KR100341982B1

KR100341982B1 - 프롤릴엔도펩티다제억제제

Info

Publication number: KR100341982B1
Application number: KR1019960702894A
Authority: KR
Inventors: 노턴 피. 피이트; 죠셉 피. 버크하트; 슈야스 메흐디
Original assignee: 메렐 파마슈티칼스 인크.
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 2002-11-30
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: EP0731788A1; NO962238L; HUT74687A; NZ276600A; DE69431359D1; AU684861B2; DK0731788T3; ATE223894T1; PT731788E; CN1136806A; CA2177821A1; DE69431359T2; IL111775A; AU1091795A; TW280818B; HU9601472D0; ES2179093T3; CA2177821C; IL111775A0; JPH09506090A

Abstract

본 발명은 그의 모든 입체 이성질체를 포함하는 하기 일반식 (1)

의 화합물, 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 또한 이들이 프롤릴 엔도펩티다제의 억제제로서 직접 작용하는 바와 같이 약릭학적 활성이 유용하기 때문에, 기억력 증진 방법, 건망증 또는 기억력 손상을 방지하거나 또는 지연시키는 방법을 제공한다.

Description

프롤릴 엔도펩티다제 억제제{Prolyl Endopeptidase Inhibitors}

프롤린에 연결된 펩티드 결합은 특이성이 광범위한 펩티다제에 대해 비교적 내성이 있는 것으로 보이는데[문헌 (Mentlein, 1988)], 이 문헌은 프롤린을 함유하는 펩티드 결합을 가수분해하는 펩티다제가 프롤린 함유 펩티드[문헌 (Atack 등, Eur. J. of Pharm., 205, 157-163 (1991)]의 대사에 중요할 수 있다는 것을 나타낸다. 프롤릴 엔도펩티다제는 생물학적 활성의 프롤린 함유 펩티드의 대사에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 이 효소는 옥시토신, 티로트로핀 방출 호르몬, 황체화 호르몬 방출 호르몬, 안지오텐신 II, 브라디키닌, 물질 P, 뉴로텐신 및 바소프레신과 같은 다수의 생물학적 활성의 프롤린 함유 펩티드를 가수분해한다.

프롤릴 엔도펩티다제는 카르복시 말단 프롤린 분할 효소로서의 활성 펩티드를 분해하는 작용을 한다. 구체적으로, 프롤릴 엔도펩티다제는 프롤린 잔기의 카르복시 측면 상의 펩티드 결합을 가수분해하는 작용을 한다. 프롤릴 엔도펩티다제는 α-키모트립신, 트립신 및 수브틸리신과 같은 기타 세린 프로테아제와 유사한 메카니즘에 의해 세린 프로테아제, 즉 분할 펩티드로서 기계학적으로 작용하는 것으로 생각되어 진다.

비록 이 효소는 펩티드 결합 함유 프롤린 유도체에 보편적으로 사용되지만,효소 형태는 상이한 조직 공급원에서 변화하는 것으로 보이며, 여기서 효소는 상이한 기질 특이성을 나타낸다. 프롤릴 엔도펩티다제는 다수의 식물(당근, 버섯), 미생물(플라보박테륨 메니고세프티큠[Flavobacterium menigosepticum]) 및 동물 조직으로부터 정제하였다. 동물 중에서, 효소는 몸 전체에 걸쳐 편재하는 것이 밝혀졌지만, 프롤릴 엔도펩티다제는 일반적으로 CNS(문헌[Wilk, 1983]) 내에서 가장 높은 농도로 발견된다. 동물 공급원에 대한 기질 시험용 효소의 가장 보편적인 공급원은 소, 쥐 및 마우스 뇌이었다.

프롤릴 엔도펩티다제의 저분자량 억제제가 연구되어 왔다. 이러한 억제제는 일반적으로 프롤린 또는 말단 프롤린 함유 저급 펩티드의 화학 유도체이다. 벤질옥시카르보닐-프롤릴-프롤리날은 효소의 특이적 전이 상태의 억제제인 것이 밝혀졌다(문헌 [Wilk, S. 및 Orloeski, M., J. Neurochem., 41, 69(1983) 및 Freidman 등, Neurochem., 42, 237(1984)] 참조). L-프롤린 또는 L-프롤릴-피롤리딘의 N-말단 치환물(문헌 [Atack 등, Eur. J. of Pharm., 205, 157-163(1991)], 일본 특허 제03 56,460호, 유럽 특허 제384,341호 참조), 뿐만 아니라 카르복시 말단에 프롤리날을 함유하는 N-벤질옥시카르보닐 (Z) 디펩티드의 변형물이 프롤릴 엔도펩티다제 억제제로서 합성되었다(문헌 [Nishikata 등, Chem. Pharm. Bull. 34(7), 2931-2936(1986) 및 Baker, A. 등, Bioorganic & Medicinal Chem. Letts., 1(11), 585-590(1991)] 참조). 티오프롤린, 티아졸리딘 및 옥소피롤리딘 치환물의 코아구조는 프롤릴 엔도펩티다제를 억제하는 것으로 보고되었다(문헌 [Tsuru 등, J. Biochem., 94, 1179(1988)], Tsuru 등, J. Biochem., 104, 580-586(1988), Saito등, J. Enz. Inhib. 5, 51-75(1991)], Uchida, I. 등, PCT 특허 출원 공개 제90 12,005호, 일본국 특허 제03 56,461호, 일본국 특허 제03 56,462호 참조). 유사하게, 각종 불소화된 케톤 유도체를 포함하여 카르복시 말단 프롤린의 각종 변형물이 제조되었다(문헌 [Henning, 유럽 특허 제4,912,127호] 참조). 불소화된 케톤 유도체의 일반적인 합성은 문헌 [Angelastro, M.R. 등, Tetrahedron Letters 33(23), 3265-3268(1992)]에 기재되어 있다. 아실-프롤린 또는 아실-펩티드-프롤린(Z-Gly-Pro-CH₂Cl)의 클로로메틸 케톤 유도체와 같은 다른 화합물은 효소의 활성 부위의 알킬화에 의해 효소를 억제하는 것으로 입증되었다(문헌 [Yoshimoto, T. 등, Biochemistry 16, 2942(1977)] 참조).

발명의 요약

본 발명은 그의 모든 입체 이성질체를 포함하는 하기 일반식 (1)의 화합물의 펩티드 유도체에 관한 것이다.

상기 식 중,

A는 벤질 또는 t-부틸기이고;

X₁은 -S- 또는 CH₂이고;

X₂는 -S- 또는 CH₂이고;

B는 -CF₃또는 -CF₂CF₃이다.

일반식 (I)의 바람직한 유도체는 마커쉬 그룹핑(markush grouping) 내에 포함되는 것이므로, 다른 그룹핑은 선택된 치환체를 함유하는 서브그룹핑을 형성하기 위하여 선택할 수 있다. 일반식 (I)의 바람직한 그룹핑은 또한 본 명세서에 보여준 바와 같이 입증된 실시예의 실시태양을 더 포함하도록 선택할 수 있다.

일반식 (1)의 화합물은 효소 프롤릴 엔도펩티다제의 중요한 억제제이다. 신규 억제제는 카르복시 말단 펜타플루오로에틸 치환체를 함유하는 디프롤릴 펩티드 유도체이다. 디프롤릴 펩티드 유도체에 있어서, 프롤린 잔기는 X₁또는 X₂가 황으로 선택된 바와 같은 티오프롤린 유도체로 임의 치환될 수 있다. 본 발명의 펩티드 동족체는 잠재적으로 프롤릴 엔도펩티다제의 중요한 억제 작용을 함유하므로, 건망증 및 기억력 손상의 치료 뿐만 아니라 기억 기능의 강화에 대해 과학적으로 관심있고 치료적으로 중요한 부가물을 제공할 수 있을 것이다. 더우기, 티아졸리딘 관능성의 존재는 이러한 화합물에 대한 작용의 개선된 효력 및 연장된 지속력을 제공할 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 기억력 복구 또는 증진용 치료 중재물을 위한 모델로서 프롤릴 엔도펩티다제의 단백질 분해 활성의 억제이다. 단백질 분해 활성의 억제는 바람직하지 못하게 높은 효소의 양을 조절하는데 사용될 수 있다. 프롤릴 엔도펩티다제의 억제제는 다수의 군에 의해 쥐 및 마우스 모델에 있어 건망증 방지 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다(문헌 [Yoshimoto 등, J. Pharmacobio-Dyn., 10, 730(1983) 및 Saito 등, J. Enz. Inhib. 3, 163(1990)], Ucida, I. 등, PCT 국제특허 공개 제90 12,005호 참조). 이론에 의해 한정되길 원하는 것은 아니지만, 개선된 기억력과 프롤릴 엔도펩티다제 억제와의 상호관계는 바소프레신을 분해하는 효소의 능력에 기인하는 것으로 믿어진다. 또한, 프롤릴 엔도펩티다제의 억제제는 마우스에 있어서 스코폴아민 유도된 기억력 손상의 효과를 반전시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Atack 등, Eur. J. of Pharm., 205, 157-163(1991)] 참조).

본 발명의 디펩티드의 합성 제조법은 반응 도식 I에 나타나 있으며, 그 다음 페이지에 설명되어 있다.

프롤릴 엔도펩티다제 억제제의 합성

반응 도식 I 중 A 내지 G 부분은 일반식 (1)의 화합물의 합성법을 나타낸다.

카르복시 말단 펜타플루오로에틸 케톤(화합물 (IVa) 및 (IVb)) 또는 메톡시메틸아미노 아미드(화합물 (IIa) 및 (IIb))를 갖는 일반식 (1)의 화합물의 합성을 위한 필수 중간체는 본질적으로 문헌 [Angelastro, M., Tetrahedron Letters, 33(23), 3265-3268(1992) 및 Nahm, S 및 Weinreb, S.M., Tetrahedron Letters, 22, 3815(1981)]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.

반응 도식 I의 단계 A는 일반식 (IIa) 및 (IIb)의 메톡시메틸아미노 아미드의 일반적인 제조 방법을 보여준다. 일반식 (IIa) 및 (IIb)의 화합물은 t-부톡시카르보닐 보호된 프롤릴(2-피롤리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르) 및 티오프롤린(티아졸리딘-3,4-디카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르) 유도체로부터 N,O-디메틸히드록실아민 염산염과의 반응에 의해 제조될 수 있다. 이 반응은 본질적으로 문헌 [Nahm, S 및 Weinreb, S.M., Tetrahedron Letters, 22, 3815(1981)]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. N,O-디메틸히드록실아민 염산염의 커플링 반응은 본질적으로 수용성 카르보디이미드 등과 같은 적합한 커플링제를 사용하여 수행할 수 있고, 생성물은 당업게에 알려진 표준 단리 방법에 의해 정제할 수 있다.

단계 B는 일반식 (IIa)의 티오프롤린의 t-부톡시카르보닐 보호기가 에틸 아세테이트 중 염산 처리에 의한 바와 같은 적합한 산 처리에 의해 제거되어 상응하는 N-메톡시-N-메틸-4-티아졸리딘카르복스아미드, 일염산염(화합물 III)을 제조할 수 있다는 것을 보여준다. 이어서, 최종 생성물은 당업계에 알려진 종래 단리 기술을 사용하여 적당하게 정제할 수 있다.

단계 C를 통하여, 화합물 (II)가 일반식 (IVa) 및 (IVb)의 펜타플루오로에틸케톤으로 전환될 수 있다. 펜타플루오로에틸 요오다이드 및 메틸리튬·리튬 브로마이드 착화합물로부터 동일 반응계 내에서 발생된 펜타플루오로에틸리튬과의 반응은 일반식 (IIa) 또는 (IIb)의 히드록사메이트를 각각 일반식 (IVa) 또는 (IVb)의 화합물로 전환시키는 적합한 수단이다. 이 반응은 본질적으로 문헌 [Angelastro, M. R. 등, Tetrahedron Letters, 33, 3265(1992)]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 최종 생성물은 당업자에게 알려진 종래 단리 방법을 사용하여 적합하게 수행할 수 있다.

단계 D는 일반식 (IVa) 또는 (IVb)의 t-부톡시카르보닐 보호기가 산이 되기 쉽고, 에틸 아세테이트 중 염산 처리에 의한 바와 같은 적합한 산 처리에 의해 제거될 수 있다는 것을 보여준다. 산으로 처리함으로써 일반식 (Va) 또는 (Vb)의 상응하는 화합물(각각, 4-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-티아졸리딘, 일염산염 또는 2-(2,2,3,3, 3-펜타플루오로-1-옥소프로필)피롤리딘, 염산염)이 생성된다. 최종 생성물은 당업자에게 알려진 종래 기술을 사용하여 적합하게 정제할 수 있다.

단계 E는 2개의 적합하게 보호된 아미노산으로부터 각각 2-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-1-피롤리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르(VIIb) 또는 4-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐)-카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르(VIIa) 등 중 어느 하나를 형성하는 축합 반응을 나타낸다. 2개 사이에 아미드 결합을 형성하는 2개의 보호된 아미노산의 축합 반응은 당업계에 잘 알려져 있다. 축합을 위한 몇몇 방법은 도시된 바와 같은 방법을 포함하여, 디메틸포름아미드와 같은 적합한 용매 중에서 화합물 (IV)의 카르복실 말단 산을 염화옥살릴로 전환시키는 것은 알려져 있다. 이어서, 산 클로라이드는 화합물 (Vb)의 알파-아미노기와 축합될 수 있다. 이어서, 최종 생성물은 당업자에게 알려진 종래 기술을 사용하여 정제할 수 있다.

단계 F는 4-[[4-[(메톡시-메틸아미노)카르보닐]-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르와 같은 화합물 (VIII)의 디티아졸리딘 유도체의 제조 방법을 보여준다. 일반식 (Ia)와 같은 화합물을 일반식 (III)의 화합물과 커플링제에 의해 축합 반응시켜 2개의 보호된 아미노산 사이에 아미드 결합을 형성하는 것은 잘 알려져 있다. 수용성 카르보디이미드와 같은 각종카르보디이미드에 의해 수행되는 축합 방법을 포함하여 몇몇 축합 방법이 알려져 있다. 축합 반응 후, 최종 생성물은 당업자에게 알려진 종래 기술을 사용하여 정제할 수 있다.

단계 C에서와 같이, 말단 메톡시 메틸아미노카르보닐을 갖는 디펩티드를 단계 G에 도시된 바와 같이 치환 반응시킨다. 화합물 (VIII)은 동일 반응계 내에서(단계 C 참조) 발생된 퍼플루오로에틸 리튬과 치환 반응을 수행하여 4-[[4-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르를 형성시킬 수 있다. 치환 반응 후, 최종 생성물은 당업자에게 알려진 종래 단리 기술을 사용하여 정제할 수 있다.

천연적으로 생성되는 프롤린 유도체는 키랄 탄소 원자를 함유한다. 구체적으로, 프롤릴 및 티오프롤린 고리의 질소에 대한 알파 탄소가 키랄이다. 그러므로, 프롤린 및 티아조프롤린 유도체는 하나 이상의 가능한 입체 이성질체로 존재할 수 있다. 구체적으로 달리 지정되지 않은 한, 본 명세서에 언급된 광학 활성 아미노산은 L-배열이다. 그러나, 키랄 특성은 D- 또는 L-배열 중 어느 하나를 구체적으로 언급할 수 있다.

케톤 관능성은 케톤으로서 또는 수화된 케톤 또는 이 두가지 상태의 혼합물로서 존재할 수 있다. 예를 들면, 펜타플루오로에틸 케톤기는 2,2,3,3,3-펜타플루오로-1,1-디히드록시프로필 또는 2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필 치환체로서 명명될 수 있다.

폴리펩티드 서열로 도입되는 각 아미노산과 사용되는 α-아미노 보호기는 당업계에 알려진 임의의 보호기일 수 있다. α-아미노 보호기의 군 중 (1) 아실계 보호기, 예를 들면 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔술포닐(토실), 벤젠술포닐, 니트로페닐술페닐, 트리틸술페닐, o-니트로페녹시아세틸 및 α-클로로부티릴; (2) 방향족 우레탄계 보호기, 예를 들면 벤질옥시카르보닐 및 치환 벤질옥시카르보닐, 예를 들면 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐릴)-1-메틸에톡시카르보닐, α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐 및 벤질히드릴옥시카르보닐; (3) 지방족 우레탄 보호기, 예를 들면 3급-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐; (4) 시클로알킬 우레탄계 보호기, 예를 들면 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐; (5) 티오우레탄계 보호기, 예를 들면 페닐티오카르보닐; (6) 알킬계 보호기, 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸) 및 벤질; 및 (7) 트리알킬실란기, 예를 들면 트리메틸실란이 고려된다. 바람직한 α-아미노 보호기는 3급-부틸옥시카르보닐(Boc) 또는 벤질옥시카르보닐이다.

치료제로서의 일반식 (1)의 화합물의 용도 및 이들의 투여 양태를 다음에 설명한다.

치료 용도

기억력 증진제로서의 본 발명의 화합물의 용도는 개선된 정신 용량, 인식 사상을 상기시키는 능력 및 학습 동기 작용을 포함한다. 이와 같이 본 발명의 화합물은 무수정체증, 실행증, 실인증, 또는 퇴행성 및 외상후 건망증을 포함하는 임의의형태의 건망증, 양성 건망증 및 코르자코프(Korsakoff) 증후군[Merk Manual of Diagnosis and Therapy, 제15 증보판(1987)]을 앓고 있는 환자에게 유용할 것이다. 본 발명의 화합물은 잠재적으로 기억력 증진 및 기능을 치료하는데 유용하기 때문에, 이들은 추가적으로 기억력 손상을 방지하거나 또는 지연시키는데 유용할 수 있다.

치료적 투여

본 발명의 펩티드 유도체를 필요로 하는 환자를 치료할 경우 그의 적당한 투여량은 특정 환자 및 선택되는 펩티드 유도체를 포함하는 기타 인자에 따라서 1일 환자 체중 당 0.2 mg/kg 내지 250 mg/kg이다. 특정 환자를 위한 적당한 투여량은 쉽게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 4일 매일 투여량은 전형적으로 투여량 당 5 mg 내지 100 mg의 활성 화합물로 투여될 것이다. 요구되는 본 발명의 펩티드의 양은 당업계의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "환자"라 함은 인간을 포함하는 영장류, 양, 말, 축우, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 마우스와 같은 포유동물을 의미하기 위하여 선택된다.

비록 몇몇 펩티드 유도체는 경구 투여 후 소화관을 통하는 경로에서 잔존하지만, 본 발명자들은 비경구적 투여, 예를 들면 피하내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 또는 복강내 투여; 축적질 주입에 의한 투여; 삽입 제제에 의한 투여 또는 본 발명의 펩티드 유도체를 분사 또는 건조 분말 형태로 함유할 수 있는 에어로졸 상태로 코, 목 및 기관지의 점막과 같은 점막으로의 투여를 선호한다.

비경구 투여를 위하여, 본 발명의 화합물들은 제약 담체를 포함하고, 물 및오일과 같은 무균 액체일 수 있고, 계면 활성제 및 기타 제약상 허용되는 부가물을 포함하거나 포함하지 않고, 약리학상 허용되는 희석액 중의 본 발명의 화합물의 액체 또는 현탁액의 주입가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 이러한 제제에 사용될 수 있는 오일의 예로는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유, 예를 들면, 땅콩유, 대두유 및 광유가 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 에탄올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주입가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다.

약리학상 유용한 약제로서, 일반식 (1)의 화합물은 각종 방법으로, 처리하고자 하는 환자에게 투여되어 목적하는 효과를 달성할 수 있고, 화합물은 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 다음 약어들은 본 발명의 화합물 또는 용도의 실시예를 설명하는데 사용된다.

실시예

본 발명은 다음 실시예의 고려에 의해 더욱 명확해질 것이며, 이 실시예는 본 발명의 용도를 순수하게 예시하기 위함이다. 본 발명의 기타 실시태양은 본 발명의 상세한 설명의 고려 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시를 고려하여 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명을 다음 표 1에 지시된 비제한적인 실시예 및 본 명세서에 더 기재된 바와 같이 다음에 의해 예시한다.

실시예 1

I. 2-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-1-피롤리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIIb)의 합성

IA. (R)-2-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-1-피롤리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 IIb)의 합성

아르곤하에 염화메틸렌 125 ml 중에서 교반시킨 Boc-L-Pro-OH 4.31 g(20.0 mmol)의 용액에 N,O-디메틸히드록실아민 염산염 1.95 g(20.0 mmol) 및 NMM 2.20ml(20.0 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 수용성 카르보디이미드 3.83 g(20.0 mmol)을 용액에 첨가하였다. 반응을 철야 진행시킨 후, 약 20 ml로 농축시켰다. 농축 현탁액을 8 ×14 cm의 실리카겔 컬럼 상에 현탁액을 부하시키고 에틸 아세테이트/헥산(60:40)으로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 표제 생성물을 함유하는 분획(Rf = 0.32)을 한데 합하고 농축시켜 무색 오일 3.21 g을 얻었다. 생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 259.1644[C₁₂H₂₃N₂O₄에 대한 이론치 질량 = 259.1658]이었다.

IB. 2-(2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 IVb)의 합성

아르곤하 -78℃에서 에틸 에테르 35 ml 중에서 교반시킨 2-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-1-피롤리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(실시예 IA의 화합물) 1.03 g(4.00 mmol)의 용액에 퍼플루오로에틸 요오다이드 1.5 ml(12.8 mmol) 및 메틸 리튬·리튬 브로마이드(에틸 에테르 중 1.5M) 7.5 ml(11.25 mmol)를 순서대로 첨가하였다. -78℃에서 30분 후, 용액을 빙수 조 중에서 0℃로 가온시켰다. H₂O 8 ml 중의 KHSO₄1.36 g(10.0 mmol)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 격렬하게 교반시킨 수분 후, 2상 현탁액의 층들 모두가 투명하게 되었고, 혼합물을 H₂O 50 ml를 함유하는 분리 깔때기로 옮겼다. 층들을 분리하고, 유기상은 반 포화된 NaHCO₃50 ml 의 수용액으로 세척한 후, 염수 25 ml로 세척하였다. 유기상은 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후 농축시켜 연황색 오일 1.3 g을 수득하였다.

생성물을 5 × 15 cm의 실리카겔 컬럼 상에서 에틸 아세테이트/헥산(15:85) 및 에틸 아세테이트/헥산(60:40) 1.3 리터로 순서대로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 생성물의 분획을 한데 합하고 농축시켜 무색 액체 0.94 g을 수득하였다. 생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 318.1135[C₁₂H₁₇F₅NO₃에 대한 이론치 질량 = 318.1129]이었다.

IC. 2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)피롤리딘 염산염(반응 도식 I, 화합물 Vb)의 합성

빙수 조에서 0℃로 냉각시킨, 에틸 아세테이트 15 ml 중에서 교반시킨 2-(2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(실시예 1B의 화합물) 121 mg(0.38 mmol)의 용액에 5분 동안 HCl 가스를 버블링시켰다. HCl의 버블링을 멈추고, 반응을 캡핑하고, 2시간 동안 더 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시켜 무색 오일을 얻고, 이를 고진공하 KOH 펠릿 상에서 3시간 동안 건조시켜 고상화된 생성물 103 mg을 수득하였다.

생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 218.0601[C₇H₉F₅NO에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 218.0604]이었다.

ID. 2-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-1-피롤리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIIb)의 합성

아르곤하 염화메틸렌 10 ml 중에서 교반시킨 CBZ-L-Pro-OH 0.62 g(2.49 mmol)의 용액 및 DMF 한 방울에 염화옥살릴 0.26 ml(2.99 mmol)를 첨가한 결과, 가스가 격렬하게 발생하였다. 가스 방출이 멈춘 후, 반응 혼합물을 30분 동안 더 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시켜 N-카르보벤족시-L-프롤릴 클로라이드(CBZ-L-Pro-Cl)를 연황색 오일로서 수득하였다.

염화메틸렌 10 ml를 CBZ-L-Pro-Cl에 첨가한 후, 아르곤하 염화메틸렌 7 ml에 용해시킨 2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)피롤리딘 염산염(실시예 IC의 화합물) 2.49 mmol 및 N-메틸모르폴린 0.54 ml(4.98 mmol)의 현탁액과 반응시켰다. 2.5시간 후, 반응 혼합물을 농축시키고 염화메틸렌 1 ml로 옮기고, 생성물을 실리카겔 컬럼 상에서 에틸 아세테이트/헥산(50:50)으로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 생성물을 분획을 한데 합하고 농축시켜 목적 생성물 0.52 g을 무색 오일로서 수득하였다.

생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 449.1508[C₂₀H₂₂F₅N₂O₄에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 449.1500]이었다.

II. 4-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIIa)의 합성

IIA. 티아졸리딘-3,4-디카르복실산, 3-페닐메틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIa)의 합성

빙수 조에서 냉각시킨 L-티아졸리딘-4-카르복실산 13.32 g(0.10 mole)의 격렬하게 교반시킨 용액에 벤질 클로로포르메이트 15.70 ml(0.11 mmol) 및 2N의 수산화나트륨 55 ml를 20분에 걸쳐 5 ml씩 교대로 첨가하였다. 첨가 10분 후, 반응 혼합물을 실온에 되게 하고, 30분 동안 더 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸에테르 75 ml로 3회 추출하고, 수성층을 6N의 HCl 약 20 ml로 산성화시켰다. 분리한 유기 물질을 한데 합하고, 에틸 에테르 100 ml에 재용해시키고, 염수 50 ml로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 점성 무색 오일 20.4 g으로 농축시켰다.

IIB.4-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘 카르복실산, 페닐메틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIIa)의 합성

아르곤하 및 -17℃로 냉각시킨 염화메틸렌 15 ml 중에서 교반시킨 CBZ-L-티오 Pro-OH(실시예 IIa의 화합물) 267 mg(1.00 mmol) 및 NMM 0.12 ml(1.05 mmol)의 용액에 이소부틸 클로로포르메이트 0.13 ml(1.00 mmol)을 첨가하였다. 20분 후, NMM 0.12 ml(1.05 mmol)를 더 첨가하고, 아세토니트릴 10 ml 중의 2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)피롤리딘 염산염(화합물 IC) 253 mg(1.00 mmol)의 엷은 현탁액을 수분에 걸쳐 첨가하였다. -20℃에서 1½시간 후, 반응 혼합물을 실온이 되게하고, 1시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고 염화메틸렌 3ml를 잔류물에 첨가하고, 이를 4 ×15 cm의 실리카겔 컬럼 상에 부하하였다. 컬럼을 에틸 아세테이트/헥산(30:70) 및 에틸 아세테이트/헥산(35:65) 400 ml로 순서대로 용출시켰다. 생성물 함유 분획을 한데 합하고 농축시켜 무색 점성 오일 63 mg을수득하였다. 생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 467.1053[C₁₉H₂₀F₅N₂O₄S에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 467.1064]이었다.

III. 4-[[4-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIII)의 합성

IIIA. 티아졸리딘-3,4-디카르복실산, 3-(1,1-디메틸에틸)에스테르(반응도식 I, 화합물 Ia)의 합성

THF/H₂O(1:1) 100 ml 중에서 격렬하게 교반시킨 L-티아졸리딘-4-카르복실산 10.0 g(75.09 mmol)의 현탁액에 탄산나트륨 11.94 g(0.11 mole) 및 디-3급-부틸 디카르보네이트 16.39 g(75.09 mmol)을 순서대로 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 철야 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과시키고, 여액을 디에틸 에테르 100 ml를 함유하는 분리 깔때기로 옮기고 층들을 분리하였다. 수성층을 갓 제조한 디에틸 에테르 200 ml로 덮은 후, 1N 염산 수용액으로 산성화시켰다. 유기층을 0.5N의 염산 수용액 및 염수 50 ml로 순서대로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켜 백색 고상물 14.56 g을 수득하였다.¹H-NMR 스펙트럼은 이론 구조와 일치하였다. 10.56 (s - 1H, CO₂H), 4.78 (m - 1H, CH), 4.59 및 4.39 (pr d, 2H, J = 8Hz; NCH₂S), 3.22-3.36 (m, 2H, CH₂S), 1.43 [s, 9H, OC(CH₃)₃].

IIIB. 4-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 IIa)의 합성

아르곤하 염화메틸렌 40 ml 중에서 교반시킨 티아졸리딘-3,4-디카르복실산, 3-(1,1-디메틸에틸) 에스테르 2.33 g(9.99 mmol) 및 DMAP 1.22 g(9.99 mmol)의 용액에 염화메틸렌 15 ml 중의 N,O-디메틸히드록시아민 염산염 0.98 g(9.99 mmol) 및 NMM 1.10 ml(9.99 mmol)의 현탁액을 첨가하였다. 이어서, 수용성 카르보디이미드 1.92 g(9.99 mmol)을 용액에 첨가하고, 반응을 철야 진행시켰다. 반응 혼합물을 약 15 ml로 농축시키고, 6 ×10 cm의 실리카겔 컬럼 상에 현탁액을 부하시키고 에틸 아세테이트/헥산(50:50)으로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획(Rf = 0.39)을 한데 합하고 농축시켜 무색 오일 1.95 g을 얻었다. 생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 277.1216[C₁₁H₂₁N₂O₄S에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 277.1222]이었다.

IIIC. N-메톡시-N-메틸-4-티아졸리딘카르복스아미드, 일염산염(반응 도식 I, 화합물 III)의 합성

빙수조 중에서 냉각시킨 에틸 아세테이트 중에서 교반시킨 4-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(일반식 IIIB의 화합물) 1.05 g(3.80 mmol)의 용액에 HCl 가스를 10분 동안 버블링시켰다. 가스를 첨가한 후, 반응을 캡핑시키고, 2시간 동안 더 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 무색 오일로 농축시키고 고진공하에 KOH 펠릿 상에서 3시간 동안 건조시켜 고상화된 백색 고상물 0.76 g을 수득하였다.

IIID. 4-[[4-[(메톡시메틸아미노)카르보닐]-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘 카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 VIII)의 합성

아르곤하 염화메틸렌 20 ml 중에서 교반시킨 3,4-티아졸리딘카르복실산, 3-(1,1-디메틸에틸) 에스테르(실시예 IIIA의 화합물) 0.81 g(3.49 mmol) 및 DMAP 0.43 g(3.49 mmol)의 용액에 염화메틸렌 10 ml 및 수용성 카르보디이미드 0.67 g(3.49 mmol) 중의 NMM 0.38 ml(3.49 mmol) 및 N-메톡시-N-메틸-4-티아졸리딘카르복스아미드 일염산염(실시예 IIIC의 화합물) 0.76 g(3.49 mmol)을 순서대로 첨가하였다. 반응을 완결시킨 후, 반응 혼합물을 약 10 ml로 농축시키고, 5 × 13 cm의 실리카겔 컬럼 상에 현탁액을 부하시키고 아세톤/에틸 아세테이트(8:92)로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획(Rf = 0.66)을 한데 합하고 농축시켜 백색 발포체 0.35 g을 얻었다. 생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 392.1324[C₁₅H₆₀N₃O₆S₂에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 392.1314]이었다.

IV. 4-[[4-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 IX)의 합성

IVA. 4-[[4-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥소프로필)-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(반응 도식 I, 화합물 IX)의 합성

아르곤하 -78℃에서 에틸 에테르 30 ml 중에서 교반시킨 4-[[4-(메톡시메틸아미노)-카르보닐]-3-티아졸리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘 카르복실산, 1,1-디메틸에틸 에스테르(실시예 IIID의 화합물) 0.33 g(0.84 mmol)의 용액에 퍼플루오로에틸 요오다이드 0.32 ml(2.70 mmol) 및 메틸 리튬·리튬 브로마이드 1.57 ml(2.36 mmol, 에틸 에테르 중 1.5M)를 순서대로 첨가하였다. TLC는 반응이 완결되었다는 것을 나타낸다. 반응 혼합물을 실리카겔 25 g을 함유하는 에틸 에테르 100 ml에 부었다. 플라스크 중의 생성물 잔량을 에틸 에테르에 용해시키고, 실리카/에테르 용액에 첨가하였다. 연속적으로, 유기상을 제거하고, 실리카겔을 에틸 에테르 100 ml로 2회 세척하였다. 한데 합한 유기 물질을 황산마그네슘 및 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 여과시키고 증발시켜 오일상 백색 발포체 0.34 g을 수득하였다. 이어서, 이 물질을 4 ×10 cm의 실리카겔 컬럼 상에 현탁액을 부하시키고 에틸 아세테이트/헥산(30:70) 0.4 리터 및 에틸 아세테이트/헥산(75:25) 0.5 리터로 순서대로 용출시킴으로써 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 한데 합하고 농축시켜 오일 49 mg을 얻었다.

생성물을 질량 스펙트럼 분석한 결과 MH⁺는 451.0799[C₁₅H₂₀F₅N₂O₄S₂에 대한 이론치 질량(MH⁺) = 451.0785]이었다.

합성 평가 분석

합성 반응은 일반적으로 에틸 아세테이트:헥산 용매 중에서 전개시킨 아날테크(Analtech) 실리카겔 판 상에서 TLC에 의해 수행하였다. 화합물은 이 판을 알칼리성 과망간산칼륨으로 처리한 후 가열시켜 확인하였다.

V. 효소 억제 평가 분석

프롤릴 엔도펩티다제는 50 mM HEPES(pH 7.4)를 트리스 완충액 대신에 사용하였다는 것을 제외하고는, 본질적으로 문헌 [Yoshimoto 등, Biochem., 94, 1179(1983)에 기재된 바와 같이 소 뇌로부터 부분적으로 정제된다. 이 효소 제제는 관례적인 억제 측정에 적합하지만, 이 효소는 다음과 같이 더 정제될 수 있다. 효소의 순수 상태는 측정된 K_i에 영향을 주지 않는 것으로 예상된다. 50% 내지 80% 황산암모늄 컷으로부터의 펠릿을 균질화 완충액에 재용해시키고, 파마시아 모노 Q컬럼(Pharmacia Mono Q, 0.5 x 5 cm)을 1 ml/분으로 통과시켜 탈염시키고, 이 컬럼을 완충액 A 내지 완충액 B 5 ml(총 20 ml; 완충액 A = 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT; 완충액 B = 완충액 A + 0.5M NaCl)로 세척하였다. 효소 활성은 약 [NaCl] = 0.25M에서 용출된다. 예비 데이타는 효소가 장기간(1 내지 2달) 저장하는데 안정하지 않으므로, 갓 제조한 효소 제제가 바람직하다는 것을 보여준다.

효소는 20 μM 기질(CBz-Gly-Pro-p-니트로아닐리드)을 함유하는 완충액 A 3.0 ml 중 37℃에서 평가 분석하였다. 410 nm에서의 흡광도가 증가하는 것이 모니터링 된다(410 nm = 8.4 mM^-1cm^-1). 억제제 원액을 DMSO 중에 제조한다. 가역적 경쟁 억제제를 특정화하기 위하여, 3개의 억제제 농축액의 존재하에 [S] = 50 μM을 사용하여 초기 속도를 측정한다(기질에 대한 K_M은 11 μM임). 늦은 결합이 관찰될 경우, 최종 평형 농도를 사용한다.

경쟁 억제제에 대한 K_i는 알려진 식 v_o/v_i= (1 + [I]/K_i, app) 및 K_i= K_i,_app/(1 + [S]/K_M){식 중, v_o는 억제제 부재하의 초기 속도이고; v_i는 농도 [I]에서 억제제 존재하의 초기 속도이고; [S]는 기질 농도임}을 사용하여 계산한다. "늦은 결합"이 관찰될 경우(즉, 결합 평형에 대한 접근이 늦을 경우), 초기 속도보다는 최종 정상 상태 속도를 v_i로서 선택한다.

일반식 (1)의 각종 화합물에 대하여 설명된 방법을 사용하여 효소 억제 상수를 밝혀내었다. 표 2는 지시된 바와 같이 시험된 화합물에 대해 밝혀낸 데이타를 나타낸다.

화합물은 또한 문헌 [Atack, Eur. J. Pharm., 205, 157-163(1991)]에 기재된 방법과 당업계에 알려진 다른 방법을 포함하여 각종 방법으로 억제에 대하여 생체내에서 시험할 수 있다. 예를 들어 화합물을 암컷 BKTO 마우스(25-30 g)에게 염수중에 주입하거나 메틸 셀룰로오스와 같은 담체로 i.p. 주입하고, 적당한 시간에 희생시키고, 뇌 및 신장을 제거할 수 있다. 조직을 빙냉 평가 분석 완충액 10 ml(약20 부피) 중에서 균질화시킬 수 있다. 이어서, 균질화액의 부분 표본을 사용하여 문헌 [Lowry 등, J. Biol. Chem., 193, 265(1951)]의 방법에 의한 바와 같이 단백질 농도를 측정할 수 있다. 억제제 해리는 실온에서 2분 동안 인큐베이션시킨 조균질화액의 부분 표본 199 μ1를 사용하고, 동물을 희생시키고 평가 분석하는 동안의 총 시간이 약 3분이 되게함으로써 최소화할 수 있다. 활성은 단백질 mg 당 활성으로서 표현할 수 있고, 비히클 처리된 동물에 대한 백분율로서 표현할 수 있다.

화합물에 의한 기억력에 대한 작용 효과는 문헌 [Atack, Eur. J. Pharm., 205, 157-163(1991)]에 기재된 방법을 포함하여 각종 방법으로 시험할 수 있다. 기억력에 대한 화합물의 효과는 마우스 수동-회피 모델 중에서 스코폴아민 유발된 기억력 손상의 반전을 평가함으로써 시험할 수 있다. 이러한 모델에서, 마우스들을 (1) 비히클; (2) 비히클 및 스코폴아민(즉, 약 0.2 mg/kg): 또는 (3) 본 발명의 화합물 각종 투여량(즉, 약 0.1 mg/kg 내지 1.0 mg/kg)을 주입받은 각종 군으로 지정하였다. 이어서, 마우스들을 2개의 체임버, 명/암 박스의 조명된 측면에 놓는다. 박스의 어두운 측면에 유입시킬 때, 동물은 짧은 전기 쇼크(즉, 약 2초, 약 0.4 mA)를 받는다. 어두운 체임버로 유입되는데 걸린 시간(스텝-스로우[step-through] 잠복기)을 기록한다. 다음 날, 마우스들을 박스의 밝은 측면으로 옮기고, 어두운 측면으로 스텝-스로우하는데 걸린 시간을 기록한다. 이 모델에 있어서 기억력 손상은 2개의 연속적인 날에 있어서 어두운 측면으로 스텝-스로우하는데 걸린 시간의 차이에 정비례한다. 2일에서의 스텝-스로우 시간이 길면 기억력을 나타내는 것인 반면, 스텝 스로우 시간에 차이가 없는 것은 기억력 손상을 나타내는 것이다.

구체적으로 기재된 실시태양에 대한 변화 및 변형을 첨부된 특허 청구의 범위의 영역에 의해서만이 제한하고자 하는 본 발명의 영역으로부터 벗어남이 없이 수행할 수 있다.

Claims

제약상 허용되는 담체와 함께 하기 일반식 (1')의 화합물을 그의 1종 이상의 입체 이성질체 형태로 포함하는 기억력 증진용 제약 조성물.

상기 식 중,

A는 벤질 또는 t-부틸 보호기이고;

X₁은 -S- 또는 CH₂이며;

B는 CF₃또는 CF₂CF₃이다.
제약상 허용되는 담체와 함께 하기 일반식 (1')의 화합물을 그의 1종 이상의 입체 이성질체 형태로 포함하는 기억력 손상 방지 또는 지연용 제약 조성물.

상기 식 중,

A는 벤질 또는 t-부틸 보호기이고;

X₁은 -S- 또는 CH₂이며;

B는 CF₃또는 CF₂CF₃이다.
제1항 또는 2항에 있어서, 상기 화합물이 4-[[2-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-옥시프로필)-1-피롤리디닐]카르보닐]-3-티아졸리딘카르복실산, 페닐메틸 에스테르인 것인 제약 조성물.