KR100317901B1 - 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) KFCC-10656을 모균주로 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 모균주의 형질을 변형시켜, 모노플루오로아세테이트 내성을 가지게 함으로써 균주의 대사경로에 변화가 생겨서, 모균주에 비해 글루탐산 생산능력이 향상된 변이주에 관한 것이다. 또한 이 변이주를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는, 미생물을 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법{A microorganism producing glutamic acid and a method for producing glutamic acid using said microorganism}

본 발명은 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) KFCC-10656의 변이주로서 모노플루오로아세테이트(monofluoroacetate) 내성을 보유하며 이에 따른 대사경로상의 변화에 의해 기존 균주에 비해 글루탐산의 생산능력이 향상된 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

글루탐산 생성 대사 경로에서는 시트르산 회로가 대사 전구 물질들의 공급원으로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 글루탐산의 선구 물질인 α-케토글루타르산의 공급은 시트르산 회로의 순환에 의해 이루어지며, 따라서 원활한 시트르산 회로의 순환이 이루어질 때 글루탐산 생성에 유리하다. 시트르산 회로는아세틸-CoA와 옥살로아세트산의 반응에 의해 시트르산이 생성되는 것으로부터 시작된다. 아세틸-CoA는 아세트산으로부터 생화학적 반응에 의해 쉽게 생성되며, 따라서 아세트산 자화성이 높은 균주를 얻는 것은 시트르산 회로를 강화한다는 측면에서 글루탐산 생산에 유리하게 작용할 것으로 생각된다.

그러나, 미생물의 대사 과정에는 과량의 대사 산물이 생성되는 것을 억제하는 기작으로서 대사 산물 저해라는 기구가 존재하므로 과량의 중간 대사 산물이 생성 또는 축적 이용되게 하는 것은 쉽지 않다. 즉, 각 대사의 단계에서 생성되는 산물들은 그 대사 산물을 생성하는데 관여하는 효소의 활성을 저해해서 필요 이상으로 대사 산물이 생성, 축적되는 것을 방지한다.

인위적으로 이러한 조절 기구를 해제하는 기존의 방법으로서 특정 대사산물의 유사체에 대한 내성을 지닌 미생물 균주를 획득하는 방법이 통용되어 왔다.

본 발명자들은 아세트산 유사체에 대한 내성을 지니고 아세트산 자화성이 높은 균주를 얻기 위해 아세트산 유사체인 모노플루오로아세테이트에 내성을 가진 균주를 선별하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 미생물 TS1은 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC 10656을 모균주로 하여 자외선조사, N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후, 모노플루오로아세테이트가 농도별로 첨가된 배지[포도당 10 g/l, 인산제1칼륨 1 g/l, 인산제2칼륨 0.5 g/l, 황산암모늄 0.5 g/l, 요소 1 g/l, 황산철 20 mg/l, 황산마그네슘 0.5 g/l, 황산망간 20 mg/l, 티아민염산염 200 ㎍/l, 비오틴 200 ㎍/l, 당밀 5 g/l, pH 7.0로 이루어진 최소배지에 모노플루오로아세테이트 30-150 g/l을 첨가한 배지]에서 생육할 수 있는 변이주들 중에서 선별된 균주이다. 이때 실험에 사용된 배지중의 모노플루오로아세테이트 농도는 150 g/l까지였으며 분리에 성공한 내성변이주는 70 g/l 모노플루오로아세테이트 농도에서 생육가능한 것으로 확인되었다.

여기서 얻어진 변이주에 대해 플라스크 실험 및 발효조 배양 실험을 실시한 결과 기존 균주에 비해 글루탐산 생산성이 약 11% 정도 향상된 사실이 입증되었으며, 이 균주를 TS1이라 명명하여 1999년 11월 2일에 수탁번호 KFCC-11113으로 한국종균협회에 기탁하였다.

본 발명의 균주를 위해 사용된 영양배지는 펩톤 1, 육즙 1, 염화나트륨 0.25, 효모엑기스 1, 한천 2, pH 7.2로 구성된다.

본 발명에서 분리한 신규 변이주 TS1의 생화학적 특성은 표1 및 표2의 기재와 같으며, 이들 내용에 의하면 본 발명의 미생물은 70 g/l농도의 모노플루오로아세테이트 첨가배지에서도 생육가능하며, 기존 균주에 비해 아세트산 자화성[아세트산 자화성 실험용 배지: 아세트산 10-100 g/l, 인산제1칼륨 1 g/l, 인산제2칼륨 0.5 g/l, 황산암모늄 0.5 g/l, 요소 1 g/l, 황산철 20 mg/l, 황산마그네슘 0.5 g/l, 황산망간 20 mg/l, 티아민염산염 200 ㎍/l, 비오틴 200 ㎍/l, 당밀 5 g/l, pH 7.0]이 향상된 균주임을 알 수 있다.

본 발명 미생물의 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

모노플루오로아세테이트에 대한 내성 비교

균 주	모노플루오로아세테이트 (g/l)
	0	30	50	70	100	120	150
KFCC-10656	+++	+	-	-	-	-	-
TS1	+++	+++	++	+	-	-	-

(주) +; 생육, -; 생육하지 못함, 30℃에서 72시간 배양.

아세트산 자화성의 비교

균 주	아세트산 농도(g/l)
	0	10	20	40	60	80	100
KFCC-10656	+++	+++	+++	++	+	-	-
TS1	+++	+++	+++	+++	++	+	+

(주) +; 생육, -; 생육하지 못함, 30℃에서 72시간 배양.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

실시예 1

사용균주: 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10656 및 이의 변이주인 본 발명의 미생물 TS1(KFCC-11113).

종배지: 펩톤 1, 효모엑기스 0.5, 육즙 0.5, 포도당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.13, pH 7.2.

발효배지: 포도당 3, 미액 0.2, 비오틴 1 ㎍/l, 폐당밀 0.05, 황산암모늄 0.1, 황산철 0.002, 황산 망간 0.002, 황산 마그네슘 0.05, 티아민 염산염 200 ㎍/l, 인산 제1칼륨 0.2, 요소 0.95, pH 7.2.

발효방법: 상기 종배지 3 ml을 지름 18 mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40 ml을 500 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 1 ml을 식균한 다음 48시간동안 배양하였다. 회전수는 분당 180회, 30℃, pH 7.2로 조절하였다. 배양완료 후, 배지내 글루탐산 축적량은 KFCC-10656이 16.8 g/l, TS1이 18.7 g/l이었다.

본 실시예의 결과, 본 발명의 미생물은 기존 균주에 비해 당 농도 3배지에서 글루탐산 생산성이 약 11정도 향상된 것으로 확인되었다.

실시예 2

사용균주: 실시예 1과 동일

1차 종배지: 펩톤 1, 효모 엑기스 0.7, 육즙 0.7, 포도당 1, 자당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.3, 페놀레드 0.001, pH 7.2.

2차 종배지: 원당 3, 포도당 1, 과당 1, 황산 마그네슘 0.04, 인산 제1칼륨 0.1, 인산 제2칼륨 0.05, 황산 암모늄 0.8, 황산철 0.002, 황산망간 0.002, 황산아연 0.0002, 황산구리 0.0002, 비오틴 500 ㎍/l, 티아민 염산염 2 mg/l, 대두단백 가수분해물 0.2, 페놀레드 0.001, pH 6.8.

발효배지: 자당 6, 포도당 2, 과당 2, 황산 마그네슘 0.05, 인산 제1칼륨 0.05, 인산 제2칼륨 0.15, 황산 암모늄 0.1, 황산철 0.002, 황산망간 0.002, 황산아연 0.0002, 황산구리 0.0002, 비오틴 30 ㎍/l, 티아민 염산염 1 mg/l, 대두단백 가수분해물 0.2, 페놀레드 0.001, 탄산칼슘 3, pH 6.75.

1차 종배양: 상기 1차 종배양 배지 2.5 ml을 18 mm 시험관에 분주하고 121℃에서 5분간 가압 살균하여 냉각한 후 사용균주를 접종하고 30℃에서 분당 160회의 회전수로 12시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지 30 ml을 250 ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 5분간 가압 살균하여 냉각하고, 1차 종배양액의 배양완료액을 1 ml 접종한 후 31℃에서 150 rpm으로 14시간 진탕 배양하였다.

발효방법: 상기 발효배지를 250 ml 삼각 플라스크에 30 ml씩 분주하고, 10요소 용액 1 ml을 첨가한 후 2차 종배양액 5 ml을 접종한 후 31℃에서 150 rpm으로 36시간 배양하였다. 배양 중간에 pH에 따라 10요소수용액 8 ml을 수시로 첨가하여, pH 조절 및 질소원을 공급하였다. 발효시작 2시간 후 계면 활성제 0.04와 페니실린 0.3 U/ml을 첨가하고 당이 모두 소모될 때까지 배양하였다.

배양완료 후 글루탐산의 농도는 KFCC-10656이 45.7 g/l, TS1이 51.9 g/l였다.

실시예 3

1차 종배지: 펩톤 0.7, 효모엑기스 0.7, 육즙 0.7, 포도당 1, 염화나트륨 0.25, 요소 0.13, 황산 암모늄 0.1, pH 7.5.

2차 종배지: 원당 3, 당밀 1, 황산마그네슘 0.04, 인산제2칼륨 0.1, 황산 암모늄 0.3, 황산철 0.001, 황산망간 0.001, 비오틴 500 ㎍/l, 티아민 염산염 2 mg/l, 요소 0.1, pH 7.1.

발효배지: 원당 1.7, 당밀 6.8, 인산 0.13, 황산마그네슘 0.04, 황산철 0.001, 황산망간 0.001, 미액 0.1, 티아민 염산염 200 ㎍/l, 수산화칼륨 0.18, 소포제 0.005, pH 7.5.

1차 종배양: 1차 종배지 40 ml을 500 ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균하여 냉각 후 균주를 접종하여 회전수 분당 180회, 30℃에서 20시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양: 2차 종배지를 5리터 용량의 실험용 발효조에 2.5리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균한 후 냉각시켜 1차 종배양액의 배양완료액을 30 ml 접종한 후 공기를 분당 0.5리터 공급하면서 900 rpm, 30℃에서 18시간 진탕 배양하였다.

발효방법: 상기 발효배지를 30리터 용량의 시험발효조에 9리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 약 1.5리터씩 접종한 후, 공기를 매분당 2.5리터씩 공급하면서 450 rpm, 31℃에서 배양하였다.

상기 조건으로 배양하여 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린 혹은 계면활성제를 첨가하고 배양하며 배양중 발효액의 pH는 28암모니아수로 pH 7.7이 되도록 계속 조절하였다. 배양중 잔당의 농도가 1.5가 되면 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정한 비율로 혼합한 당을 수시로 공급하였다. 추가로 당밀 또는 혼합당과의 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량 대비 22가 될 때까지 계속 배양하였다. 배양완료 후 글루탐산의 농도는 KFCC-10656이 109.6 g/l, TS1이 121.1 g/l이었다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 TS1은 글루탐산 생산능이 향상된 균주로서 이를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지에서 배양하여 글루탐산을 고수율로 제조할 수 있다.

Claims (4)

1. 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum)의 변이주로 글루탐산을 생산하는 미생물 TS1 (KFCC-11113).
2. 제1항에 있어서, 모노플루오로아세테이트 농도 70 g/l 이상에서 생육할 수 있는 미생물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지중 탄소원으로 아세트산이 80 g/l 이상 존재할 때 이를 이용하여 생육가능한 미생물.
4. 코리네박테리움 글루타미컴 TS1을 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는 것을 특징으로 하는 글루탐산의 제조방법.