KR100346577B1

KR100346577B1 - 간세포 특이적인 담체 및 이의 ｄｎａ와의 복합체

Info

Publication number: KR100346577B1
Application number: KR1020000033794A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 박인규; 박영환; 신부안; 최형준; 김범철
Original assignee: 주식회사 티씨 싸이언스
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2002-07-26
Anticipated expiration: 2020-06-20
Also published as: KR20020000227A

Abstract

본 발명은 키토산에 간세포의 아시알로글리콜단백질 수용체와 특이적으로 결합하는 갈락토오스기와 수용액 중에서의 안정성 향상을 위한 덱스트란을 도입시켜 제조된 양이온성 고분자 화합물(GCD) 담체 및 이 담체와 DNA의 복합체에 관한 것이다. GCD/DNA 복합체는 세포표면에 아시알로글리콜단백질 수용체가 존재하는 사람의 간 세포와 Hep G2 세포에만 트랜스펙션(transfection)되었으며, 이는 세포의 ASGR과 키토산의 리간드 사이의 특이적 상호작용이 존재함을 의미한다.

Description

간세포 특이적인 담체 및 이의 ＤＮＡ와의 복합체 {Carrier specific to liver cell and the carrier-DNA conujugate}

본 발명은 간세포에 특이적으로 결합하는 DNA 담체 및 이의 DNA와의 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간세포에 특이적으로 결합하고 독성이 없으며 세포에의 도입효율이 높아 생체 적합성이 우수한 DAN 담체 및 이의 DNA와의 복합체에 관한 것이다.

DNA는 생물의 유전자 본체로서 생체 내에 도입시켜 형질을 발현할 수 있으며, 특히 주요 대사 효소의 유전적 결함을 치료할 수 있기 때문에 최근에 새로운 의약품으로 주목되고 있다. 그러나, 이러한 DNA 물질은 생체 중에서 가수분해를 받기 쉽고 또한 세포 내로 집어넣는 효율이 낮은 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하여 유전자 치료법을 실용화하기 위하여 DNA 담체를 이용하여 특정의 염기배열을 갖는 DNA를 세포 내에 보내는 약물 전달계(Drug Delivery System; DDS)가 연구되고 있다.

최근까지 임상 실험에 전달계로서 쓰이고 있는 것 중에는 바이러스성 벡터(viral vector)가 트랜스펙션(transfection) 효율이 높기 때문에 사용되고 있다. 그러나, 이는 제조가 복잡할 뿐만 아니라 면역원성, 감염가능성, 염증생성 등의 안전성이 문제가 되어 현재로는 비바이러스성 담체(nonviral carrier)가 각광을 받고 있다.

비바이러스성 담체 중에서 가장 많이 사용된 것은 주로 양성의 리포좀계로서, 예를 들면,N-[1-(2,3-디올렉시옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA)(P. L. Felgner et al., 「Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure」, Proc. Natl. Acad. U.S.A.84, 7314(1987)), 알킬암모늄(P. Pinnaduwage et al., 「Use of a quaternary ammonium detergent in liposome mediated DNA transfection of mouse L-cells」, Biochem. Biophys. Acta,985, 33(1989)), 양이온성 콜레스테롤 유도체(H. Farhood et al.,「Effect of Cationic cholesterol derivatives on gene transfer and protein kinase C activity」, Biocheim. Biophys, Acta1111, 239(1992)), 그라미시딘(J.Y. Legendre et al., 「Cyclic amphipatic peptide-DNA complexes mediate hight-efficiency transfection of adherent mammlian cells」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90, 6077(1993)) 등이 DNA와 결합하여 효율적으로 세포막으로 들어간다고 보고되고 있다. 그러나, 이러한 리포좀은 조제가 번잡하고, 분자량이 큰 DNA에서의 내포율이 낮고 입자 크기가 큰 문제점이 있다.

또한, 현재 가장 많이 이용되는 리포펙틴(lipofectin)의 경우도 세포 독성이 크게 문제가 되고 있다(J.H. Felgner et al., 「Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations」, J. Biol. Chem.28, 2550(1994)).

최근에는 양성의 고분자가 DNA 도입 시약으로 많이 이용되고 있는데, 여기에는 디에틸아미노에틸덱스트란(L. Sompayrac et al., 「Efficient infection ofmonkey cells with DNA of Simian virus 40」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.12, 7575(1981)), 폴리(L-리신)(G. Y. Wu et al., 「Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system」, J. Biol. Chem.262, 4429(1987)), 히스톤(O. Boussif et al., 「A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92, 7297(1995)), 프로타민(J. Hadrsler et al., 「Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture」, Bioconjugate Chem.4, 372(1993)), 폴리(에틸렌이민)(T.M. Chang et al., 「Studies fo the mechanism of cell intoxication by diphteria toxin fragment A-sialoorso-comucoid hybrid toxins. Edivence for utilization of an alternative receptor-mediated transport pathway」, J. Biol. Chem. 257, 12563(1982)), 양이온성 덴드라이머(I.A. Simpson et al., 「Hormonal regulation of mammalian glucose transport」, Ann. Rev. Biochem.,55, 1059(1986)) 등이 있다.

DNA는 음성의 고분자이기 때문에 양성의 고분자와 이온결합을 형성하며, 제조된 DNA 복합체의 표면전하를 양성으로 함으로써 음성의 표면전하를 갖는 세포에의 도입효율을 높일 수 있다. 이러한 방법은 DNA 복합체가 침전을 일으키기 쉽고 독성이 크며 세포특이성이 없다는 등의 문제점이 지적되고 있기는 하나, 조정법이 간단하고 때로는 높은 유전자 발현활성을 나타내는 경우가 있기 때문에 많은 연구가 진행되고 있다.

또한 세포들에는 아시알로글리코프로테인(A. Daurey-Varsat, 「Receptor-mediated endocytosis: the intracellular journey of transferrin and its receptor」. Biochimie,68, 375(1986)), 인슐린(G.Y. Wu et al., 「Edidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro」, Biochemistry,27, 887(1988)), 트랜스페린(G.Y. Wu et al., 「Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo」, J. Biol. Chem. 263, 14621(1988)) 등의 수용체들이 존재하기 때문에, 세포에의 특이성을 높이기 위해, 양성의 고분자에 세포특이적인 인식소자인 당쇄(V.S. Trubetskoy et al., 「use of N-terminal modified poly(L-lysine) andtibody conjugate as a carrier for targeted gene delivery in mouse lung endothelian cells」, Bioconjugate Chem. 3, 323(1992); F.C. MacLaughlin et al., J. Controlled Rel.56, 258 (1998)와 항체(I.E. Uchegbu et al., 「Polymeric chitosan-based vesicles for drug delivery」, J. Pharm. Pharmacol. 50, 453(1998))를 결합시킨 연구도 진행되었다.

이와 같이 DNA 화합물을 세포 내에 효과적으로 도입시키기 위하여 양성고분자의 양성 전하, 소수성기, 에틸렌글리콜쇄 및 당쇄, 항체, 수용체 등의 특이적 인식소자 등이 조절되어 DNA의 세포에로의 도입효율이 상당히 진전되고 있는 실정이다. 그러나 세포에로의 도입효율이 진전된다 하더라도, 현실적으로in vivo에서의 DNA 전달은 아직도 세포독성, 면역 반응성과 거기에 수반되는 부작용의 문제가 대두되고 있기 때문에, 세포독성이 없고 면역계에서 인식되지 않는 새로운 DNA 담체가 개발돼야 하는 과제가 여전히 남아 있다.

이에 본 발명자들은 연구를 거듭한 결과, 독성이 없고 생체 적합성이 우수하고 간세포와 특이적으로 결합하여 DNA의 세포에로의 도입효율을 향상시키는 신규한 담체 및 이와 DNA와의 복합체를 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 독성이 없고 생체 적합성이 우수하고 간세포와 특이적으로 결합하는 신규한 담체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 독성이 없고 생체적합성이 우수하고 간세포와 특이적으로 결합하는 담체와 DNA와의 복합체를 제공하는 것이다.

도 1은 락토바이오산(LA), 갈락토오스기를 갖는 키토산(GC) 및 갈락토오스기를 갖는 키토산과 덱스트란의 그래프트 중합체(GCD)의 IR 스펙트럼이다.

도 2는 GCD/DNA 복합체의 전하비율에 따른 입자크기의 그래프이다.

도 3은 GC/DNA 복합체 및 다양한 전하비율의 GCD/DNA 복합체들의 탁도를 나타내는 그래프이다.

도 4는 DNA 및 다양한 전하비율의 GCD/DNA 복합체의 원편광이색성(CD) 스펙트럼이다.

도 5는 DNA 및 다양한 전하비율의 GCD/DNA 복합체들의 전기영동사진이다.

도 6은 다양한 전하비율의 GC/DNA 복합체 및 GCD/DNA 복합체의 투과전자현미경 사진이다.

도 7은 다양한 전하비율에서 GCD/DNA 복합체의 주사전자현미경 사진이다.

도 8은 GCD/DNA 및 DOTAP/DNA로 트랜스펙션된 창 리버(Chang liver) 세포와 헬라(HeLa) 세포의 형광사진이다.

도 9는 창 리버 세포, Hep G2 세포, CT-26 세포 및 헬라세포의 세포 성장에 대한 GCD/디코이 올리고뉴클레오티드 복합체의 트랜스펙션 정도를 나타내는 사진이다.

본 발명은 하기 화학식 1을 주 반복단위로 포함하고, 분자량이 10,000 내지 30,000인 양이온성 고분자 화합물 담체에 관한 것이다.

단, m은 1 이상의 정수임.

본 발명에 있어서, 상기 화합물은 갈락토오스기를 갖는 키토산과 덱스트란의 그래프트 중합체로서, 그 비율은 중합체 중 키토산과 덱스트란이 1:4 내지 1:8 중량부의 비율로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 담체와 DNA와의 복합체에 관한 것이다.

상기 복합체는 이온결합 생성물로서, 이중 담체와 DNA의 전하 비율은 3:1 내지 7:1인 것이 바람직하다.

이하에서, 본 발명의 담체 및 복합체에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

상기 화학식 1의 본 발명의 담체는 천연고분자로서 독성이 없고 생체적합성이 우수한 양성의 다당물질인 키토산에, 간세포의 아시알로글리콜단백질 수용체와 특이적으로 결합하는 갈락토오스기와, 수용액 안정성 향상을 위한 덱스트란 당쇄를 도입시킨 양이온성 고분자 화합물이다.

상기 화학식 1의 본 발명의 담체 화합물을 제조하기 위해서는 우선 키토산에 갈락토오스기를 도입하여 하기 화학식 2의 키토산(Galactosylated Chitosan:GC)을 제조한다.

단, n 〉x이고, x는 1 이상의 정수임.

상기 화학식 2의 GC의 제조는 락토바이오산(lactobionic acid:LA)과 같이 갈락토오스기를 가지고 있는 물질과 키토산간의 반응에 의하여 이루어진다. 반응은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)의 존재하에서 활성 에스테르 중간체를 경유하여 결합되고, 이 반응의 상세한 설명은 Hermanson et al., 「Immobilized affinity ligand techniques, Academic press, San Diego, 1992.(이를 본 명세서의 일부로 함)에 기재되어 있다.

이어서, 상기 화학식 2의 GC를 친수성 덱스트란과 그래프트시켜 하기 화학식 1의 GCD를 제조한다.

단, m은 1 이상의 정수임.

이때 덱스트란의 도입은 입자간의 응집을 막아 수용액 중에서의 안정성의 향상을 위해서이며, GC와 덱스트란의 합성은 환원성 아민화 반응으로서, 반응시 GC와 덱스트란의 비율은 1:4 내지 1:8 중량부의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. 만일 1:4 중량부 미만이면 GCD가 충분한 수용성을 가지지 못하는 단점이 있고, 반대로 1:8을 초과하면 DNA와 복합체를 형성하기 위해 GCD를 과량 첨가해야 하고 복합체의 크기가 커지는 문제점이 있다.

이렇게 제조되는 상기 화학식 1의 본 발명의 GCD에 도입된 갈락토오스기는 아시알로글리콜단백질 수용체(ASGR) 간세포에 수용체-리간드 특이성을 가지며 이들 세포에 수용체-조정 세포내이입(receptor-mediated endocytosis)을 통해 세포내로 전달가능하게 한다. 또한 GCD에 도입된 덱스트란으로 인해 수용액 중에서의 안정성이 더욱 향상되어 간질환 치료제로서의 효과가 더욱 증진된다.

이와 같은 본 발명의 GCD를 수용액 중에서 DNA와 혼합하게 되면, 양이온성 고분자인 본 발명의 GCD와 음이온성 고분자인 DNA가 정전기적으로 보완적인 사슬간의 협력적 결합, 즉 복합체 형성을 이루게 된다. 이러한 GCD/DNA 복합체의 바람직한 전하 비율은 GCD:DNA가 3:1 내지 7:1이 바람직하다. 만일 전하비율이 3:1 미만이면, 복합체를 불완전하게 형성하는 단점이 있고, 반대로 7:1을 초과하면 복합체의 크기가 커지며 트랜스펙션 효율이 감소하는 단점이 있다.

이러한 본 발명의 GCD/DNA 복합체는 ASGR이 세포 표면에 존재하는 간세포에만 트랜스펙션되므로, DNA를 간세포에 효과적으로 도입함으로써 주요 대사 효소의 유전적 결함을 치료할 수 있게 된다.

이하에서, 실시예를 들어 본 발명에 대하여 상세하게 설명하기로 하되, 이는 본 발명의 예시에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<제조예 1: 갈락토오스기를 갖는 키토산(GC)의 제조>

후나코시 화학사에서 키토산(M_n≒4,000)과 덱스트란(M_n≒5,900)을 구입하였으며, DNA(sodium salt, from salmon testes)는 시그마사에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 더 이상의 정제 과정 없이 사용하였다.

키토산 15g (93.07mM)과 같은 몰수의 LA (33.35g; TCI, Japan)를 300 ml의 10 mMN,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) (Aldrich, USA)/HCl 완충액 (pH 4.7)에 용해시킨 후 EDC (93.07×1.5 mM) 27.6g를 첨가하여 실온에서 3일간 방치하였다. 생성물을 투석막(Spectra/Por7 membrane; MWCO = 3,500)을 사용하여 증류수에서 4일 동안 투석하여 GC를 얻었다. 생성된 GC의 적외선 분광분석을 행하여 그 결과를 도 1에 도시하였다(도 1(b)).

<제조예 2: 갈락토오스기를 갖는 키토산 및 덱스트란의 그래프트 중합체(GCD)의 제조>

GCD는 환원성 아민화 반응에 의해 합성하였다. 상기 제조예 1에서 제조한 GC 0.5g과 키토산의 20mol%에 해당하는 덱스트란 2.5g을 0.07M 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 용해한 후, 덱스트란 몰수의 10배에 해당하는 소듐 시아노하이드라이드를 첨가하였다. 생성물을 투석막(MWCO=12,000∼14,000)을 사용하여 정제하였다. 겔투과크로마토그래프를 사용하여 정제된 GC와 GCD를 확인하였다. GC와 GCD의 조성비는 NMR (Bruker, 600MHz, Germany)로 결정하였으며, 키토산과 LA 및 덱스트란과의 반응을 확인하기 위해 적외선 분광분석을 행하여 그 결과를 도 1에나타냈다(도 1(c)).

도 1은 LA, GC 및 GCD의 IR 스펙트럼으로서, 이중 (a)가 LA, (b)가 GC, (c)가 GCD의 IR 스펙트럼이다. 도 1의 (a)와 (b)를 비교하면, 키토산과 LA를 반응시켜 제조한 GC의 경우 스펙트럼의 LA에 존재하는 카르복실기(1730cm^-1)가 사라지는 것을 볼 수 있는데 이는 LA의 카르복실기가 키토산의 아민기와 반응하기 때문이다. 그러나, 도 1의 (c)의 GC와 덱스트란의 환원 아민화 반응에서는 덱스트란이 키토산과 구조적으로 유사하기 때문에 키토산과 구별되는 덱스트란의 특정밴드의 소멸로서는 반응의 진행의 확인이 힘들며 키토산에 존재하는 일차 아민기(1550 cm^-1)의 강도 감소와 아미드기(1640 cm^-1)에 비하여 덱스트란의 OH기(3450 cm^-1)가 증가하는 것으로써 반응의 진행됨을 간접적으로 확인할 수 있다.

제조예 1의 GC와 제조예 2의 GCD에서 키토산에 결합된 갈락토스와 덱스트란 잔기의 치환값은 각각 12.8%와 20.2%였으며 이는 NMR 측정으로 확인하였다.

<제조예 3: GCD/DNA 복합체의 제조>

전하비율을 계산하기 위해서 DNA는 330의 분자량당 하나의 전하로 계산하였으며, GCD는 갈락토스와 덱스트란 부분을 포함한 전체 고분자의 평균값으로 분자량당 전하를 계산하였다. DNA는 에티디움 브로마이드를 사용하여 형광을 나타내게 하였다. 150mM NaCl에 들어있는 10 mM 인산 완충액 (PBS, pH 7.4)에서 DNA(30 ㎍/ml)와 GCD 고분자 용액을 3:1의 전하 비율로섞음으로써 자발적인 복합체 형성을 유도하였으며, PBS를 첨가하여 최종 DNA 농도를 10 ㎍/ml로 맞춘 후 실온에서 12시간 동안 방치하였다. 복합체의 형성은 트리스-아세테이트 (TAE) 러닝 버퍼를 사용하여 1.0% 아가로스 겔에서 100V, 30분 동안 전기영동함으로써 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

이하는 본 발명의 GCD/DNA 복합체의 조성비 및 전하비에 따른 여러가지 물리화학적인 성질의 변화에 대하여 측정한 결과이다.

<시험예 1: GCD/DNA 복합체의 전하비율에 따른 입자 크기 측정>

GCD/DNA의 전하비율을 1, 3, 5, 7로 하는 것을 제외하고는 상기 제조예 3과 같은 방법으로 하여 GCD/DNA 복합체를 각각 형성하여 이들의 입자 크기를 측정하였다. 복합체 입자 크기의 측정은 전기영동 광산란 스펙트로포토미터(ELS 8000, Otsuka Electronics, Ltd., Osaka, Japan)로 25℃, 산란각 90°에서 측정하였다. 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2를 참조하면, GCD/DNA 복합체의 입자크기는 DNA에 대한 GCD의 비율이 증가할수록 감소하였으며, 전하비율 5에서 약 200nm의 최소값을 가진다. 일반적으로 전하 상호작용에 의한 경우 시간에 따라 응집이 형성되어 시간에 따라서 계속적으로 상당히 큰 크기의 복합체가 형성되지만, GCD의 경우에는 복합체의 표면에 존재하는 덱스트란 뿐만 아니라 표면의 (+) 전하에 의한 정전기적 반발력에 의해서 DNA가 뭉치는 것을 막아주는 것으로 생각된다.

<시험예 2: GCD/DNA 복합체의 탁도 측정>

전하비율 1,3,5,7의 GCD/DNA 복합체를 상기 제조예 3과 같은 방법으로 제조하였다. 제조된 GCD/DNA 복합체를 150mM NaCl이 들어있는 10mM PBS 완충액에 각각 용해시킨 후, 초음파 410 소니케이터(Hwa-Shin Instrument Co., Korea)를 사용하여 30W에서 2분간 초음파 처리하였다. 복합체의 분산안정성은 UV-VIS 스펙트로포토미터 (Uvikon923, Kontron Instruments, Italy)를 이용하여 500nm에서 측정하고, 그 결과를 도 3에 도시하였다. 또한, 전하비율 3의 GC/DNA 복합체를 같은 방법으로 제조하여 탁도를 측정한 후, 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3을 참조하면, 전하비율 3인 GC/DNA 경우(도 3의 (a)), 친수성 덱스트란 잔기가 없는 GC와 DNA의 복합체는 측정시간이 경과함에 따라 침전 발생 없이 점진적인 탁도의 증가를 관찰할 수 있는데 이는 응집이 형성됨을 의미한다. 특히 높은 전하비율(5 및 7: 도시하지 않음)에서는 복합체 형성의 초기 단계에서도 급격하게 침전되었다. 그러나, GCD/DNA 복합체 현탁액(도 3의 (b) 내지 (e))은 전하비율 1과 3 사이에서는 탁도가 서서히 감소하다가 전하비율 5 이상에서는 큰 변화가 없는 것을 볼 수 있으며, 이는 키토산 주쇄의 강직한 구조와 GCD의 거대한 측쇄로 인해 전하비율 5 부근에서 DNA의 (-) 전하를 완전히 둘러싸기 때문으로 생각되며 이러한 경향은 도 3의 입자크기 결과들과 밀접한 관련이 있을 것으로 예상된다.

이들 결과들로부터 GCD/DNA 복합체는 GC/DNA 복합체보다 안정하며 GCD/DNA 복합체에 존재하는 덱스트란 측쇄는 입자의 응집을 막는데 효과적임을 알 수 있다.

<시험예 3: 원편광이색성 분석(CD)>

DNA 및 전하비율의 1, 3, 5의 GCD/DNA 복합체의 2차 구조를 비교분석하기 위하여 CD 측정을 행하였다. 복합체는 탁도측정에서 제조된 것을 사용하였으며, CD 스펙트럼은 스펙트로포토미터(Jasco model J-715)로 측정한 6 스캔의 평균값을 사용하였다. 그 결과를 도 4에 도시하였다.

도 4를 참조하면, DNA만을 측정한 스펙트럼(도 4의 (a)) 과 GCD/DNA 복합체의 CD 스펙트럼(도 4의 (b) 내지 (d))을 비교하여 보았을 때, 큰 차이는 없는 것을 관찰할 수 있었는데, 이로 보아 DNA는 GCD와 복합체를 형성한 후에도 2차구조는 변하지 않음을 알 수 있다.

<시험예 4: 전기 영동 분석>

DNA에 대한 GCD의 전하 비율을 변화시키는 것을 제외하고는, 상기 제조예 3과 같은 방법으로 GCD/DNA 복합체를 제조하여 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 또한, DNA에 대해서도 아가로스 겔 전기영동을 행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 각 레인의 조성은 다음과 같다.

레인 1 : DNA 0.25㎍

레인 2 : DNA 0.25 ㎍＋ GCD 0.0025 ㎍ (2.5 ng)

레인 3 : DNA 0.25 ㎍＋ GCD 5 ng

레인 4 : DNA 0.25 ㎍＋ GCD 10 ng

레인 5 : DNA 0.25 ㎍＋ GCD 25 ng

레인 6 : DNA 0.25 ㎍＋ GCD 50 ng

도 5를 참조하면, DNA을 사용한 경우는 DNA가 (-) 전하를 띠기 때문에 전기적 상호작용에 의해서 (+) 전하를 띠는 아래쪽으로 이동하게 되지만 GCD와 복합체를 형성할 경우에는 전체적인 전하는 중성이나 (+)를 띠게 되고 또한 복합체의 큰 크기로 인해 이동을 하지 않게 된다. 레인 1은 플라스미드 DNA의 두 가지 형태, 수퍼코일형 및 닉크 형을 의미하는 두 밴드가 아래쪽에 보이는 것을 볼 수 있고, 레인 2에서 6으로 시료에서 GCD의 비율이 증가함에 따라 겔로 들어가는 DNA의 염색 강도는 감소하고 복합체로서 위부분에 머무르는 이동하지 않는 DNA의 염색 강도는 증가한다. 이러한 결과들은 DNA에 대한 GCD의 비율이 증가함에 따라 복합체의 비율도 증가하고 따라서 위부분에 머무르는 양도 증가하기 때문으로 해석된다.

<시험예 5: 투과전자현미경 분석(TEM)>

복합체의 전하비율은 DNA의 압축(compaction)에 중요한 영향을 끼친다. 복합체의 모양을 살펴보기 위해 투과전자현미경 (TEM)을 살펴보았다.

우선, 전하비율 1 및 3의 GC/DNA 복합체 및 전하비율 1 및 7의 GCD/DNA 복합체를 상기와 같은 방법으로 제조한 후, 이들 복합체의 형태를 TEM(JEM 1010, JEOL, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 관찰은 복합체 한방울을 구리 그리드에 떨어뜨린 후 1%의 우라닐 아세테이트 용액으로 30초간 네가티브 염색(negative staining)하였다. 이 후 10분 동안 그리드를 완전히 건조한 후 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 도시하였다.

도 6을 참조하면, GC/DNA 복합체는 뻗고(extended) 뭉쳐진 형태를 가진 반면에(도 6의 (a)), GCD/DNA 복합체는 GC/DNA에 비해 구형의 더 작고 압축된 형태를 가진다(도 6의 (b)).

<시험예 6: 주사전자현미경 분석(SEM)>

전하비율 1, 3, 5 및 초음파 처리후 전하비율 3의 GCD/DNA 복합체를 상기와 같은 방법으로 제조한 후 이들에 대하여 주사현미경 관찰을 행하였다. 관찰은 복합체 한방울을 스터드(stud)에 떨어뜨리고 상온에서 건조한 후 시료는 JEOL JFC-110E 이온 스퍼터링 기기(Japan)를 이용하여 금박코팅하였다. SEM 관찰은 JSM 5410LV 주사 전자 현미경(JEOL, Japan)을 사용하여 행하였다. 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, GCD/DNA 복합체는 구형의 압축된 형태를 가진다.

<시험예 7: GCD/DNA 복합체의 ASGR 특이성>

이하에서는, 본 발명의 GCD/DNA 복합체의 ASGR 특이성에 대하여 살펴보기로 한다. 본 실시예에서는 세포표면에 ASGR이 존재하는 창 리버 세포와 이들 수용체가 없는 헬라 세포(J. You et al., 「Enhancement of transfection efficiency using ligand-modified lipid vesicles」,J. Ferment. Bioeng.,85, 525(1998))의 유전자 형질변환에 관한 GCD/DNA 복합체의 효능을 측정하였다.

이 실험에서 사용된 DNA는 세포질에서 녹색 형광성의 단백질을 합성하는pEGFP-1으로서, 이는 야생형의 녹색 형광 단백질보다 35배 강한 형광 강도를 갖는 녹색 형광 단백질의 C 말단을 인코딩한다(J. Sambrook et al., 「Molecular cloning」 2nd ed. 1989). 상기와 같은 방법으로 합성한 GCD 50 ng과 pEGFP 0.25㎍으로 GCD/DNA 복합체를 제조하여, 창 리버 세포 및 헬라 세포를 트렌스펙션시켰다. 마찬가지로, 시판되고 있는 양이온성 지질로서 세포의 특이성이 없는 DOTAP(N-[1-(2,3,-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드) 2㎍ 및 pEGFP 0.25㎍의 DOTAP/DNA 복합체를 제조하여, 창 리버 세포 및 헬라세포를 트렌스펙션시켰다. 그 결과는 도 8에 나타낸다.

도 8을 참조하면, 창 리버 세포의 경우(도 8의 (a))에는 GCD/DNA와 DOTAP/DNA 복합체가 모두 트랜스펙션되어 UV 조사하에서 녹색 형광을 띠는 것을 볼 수 있는 반면, 헬라 세포(도 8의 (b))에서는 DOTAP/DNA 만이 트랜스펙션됨을 관찰할 수 있다. 이들 결과로부터 GCD/DNA 복합체는 ASGR을 통해 세포내로 트랜스펙션되는 것을 알 수 있다.

<시험예 8: GCD의 간암 치료에서의 사용가능성>

본 발명의 GCD는 간세포 특이성을 가지는 세포에서 유전적 결함의 치료를 목적으로 합성되었다. 본 시험예에서는 GCD의 간암 치료에의 사용가능성을 알아보기 위해 세포성장을 억제하는 단백질을 합성하는 유전자를 GCD와 복합체 형성시킨 후, 이를 세포에 처리하여 간세포에서만 세포 성장이 억제되는지를 살펴보았다.

디코이 올리고뉴클레오티드(decoy oligonucleotide)의 제조

YB-1은 Y-box 단백질군에 속하며 세포성장에 중요한 역할을 한다.YB-1전사인자인 디코이 뉴클레오티드는YB-1유전자를 활성화시키는 전사인자의 기능을 억제시키며YB-1의 발현을 저하하는 것으로 알려져있다. 디코이 올리고뉴클레오티드는 자동 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해서 단일쇄 형태로 합성되었으며, DNA의 상보성을 통해서 열처리(annealing)되었으며, 그들의 뉴클레오티드 순서는 5'-GGGTCAGGTGGGCAGATTGACAGTACCACT-3'이다.

세포계와 세포 배양

헬라 세포(사람의 자궁경부암 세포), CT-26(쥐의 선암 세포)는 듀벨코 개질 이글 배지(Dubelccos' modified Eagle medium: DMEM, Gibco BRL, Paris, France)에서 배양하였으며, Hep G2(사람의 간암 세포)와 창 리버 세포는 최소 필수배지(minimum essential medium: MEM)에서 배양하였다. 모든 배양 배지에는 10%의 소태아혈청(FBS)을 보충하였다. 세포들은 5% CO₂잉큐베이터에서 37℃로 유지되었다.

트랜스펙션 프로토콜

HeLa, CT-26, Hep G2와 창 리버는 5% CO₂항온기에서 37℃로 10% FBS가 들어있는 배지에서 배양하였으며, 22 mm 배양판에 5×10⁴/ml의 밀도로 집어넣어서 60∼70% confluency까지 성장시켰다. 무혈청배지로 희석한 GCD/DNA 복합체를 배양판에 첨가한 후 37℃, 5% CO₂분위기에서 6시간 동안 배양하였으며 처리후 무혈청배지는 혈청이 들어있는 새배지로 바꾸고 3일간 다시 배양하였다. YB-1 전사인자 디코이 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포들은 배양판에서 제거하고 세포수를 측정하였다. 그 결과를 도 9에 도시하였다.

본 실험에서는 GC/디코이 뉴클레오티드 복합체에 의한 세포 성장 억제는 이들 복합체가 가지는 상대적으로 큰 크기와 수용액에서의 불안정성이 수용체-조정 세포내이입에 적당하지 않기 때문에 측정하기 않았다. 세포 표면에 ASGR을 가지는 창 리버 세포와 Hep G2 세포에서는 GCD/디코이 뉴클레오티드 복합체가 트랜스펙션되어 GCD (50ng)/디코이 뉴클레오티드(0.25㎍)의 농도에서 세포 성장이 억제됨을 볼 수 있었지만(도 9(a)와 (b) 참조), 그 효과는 DOTAP에 비해 다소 낮은 값을 가졌다. 그렇지만 ASGR이 없는 CT-26과 HeLa 세포에서는 GCD/디코이 뉴클레오티드는 트랜스펙션이 일어나지 않았다. 또한 세포독성이 있는 것으로 알져진 DOTAP(F. Tang et al., 「Synthesis of a single-tailed cationic lipid and investigation of its transfection」,J. Control. Rel.62, 345(1999))과는 반대로 가장 독성이 높은 것으로 기대되는 양이온성 GCD 자체에서도 거의 독성을 보이지 않았으며 디코이 뉴클레오티드와 복합체를 형성한 경우에는 분산된 전하 밀도로 인해 전혀 독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과들은 GCD 콘쥬게이트를 간세포 특이적 유전자 전달계에 사용가능함을 제안한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르는 GCD 담체는 간세포 특이적인 유전자 전달계에서 효과적으로 사용될 수 있으며, DNA/GCD 복합체는 간세포에 특이적으로 결합하고 독성이 없으며 세포에의 도입효율이 높아 생체 적합성이 우수하다.

Claims

하기 화학식 1을 주 반복단위로 포함하는 분자량 10,000 내지 30,000의 고분자 화합물.

단, m은 1 이상의 정수임.
제1항에 있어서, 갈락토오스기를 갖는 키토산(GC)과 덱스트란이 1:4 내지 1:8의 중량비의 비율로 포함되어 있는 고분자 화합물.
제2항에 있어서, 갈락토오스기를 갖는 키토산(GC)이 하기 화학식 2의 화합물인 고분자 화합물.

단, n 〉x이고, x는 1 이상의 정수임.
제1항의 고분자 화합물과 DNA와의 복합체.
제4항에 있어서, 상기 복합체 중 제1항의 담체와 DNA의 전하 비율이 3:1 내지 7:1인 복합체.
제4항의 복합체를 유효성분으로 하는 간질환 치료제.