KR100347220B1

KR100347220B1 - 재조합아데노바이러스hiv백신

Info

Publication number: KR100347220B1
Application number: KR1019940019699A
Authority: KR
Inventors: 알란로버트데이비스; 폴포웬헝; 마이클데이비드루벡크; 로버트제임스네이턱; 라납쿠마르챤다; 슈리드하라치카투르샹카라나라야나무르티; 쇼-구앙린리
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1994-08-08
Publication date: 2003-02-26
Anticipated expiration: 2014-08-08
Also published as: ES2196018T3; PT638316E; KR950005326A; HU9402309D0; EP0638316A1; FI943626L; IL110560A; ATE241385T1; SG43029A1; FI943626A0; AU4850697A; BR9403202A; JPH07145079A; NZ264190A; DK0638316T3; FI113621B; IL110560A0; HK1009934A1; EP0638316B1; DE69432730D1

Abstract

본 발명은 비리온 구조 단백질이, 이로부터 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 온혈 포유동물에서의 감염성 유기체에 대한 항체에 상응하는 항원을 암호화하거나 상기 감염성 유기체에 대한 세포 매개성 면역을 유도하는 유전자를 함유하는 생 재조합 아데노바이러스를 온혈 포유동물에게 비강내, 근육내 또는 피하내 투여함을 특징으로 하여, 온혈 포유동물에서의 감염성 유기체에 대한 항체 또는 세포 매개성 면역을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 아데노바이러스 HIV 백신{Recombinant adenovirus HIV vaccines}

생의학 연구의 중요한 목적은 면역화를 통해 바이러스 질환에 대한 보호책을 제공하는 것이다. 하나의 접근 방법은 사멸된 백신을 사용하는 것이었다. 하지만 사멸된 백신의 경우, 충분한 항원성 집단을 보유하기 위해서는 다량의 물질이 요구된다. 또한, 사멸된 백신은 종종 제조중에 바람직하지 못한 산물로 오염된다. 그 자체가 백신인 적절히 조작된 아데노바이러스를 사용하여 제조한 이종성의 살아있는 백신은 탁월한 면역원 처럼 보인다[참조: Chanock R., JAMA, 195, 151 (1967)]. 본 발명은 아데노바이러스를 벡터로서 사용하는 백신에 관한 것이다.

현재 시판되는 아데노백신은 장용 피복된 투여형태로 감염성의 살아있는 아데노바이러스를 포함한다. 예비 접종한 환자에게 투여시, 바이러스는 상부 호흡계(여기서, 질환 유발 감염이 발생하는 것으로 생각됨)를 통해 운반되어 장으로 방출된다. 장에서 바이러스는 소화관 벽 내에서 증식되어, 비록 아데노바이러스 질환을야기시킬 수 없을지라도 아데노바이러스 항체 형성을 유도하여 아데노바이러스 질환에 대한 면역성을 부여한다. 본 발명에서, 감염성의 살아있는 아데노바이러스는 기타 질환-야기 유기체에 의해 생성되는 항원을 암호화하는 유전자를 함유하도록 조작된다. 방출시, 당해 바이러스는 증식되고, 아데노바이러스 항원 및 병원체 항원 모두를 각각 발현하여, 아데노바이러스 및 기타 질환-야기 유기체 모두에 대한 항체의 형성을 유도하거나 세포 매개된 면역성을 유도한다. 용어 "살아있는 바이러스란 "사멸된" 바이러스의 상대어로, 그 자체로 또는 또 다른 유전 물질과 함께, 동일한 자손을 생산할 수 있는 바이러스를 의미한다. 용어 "감염성"이란 바이러스 게놈을 세포내로 운반할 수 있는 능력을 지님을 의미한다.

유럽 특허공보 제80,806호(1983, Roy)에는 면역성이 부여된 제2 미생물의 항원을 발현하는 외래 유전자를 함유하는 미생물을 투여함으로써 미생물 질환에 대한 면역성을 부여하는 방법이 제시되어 있다. 상기 문헌에는 바람직한 경구용 제제가 장용성 제피제임을 기술한다. 둘베코는 아데노바이러스의 표면 단백질이 변형되어 이의 구조내에, 동물에게 투여시 목적하는 생물학적 반응을 유발시키게 될 외래 유전자 절편을 함유하는 재조합 아데노바이러스 백신을 제시하였다[참조: PCT 국제공개 특허공보 제WO 83/02393호(1983)]. 데이비스는 재조합 아데노바이러스로부터 유래되는 경구용 백신을 기술한다[참조: UK Patent GB 2166349B].

사람 면역결핍 바이러스 제1형은 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 관련 질환과 병원학적으로 연루되어 있다[참조: Barre-Sinoussi, F., Science 220:868 (1983); Gallo, R., Science 224:500 (1984); Popovic, M., Science 224:497 (1984);Sarngadharan, M., Science 224:506 (1984)]. AIDS는 현재 전세계적인 유행병으로, 백신 또는 치료법이 전무한 상태이다. 백신 개발을 위한 대부분의 노력은 보호적 면역성을 제공할 수 있는 항원으로서 외피(env) 당단백질에 집중되고 있다. 정제된 gp120에 대해 제조된 항혈청은 시험관내 HIV-1을 중화시킬 수 있다[Crowl, R,, Cell 41:979 (1985); Putney; S , Science 234: 1392 (1986); Ho, D,, J. Virol. 61:2024 (1987); Nara, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3797 (1987)]. HIV-1 외피 항원은 에스케리차 콜라이[참조: Crowl, R., Cell 41:979 (1985); Chang, T., Bio/Technology 3:905 (1985); Dawson, G., J. Infect. Dis. 157:149 (1988)] 및 포유동물[참조: Chakrabarti, S,, Nature 320:535 (1986); Dewar, R., J. Virol. 63:129 (1989); Rekosh, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:334 (1988); Whealy, M., J. Virol. 62:4185 (1988)], 효모[참조: Barr. P,, Vaccine 5:90 (1987)] 및 곤충 세포[참조: Hu, S., Nature 328: 721 (1978); Rusche, J,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6294 (1987)]를 포함한 상이한 발현 시스템 중에서 생성되어 왔다.

전체 HIV-1 env 당단백질[참조: Hu, S, J. Virol. 61:3617 (1987)] 또는 정제된 재조합 gp120 env 당단백질[참조: Berman, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5200 (1988)]을 발현하는 살아있는 재조합 백시니아 바이러스는 침팬지의 백신 대체물로서 평가되었다. 이들 백신으로 자동 면역화하여 env 항원에 대한 세포 독성 T-세포 활성뿐 아니라 우수한 세포-매개된 면역 반응을 유도하였다[참조: Zarling, J., J. Immunol. 139:988 (1987)]. 모든 실험 동물은 ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 의한 분석시 혈청전환 되었다. 하지만, 면역화된 침팬지는 HIV-1에 대한중화 항체의 낮은 역가를 나타내거나 역가를 전혀 나타내지 않았다. 살아있는 바이러스를 사용한 챌린지(challenge)는 이들 백신으로부터 침팬지를 보호하지 못하였다. 유형-특이적 HIV-1 중화 항체는 침팬지 내에서, gp120의 C-말단 1/2 내에 있는 가변성 도메인(V3)에 대한 감염 초기에 발견되었다[참조: Goudsmit, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4478 (1988)]. 곤충 세포 내에서 제조된 재조합 gp120 또한 염소에서 체액성 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다[참조: Rusche J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6294 (1987)]. 자거리[참조: Zagury, Nature 332:728 (1988)]는 gp160을 발현하는 백신 바이러스 재조합체를 사용하여 사람에서 체액성 및 세포성 2차 면역 반응 모두를 입증하였다[참조: Chakrabarti, S., Nature 320:535 (1986); Hahn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4813 (1985)]. 감염된 T4 세포에 대한 세포-매개된 세포 독성 및 그룹-특이적 세포-매개된 면역성 또한 발견되었다. 이들 결과는 HIV-1에 대한 면역 상태가 재조합 env-계 백신을 사용하여 사람에게서 수득될 수 있음을 시사한다. 최근, 데스로지어(Desrosiers)에 의하면, 불활성화된 전체 원숭이 면역결립 바이러스(SIV)로 예방 접종한 경우 살아있는 SIV로 챌린지한 붉은 털 원숭이를 보호할 수 있음이 입증되었다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6353 (1989)]. 이들 데이터는 사람 AIDS 바이러스, HIV-1 감염에 대한 백신 보호가 가능할 수 있다는 기대를 제공한다.

챤다(Chands)는 헬퍼-독립성 아데노바이러스 제7형 재조합체를 사용하여 rev 유전자 존재하에 HIV-1의 외피 당단백질을 고수준으로 발현시키는 것에 대해 기술하고 있다[참조: Virology 175:535 (1990)]. 버논(Vernon)은 재조합 아데노바이러스 벡터 시스템의 HIV-1 gag 서브유니트의 거대 구조적 특성을 기술하고 있다[참조: J. Gen. Virology 72:1243 (1991)]. 버논은 또한 HIV-1 재조합 아데노바이러스 Ad7-rev-gag 및 Ad4-rev-gag의 제조에 대해서도 기술하고 있다.

본 발명은, 재조합 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질이 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 감염성 유기체에 대한 항체에 상응하는 항원 또는 감염성 유기체에 대해 세포 매개전 면역성을 유도하는 항원을 암호화하는 유전자를 함유하는 살아있는 재조합 아데노바이러스를 온혈 포유동물에게 비강내, 근육내 또는 피하 투여함을 특징으로 하여, 온혈 포유동물에서의 감염성 유기체에 대한 항체 또는 세포 매개된 면역성을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에 있어, 본 발명은 재조합 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질이 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 각각 사람 면역결핍 바이러스, B형 간염, C형 간염, 사람 유두종 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로타바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스를 암호화하는 유전자를 함유하는 살아있는 재조합 아데노바이러스를 온혈 포유동물에게 비강내, 근육내 또는 피하 투여함을 특징으로 하여, 온혈 포유동물에서 사람 면역결핍 바이러스(HIV-1), B형 간염, C형 간염, 사람 유두종 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로타바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 생성시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 재조합 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질이 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 감염성 유기체에 대한 항체에 상응하는 항원 또는 감염성 유기체에 대해 세포 매개된 면역성을 유도하는 항원을 암호화하는 유전자를 함유하는 살아있는 재조합 아데노바이러스를 포함하는, 비강내, 근육내 또는 피하 투여형으로 제형화된, 온혈 포유동물에서 감염성 유기체에 대한 항체 또는 세포 매개된 면역성을 생성시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 명세서 중에는 제4형, 제5형 또는 제7형의 아데노바이러스를 구체적으로 언급하고 있으나, 어떠한 유형의 살아있는 감염성 아데노바이러스도 본 발명에 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서는 초기 영역 3(E3)이 결실된 아데노바이러스를 구체적으로 언급하고 있으나, 감온성 장애를 포함하는 감쇠된 아데노바이러스, 또는 E1 결실체도 또한 벡터로서 사용될 수 있다. 유사하게, HIV, B형 간염, C형 간염, 사람 유두종 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로타바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 생성하는 백신에 대한 구체적인 언급이 있을지라도, 본 발명은 온혈 동물에서 항체 또는 세포 매개된 면역성을 생성시키는, 약 3000bp 이하로 구성된 유전자에 의해 암호화되는 항원을 함유하는 감염성 제제에 대한 백신을 제공한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 영역내에는 인플루엔자, A형 간염, 콜레라, 이.콜라이, 백일해, 디프테리아, 파상풍, 이질, 임질, 마이코플라즈마 폐렴 등과 같은 질환에 대한 면역화가 포함된다.

바람직한 양태에 있어서, 치료 방법은 HIV-1에 걸리기 쉬운 포유동물에게 예방학적으로, 및 상기 포유동물에서 HIV 검출 후 면역 치료학적으로, 재조합 아데노바이러스를 투여함을 포함한다. 하기 재조합 아데노바이러스를 함유하는 처방제를 사용하여 항-HIV 반응을 생성시킨다. 이들 바이러스는 미합중국 메릴랜드 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 부다페스트 조약하에 하기 기탁 번호로 기탁되어 있다.

상기 표에서, Ad4, AD5 및 Ad7은 E3 영역이 결실된 사람 아데노바이러스 제4형, 제5형 및 제7형을 각각 의미한다. env는 HIV 외피 당단백질(gp160) 유전자를 의미한다. gag는 HIV gag/pro 유전자를 의미한다. rev는 HIV 조절 유전자를 의미한다. Hrev는 이의 뉴클레오타이드 서열이 사람 유전자 내에서 빈번히 사용되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 변화시키지 않고 변화된 rev 유전자의 변형된 형태를 의미한다. tpl은 재조합 유전자의 앞에 위치하는 제1 및 제2 리더 서열 사이에 개재(intervening) 서열을 갖는 상부 아데노바이러스 삼부체(tripartite) 리더 서열을 의미한다. Ad7-env, Ad7-gag, Ad7-gag-1, Ad4-env, Ad4-gag, Ad4-gag-1, Ad5-env, 및 Ad5-gag로 명명된 작제물은 HIV의 LAV 주(strain)로부터의 gag 또는 env 유전자를 함유하고, Ad7-env_MN, Ad4-env_MN및 Ad5-env_MN작제물은 HIV의 MN 주로부터의 env 유전자를 함유한다. HIV-1의 LAV 및 MN 주로부터 제조된 재조합 아데노바이러스는 본 발명에 포함되는 재조합 아데노바이러스의 예이다. 본 발명은 또한 HIV-1의 기타 주로부터의 env 및/또는 gag 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 포함한다.

Ad-env 및 Ad-env_MN아데노바이러스 모두는 사람 A549 세포 내에서 복제되는 것으로 보이며, 재조합 env 항원을 시험관내 발현시켜 포유동물에서의 세포 매개성, 체액성 및 분비성 면역성을 생성시키는 이들의 수행력을 입증하고 있다.

하기 세부적으로 기술되는 바와 같이, Ad-HIV 재조합 바이러스를 미실험의 침팬지에게 비강내 투여함으로써, HIV 재조합 항원에 의해 유도되는 체액성 및 세포-매개된 면역 반응 모두가 프라이밍(priming)되고 부스팅(boosting)된다. 침팬 지에게 투여된 재조합 아데노바이러스는 HIV의 env 및 gag 단백질에 대한 항체를 생성시키는 것으로 나타났다. HIV에 특이적인 IgG 항체가 재조합 아데노바이러스 투여후 비강, 타액 및 질 분비물에서 관찰되었고, HIV에 특이적인 IgA 항체는 비강및 타액 분비물에서 관찰되었다. 첫 번째 세트의 재조합 바이러스(Ad7)는 최장기간 동안 방출되어 최고의 항-Ad 항체 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 결과는 또한 비강내 경로에 의한 Ad-HIV 백신 투여가 경구적 경로에 의한 장용성 제피 재조합 바이러스의 투여보다 우수함을 나타냈다.

HIV 항원에 의해 유도되는 최적 면역 반응은 강력한 항-HIV 결합 항체를 유도하기 위하여 이형 재조합 Ad-HIV를 사용한 1차 감염 부스터 면역화를 필요로 했다. Ad-HIV 바이러스의 비강내 투여는 침팬지를 효율적으로 프라이밍시켜 후속적인 HIV-1 서브유니트 단백질 부스터 면역화 후 HIV-1에 대한 고역가 중화 항체로 반응하였다.

대표적인 재조합 아데노바이러스의 제조

하기 실시예에는 본 발명의 대표적인 재조합 아데노바이러스 작제를 나타낸다. 재조합 바이러스를 A549 세포 상에서 생장시키고, 연속하여 A549 세포 상에서 역가 측정했다.

실시예 1

Ad7-gag-1

HIV 외피 단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스의 작제가 문헌[참조: Chanda, P., Virology 175:535 (1990)]에 기술되어 있다. 유사한 방법으로 gag 및 pro를 통합시켰다[참조: Vernon, S., J. Gen. Virology 72:1243 (1991)]. 즉, HIV-1주 LAV의 전체 gag 및 pro 암호화 영역(bp 335 내지 2165)을 함유하는 DNA 단편을, 바이러스 rev-반응성 요소(rre; bp 7178 내지 7698)의 삽입을 위해, gag 유전자의 AUG 코돈 앞에 단일 Sa/I 부위를, bp2165에 XbaI 부위를 포함하도록 작제했다. 3개의 HIV-1 서열을 함유하는 2.37kb SaI 단편을, 문헌[참조: Chanda, Virology 175:535 (1990)]에 기술된 바와 같이, 아데노바이러스 제7형 (Ad7) 주요 후기 프로모터(MLP), 제1 및 제2 리더 사이에 개재 서열을 갖는 삼부체리더(TPL) 및 헥손 폴리아데닐화 부위(폴리 A)를 함유하는 발현 카세트내의 SaI 부위에 삽입했다. 결실된(79.5 내지 88.4 지도 단위, m. u.) E3 영역[참조: Chandab P., Virology 175:535 (1990)]내에 HIV-1 rev 유전자[참조: Feinberg, M., Cell 46:807 (1986); Sodroski, J., Nature 321: 412 (1986)]를 함유하는 Ad7 게놈[참조: Sussenbach, The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, pp. 34-124 (1984)]의 우측 말단으로부터 159bp 위치에 상기 카세트를 삽입했다.

실시예 2

Ad4-gag-1

실시예 1중의 Ad7-gag-1 재조합 아데노바이러스 작제를 위한 방법에 따라, 유사한 Ad4 서열 및 3개의 HIV 암호화 영역을 함유하는 유사한 발현 카세트를, 76 및 86 m. u. 사이의 E3 결실부내에 HIV-1 rev를 함유하는 Ad4 게놈의 우측 말단으로부터 139bp에 삽입했다.

실시예 3

Ad5-env

Ad5-tplenv-tplHrev는 HIV-1(LAV 주) gp160의 전체 암호화 서열 및 소위 Hrev로 불리는 rev 유전자의 변형된 형태를 함유한다. env 뿐만 아니라 rev 유전자 모두는 Ad5 3부체 리더(Ad5-tpl)의 합성 복사체 뒤에 존재시켰다. Ad5-tpl을 화학적으로 합성하여 pTZ 벡터내로 클로닝했다. 그후 gp160 DNA 서열을 Ad5-tpl 뒤에 삽입시켜 Ad5-tplenv/PTZ18R 클론을 제조했다. Hrev(∼360bp)도 또한 화학적으로 합성했는데, 이의 뉴클레오타이드 서열을 코돈 사용빈도(codon usage)의 도움으로아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 변화시켰다. 이것은 일부의 동일한 서열이 env와 rev 사이에 존재하므로 상동 재조합을 피하기 위해 실시했다. Ad5-tplenv 작제와 유사한 방법으로, Hrev 유전자를 pTZ18R 벡터내의 tpl 뒤에 삽입시켜 플라스미드 Ad5-tplHrev를 제조했다. Ad5-tplHrev를 함유하는 전체 서열을 절단해내고 Ad5-tplenv 뒤에 삽입시켜 플라스미드 Ad5-tplenv-tplHrev를 제조했다. 그후, 이 플라스미드를 78.8mu에서 Ad5 마리에타(Marietta) 주(78.8-85 7mu 결실)의 결실된 E3 영역에 삽입시켰다. 이 플라스미드를 BglI 효소로 선형화시킨 후 이를 야생형의 정제된 Ad5 바이러스로부터 유래한 0∼87mu SnaB1 단편과 혼합시켰다. A549 세포를 DNA 혼합물로 형질감염시킨 후, 재조합 바이러스 플라크를 취하고, 플라크를 3회 정제하였으며, 이들의 게놈 구조를, 허트(Hirt)[참조: Hirt, J. Mol. Bio. 26:365 (1967)]의 방법으로, 감염된 세포로부터 추출한 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 부위 분석을 통해 확인했다.

실시예 4

Ad5-gag

Ad5-tplgag-tplHrev는 변형된 rev 유전자인 Hrev 뿐만 아니라 전체 gag 및 pro 영역 모두를 함유한다. Ad5 합성 3부체 리더의 복사체는 gag 및 Hrev 유전자의 앞에 위치시켰다. 전체 gag 및 pro 영역(HIV-1의 LAV 주의 bp 335 내지 2165)을 함유하는 DNA 단편을, 바이러스성 rev-반응성 요소(rre; bp 7178-7698)의 삽입을 위해, gag 유전자의 AUG 코돈 앞에 단일 SalI 부위를, bp 2165에서 xba 부위를 포함하도록 작제했다. 두 개의 별개 플라스미드 Ad5-tplgag 및 Ad5-tplHrev를 앞서Ad5-tplenv-tplHrev에 대해 기술한 것과 유사한 방법으로 제조했다. 그후, Ad5-tplHrev 단편을 Ad5-tplgag 뒤에 삽입시켜 플라스미드 Ad5-tplgag-tplHrev를 제조했다. 그후 단편 Ad5-tplgag-tplHrev를, E3 결실부(78.8-85.7mu E3 결실부)가 있는 Ad5 마리에타 주의 지도 위치 78.8에 위치하는 단일 XbaI부위에 삽입했다. 그후 Ad5 서열을 함유하는 최종 플라스미드를 선형화하고 그후 형질감염을 위해 0 내지 87mu SnaB1 바이러스 단편과 혼합했다. 재조합 플라크를 취해, 이 플라크를 3회 정제하고, 감염된 세포로부터 추출된 DNA의 허트 분석으로 체크했다.

실시예 5

장용성 피복 캅셀제

재조합 아데노바이러스를 A549 세포 중에서 생장시키고 3회의 냉동-해동 주기 후에 수거했다. 청징화시킨 감염된 세포 용해물을 동결 건조시키고 60 내지 100mg을 제습 조건하에 1ml의 주사기 플런저를 사용하여 #2 젤라틴 캅셀내에 충전시켰다. 이 캅셀을 침지 중간에 공기 건조시키면서, 각 말단을 6회씩 손으로 침지시켜 아세톤/100% 에탄올(1:1) 중의 10% 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트로 피복시켰다. 이들 조건하에서 69 내지 77mg의 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 피복물이 형성되었다. 샘플 캅셀을, 반켈 붕해 테스터(Vankel Disintegration Tester) 장치를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 모조 위액(0.32% 펩신, 0 2% NaCl, pH 1.2)에 대한 내성에 대해 시험했다. 이 캅셀을 구멍이나 균열(crack)에 대해 검사하고 10ml의 모조 장액(1.0% 판크레아틴, 0.05M 일염기성 인산칼륨, pH 7.5)을 함유하는 l5m의 튜브에 넣고 37℃에서 회전시켰다. 시험한 모든 캅셀은 교반시 37℃에서 1시간동안 모조 위액에 대해 내성이 있었으며, 모조 장액내에서는 15분 이내에 용해되기 시작했다. 일정량의 바이러스를, 플라크 분석으로 융합성(confluent) A549 세포 단층 상에서 역가 측정하고, 바이러스 DNA 안정성을 허트 분석으로 확인했다.

실시예 6

Ad7-env_MN

HIV-1의 MN 주의 env(gp160) 유전자의 암호화 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스의 작제는 다음과 같이 간단하게 기술된다: 컨센서스(consensus) 코자크(Kozak) 서열 뿐만 아니라 개시 코돈(ATG)을 포함하는 env(gp160) 유전자의 아디노(NH₂) 말단의 125bp(6243 내지 6367) 단편을 클론 pMNST 1-8-9로부터 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 그후 이 단편을 pGEM 벡터로 클로닝시키고 생성된 클론을 pGEMMNenv로 명명했다. 다음의 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 및 XbaI로 분해시켜 클론 PAd5tpl_MNenv 223(6367bp 내지 8816bp), PGEMenv로부터의 XhoI + KpnI 단편 및 pAd7tpl 18RD로부터의 SalI + XbaI 단편을 분리해 냈다. 이들 단편 전부를 서로 결합시키고 생성된 클론을 pAd7tpl_MNenv로 명명했다. 그후, 이 플라스미드를 Xbal으로 분해시키고 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP)로 처리했다. Hrev 유전자의 NheI + XbaI 단편을 플라스미드 pAd7tplHrev 18RD로부터 분리했다. 이들 두 단편을 결합시켜 수득한 클론을 pAD7tpl_MNenvtplHrev로 명명했다. 그후 이 플라스미드를 NheI + XbaI으로 분해시킨 후, 마찬가지로 XbaI으로 분해시킨 후 ClAP로처리한 Ad7의 E3 결실 플라스미드, 즉 pAD7△E3(68mu 내지 100mu 결실)와 결합시켰다. 생성된 플라스미드를 pA7△E3tpl_MNenvtpl_MNHrev로 명명했다. 이 플라스미드를 EcoRI으로 분해시키고 Ad7 게놈성 DNA의 EcoRI(0-87m.u.) 단편과 혼합했다. 그후 A549 세포를 이들 DNA로 형질감염시켰다. 생체내 재조합으로부터 수득한 재조합 플라크를 허트 DNA의 적절한 제한 분해 분석으로 확인했다. 플라크는 또는 웨스턴 블롯상에서 적절한 항체를 사용하여 gp160, gp120 및 gp41의 생성으로 확인되었다.

실시예 7

Ad4-env_MN및 Ad5-env_MN

Ad4 및 Ad5 재조합체의 작제는, Ad4의 경우, pAd4△E3tpl_MNenvtplHrev를 EcoRI-분해시켜 수득한 DVA를 Ad4 게놈성 DNA로부터의 BclI(0-87m.u.) 단편과 조합시켜 재조합 Ad4 바이러스를 작제하는 점을 제외하고는 Ad7env_MN의 경우와 동일하다. Ad5의 경우도 유사하게, pAd5△E3tpl_MNenvtplHrev를 MluI-분해시켜 수득한 DNA를 Ad5 게놈성 DNA의 SpeI(0-75m.u.) 단편과 조합시켜 재조합 Ad5 아데노바이러스를 제조했다. Ad7과 마찬가지로, Ad4 및 Ad5 재조합체를 A549 세포로부터 수득했다.

실시예 8

서브유니트 항원 제조

gp-120_MN을 문헌[참조: Kanfman, R. j,, Nucleic Acid Res. 19: 4485(1991)]에 따라 제조하고, SAF-m 보조제 중에 사용했다[참조: Allison, A. C., J. Imm. Meth. 95:157 (1986)]. gp-120_SF2를 문헌[참조: Scandella, C. J., AIDS Res. Human Retroviruses 9:1233 (1993)]에 따라 제조하고 MF-59 보조제 중에 사용했다[참조: Keitel. W., Vaccine 11; 909 (1933)], 문헌[참조: Kalayan, N., Vaccine 12:753 (1994)]에 따라 HA-env_K17K를 제조하고 SAF-m 보조제 중에 사용했다.

복제 및 항원 발현의 측정

사람 A549 세포를 LAV 또는 MN env 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 제4형, 제5형 및 제7형으로 감염시켰다(M0I 10:1). 감염 후 34시간째에 바이러스 역가 및 env 항원 발현을 복제 샘플 중에서 측정했다. 감염된 세포의 1개의 접시를 3주기로 냉동-해동시키고, 세포 용해물을 플라크 분석으로 감염성 바이러스의 존재에 대해 시험했다. 제2 배양물 접시를 세척하고, 세제 용해시켜 세포 용해물의 분취량을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩(loading)했다. 전기영동후, 분리시킨 단백질을 웨스턴 블롯 장치를 이용하여 니트로셀룰로스로 옮겼다. 옮긴 단백질을 항-env 시약으로 면역염색시켰다. 공지된 표준 재조합 gp160을 전기영동전에 가했다. 생성된 면역 블롯을 농도계로 스캐닝하고 재조합 env의 양을 측정했다. 야생형 아데노바이러스와 LAV 또는 MN env 유전자중 어느 하나를 발현하는 재조합 아데노바이러스 간에는 전혀 유의성 있는 차이점이 없었다. LAV 또는 MN 두 유형의 재조합 아데노바이러스는 비슷한 양의 env 항원을 생성했다. 따라서, 두 유형의 Ad-env 재조합체 LAV 및 mn 모두는 이들의 상응하는 야생형 아데노바이러스 와 마찬가지로사람 A549 세포중에서 생장할 수 있었고, 재조합 env 항원을 발현시킬 수 있었다. 따라서, 이같은 결과는 LAV 및 MN 아데노바이러스 재조합체 모두가 포유동물에서 세포 매개성, 체액성 및 분비성 면역을 생성시킬 수 있음을 입증한다. 수득된 데이터는 다음의 표에 요약되어 있다.

아데노바이러스 복제 및 항원 발현

처리 방법

재조합 아데노바이러스의 HIV에 대한 면역원성은 침팬지의 경우 4가지 처리방법(1, 2, 3 및 6)으로, 개의 경우 2가지 처리 방법(4 및 5)으로 평가했다. HIV~1 감염에 대한 보호는 침팬지에서 6번 처리 방법으로 평가했다. 첫 번째 방법은, 0, 7 및 26주째에 장용 피복 캅셀제(실시예 5 참조)를 통해 재조합체 아데노바이러스를 경구투여하고, 이어서 보조제로서 명반을 사용하여 env + gag 서브유니트 단백질 부스터로 처리하는 것으로 구성되었다. 두 번째 방법은 46 및 58주째에 방법 1을 적용한 침팬지를 재조합 아데노바이러스의 추가 부스터를 비강내 투여하여 처리하는 것으로 구성되었다. 세 번째 처리 방법은 0, 24 및 52주째에 미실험의 침팬지에게 비강내로 재조합 아데노바이러스를 투여하고 75주째에 env 서브유니트 부스터로 처리하는 것으로 구성되었다. 네 번째 처리 방법은 HIV-1의 LAV 및 MN 주 모두에서 유래한 재조합 아데노바이러스를 개에게 투여하는 것으로 구성되었다.

다섯 번째 처리 방법은 이미 면역화시킨 개 또는 대조용 개에게 env 서브유니트 부스터를 투여하는 것으로 구성되었다. 각각의 처리 그룹은 이미 면역화시킨 6마리의 개 및 2마리의 대조용 개로 구성되었다. 이미 면역화된 개중, 6마리는 처리 방법 4를 적용했고(그룹 A); 6마리는 처리 방법 4를 적용했으며(그룹 D); 6마리에는 Ad-env_HXB2(HIV의 LAV 주로부터 유래한 HIV env V3 루프의 일부를 발현)를 투여했고; 12마리에는 Ad-env_HXB2(HIV의 MN 주로부터 유래된 HIV env V3 루프의 일부를 발현)를 이미 투여한 바 있다[문헌; Rogert-Guroff, M., J. Voirol. 68:3459(1994) 및 Veronese, F. D., J. Biol. Chem. 268:25894(1993)에 따라 제조].

여섯번째 처리 방법은, 침팬지에게 Ad-env_MN재조합체를 투여한 후 이종성 Ad 벡터를 사용하여 0, 1 또는 2 Ad-env_MN부스터 면역화시키는 것으로 구성되었다. 그후 침팬지를 env(gp120_SF2) 서브유니트 항원 제제로 1 또는 2회 부스터 면역화시키고 HIV의 SF2주로 챌린지했다.

다음 표는 처리 방법 1 및 2를 요약한 것이다.

처리 방법 1 및 2

* 각 투여량은 3일 연속으로 장용-피복 젤라틴 캅셀로 투여했다.

+ 근육내 투여.

다음 표는 처리 방법 3을 요약한 것이다.

처리 방법 3

* 비강내 투여.

+ 근육내 투여.

다음 표는 처리 방법 4를 요약한 것이다.

처리 방법 4

* 각자의 재조합 아데노바이허스는 개 1마리당 1 x 10⁹의 투여량으로 기관지내 투여되었다.

다음은 처리 방법 5를 요약한다. 각각의 그룹은 상기한 바와 같이 이미 면역화시킨 6마리 개 및 2마리의 대조용 개로 구성되었다. 각 그룹에 보조제 중의 5O㎍ 서브유니트를 0주째(최종 Ad-env 투여로부터 20 내지 28주째)에 투여했다. 그룹 A에는 MF59 보조제 중의 gp120_SF2를 투여했고; 그룹 B에는 SAF-m 중의 CHO-기원 gp120_MN(항체 정제함)을 투여했으며; 그룹 C에는 SAF-m 중의 Ad5-gp160_MN-기원 gp160_MN(렌틸 렉틴 정제함)을 투여했고; 그룹 D에는 MF59 중의 Ad5-gp160_MN-기원 gp160_MN(렌틸 렉틴 정제함)을 투여했고; 그룹 E에는 HA-env_K17K(HIV env V3 루프의 일부를 발현)를 투여했다. 12주후, HA-env_K17K로 재부스팅시킨 그룹 D의 개를 제외하고, 개를 동일한 서브유니트로 동일하게 부스팅시켰다.

하기 표는 처리 방법 6을 요약한 것이다.

처리 방법 6

+ 모든 Ad-env 및 Ad 바이러스는 1.0 x 10⁷pfu/바이러스의 투여량으로 비강내 투여되었다.

* MF59 보조제중에 제형화된 50㎍ HIV gp120_SF2를 근육내 투여했다.

# 7번, 8번 및 9번 침팬지는 40주째에 챌린지했고; 11번 및 12번 침팬지는 52주째에 챌린지했으며, 10번 침팬지는 챌린지하지 않았다.

면역원성 측정: 처리 방법 1

침팬지 접종

사람 아데노바이러스 제4형 및 제7형에 대한 중화 항체의 존재에 대해 음성으로 나타난 3마리의 침팬지(숫컷 2마리 및 암컷 1마리)를 처리 방법 1을 사용하여 평가했다. 재조합 아데노바이러스를 함유하는 장용 피복 캅셀제를 3일 연속하여 마취하에 위관을 사용하여 제공했다. 두 마리의 침팬지(1 및 2)에게는 env 및 gag 재조합 바이러스를 투여하는 반면, 세 번째 침팬지(3)에게는 env 재조합 바이러스만을 투여했다.

env 또는 gag 유전자 산물을 함유하는 아데노바이러스-유래된 서브유니트 제제를 감염된 A549 세포 배양물로부터 정제하였다[참조: Vernon, S., J. Gen. Virology 72:1243 (1991) 및 Natuk, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7777 (1992)]. 재조합 항원을 명반 보조제와 함께 제형화하여 200㎍/투여량의 env 입자 및 500㎍/투여량의 gag 입자를 근육내 투여했다.

실험 도중 상이한 시점에서 전혈, 혈청 및 대변 샘플을 수집했다. 전혈은 가공 처리하여 정제된 HIV 재조합 gp160, gp120 및 p24에 대한 림프세포 증식 분석 및 FACS, HIV CTL(재조합 백시니아 바이러스 발현 HIV-env, HIV-gag 또는 lac 유전자 산물 사용)를 위한 백혈구 세포 집단을 수득했다. 혈청 및 대변 표본을 사용전 까지는 -70℃에서 보관했다.

대변 표본중 재조합 아데노바이러스의 검출

침팬지 대변 표본을 해동시키고 DMEM-함유 항생제로 10%(v/v) 현탁액을 제조했다. 청징화된 현탁액을 사용하여 60mm 조직 배양 접시내의 융합성 A549 세포 단층을 감염시켰다. 1시간 동안의 흡착 기간후, 비결합된 물질을 세척하고, 단층위에 0.5% 한천 배지가 상위하도록 피복시켰다. 플라크를 7 내지 10일 동안 발생시키고 플라크를 중성 레드 염색으로 가시화하여 계량하고 한천 피복층을 조심스립게 제거하여 세포 단층이 파괴되지 않도록 했다. 세포 시트를 니트로셀룰로즈 필터 막(Millipore Type HA, 0.45㎛)으로 옮기고 20X SSC에 예비 침지시킨 후, 세포층상에 방치시켜 2 내지 4분 동안 세포 단층과 접촉하도록 했다. 필터를 박리시키고, 공기 건조시킨 후 진공 오븐내에서 80℃하에 2시간 동안 베이킹(baking)했다. 니트로셀룰로즈 필터를 실온에서 3X SSc/O.1% SDS로 2회 세척하고, 예비하이브리드화시킨 후 표준 방법에 따라 하이브리드화 시켰다[참조: Poncet, D., J. Virol. Methods 26:27 (1989)].³²P-표지된 올리고-탐침을 하이브리드화 완충액(1 x 10⁶CPM)에 가하고 42℃에서 밤새 배양했다. Ad4 섬유(fiber), Ad5 섬유, Ad7 섬유, HIV-env 또는 HIV-gag 특이 서열을 검출할 수 있는 DNA 탐침을 제조했다[참조: Wain-Hobson, Cell 40:9 (1985)]. 필터를 세척하고, 자동 방사선 사진을 촬영하여 하이트리드화 시그날을 계수했다.

아데노바이러스 중화 시험 방법

가열 처리하여 불활성화된(56℃에서 30분) 개 혈청의 일련의 2배 희석액(1:4로 시작)을 96-웰 미세역가 플레이트(0.O5ml/웰)에 제조하고, 1시간 동안 37℃에서 30-100TCID₅₀바이러스 함유 배지 0.O5ml와 혼합했다. 각 웰에 2 x 10⁴A549 세포를 함유하는 배지 0.05ml를 가하고, 당해 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 7 내지 10일 동안 배양했다. 모든 샘플을 중복하여 수행했다. 시험 혈청에서 종말점을 측정하기 위해, 바이러스 및 비감염된 세포 대조군을 각 분석에 포함시켰다. 역가는 50%의 세포병리 효과가 관찰되는 최저 희석치의 역수로서 표시했다.

ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 의한 항-HIV 항체 검출

HIV-1 항원에 대한 항-HIV 항체 침팬지 항체 반응성 검출을, 제조자(DuPont, Wilmington, DE)의 지시대로 시판되는 ELISA 및 웨스턴 블롯 키트에 의해 각종 희석액을 시험하여 측정했다.

결과

바이러스 접종 전후에 각각의 침팬지로부터 배설물을 수집하여 -70℃에서 보관했다. 10%의 현탁액을 각 샘플로부터 제조하여, 융합 A549 세포 단층을 감염시키는데 사용했다. 7 내지 10일 후, 바이러스성 플라크를 중성 레드 염색으로 식별하고, 세포 단층을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겼다. 대표적 샘플을 각종 표지된 올리고-탐침으로 하이브리드화시켜 Ad4, Ad5, Ad7, HIV-env 또는 HIV-gag 유전자에 대한 특이적 서열을 검출했다. 특이적 재조합 Ad-HIV 바이러스를 이러한 플라크 하이브리드화 기술로 식별할 수 있었다. 재조합 바이러스중 어느 것도 7일 이상 동안 배설물에 방출되지 않았다. 최고의 역가는 항상 1 내지 3일의 샘플과 연관되어 나타나고, 대부분은 비흡착된 바이러스 접종물을 나타내는 것 같았다. Ad-HBsAg 재조합체를 사용하는 이전의 침팬지 연구에 의하면 Ad-HBsAg 재조합체는 30 내지 40일 동안 검출될 수 있는 것으로 나타났다. 장용 캅셀 투여 경로를 사용하는 경우, 이들 재조합 바이러스는 생체내에서 잘 복제되지 않는 것으로 나타났다.

사용된 아데노바이러스 벡터의 혈청형으로의 혈청전환을 중화 시험 방법으로 측정했다. 각각의 침팬지에 사용된 3가지 혈청형 모두에 대해 매우 낮거나 적절한 항-아데노바이러스 혈청 역가가 측정되었다.

재조합 HIV 유전자 산물로의 혈청전환을 ELISA 또는 웨스턴 블롯팅 기술로측정했다. Ad5-env 재조합체에 의한 제2 부스터 접종 전에는 침팬지 어느 것에서도 ELISA 반응이 검출되지 않았다. Ad5-env 접종 2주후, 항-env 반응이 세 마리중 두 마리의 동물에서 측정될 수 있었다. gag 및/또는 env 제제의 근육내 주입은 3마리중 1마리의 동물에서 약한 부스팅 효과를 나타내었다. 웨스턴 블롯 분석이 ELISA 보다 훨씬 더 민감한 것으로 보이며, 또한 면역원성인 것으로 인정되는 env 및/또는 gag 유전자 산물을 식별하는 추가적 장점을 가졌다. 저혈청 항체 역가를 1차 Ad7 재조합체 및 Ad4 재조합 바이러스에 의한 제1 부스터 후 측정했다. env 유전자 산물에 대한 혈청 역가가 Ad5-env 재조합체에 의한 제2 부스터 면역후 상당히 증가하는 것으로 관찰되었다. gag 유전자 산물을 투여한 2마리의 동물의 경우 서브유니트 제제를 주사한 후 상당히 증가하는 것으로 나타났다. HIV 항원에 대한 웨스턴 블롯 역가가 비교적 양호함에도 불구하고, 3마리 동물중 1마리만이 혈청 중화 항체에 반응했다. 2번 침팬지에서의 이 반응은 매우 낮았다(10 내지 20의 역가).

그 결과는 하기 표에 요약되어 있다.

처리 방법 1을 사용하여 수득한 결과

* N/A = 적용 불가능

세포-매개된 면역성을 침팬지로부터 수득한 말초 혈액 단핵 세포 집단에서 측정했다. HIV 특이성 CTL 활성을, HIV-env 유전자 산물, HIV-gag 유전자 산물 또는 lac 유전자 산물(비특이성 세포독성에 대한 대조군)을 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염시킨 공통 유전형 표적 세포의 용해를 조사하여 측정했다. HIV 특이성 CTL-유형의 활성 징후를 이러한 방법으로 측정했다.

림프세포 증식 분석을 수행하여, 정제된 재조합 env(gp160, gp120) 또는 gag(p24) 제제가 배자 발생을 자극할 수 있는지를 측정했다. 제1 접종후 증식이 전혀 관찰되지 않았으며, Ad4 재조합 바이러스에 의한 제1 부스터 투여후 3마리의 동물중 1마리만이 림프세포 증식 반응을 나타냈다. 3마리 동물 모두 제2 부스터 (Ad5-env) 및 제3 부스트(서브유니트 제제)후 증식 반응을 나타냈다.

면역원성 측정: 처리 방법 2

침팬지 접종 및 데이타 수집

장용 피복 캅셀제내 Ad-HIV 재조합 바이러스로 미리 접종시키고 아데노바이러스 유래된 gag 및/또는 env 서브유니트(처리 방법 1)로 부스팅한 3마리 침팬지(숫컷 2마리 및 암컷 1마리)를 Ad7-HIV 바이러스(46주)로, 이어서 12주후(58주)에 Ad4-HIV 바이러스로 비강내 감염시켰다. 인산염 염수 완충액으로 희석시킨 조직 배양 배지중 재조합 아데노바이러스를 마취하에 침팬지의 비공내로 적가했다. 2마리 침팬지(1번 및 2번)에는 env 및 gag 재조합 바이러스 모두를 투여했고, 세 번째 침팬지(3번)에는 env 재조합 바이러스만을 투여했다.

전철, 혈청 및 대변 샘플을 실험 도중 상이한 시점에서 수집하고, 방법 1에서 기술한 바와 같이 처리했다. 대변 샘플 또는 코를 훔쳐낸 면봉에서의 아데노바이러스 검출, 아데노바이러스 중화 시험 방법 및 항-HIV 항체 검출을 방법 1에 기술된 방법에 따라 수행했다.

결과

Ad7 재조합체를 갖는 1차 비강내 부스터를 1 x 10⁸pfu's/침팬지의 1회 복용 량으로 투여했다. 바이러스 투여시, 3번, 1번 및 2번 침팬지는 선행 경구 면역으로부터 각각 4, 8 및 64 미만의 혈청 항-Ad7 중화 역가를 가졌다. 코를 훔쳐낸 면봉과 대변 샘플을 플라크 하이브리드화 기술로 배출된 재조합 바이러스의 존재에 대해 실험했다. 재조합 Ad7-env가 2마리의 동물에서 7일간까지 코를 훔쳐낸 면봉에서검출되었다. 재조합 Ad7-env 및 Ad7-gag가 5일 내지 12일간의 대변 샘플 중에 존재하는 것으로 밝혀졌다. Ad7에 대한 혈청 역가와 코를 훔쳐낸 면봉과 대변 샘플내에서의 재조합 바이러스를 검출할 수 있는 능력간에는 상관관계가 있었다. 한계의 항-HIV 항체 반응을 보인 2마리의 동물은 비강내 부스터에 의해 대단히 증대되었다. 제3의 동물은 보다 약한 정도로 부스팅되었다. HIV에 대한 낮은 역가를 갖는 중화 항체가 3마리의 동물 모두에서 검출되었다. 분비성 항체가 항-gag 및/또는 env 결합 항체를 함유하는 코를 훔쳐낸 면봉 시료에서 검출되었다. Ad7 재조합 바이러스의 비강내 투여 결과, 호흡 질환에 대한 증상 또는 증후가 이들 동물에서 전혀 관찰되지 않았다.

3달후, 이들 침팬지를 1 x 10⁸pfu's/침팬지/바이러스의 단독 투여량으로 Ad4 재조합체로 면역화시켰다. 이들 동물은 비강내 챌린지 시점에 선행 경구 면역화로부터 128 내지 256의 혈청 항-Ad4 중화 역가를 가졌다. 감염후 3일째에 동물중 2마리(2번 및 3번)가 약한 기침을 했다. 제3의 동물(1번)은 세균성 폐렴[스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)가 분리되었다]으로 5일째 죽었다. 다른 2마리의 동물은 청진시 거친 소리를 내며, 에스. 뉴모니애가 두 침팬지로부터 분리되었다. 항생제 처리를 개시하고 두 침팬지를 회복시켰다.

이러한 상황에 대한 역조사로 몇몇 관찰이 이루어질 수 있었다. 비강내 투여시, 1번 침팬지는 이미 열이나고 전체 혈구수가 비정상적이었다. 다형핵 세포수가 불균형적으로 존재하였고, 함께 취한 밴드 세포(미성숙한 다형핵 세포)의 수준은5%로서, 이는 바이러스 접종전에 상당한 세균 감염이 발생하였음을 나타낸다. 폐, 간, 지라 및 혈청으로부터 취한 부검 시료를, 감염성 A549 세포 단층상의 3 블라인드 계대배양을 사용하는 조직 배양으로, 감염성 아데노바이러스의 존재에 대해 시험 한 결과 음성으로 나타났다. 플라크 하이브리드화 기술에 의해 유사한 발견이 이루어졌다. 폐 및 간 파라핀 삽입된 샘플을, 아데노바이러스 항원에 대한 시판되는 면역 형광 키트를 사용하여 아데노바이러스 항원의 존재에 대해 시험한 결과 음성으로 나타났다. 봉입체가 H & E 염색된 폐 단편에서 관찰되었다. 이들 봉입체가 아데노바이러스에 의한 것인지의 여부에 대해서는 전문가들간에 의견이 일치되지 않았다. 몇주후 또다른 침팬지가 동일한 영장류 센터에서 유사한 운명에 처해서 죽었다. 재조합 아데노바이러스의 투여가 1번 침팬지의 죽음에 관여했다면, 단지 미미한 역할을 했음직하나, 침팬지에게 아데노바이러스 재조합체를 추가로 비강내 투여하기 전 및 후에 예방학적으로 항생제를 투여하는 것이 신중하게 고려되었다.

하기 표는 처리 방법 1 및 처리 방법 2에서의 Ad7-재조합체를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다.

처리 방법 1 및 2를 이용해서 수득한 결과

*N/A= 적용 불가능

면역원성의 측정: 처리 방법 3

침팬지 접종 및 데이타 수집

사람 아데노바이러스 제4형, 제5형 및 제7형에 대한 중화 항체의 존재에 대해 음성으로 스크리닝된 3마리의 침팬지(2마리의 숫컷과 1마리의 암컷)를 처리 방법 3으로 평가했다. 2마리의 침팬지(4번 및 5번)에는 env와 gag 재조합 바이러스 모두를 투여하고 제3의 침팬지(6번)에는 단지 env 재조합 바이러스만을 투여했다. 침팬지에 항생제를 예방학적으로 투여한 결과 호흡 장애가 관찰되지 않았다.

전혈, 혈청, 및 대변 샘플을 실험 도중 다른 시점에 수집하고 방법 1에 기술한 바와 같이 처리했다. 방법 1에 기술된 과정에 따라 대변 샘플 또는 코를 훔쳐낸 면봉에서의 아데노바이러스 검출, 아데노바이러스 중화 분석 및 항-HIV 항체 검출을 수행했다.

CD4 결합 부위에 대한 Gp120 결합의 억제 검출

이 분석은 HIV gp120 항원과 천연 리간드 CD4와의 상호작용을 차단시킬 수 있는 침팬지 항-env 항체의 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 침팬지 혈청의 다양한 희석액을, 정제된 재조합 gp120(1μg/ml)과 1시간 동안 37℃에서 배양했다. HeLa CD4 양성 세포(5 x 10⁵)를 이 혼합물에 가하고 1시간 동안 4℃에서 배양했다. 이 세포를 PBS-5% BSA로 3회 세척하고, CD4 항원(gp120이 결합하는 동일 부위)에 대한 FITC-표지된 모노클로날 항체와 혼합하고, 1시간 동안 4℃에서 배양했다. 세포를 PBS-5% BAS로 3회 세척하고 유동 혈구계로 분석했다.

결과

Ad7-재조합체를 사용한 1차 면역화

재조합 바이러스가 감염후 22 내지 34일 동안 대변에 방출되었다. 재조합 바이러스는 감염후 2주째에 취한 코 분비물에서는 검출되지 않았다. 사용된 아데노바이러스 벡터의 혈청형으로의 혈청전환을 중화 분석으로 측정했다. 침팬지 각각에 사용된 Ad7 혈청형에 대한 우수한 항-아데노바이러스 혈청 역가가 3마리의 침팬지 모두에서 측정되었다. 재조합 HIV 유전자 산물로의 혈청전환을 웨스턴 블롯으로 측정했다. Ad7-재조합체로 1차 면역시킨지 4주후, 항-env 및 항-gag 반응이 3마리의 침팬지중 2마리에서 측정되었다. 감염후 20주경에, 3마리의 동물 모두가 HIV 항원에 대한 측정가능한 항체를 지녔다. 1차 면역후 처음 4주내에 취한 코를 훔쳐낸 면봉에서는 분비성 항체가 발견되지 않았다. 3마리의 침팬지 모두에서는 검출 가능한 항-HIV 중화 항체 반응이 나타나지 않았다.

Ad-4 재조합체를 사용한 1차 부스터 면역화

재조합 Ad4 바이러스는 감염후 14 내지 28일 동안 대변에 방출되었다. 코를 훔쳐낸 면봉을 실험한 결과, Ad4 바이러스가 감염후 최소한 7일 동안 3마리의 침팬지 모두에서 검출될 수 있는 것으로 나타났다. 비강내 투여후 Ad4 혈청형에 대한 항-Ad4 반응이 상당히 증가되었다. Ad-7 재조합 바이러스에 대해 측정된 것보다 다소 낮은 양이었다. 3마리 동물 모두에서 gag 및/또는 env 항원에 대해 우수한 부스터 반응이 측정되었다. 낮은 역가(1:2)의 항-gag 및/또는 항-env 반응이 4번 및 5번 침팬지로부터의 코를 훔쳐낸 면봉에서 측정되었다. 항-HIV 중화 항체는 어떠한 동물에서도 여전히 측정되지 않았다.

Ad5-재조합체를 사용한 2차 부스터 면역화

재조합체 Ad5 바이러스는 감염후 8일 동안 대변에 방출되었다. 재조합 바이러스는 감염후 0, 1또는 2주째에 코를 훔쳐낸 면봉에서 검출되지 않았다. env 및 gag에 대한 항-HIV IgG 및 IgA 항체 반응이 Ad5-재조합체 부스터 면역화후 3마리의 침팬지중 2마리로부터 취한 코를 훔쳐낸 면봉에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정되었다. IgG 및 IgA 항-env 및/또는 항-gag 항체가 3마리의 침팬지중 2마리로부터 취한 타액 샘플 중에서 검출되었다. IgG 부류의 항-env 및 항-gag 항체가 한 마리의 암컷 침팬지로부터 취한 질을 닦아낸 면봉에서 검출되었다.

1gA 부류의 항-HIV 항체를 다량 함유하는 수개의 샘플을 분비 성분의 존재에 대해 조사했다. 이는 HIV 웨스턴 블롯 분석에서 폴리클로날 항-IgA(사람) 대신 폴 리클로날 항-분비 성분(사람)을 사용함으로써 달성되었다. 분비 성분을 함유하는 분비성 항-HIV IgA가 3마리의 침팬지중 1마리에서 코를 훔쳐낸 면봉과 타액 샘플 모두에서 검출되었다.

env 서브유니트를 사용한 3차 부스터 면역화

살아있는 재조합 아데노바이러스로 프라이밍시킨 침팬지에 대해 서브유니트를 투여한 후 가장 강력한 항-env 항체 반응이 측정되었다. 항-env 항체 반응이 비강-구강, 질, 및 직장으로부터 수집한 다양한 분비 샘플 및 혈청 모두에서 검출되었다. 피크 항체 역가가 env 서브유니트로 투여한지 4주후에 검출되었다.

320 내지 640의 혈청 항-HIV 중화 항체 역가가 3마리 침팬지 모두에서 관찰되었다. gp120 V3 루프에 대해 유도된 항체를 ELISA로 검출하고, gp120 CD4 결합 부위에 대해 유도된 항체를 FACS 차단 분석으로 검출했다. 3마리 침팬지 모두가 V3 루프(HIV에 대한 주요 중화 결정인자를 포함하는 영역)에 대한 높은 ELISA역가(1000 내지 9000)를 나타냈다.

중화 반응이 높을 때 수집된 침팬지 혈청을 항-CD4 결합 부위 항체의 존재에 대해 평가했다. 3마리의 동물 모두가 gp120과 CD4 간의 상호작용을 차단할 수 있는 후천성 항체를 지녔다. CD4 결합 부위는 구조적 에피토프이며, 이 부위에 대해 유도된 항체가 무세포 HIV를 취하는 것을 차단시키는데 중요하고, gp120-CD4 합포체 유도를 억제시킬 수 있는 것으로 믿어진다. 이 결과가 제1도에 나타나있다.

면역글로불린 IgG 및 IgA 부류의 코를 훔쳐낸 면봉의 항-env 항체 역가는, env 서브유니트로 부스터 면역화시킨 후 각각 3마리중 3마리 및 3마리중 2마리에서 부스팅되었다. 이들 침팬지로부터 취한 타액 샘플에서 유사한 결과가 관찰되었다. 3마리의 침팬지중 2마리는 직장을 닦아낸 면봉에 존재하는 IgG 항-env 항체를 가졌으며 한 마리의 암컷 침팬지는 질을 닦아낸 면봉에서 측정된 강력한 IgG 항-env 부스터 반응을 가졌다. 특정한 점막 표면이 HIV 감염에 대한 주요 부위를 나타내므로, 점막 분비물중 항-HIV 항체의 존재가 중요하다.

요약 표: 하기 표는 처리 방법 3을 이용해서 수득한 결과를 나타낸다.

* N/A = 적용 불가능

하기 표는 Ad5-HIV 재조합체로 비강내 부스터 면역화한 후 및 근육내 서브유니트 부스팅한 후(부스팅 후 23주) 침팬지 분비물에서 검출된 항-HIV 반응을 요약한 것이다.

분비물 중에서 검출되는 항-HIV 반응

* -는 비강 및 질을 닦아낸 면봉의 경우 90 미만이고, 타액 샘플의 경우 20 미만에 해당한다.

+ N/A = 적용 불가능.

** Ad5 부스팅 후. Ad5 부스팅 후 23주째에 서브유니트 부스트를 투여했다.

면역원성의 측정: 처리 방법 4

개 접종 및 데이타 수집

재조합 아데노바이러스를 처리 방법 4에 대한 상기 표에 따라 투여했다. 혈청을 실험 도중 다른 시점에 수집하여 방법 1에 기술한 바와 같이 처리했다. 아데노바이러스 중화 시험을 방법 1에 기술된 방법에 따라 수행했다. 비오티닐화 염소 항-사람 IgG_(H+L)을 비오티놀릴화 염소 항-개 IgG_(H+L)로 대체하는 점을 제외하고는 방법 1에서 기술한 방법에 따라 항-HIV 항체의 검출을 수행했다.

혈청 샘플을 1차 면역 및 부스터 면역 후 일정 간격으로 면역화된 개로부터 취했다. 사용된 아데노바이러스 벡터의 혈청형으로의 혈청전환을 중화시험 방법으로 측정했다. 개는 전부 Ad7 벡터에 대한 강한 항-아데노바이러스 역가로 반응했다. 보다 약한 항-Ad5 반응이 Ad5 1차 또는 부스터 접종후에 나타났다. env 항원으로의 혈청전환을 웨스턴 블롯 및 HIV 중화 분석에 의해 측정했다. 일부의 개는 재조합 Ad-env(LAV 또는 MN)를 사용한 1차 면역화 후 낮은 역가의 항-env 항체를 생성할 수 있었다. env 항원에 대한 상당한 부스터 반응이, 동일 유형의 env 항원을 발현하는 또다른 재조합 Ad-env(LAV 또는 MN)를 사용한 이종 부스팅 후에 거의 모든 개에서 관찰되었다.

Ad7-env_MN으로 프라이밍되고 Ad5-env_MN으로 부스팅된 개는 부스팅후 4주째에 평균 180이상(범위 45 내지 270이상)의 항-Ad7-HIV_MN혈청 역가를 가졌다. Ad5-env_MN및 Ad4-env_MN조합물을 투여받은 개는 동시에 평균 170 이상 (범위 45 내지 270이상)의 항-HIV_MN혈청 역가를 가졌다. 이들 개중 HIV_LAV주에 대한 교차 보호성 항체는 없었다. Ad7-env 및 Ad5-env 조합물을 투여받은 개는 부스팅 후 4주째에 평균 55 (범위 20 내지 85)의 항-HIV_LAV혈청 역가를 가졌지만 항-HIV_MN역가는 갖지 않았다. MN 및 LAV 재조합 바이러스를 둘다 함유하고 있는 "재조합 칵테일(cocktail)"을 투여받은 개 세마리중 한마리 이상에서 항-HIV_MN혈청 역가가 90이었고 항-HIV_LAV역가가 50이었다. 다른 두마리의 개는 항-HIV_LAV역가가 45 및 15이었다.

이런 결과는 재조합 Ad-HIV_MN바이러스가 모두 HIV의 MN 주에 대한 중화 항체를 유도함을 입증한다. 낮은 중화 역가가 Ad-env_MN재조합체에 의한 1차 면역 후 그룹 1의 6마리중 2마리의 개 및 그룹 4의 6마리중 1마리의 개에서 나타났다. 이형 재조합 바이러스의 부스터 면역후 이들 두 그룹의 개 모두에서 낮은 중화 역가로부터 높은 중화 역가까지 측정되었다. 생성된 중화 역가는 유형-특이적이며 HIV의 LAV 주와 교차반응하지 않았다. LAV 재조합 Ad-env 바이러스로 처리된 다른 개들과 직접 비교해보면, Ad-env_MN재조합 바이러스가 개의 표준 약리학적 시험에서 보다높은 유형-특이적 중화 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 결과적으로, MN 및 LAV 재조합체 모두를 함유하는 "재조합 칵테일"을 사용하는 경우 HIV 두개의 주 모두에 대해 모두 중화 항체를 유도할 수 있는 것으로 보인다.

면역원성 측정: 처리 방법 5

개에게 HIV 서브유니트 투여

Ad-env 재조합체로 사전에 2회 면역화시킨 30마리의 실험용 개 및 Ad-env 재조합체에 전혀 노출된 적이 없는 10마리의 대조용 개에게, 상기 처리 방법 5에 기술된 바에 따른 5개의 상이한 HIV-env 서브유니트 제제중 하나를 주사했다. 모든 면역 물질을 피하로 투여했다. 혈청을 실험 도중 다른 시점에 수집하고, 방법 1에 기술된 바와 같이 처리했다. 방법 1에 기술되어 있는 방법에 따라 아데노바이러스 중화 시험을 수행했다.

결과

수득된 결과를 아래 기술하였고 요약하여 하기 표에 나타내었다.

1차 서브유니트 투여

Ad-env "프라이밍된" 개에 투여된 서브유니트 백신은 전부 항-HIV_MN중화 항체 반응을 부스팅했다. 두가지 서브유니트 제제, A 및 C 모두를 HIV_SF2에 대한 교차 중화 반응 유도 능력에 대해 시험했다. 이종 부스팅(즉, Ad-env_MN프라이밍 및 gp-120_SF2부스팅) 및 동종 부스팅(Ad-env_MN프라이밍 및 gp-160_MN부스팅)은 모두 항-HIV_SF2중화 항체 반응을 자극했다. 그룹 B 및 C로부터의 대조군 개는 HIV-env에 대한 항-env 결합 항체를 생성했다. 중화 항체 반응은 1차 서브유니트 투여 후 대조군 개에서는 관찰되지 않았다.

2차 서브유니트 투여

2차 서브유니트 투여는 1차 서브유니트 투여에 비해 부스팅제로서 효과적인 것으로 보이지 않았다. 그룹 B의 개가, 2차 부스터 면역 후, 5개 그룹중에서 가장 큰 혈청 중화 항체 반응을 나타냈다(3 내지 4배 증가), 그룹 A 및 C에서는 2차 서브유니트 투여 후 2배의 증가를 보인 반면, HA-env 항원은 그룹 D 또는 E의 기하평균 중화 역가를 크게 변화시키지 못했다. 5개 그룹으로부터의 대조군은 항-env 결합 항체를 생성했다. 작용성 중화 항-HIV 항체는 그룹 B, C 및 D 대조군에서만 관찰되었다. 그룹 A 및 E 대조군은, 2차 서브유니트 투여 후, 여전히 중화 항체 반응을 생성하지 못했다.

요약하면, 이들 결과는 강력한 중화 항체 반응이 사전에 Ad-HIV 재조합체에 의해 "프라이밍"된 그룹 전부에서 유도됨을 입증한다. 프라이밍 후, 높은 중화 항체 역가가 이종(gp120_SF2) 및 동종(gp120_MN) 부스팅된 그룹에서 관찰되었다. 프라이밍된 개에서, 중화 항체는 HIV의 MN 및 SF2 주 모두에 대해 생성되었다. 중화 항체 역가가 2차 부스팅 전 12주때에도 관찰되었다. 2차 부스팅 후, gp120-부스팅된 그룹(그룹 A 및 B) 모두에서 중화 항체의 상당한 증가가 관찰되었다.

요약 표

하기 표는 처리 방법 5를 사용하여 수득되는 결과를 나타낸다.

Ad-HIV 프라이밍된 개에서의 HIV 서브유니트 면역

+ 각 그룹은 사전에 Ad-Env_MN으로 2회 면역화시킨 6마리의 개와 면역화되지 않은 2마리의 대조군 개로 구성되었다.

* HIV_MN에 대한 기하평균 중화 역가 역수. 2주째에, 그룹 A 및 C의 사전 면역된 개에서 각각 HIV_SF2에 대한 기하평균 중화 역가의 역수가 98 및 42로 관찰되었다.

면역원성 측정: 처리 방법 6

침팬지 접종 및 데이타 수집

6마리의 암컷 침팬지를 사람 아데노바이러스 제4형, 제5형 및 제7형에 대한 혈청학적 측면을 기초로 하여 선택하고, 처리 방법 6에 대한 상기 표에 따라 처리했다. 투여하기로 정해진 각종 Ad-env 백신 조합물에 대한 가능한 혈청 중화 역가중 가장 낮은 값을 갖기 위한 "최선의 적합도(best fit)"를 기초로 하여 선택이 이루어졌다. 혈청음성이거나 약한 혈청양성인 4마리의 침팬지에게 재조합 Ad-env를, 1, 2 또는 3회 연속으로 비강내 투여하여 면역화시켰다(12주 간격)(7, 8, 9 및 11번 침팬지). 강한 혈청양성인 1마리의 침팬지(전부 3마리 Ad 혈청형에 대한 역가 128; 침팬지 10)에 1차 면역화를 위해 3개의 조합체 모두의 혼합물(각 1 x 1O⁷pfu 투여량)을 투여하고, 동일 혼합물로 12주후 부스팅했다. Ad-env 면역된 침팬지 모두를, MF59 보조제중에 제형화된 gp120_SF2HIV-env 서브유니트 50㎍으로 근육내 면역 부스팅시켰다[MF59 보조제는 Vaccin 11:909 (1993) 참조]. 1마리의 대조군 침팬지(12번)에는 야생형 사람 아데노바이러스를 3회 연속 비강내 투여하여(12주 간격), 면역화시키고 48주째에 MF59 보조제를 단독으로 근육내 투여하여 면역화시켰다. 모든 침팬지에 예방학적으로 항생물질을 투여하였고, 호흡 장애는 관찰되지 않았다.

전혈, 혈청 및 대변 샘플을 실험 도중 다른 시점에 수집하고, 방법 1에 기술한 바와 같이 처리했다. 대변, 비강 또는 인후 면봉의 샘플에서의 아데노바이러스 검출을 플라크 하이브리드화 분석(방법 1에 기술) 또는 PCR 기술(하기 참조)에 의해 수행했다. 아데노바이러스 중화 분석 및 항-HIV 항체 검출을 방법 1에 기술되어 있는 방법에 따라 수행했다. 중국 햄스터 난소 세포(CHO)-유래된 gp120 또는 시판중인 HIV V3_MN펩타이드(American Biotechnologies, Cambridge, MA)를 항체 결합 분석에서 대용 항원 시약으로 사용했다.

침팬지 대변 샘플에서의 재조합 Ad-env의 PCR 검출을 공급자의 지침에 따라 시판되는 PCR 키트(Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT)를 사용하여 수행했다. 다시 말하면, 대변 샘플 약 250㎕를 5분 동안 95℃로 가열하고 미세원심분리기 속에서 최대 속도로 2내지 3분 동안 원심분리했다. 상층액을 저장했다. PCR 반응당 샘플 1 내지 10㎕가 사용되었다. 마스터 혼합물의 여러 튜브를 PCR 키트로부터 제조한 다음 -20℃에서 동결보관했다. 10개의 반응 튜브를 위해, 멸균수(615㎕), 10X 완충액(100㎕), dATP(20㎕), dCTP(20㎕), dCTP(20㎕) 및 dTTP(2O㎕)를 혼합하여 마스터 혼합물을 제조했다. 각각의 반응에 마스터 혼합물 79.5㎕를 사용했다. 1차 PCR을 수행하는 날에 마스터 혼합물(10rx)의 튜브를 해동시켰다. 마스터 혼합물에 각각의 올리고머 10㎕, 천연 Taq DNA 중합효소 54㎕ 및 물 50㎕를 가했다. 용액을 혼합한 다음 약 90㎕를 각각의 반응 튜브에 분산시켰다. PCR을 0.5ml 용적의 에펜도르프 튜브 내에서 수행했다. 각각의 튜브에 대변 상층액 10㎕를 가했다. 30회의 PCR 증폭을 90℃에서 1시간, 45℃에서 1.5시간 및 72℃에서 2시간 동안 수행했다. DNA 주형으로서 1차 PCR 생성물 분취량 2.5㎕를 사용하고 프라이머로서 상응하는 올리고 쌍을 사용하여, 2차 PCR을 수행했다. 30회 증폭시킨 후, 반응 생성물 10㎕를 1.2% 아가로스 겔상에서 전개시켰다. 800 bp DNA 밴드가 Ad7-env에 대한 양성대조군으로서 관찰되었다. 다음 프라이머 쌍이 네스티드 PCR을 위해 사용되었다.

HIV 특이성 CTL 활성을, HIV-env 유전자 산물, HIV-gag 유전자 산물 또는 lac 유전자 산물(비특이성 세포 독성에 대한 대조용)을 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감연시킨 공통 유전형 표적 세포의 용해를 조사하여 측정했다.

결과

Ad5-재조합체를 사용한 1차 면역:

재조합체 Ab5 바이러스는, Ad5에 대해 혈청음성이거나 약하게 혈청양성인 침팬지로부터 0 내지 7일 동안 수집한 배설물, 인후 및/또는 비강 시료로 방출되었다. 3개 재조합체의 혼합물로 면역화시킨 혈청양성이 강한 침팬지에서 단지 Ad5 재조합체만이 검출되었다. 야생형 아데노바이러스는 Ad5에 대한 혈청양성이 약한 대조군 침팬지에서 56일 동안 방출되었다. 대부분의 침팬지에서 상당한 항-Ad5 반응이 나타났으며, 야생형 Ad5으로 면역화시킨 대조군 동물에서 가장 강한 반응이 나타났다. 단일 Ad5 재조합체로 면역화시킨 4마리의 침팬지중 3마리(7번, 9번 및 11번)는 약한 항-env 항체 반응을 나타냈다. 작용성 혈청 중화 항-HIV 항체는 Ad5에 대해 본래 혈청음성인 5번 침팬지에서만 검출되었다. 분비성 항-IgG 항-env 항체는 11번 침팬지로부터 수집된 질, 비강 및 타액 시료에서 검출되었다. env-특이성 CTL 활성(특이성 용해: ≥ 10%)의 산발적인 검출은 먼저 Ad5-env로 1차 면역화시킨 7, 8, 9 및 10번 침팬지로부터 수득한 시험관내 자극된 말초혈 임파구(PBL) 집단에서 관찰되었다. 11번 침팬지로부터 수득된 PBL에서는 상당한 CTL 반응이 관찰되지 않았다.

Ad7-재조합체를 사용한 2차 면역:

재조합체 Ad7 바이러스는, Ad7-env 단독으로 면역화시킨 3마리의 침팬지(8번, 9번 및 11번)로부터의 배설물, 인후 및/또는 비강 시료에 7 내지 10일 동안 방출되었고, 또한 3개의 재조합체 아데노바이러스 모두에 대한 혈청양성이 강한 침팬지(10번)로부터의 배설물, 인후 및/또는 비강 시료에 7일 동안 방출되었다. 야생형 Ad7은 대조군 침팬지(12번)에서 14일 동안 방출되었다. 모든 Ad7-면역화된 동물에서 상당한 항-Ad7 반응이 관찰되었는데, 야생형 바이러스로 면역화시킨 대조군 침팬지에서 가장 강한 반응이 관찰되었다. 상당한 항-env 반응이, Ad7-env 단독으로 부스팅시킨 3마리의 침팬지중 2마리(9번 및 11번)에서 부스팅된 반면, 비유의적 변화가 혼합된 아데노바이러스 제제를 투여한 동물에서 관찰되었다. 중요하게, 2마리의 침팬지는 둘다 HIV_MN에 대한 작용성 중화 항체를 함유했다. 11번 침팬지는 또한 HIV_SF2에 대한 매우 낮은 교차-음성 중화 항체 반응을 나타냈다. 이러한 침팬지로부터 수집한 비강 및 타액 시료는 항-env IgG 항체에 대해 양성이 되었다. 질의 항-env IgG 항체 반응은 또한 11번 침팬지에서 부스팅되었다. 여전히, 항-env 항체 반응은 다른 침팬지로부터 수집한 어떠한 분비액에서도 관찰되지 않았다. 다시, env-특이성 CTL 반응의 산발적인 검출만이 8번, 9번 및 10번 침팬지로부터 제조된 시험관내 자극된 PBL 집단에서 검출되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 11번 침팬지로부터 수득한 PBL 집단에서는 상당한 CTL 반응이 관찰되지 않았다.

Ad4-env 재조합체를 사용한 3차 면역

재조합체 Ad4-env는, Ad4-env 단독으로 면역화시킨 한 마리의 동물(11번)에서 최대 3일 동안 대변으로 방출되었다. 혼합된 Ad-env 제제로 각각 면역화시킨 후, 항-Ad 혈청양성이 매우 강한 침팬지(10번)에서는 Ad4-env 방출이 관찰되지 않았다. 야생형 Ad4는 12번 침팬지에서 7일 동안 방출되었다. 11번 및 12번의 2마리 침팬지는 우수한 항-Ad4 항체 반응을 나타냈다. 11번 침팬지에서의 2차 부스터 면역은 항-HIV_MN중화 항체 반응을 포함하는 항-env 항체 반응을 상당히 부스팅했다. 비강, 질 및 타액 항-env IgG 항체 반응은 11번 침팬치로부터 수집된 샘플에서 부스팅되었다. 11번 침팬지에서 우수한 체액성 항-env 면역 반응이 생성됨에도 불구하고, 상당한 CTL 반응이 관찰되지 않았다.

1차 서브유니트 부스트

이종성 gp120_SF2서브유니트 항원 제제를, 1차 Ad5-env 면역화시킨지 26주 후에 7번 침팬지에 투여했다. 서브유니트 면역은 항-env 항체 반응을 부스팅시키는데매우 효과적이었다. 역가가 높은 중화 항-HIV_MN반응(> 400)은 낮은 항-HIV_SF2반응(100)과 함께 관찰되었다. 서브유니트 투여는 또한 비강 및 질 분비물에서 강한 항-env IgG 항체 반응을 유도할 뿐만 아니라 직장 분비물에서 약한 항-env 반응을 유도해냈다. (Ad5-env)/(Ad7-env) 조합물을 투여한 2마리의 침팬지중 1마리(9번 침팬지)는 또한 서브유니트 투여 후에 우수한 항-env 부스터 항체 반응을 나타냈다. 당해 동물은 1번 침팬지에서 나타난 것과 유사한 항-HIV_MN및 항-HIV_SF2중화 역가를 가졌다. 약한 항-env IgG 반응은 당해 동물로부터 수집된 비강, 직장, 타액 및 질 분비물에서 관찰되었다. 다른 침팬지(8번)에서는, 서브유니트 투여 후 훨씬 약하지만, 여전히 상당한 항-env 반응이 유도되었는데, 이러한 반응은 HIV에 대한 작용성 중화 항체를 포함하지는 않았다. 이러한 침팬지로부터 수집된 어떠한 분비물에서도 항-env 항체는 검출되지 않았다. (Ad5-env)/(Ad4-env) 조합물을 투여받은 11번 챔핀지는 또한 우수한 항-env 항체 부스터 반응을 나타냈다. 이는 HIV_MN에 대한 매우 높은 중화 역가(> 1400)와 HIV_SF2에 대한 높은 역가(> 400)를 포함했다. 우수한 항-env IgG 항체 반응이 질, 비강 및 타액 시료에서 관찰되었다. 약한 항-env 반응은 인후 분비물에서 관찰되었다. 서브유니트는 10번 침팬지(항-Ad 혈청양성이 강한 동물)의 항-env 항체 반응(혈청 또는 분비성)에 대해 충분한 효과를 갖지 못했다. 산발적인 항-env CTL 활성은 서브유니트 투여후 7번 및 8번 침팬지로부터 수집된 시험관내 자극된 PBL 집단에서만 검출되었다. 시험관내에서 자극된 림프절 세포(서브유니트 접종 부위에 근접한 위치의 림프절 생검으로부터 수득함)를 유사하게 분석하면, 8번 침팬지로부터 수득된 세포(기본적으로 비체액성 반응자)만이 env_SF2및 env_MN모두에서 유도된 상당한 CTL 활성을 가지는 것으로 나타났다.

2차 서브유니트 부스트

단지 7번 침팬지에만 2차 서브유니트를 투여하여 면역화시켰다. 이러한 2차 면역화는 역가가 높은 항-HIV_MN(> 200)과 낮은(< 100) 항-HIV_SF2중화 항체 반응을 포함하는 항-env 항체 반응을 충분히 부스팅시켰다. 우수한 항-env IgG-반응이 질, 비강 및 직장 시료에서 관찰되었다. 산발적인 항-HIV CTL 활성도 또한 PBL 집단에서 나타났다.

면역화시킨 침팬지 및 대조군 침팬지의 HIV_SF2챌린지

무세포 HIV_SF2챌린지를 6마리의 침핀지중 5마리(7번, 8번, 9번, 11번, 12번)에 정맥내 투여했다. 1/40의 챌린지 스톡 희석액이 대조군 침팬지를 3 내지 4주내에 생산적으로 감염시키는 것으로 나타났다. 침팬지들을 10주 동안 HIV 감염의 징후에 대해 관찰했다. HIV는, 챌린지후 4주 및 6주째에 수집된 대조군 12번 침팬지로부터 수득된 PBL로부터 동시-배양될 수 있었다. 챌랜지 후 6주, 8주 및 10주째에 수집된 혈청 샘플에서 항-gag 항체 반응을 쉽게 측정할 수 있었다(재조합체 백신은 gag 결정인자가 부족하기 때문에, HIV 감염의 또다른 징표이다). 다른 침팬지들은 모두 10주째에 HIV 챌린지로부터 보호되었다.

이들 결과는 Ad-env 재조합체(특히 Ad7-env_MN, Ad5-env_MN, Ad4-env_MN또는 이의 조합물)을 비강내 투여하면 HIV-1에 대한 중화 항체의 생성이 유도됨을 입증한다. 중화 항체는 Ad--env 재조합체를 처음 투여한 후 생성되었고, 역가는 Ad-env 재조합체와 함께 1회 이상 부스터를 비강내 투여하여 면역화시킴으로써 증가되었다. HIV의 MN 및 SF2 주 모두에 대한 항체 반응은 env(gp120) 서브유니트 항원 제제(특히 gp 120_SF2)를 1회 이상의 접종으로 투여함으로써 추가로 부스팅되었다. Ad-env/서브유니트 부스터 처리 방법으로 투여함으로써 HIV-1 감염으로부터의 보호가 입증되었다는 것이 가장 중요하다.

제1도는 재조합 Ad-HIV 백신에 의해 개에서 유도된 혈청에 의한 gp120의 CD4로의 결합 억제를 나타낸다.

Claims

비리온 구조 단백질이 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 사람 면역결핍 바이러스 제1형에 대한 항체에 상응하는 항원 또는 사람 면역결핍 바이러스 제1형에 대한 세포 매개성 면역을 유도하는 항원을 암호화하는 사람 면역결핍 바이러스 제1형의 MN 주로부터의 env 유전자를 함유하는, 초기 영역 3의 유전자가 결실된 아데노바이러스 제4형, 아데노바이러스 제5형 및 아데노바이러스 제7형으로 이루어진 그룹중 하나 이상으로부터 선택되는 살아있는 재조합 아데노바이러스를 포함하는, 비강내, 근육내 또는 피하 투여형으로 제형화된, 영장류에서 사람 면역결핍 바이러스 제1형에 대한 항체 또는 세포 매개성 면역을 생성시키기 위한 백신.
제1항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 Ad7-tplenv_MN-tp1Hrev, Ad4-tplenv_MN-tplHrev 및 Ad5-tplenv_MN-tplHrev로 이루어진 그룹중 하나 이상으로부터 선택되는 백신.
제2항에 있어서, 하나 이상의 사람 면역결핍 제1형 env 서브유니트 단백질 또는 gag 서브유니트 단백질을 추가로 포함하는 백신.
제3항에 있어서, 서브유니트 단백질이 살아있는 재조합 아리노바이러스 투여후에 투여되는 백신.
제4항에 있어서, env 서브유니트 단백질이 gp120_MN또는 gp120_SF2인 백신.
비리온 구조 단백질이 재조합 아데노바이러스가 생성되는 천연 아데노바이러스의 비리온 구조 단백질로부터 변형되지 않고, 사람 면역결핍 바이러스 제1형의 env 유전자 또는 gag 유전자를 함유하는, 초기 영역 3의 유전자가 결실된 아데노바이러스 제4형, 아데노바이러스 제5형 및 아데노바이러스 제7형으로 이루어진 그룹중 하나 이상으로부터 선택되는 살아있는 재조합 아데노바이러스를 포함하는 비강내 투여형으로 제형화된 제1 단계 백신; 및 사람 면역결핍 제1형 env 서브유니트 단백질 또는 gag 서브유니트 단백질을 포함하는 근육내 투여형으로 제형화된 제2 단계 백신으로 이루어지며, 이때 제1 단계 백신은 제2 단계 백신 투여에 앞서 투여됨을 특징으로 하는, 사람 면역결핍 제1형 감염으로부터 영장류를 보호하기 위한 2단계 백신.
제6항 있어서, 살아있는 재조합 아데노바이러스가 Ad7-tplenv_MN-tplHrev, Ad4-tplenv_MN-tplHrev, Ad5-tplenv_MN-tplHrev 또는 이들의 조합물인 백신.
제7항에 있어서, 사람 면역결핍 제1형 서브유니트 단백질이 env인 백신.
제8항에 있어서, env 서브유니트 단백질이 gp120_MN또는 gp120_SF2인 백신.
재조합 아데노바이러스 X-tplY-tplHrev(여기서, X는 Ad4, Ad5 또는 Ad7이고, Y는 env이며, env는 HIV-1의 MN 주로부터 유래된다).
제10항에 있어서, Ad7-tplenv_MN-tplHrev인 재조합 아데노바이러스.
제10항에 있어서, Ad4-tplenv_MN-tplHrev인 재조합 아데노바이러스.
제10항에 있어서, Ad5-tplenv_MN-tplHrev인 재조합 아데노바이러스.
Ad7-tplenv_MN-tplHrev, Ad4-tplen_MN-tplHrev, Ad5-tplenv_MN-tplHrev 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 살아있는 재조합 아데노바이러스를 포함하는 비강내 투여형으로 제형화된 제1단계 백신; 및 사람 면역결핍 제1형 env 서브유니트 단백질 또는 gag 서브유니트 단백질을 포함하는 제2단계 백신으로 이루어지며, 이때 제l단계 백신은 제2단계 백신 투여에 앞서 투여됨을 특징으로 하는, 영장류에서 사람 면역결핍 바이러스 제1형에 대한 항체 또는 세포 매개성 면역을 생성시키기 위한 2단계 백신.
제14항에 있어서, 사람 면역결핍 제1형 서브유니트 단백질이 env인 백신.
제15항에 있어서, env 서브유니트 단백질이 gp120_MN또는 gp120_SF2인 백신.
제6항에 있어서, 살아있는 재조합 아데노바이러스가 Ad7-tplenv-tplHrev, Ad7-tplgag-tplHrev, Ad7-rev-gag, Ad4-tplenv-tplHrev, Ad4-tplgag-tplHrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tplenv-tplHrev, Ad5-tplgag-tplHrev, Ad7-tplenv_MN-tplHrev, Ad4-tplenv_MN-tplHrev, Ad5-tplenv_MN-tplHrev, 또는 이들의 조합물인 백신.