에 대해 4.17+/- 1.58%와 잠재 배자 항원에 대해 1.67+/-0.95%, 그리고

대조군에서 횡문근육종 항원에 대해 1.50+/-0.62%와 잠재 배자 항원에 대해 1.83+/-1.28%.

그러므로 EPM-시험은 양쪽 군의 래트에 대해 음성으로 나타났고, 이는 신규 CL PAA 히드로겔이 발암 활성을 나타내지 않는다는 것을 가리킨다.

내보철 진료 및 전색에의 신규 CL PAA 생체적합성 히드로겔 이용가능성에 대한 더 상세한 의학적 및 생물학적 시험은 3 내지 4년생의 25 내지 30㎏ 체중의 잡종 수컷 개에 대해 실시하였다. 개에서 성기를 덮고 있는 피부를 10% 요오드팅크제로 소독하고 국소마취한 후 멸균조건하에 내보철의 삽입 시험을 다음과 같이 실시하였다:

6마리 개는 5㎖의 3.5% CL PAA 히드로겔로 한번 피하 주사하였다;

또한 6마리 개는 총 8.0㎖가 되도록 분절당 1.5㎖ 까지의 양으로 성기의 양쪽면을 따라 3분절내로 9% CL PAA 히드로겔로 근막내 (백막하 침투는 배제) 주사하였다; 그리고

다른 6마리 개는 총 8.0㎖가 되도록 분절당 1.5㎖ 까지의 양으로 성기의 양쪽면을 따라 3분절내로 6% CL PAA 히드로겔로 공동내(백막하, 주로 해면체 소주내로 침투를 포함하나 요도의 손상을 배제) 주사하였다.

3마리 개의 제4군을 대조군으로 사용하였다.

개들은 다음과 같이 정맥내 넴부탈 주사에 의해 하나씩 죽었다:

시험 동물은 CL PAA 히드로겔이 삽입된지 1, 7 및 14일과 1, 3 및 6개월후에 죽었다;

대조군은 1, 3 및 6개월후에 죽었다.

개의 성기, 국부 림프절 및 폐의 전단면 슬라이스의 절편을 대조 슬라이스와 함께 10 및 6% 중성 포르말린에서 그리고 증대하는 강도의 알코올로 탈수된 Carnoy 용액에서 고정시키고, 파라핀으로 덮었다.

마운트를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 피로후크신으로 van Gison-염색하고, 탄력층에 대해 Weigert-염색하고, 다양한 pH의 염색용액에서 톨루이딘블루로 염색한 후, 화학적 및 효소적 방법에 의해 글리코사미노글리칸을 검출하였다.

당단백질 및 글리코겐은 McManus-과요오드산 Schiff반응(이하 PAS-반응)에 의해 검출하였고, 칼슘염은 von Koss 방법에 의해 검출하였고, RNA는 Brachet 방법(리보뉴클레아제)에 의해 검출하였다.

다음 효소의 활성을 연구하였다. 즉:

말레이트 탈수소효소 (이하 MDG);

숙시네이트 탈수소효소 (이하 SDG), Nachlass 방법에 의해;

락테이트 탈수소효소 (이하 LDG);

글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (이하 G-6-PDG), NAD- 및 NADP-디아포라제, 각각 Hess, Scarpelli 및 Pearce 방법에 의해;

알칼리성 포스파타제(이하 AP), Gomori 방법에 의해; 그리고

아데노신트리포스파타제(이하 ATPase), Wachstein-Meisel 방법에 의해.

신경 조직을 Bielschowsky-Gross 방법에 의해 질산은으로 함침시켰다.

조직화학 반응을 E. Pearce "HISTOCHEMISTRY" (러시아판의 영어번역/2판-모스크바, 1962)에 의한 매뉴얼에 기재된대로 수행하고 제어하였다.

연구는 다음 결과를 나타내었다:

A.CL PAA 히드로겔의 피하주사의 경우

다음날, 피부가 약간 얇아지는 연질-탄력밀도의 슬리브 같은 팽창이 주사 부위에서 관찰되었다 (한 마리의 개는 7일째에 해결된 조작 손상으로 여겨지는 작은 병소 출혈을 갖는 이식편 주변 조직의 적은 부종 및 충혈을 발달시켰다);

7일 후에, 시각으로 인지가능한 혈액동태, 체질개선 및 염증반응은 없었다. 조직학적 시험에서 이식편은 CL PAA 히드로겔 및 성기 근막 및 피부 덮개를 분리하는 얇은 결합조직 캡슐에 의해 둘러싸인 큰 담청색 액포였다. 캡슐은 부드러운 콜라겐 및 탄성섬유가 둘러싸여 보이는 젊은 섬유아세포의 한 개 또는 두 개 층으로 구성되었다. 산화환원효소(SDG, MDG, NAD- 및 NADP-디아포라제, LDG) 및 AP의 피로닌경향 및 향상된 활성은 섬유아세포내 세포질에 전형적이다. G-6-PDG의 활성증가는 펜토스-경로 물질대사의 활성화를 보였다. 백혈구 및 대식세포의 느슨한 침윤은히드로겔의 표면 가까운 층에서 관찰되었다. 캡슐은 팽창된 상피 세포로 덮힌 적당한 수의 새로 성장된 혈관의 육아조직의 주변부를 가지며, 그 관강은 국소확대되어 조혈요소로 채워져 있었다. 증식 섬유아세포, 조직구 및 단독 원형질 세포가 혈관 외막에서 발견되었다. 모든 경우에 거대세포반응은 관찰되지 않았다. 톨루이딘블루로 염색시 사용된 용액의 모든 pH 값에서 변색성 병소는 검출되지 않았다. 질산은으로 함침된 소수의 신경섬유는 축삭의 국소팽창, 그들 섬유구조의 상실, 액포화, 정맥류양종창, 저-또는 초함침과 같은 여러 변화를 보였다. 때때로 신경섬유를 따라 또는 그들의 말단에 옥소플라즈마의 축적, 수초막의 부분적 불균일과 그것의 짧고 긴 단편으로의 분해가 관찰되었다. 이들 변화는 CL PAA 히드로겔상의 액포로부터의 압축에 대한 그것들의 상보-적응성 재구성에서 신경섬유의 특징이다;

14일 후에, CL PAA 히드로겔 이식편에 인접한 조직에서 대식세포-백혈구 반응이 상당히 증가하고; 액포 주위의 결합조직의 연속적 형성을 포함하는 뚜렷한 섬유아세포 반응이 관찰되고, 캡슐은 국소적으로 젊은 섬유아세포 및 신생 모세관을 그 사이에 갖는 임의로 배열된 콜라겐 및 탄성섬유로서, 한편 다른 위치에서 몇줄의 콜라겐 및 나란히 배열된 탄성섬유 뿐만아니라 증식 섬유아세포로 구성된 더 성숙한 결합조직으로서 나타난다. 산화환원 및 가수분해 효소의 활성 뿐만아니라 세포질 및 핵내의 RNA-함량도 증가하였다. 섬유아세포 세포질은 pH 2.8에서 톨루이딘블루로 쉽게 검출가능한 이염성 과립이 강화되었으며, 이는 글리코사미노글리칸의 합성이 증가된 증거이다. 신생 혈관의 수는 캡슐 주변조직에서 급격히 감소하였고, 글리코사미노글리칸 및 콜라겐을 생성하는 조직형성형 세포는 그들의 장소에서 우세하였다. 거대세포는 극히 드물었다. 신경섬유의 변화는 상기와 같다;

주사한지 1개월 후, 성숙 결합조직 캡슐이 CL PAA 히드로겔의 액포주위에 발달하였고, 이것은 pH 2.8에서 톨루이딘 블루로 검출되는 적당한 양의 RNA 및 고-황산염 글리코사미노글리칸을 함유하는 성숙 섬유아세포를 그 사이에 갖는 원형 배열된 콜라겐 및 탄성섬유로 구성된다. 섬유세포 세포질에서 산화환원 및 가수분해효소의 활성은 정상이었다. 때때로 대식세포 및 원형질세포의 자유로운 확산 침윤으로서 나타나는 세포반응이 히드로겔 표면상에서 관찰되었다. 이식편 주변 조직의 구조는 완전히 정규화되었고, 순수 동물의 동일조직의 것과 다르지 않았다. 감각 신경섬유의 반응변화는 줄어들기 시작하였고 축삭의 불규칙한 확대 또는 축소와 그들의 병소 저-또는 초함침으로 주로 나타난다;

3개월 후, CL PAA 히드로겔의 두께형성이 콜라겐 및 탄성섬유 및 섬유세포형 세포로 구성된 결합 캡슐에 의해 인접조직으로부터 이식편의 잘 한정된 분리와 호염기성의 증가에 따라 관찰되었다. 인접조직의 구조적 및 조직학적 변화는 관찰되지 않은 반면, 신경섬유는 그들의 정상 형상을 발달시켰다;

6개월 후, 이식편의 형상 및 치수는 CL PAA 히드로겔을 주사한지 처음 24시간 동안 실제적으로 유지되었다. 조직학적으로 이식편은 완전한 잘 캡슐화된 암청색 액포로서 나타났다. 캡슐은 한 개 또는 두 개 층의 섬유아세포 및 질서 있게 배열된 콜라겐 및 탄성섬유로 구성되며, 여기서 칼슘염은 von Koss 방법에 의해 검출되지 않았다. 이식편을 봉입하는 조직은 반응성, 혈액동태, 이영양, 괴사, 염증과 조직 및 세포 변형을 포함하는 다른 변화를 나타내지 않았다. 질산은으로 함침시킨신경섬유는 정상으로 나타났다.

B.CL PAA 히드로겔의 근막내 주사의 경우

다음날 및 7일후에, 성기는 균일하게 팽창되었고 증가된 탄력성을 보였다. 개의 체온은 정상이었고, 주사부위의 피부 색깔은 보통 때와 같았고, 국소염증은 관찰되지 않았다. 조직학적으로 주사부위에서의 이식편은 담청색 액포로서 나타났다. 7일후에, CL PAA 히드로겔 액포는 한 개 또는 두 개 층의 젊은 섬유아세포와 섬유아세포층을 둘러싸는 부드러운 결합섬유 및 일부 신생 모세관으로 주로 구성되는 얇은 벽의 캡슐로 봉입되어 있는 것이 관찰된 반면, 백혈구 및 대식세포는 히드로겔 표면상에서 관찰되었다. SDG, MSG, NAD- 및 NADP-디아포라제의 활성 뿐만 아니라 세포질 및 핵내의 RNA-함량도 증가하였다. 세포질내의 LDG 및 G-6-PDG 또한 증가하였다. 캡슐을 봉입하는 육아조직은 약간 넓어지고 혈액-충전된 관강 및 팽창된 내피를 갖는 모세관을 새롭게 형성하였다. 증식 섬유아세포 및 일부 원형질 세포가 혈관의 외피에서 발견되었다. 조직화학적 반응은 이영양 및 더욱이 괴사적 변화가 이식편을 봉입한 근막조직에서 검출되지 않고 이식편으로부터 떨어진다는 것을 확인시켰다. 그래서 마운트를 어떤 pH의 톨루이딘블루 용액으로 염색시 CL PAA 히드로겔의 파괴를 표시하는 변색성 병소가 발견되지 않았다. 혈관주위 공간에서 뿐만아니라 작은 크기 및 중간크기의 혈관 벽에서도 아밀라제에 안정한 PAS-양성 물질이 검출되지 않으므로 혈관의 투과성은 정상으로 남아 있는 반면, 미세환상 베드의 벽에서 AP 및 ATP-ase 활성은 낮게 유지되었다. 일부의 경우에 질산은으로 함침되고 Spielmeyer 방법에 의해 시험된 신경섬유는 파도-또는 나선형으로 관찰되었고, 다른 경우에 그것들은 말단이 팽창되었다. 수초탈락 부위는 신경섬유발달 고리-유사구조의 국소전개 만큼 드물었다. 비대 Schwann 세포의 증식은 드물게 관찰되었다. 변화는 이식편의 압축에 대한 신경섬유의 응답으로 처리된다;

14일 후, 이식편 근처의 대식세포 반응은 약간 더 강하였으나 거대세포는 관찰되지 않았다. 뚜렷한 섬유아세포 반응 및 액포주변의 결합조직 캡슐의 성장이 관찰되었고; 약간의 캡슐은 세포질내 높은 RNA 함량과 향상된 산화환원효소 활성을 보이는 젊은 섬유아세포를 갖는 탄성섬유 및 임의화된 콜라겐으로 구성된다. 여러 층의 콜라겐 및 탄성섬유 및 섬유아세포형 세포로 구성된 더 성숙한 결합조직이 다른 부위에서 발견되었다. 증가된 수의 조직형성 세포와 증가된 수의 신생 혈관이 캡슐에 인접한 육아 조직에서 관찰되었다. 내피 및 중간막구조, 혈관의 외피와 혈액동태 인자는 변하지 않는 반면, 신경세포의 변화는 상기와 같았다;

1개월 후, 이식 캡슐은 섬유아세포 계열의 세포 요소로 구성되었고, 적당히 피로닌경향 세포질을 갖는 섬유세포가 우세하였다. pH 2.8의 메틸렌블루로 염색시 섬유아세포에서 적당한 수의 고-황산화 글리코사미노글리칸을 나타내었다. 섬유세포 세포질내 효소활성은 대조와 일치하였다. CL PAA 히드로겔의 표하층은 어느정도 대식세포 및 원형질 세포에 의해 침윤되었다. 이식편 주변의 조직에서는 혈류장애, 염증, 퇴하 또는 괴사가 관찰되지 않았다. 상기 신경섬유의 변화는 여전히 관찰되었다;

주사한지 3개월 후, CL PAA 히드로겔의 호염기성의 증가가 관찰되었다. 겔 액포는 섬유세포를 그 사이에 갖는 탄성섬유 및 콜라겐의 얇은 결합조직 캡슐에 의해 근막으로부터 잘 한정된다. 혈관은 정상이었다. 성기 조직의 응답은 관찰되지 않았다 (대조와 같이 근막은 통합성의 상실과 미소- 및 거대레벨 둘다에서 칼슘고정 없이 원형 배열된 잘 한정된 콜라겐 및 탄성섬유로서 나타나고, 신경섬유는 정상이다);

6개월 후, 개에서 성기의 형상 및 치수는 시각으로 관찰하여 두 번째 7일째에 관찰된 것과 유사하였다. 조직학적으로 이식편은 완전한 잘 캡슐화된 암청색 액포로서 나타났다. 캡슐은 한 개 또는 두 개 층의 섬유세포와 질서 있게 배열된 가는 콜라겐 및 탄성섬유로 구성되었고, 칼슘의 염은 거시적 또는 미시적 von Koss 방법에 의해서도 발견되지 않았다. 반응성, 혈액동태, 퇴화, 괴사, 염증 또는 조직 및 세포 변형을 포함하는 다른 변화는 이식편 주변 조직에서 발견되지 않았다. 질산은으로 함침된 신경조직은 실험 및 대조 동물 둘다에서 실제적으로 동일하였다. 국부 림프절, 소주내 및 음경해면체의 소주공간, 성기 정맥 및 폐에서, 히드로겔 입자가 발견되지 않았다;

C.CL PAA 히드로겔의 공동내 주사의 경우

1일 및 7일후에, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시 균질 담청색 액포로서 나타나는 CL PAA 히드로겔을 나타내었고, 그것은 7일 내에 음경해면체의 소주 및 백막의 이동 및 약한 압축을 유발하는 얇은 결합조직 캡슐에 의해 둘러싸여 있다. 캡슐은 얇은 섬유, 주로 콜라겐 및 한 개 또는 두 개 층의 섬유아세포로 구성되었다. 캡슐에 인접한 음경해면체 소주의 결합조직은 일반적 구조로서 조직화학 또는 조직학적 시험에서 퇴화 및 괴사의 어떤 기미도 없이 소수의 탄성섬유를 갖는 명확히한정된 평활근을 가진다. 백혈구 및 대식세포의 적은 유입이 CL PAA 히드로겔 이식편의 표면상에서 관찰되었다. 소주내 공간은 소량의 혈액으로 채워져 있고, 내피는 약간 팽창되었다. 더 적은 동맥 및 정맥이 혈액으로 적당히 채워져 있고, 약간 두꺼워진 벽을 가졌다 (주로 내피의 팽창과 외피막에서 섬유아세포, 조직세포 및 원형질세포의 증식으로 인해). 캡슐은 소수의 얇은 벽의 신생 혈관과 섬유아세포 및 조직세포 같은 주로 조직형성 기원이 다른 세포로 구성되는 육아 조직에 의해 둘러싸여 있는 것으로 관찰되었다. 약간의 신경섬유는 Spielmeyer 방법에 의해 함침되고 시험되었을 때 축삭, 수초막 및 Schwann 세포의 변화를 보였다. 외부물질의 용해의 결과로서 관찰되는 거대세포는 없었다. 신경조직의 꼬임, 국소팽창 및 불규칙 두께형성 뿐만아니라 정맥류양종창과 축삭의 섬유구조 상실, 그들 말단의 구형 및 곤봉형 확대와 국소 수초탈락은 관찰되지 않았다. Schwann 세포의 반응성 증식이 발견되었고, 그중 약간은 비대해졌다;

14일 후에, CL PAA 히드로겔 이식편 주위의 백혈구 및 대식세포 반응은 약간 더 강해졌으나, 외부물질을 용해할 수 있는 거대세포는 상기와 같이 발견되지 않았다. 이식편 주위의 결합조직 캡슐은 일부 경우에 약간 다공성이고, 임의로 산포된 콜라겐 및 탄성섬유 및 젊은 섬유아세포로 구성되며, 그들중 약간은 더 성숙하게 나타났고, 탄성섬유 및 섬유아세포 요소를 포함하는 평행 콜라겐 섬유로 주로 구성되었다. 병소주변 육아조직은 소수의 편평한 신생 혈관과 적당한 양의 RNA 및 고-황산화 글리코사미노글리칸의 과립을 함유하는 섬유아세포로 구성되었다. 신경조직의 변화는 축삭의 국소팽창, 그들내 섬유구조의 상실, 액포화, 정맥류양종창, 저-및 초함침과, 때때로 신경섬유를 따라 또는 그들의 말단에 옥소플라즘의 국소축적, 수초막의 부분적 거칠음과 그것의 짧고 긴 단편으로의 분해로서 발생되며, 이는 압축에 대한 상보적응 응답으로서 고려되어야 한다. 국부 림프절, 해면체의 소주간 공간, 성기 정맥 및 폐에서, CL PAA 히드로겔 입자는 검출되지 않았다.

1개월 후에, CL PAA 히드로겔 이식편은 층 사이에 성숙 섬유아세포 요소를 갖는 원형 배열된 콜라겐 및 탄성섬유로 구성되는 얇은 성숙 결합조직 캡슐에 의해 둘러싸여 있었다. 대식세포 및 원형질세포의 적은 확산침윤이 그들의 표면에 인접한 이식편의 층에서 관찰되었다. 결합조직의 해면체 소주는 대조군과 구조적으로 다르지 않았고, 정상 내피로 덮혀 있었다. 소량의 혈액이 소주간 공간에서 발견될 수 있었다. 해면체 정맥 및 동맥의 벽은 가시적인 구조변화를 보이지 않았다. 신경섬유의 반응성 변화는 이전 기간과 비교하여 덜 현저했으며, 주로 축삭의 불규칙 두꺼워짐 또는 얇아짐과 국소 저-또는 초함침으로서 나타났다.

3개월 후에, 히드로겔은 더 두꺼워지고 호염기성으로 되었다. 이식편은 소수의 섬유세포를 사이에 갖는 평행 콜라겐 및 탄성섬유의 얇은벽 캡슐을 갖는 주변조직과 구분되었다. 세포요소는 이식편의 표면상에서 관찰되지 않았다. 혈관를 갖는 인접조직은 통상의 구조를 가졌다. 기초 간질물질에서의 글리코사미노글리칸, 섬유형성 및 결합조직의 세포요소는 대조군의 것과 실제적으로 동일하였다. 신경섬유의 변화는 관찰되지 않았다;

6개월 후, 개에서 성기의 형상 및 치수는 시각으로 관찰하여 두 번째 7일째 관찰된 것과 유사하였다. 조직학적으로 이식편은 완전한 잘 캡슐화된 암청색 액포로서 나타났다. 캡슐은 한 개 또는 두 개 층의 섬유세포와 규칙적으로 배열된 가는 콜라겐 및 탄성섬유로 구성되며, 칼슘의 염은 거시적 또는 미시적 von Koss 방법에 의해서도 발견되지 않았다. 이식편 인접조직에서 반응성, 혈액동태, 퇴화, 괴사, 염증과 조직 및 세포 변형을 포함하는 다른 변화는 관찰되지 않았다. 질산은으로 함침시, 나타난 신경섬유는 실험 및 대조 동물에서 실제적으로 동일하였다. 국부 림프절, 해면체의 소주간 공간 및 성기 정맥 뿐만아니라 폐에서도, CL PAA 히드로겔 입자는 발견되지 않았다.

유사한 형태학적 데이터가 임상 실험에 의해 얻어졌다. 시험재료로 사용된 것은 생검 6년전에 8% 농도 CL PAA의 신규 히드로겔 10㎖로 피하주사된 45세의 건강한 남성 지원자에서 얻은 피하 세포조직의 생검 샘플이었다.

생검 샘플을 10% 포르말린에 고정시키고, 증가하는 강도의 알코올에 탈수시키고, 파라핀에 넣었다. 마운트를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고; 콜라겐 섬유는 van Gison 방법에 의해 결정하고, 탄성섬유는 Weigert 방법에 의해 레조르신-푹신으로 결정하고; 글리코사미노글리칸은 필요한 화학적 및 효소적 제어를 가하여 여러 pH 값의 톨루이딘블루 용액으로 결정하고; 당단백질 및 글리코겐 농도는 McManus 방법에 의해 PAS-반응으로 결정하였다.

거시적으로, 생검 샘플은 타원형, 연질탄성, 담분홍색이었고, 인접 조직과 구별되는 어떤 가시적 변화도 없었다.

미시적 시험에서, 모든 제제는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되어 다양한 명암의 청색을 획득한 CL PAA 히드로겔을 나타내었다. 히드로겔 이식편은 질서 있게 배열된 콜라겐 및 탄성섬유와 적은 수의 세포요소(대개, pH 2.8의 톨루이딘블루로 염색시 글리코사미노글리칸의 증거가 되는 이염성이 이들 섬유아세포의 세포질에서 검출되지 않으므로 불활성 섬유아세포와 같은 그리고 단독 단핵 대식세포와 같은)를 포함하는 기초물질로 주로 구성되는 잘 혈관화된 부드러운 결합조직으로 꿰어져 있었다.

이 결합조직은 군체로 위치하는 혈관을 가지고, 편평한 내피를 갖는 불규칙한 두께의 벽을 가졌다.

다형핵 백혈구, 유상피세포, 외부물질을 용해할 수 있는 거대세포와 림프 및 조직구 둘다의 침윤물과 같은 급성 및 만성 염증의 증후는 전혀 없었고, 마찬가지로 림프구, 대식세포 및 조직구와 같은 알레르기 반응의 증후 뿐만아니라 혈관의 다혈증, 전충혈, 울혈, 혈전증과 악성화 예컨대 세포 또는 조직 변형 및 세포증식과 같은 혈액동태 장애의 증후도 없었다. 칼슘염은 마운트에서 거시적 또는 미시적으로도 검출되지 않았다. 달리, 즉 이영양 또는 괴사변화가 발견되지 않았다.

이식편을 둘러싼 섬유상 캡슐이 관찰되지 않았다.

신규 CL PAA 생체적합성 히드로겔을 사용하여 인체의 미용적 또는 기능적 결함을 교정하는 기초방법은 다음으로 구성된다:

기왕력, 시험 및 만약 필요시 외과치료될 환자에 일반적으로 허용가능한 실험적 연구(특히 항체에 대한 개체반응)에 의거하여 다음과 같은 잠정적 결론이 도출된다:

- 첫째, 형태 및 치수 또는 기능적 효험을 위해 치료될 기관을 한정한다;

- 둘째, 미래 치료의 양, 전략 및 형태(외래환자 또는 환자)를 계획한다;

- 신규 히드로겔의 주사전에 마취(대개, 국소침윤)를 도입한다;

- 추가적으로 항생제로 포화된 멸균 CL PAA 히드로겔을 정상체온(36-37℃)에 가까운 온도로 치료될 부위에 저속으로 (보통 2 또는 3단계로) 주사한다.

이 방법은 유방성형술 (바람직하게는 발육부전 및 유방왜소증의 경우) 및 이물적 성형술(노화 또는 이전 손상으로 인한 발기 저하로 발현되는 성교불능의 경우)에 가장 적합하다.

따라서 유방성형술에서, 바람직하게는 3.5-6.0% 범위의 농도, 가장 바람직하게는 5.0-6.0% 범위의 농도를 갖는 CL PAA 히드로겔을 유선뒤로, 피막내로 및/또는 근막하로, 개체의 해부학적 유방특색에 따라 2 또는 3단계로, 일반적으로 단계마다 유방당 40-160㎖ (그러나 200㎖를 초과하지는 않음)의 양으로 주사한다.

음경성형술에서, 바람직하게는 4.5-6.0% 범위의 농도, 가장 바람직하게는 5.0%의 농도를 갖는 CL PAA 히드로겔을 대개 성기의 각면을 따라 3개의 소주분절에 공동내로 주사한다. 하나의 음경성형술에 필요한 CL PAA 히드로겔의 총량은 바람직하게는 40 내지 60㎖의 범위내이다. 주사된 히드로겔의 특정량은 성기의 허용가능한 부피 및 탄력성, 배제된 요도의 가능한 압축의 기준으로부터 계산된다.

신규 생체적합성 히드로겔을 임상적으로 시험하였다.

특히, 그것은 안면 선천성 결함의 미용적 교정을 위해 그리고 여성의 유방발육부전 및 유방왜소증의 경우 유방성형술에 이용되었다.

예컨대 환자기록은 다음과 같이 나타난다:

(1) 환자 M. (기록번호 15D), b. 1965.

진단: 선천성 우측 하악-신경-근육성 두개안면 주유(microsomia)

치료(일반마취: 정맥내 및 NLA):

- 제1단계(1993.11)- 3.5% CL PAA 히드로겔 10㎖의 근육내로 두 번 주사;

- 제2단계(1994.6)- 상기와 같은 주사 및 히드로겔(15㎖).

기록의 개선: 안면의 우측 및 좌측이 대칭으로 된다.

(2) 환자 L. (기록번호 12), b. 1967, 경산부

진단: 대칭성 유방발육부전

3단계 치료(국소마취: 0.5% 노보카인용액, 80㎖):

- 제1단계(1991.1)- 양쪽 유방에 6.0% CL PAA 히드로겔 140㎖를 근육내, 유선뒤 및 피막하 주사;

- 제2단계(1991.3)- 상기와 같은 주사 및 히드로겔(40㎖);

- 제3단계(1991.5)- 상기와 같은 주사 및 히드로겔(60㎖).

기록의 개선: 환자의 유방은 형상 및 치수에서 그녀의 체형과 일치하고; 그것의 탄력성은 천연 연조직과 유사하다.

(3) 환자 N. (기록번호 78), b. 1969, 비경산부

진단: 대칭성 유방왜소증

치료 (국소마취: 0.5% 노보카인용액, 80㎖):

- 제1단계(1993.2)- 양쪽 유방에 6.0% CL PAA 히드로겔 130㎖를 근육내, 유선뒤 및 피막하 주사;

- 제2단계(1993.3)- 상기와 같은 주사 및 히드로겔(100㎖).

기록의 개선은 상기 경우와 같다.

(4) 환자 K. (기록번호 17L), b. 1967, 경산부

진단: 대칭성 유방왜소증

치료(국소마취: 0.5% 노보카인용액, 80㎖):

- 제1단계(1994.1) - 양쪽 유방에 6.0% CL PAA 히드로겔 130㎖를 근육내, 유선뒤 및 피막하 주사;

- 제2단계(1994.7) - 상기와 같은 주사 및 히드로겔(60㎖).

기록의 개선은 상기 경우와 같다.

이 경우에 치료의 효과는 뒤로 누운 자세로 치료된 유방의 각 8㎜ 심단면을 스캐닝함으로써 SIEMENS "SONATRON CR" 단층촬영기(독일)상에서 가슴의 컴퓨터 축방향 단층촬영법에 의해 얻은 데이터로부터 추가적으로 평가되었다. 얻어진 많은 것들중 두 개의 단층 사진이 다음과 같이 첨부도면에 보여진다.

Claims

주사에 의한 내보철 삽입용 생체적합성 히드로겔에 있어서, 라디칼 중합에 의해 생성된 가교 폴리아크릴아미드 및 무발열원성 물을 포함하고, 상기 가교 폴리아크릴아미드가 히드로겔의 총중량을 기준으로 3.5 내지 9.0중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체적합성 히드로겔.