KR100381512B1

KR100381512B1 - 유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과이의 용도

Info

Publication number: KR100381512B1
Application number: KR10-2000-0055400A
Authority: KR
Inventors: 문우철; 문철소; 김병구; 신찬재; 김흥재; 문영호; 김동환; 엄태한; 김화수; 송미경; 송석범
Original assignee: 굿젠 주식회사; 문우철
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2003-04-26
Anticipated expiration: 2020-09-21
Also published as: AU2001292389A1; US7550452B2; KR20020022869A; WO2002024627A1; US20040185090A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질, 이의 제조방법과 상기 양이온성 지질을 사용하여 세포내로 음이온성 분자물질을 효과적으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 상기 지질은 안정성 및 전달효율이 높아 유전자치료에 적합하다.

화학식 1

상기 식에서 y는 1 내지 20 사이의 자연수이고; R₁∼R₃는 서로 같거나 다른 수소, 탄소수 1∼10 사이의 알킬 또는 하이드록시 알킬기, 또는 탄소수 7∼11 사이의 아릴 또는 알알킬기이며; R₄는 콜레스테롤 라디칼이고; X는 약학적으로 허용 가능한 음이온이다.

Description

유전자 및 생물학적 활성 약물 전달용 양이온성 지질과 이의 용도{Cationic lipids and use thereof}

본 발명은 유전자 또는 생물학적 활성 약물 등을 세포내로 전달할 수 있는 양이온성 지질 및 이의 용도에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 양이온성 지질을 이용하여 세포내로 음이온성 분자물질, 즉, DNA, RNA, 단백질, 또는 생물학적 활성 약물 등을 효과적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.

지금까지 개발되어진 유전자 체내 전달 수단으로는 레트로 바이러스나 아데노 바이러스 등을 이용한 바이러스 벡터를 이용한 방법과, 양이온성 양친매성 화합물을 매개로하는 리포솜 벡터를 이용하는 방법, DEAE 덱스트란법 또는 합성고분자나 유전자 주입용 총(gene gun)을 이용하는 방법 등이 있다.

바이러스 벡터(viral vector)는 유전자 발현 효율은 높으나 일정한 발현효율을 계속 유지하기가 어렵고, 반복투여시 체내 면역체계를 자극하여 자칫 병변을 악화시킬 수 있고, 표적세포 또는 표적 조직에 대한 선택성이 없다. 또한 배양에 오랜 시간이 필요하고 원하는 만큼 쉽게 자라지 않기 때문에 빠른 시간에 대량으로 준비하기가 곤란하다는 점 등의 단점이 있다. 더욱이 체내에서 DNA 삽입 (integration)을 통해 종양형성(oncogenesis)을 유도할 수 있고, 잠재하고 있는 동종 바이러스와의 유전자 재조합으로 해서 오히려 치명적일 수 있다.

이러한 점에서 볼 때 안전성이 아직 확립되지 않은 바이러스계 벡터를 사용하는 방법 보다는 양이온계 지질, 합성 및 천연 고분자, 또는 작은 미립자를 이용한 비바이러스계 벡터들을 사용하는 방법이 바람직하나, 이러한 방법은 아직 트랜스펙션(transfection) 효율면에서 충분하지 못한 단점이 있다. 그러나, 합성 벡터 개발분야에 있어서의 최근의 괄목할만한 성과를 고려해 볼 때 그 가능성이 상당히 기대되고 있다.

한편, 양이온계 지질인 리포솜을 이용하는 기술을 기재한 문헌으로는 다음과 같은 것이 있다; Hazinski, et al, Science, 249, 1285-1288, 1991; Wang and Huang, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 84, 7851-7855, 1987; Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7416, 1987. 바이러스(viral vector)와 비교하여 리포솜(liposomal vector)은 다양한 체내 주입경로를 통해 유전자 전달이 가능한 장점을 가지고 있다. 예를 들어, 직접 조직에 주사할 수 있고, 피부나 소화기, 폐동맥(pulmonary)으로 흡수할 수 있고, 또는 정맥주사를 통해 전신적으로 투여할 수 있다. 이는 종래의 인산칼슘이나 DEAE 덱스트란(dextran), 폴리라이신(polylysine), 폴리브렌(polybrene)과 같은 양이온성 고분자를 이용한 방법들과 DNA를 조직이나 세포속에 직접 삽입시키는 유전자총(gene gun) 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 방법들과는 달리 분자수준에서 이론적으로 설계된 합성 벡터들은 유전자 요법에 필요한 새로운 형태의 고가의 의약품으로서 큰 시장을 가지리라 예측되고 있다.

현재 일반적인 유전자 치료방법으로는 유전자를 체외에서 전달한 후 유전자를 발현하는 세포를 체내로 이식하는 방법(ex vivo)이 주를 이루고 있다. 그러나 이 방법은 과정이 복잡할 뿐만 아니라 경제적인 관점에서도 임상적으로 보편화되기에는 곤란하다. 그리하여 유전자 전달 기술은 직접적인 체내전달(in vivo)을 지향하고 있고, 더욱이 표적세포에 특이적으로 유전자를 전달하고 발현할 수 있는 전신적 (systemic) 유전자 치료를 목표로 계속적으로 발전하고 있고, 현재 유전자요법용 비바이러스계 벡터로서 가장 큰 관심의 대상이 되는 것에는 양이온성 지질을 위주로 한 지질 담체(lipid carrier), 수용체 중계 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis) 원리를 이용하는 분자접합체(molecular conjugate), 합성고분자 벡터 등이 있다.

양이온성 지질은 음이온계의 DNA와 안정한 이온결합에 의한 복합체 입자를 형성함으로써 세포막 융합이나 자연적인 엔도시토시스에 의한 세포 내로의 수송이 가능하다. 1987년 Felgner 박사 연구진이 양이온성 4급 아미노 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-triethylammonium chloride; DOTMA)와 세포막 융합활성을 가진 것으로 알려진 디올레오일포스페이티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)로 이루어진 양이온성 리포좀이 유전자 전달에 유용하다는 연구 결과를 처음으로 발표한 이후, 다양한 양이온성 지질들이 합성되어 유전자 전달에 이용되고 있다. DOTMA는 전달효율이 매우 높은 양이온성 지질로서, 이것의 소수성기는 이중결합을 갖는 탄소수 18개의 지방족 화합물 그룹 (aliphatic group)이다. 또한 이것은 3-탄소 스페이서 아암(3-carbon spacer arm)과 2개의 에테르 연쇄결합(ether linker bond)을 통하여 결합된 소수성기의 반대쪽에 4차 암모늄염이 결합되어 있다. 비록 이것이 전달효율은 높지만 독성을 지니고 있으며, 많은 합성과정을 거쳐야 하고, DOTMA와 DOPE를 혼합하여 시판되고 있는 리포펙틴(Lipofectin)은 고가로 판매되고 있다.

유전자 요법에 사용되는 양이온성 지질들은 양성(amphipathic) 화합물로써, 공통적으로 양이온성 헤드 부분, 스페이서, 소수성 말단 부분의 3부분으로 이루어지는 분자구조를 갖는다. 소수성 말단 부분은 올레익산(oleic acid) 또는 미리스트산 (myristic acid)과 같은 지방산 유도체가 주로 사용되고, 양이온인 암모늄기가 세포나 리포솜의 표면에 접촉할 수 있도록 하는 앵커(anchor)로써의 역할을 한다. 여기에 스페이서로서 글리세롤 등이 결합되고 탄소수 2∼15개의 보통은 친수성기이며, 주로 중성의 pH에서 양(+)으로 하전된 1차, 2차, 3차 또는 4차 암모늄기가 양이온 헤드 부분으로 결합되어 있다.

세포 내 유전자전달 효율을 보다 높이기 위해 DOTMA의 다른 형태의 유도체인 1,2-디미리실옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(1,2-dimyrisyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide; DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl sulfate; DOTAP), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스퍼마인카복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판 암모늄 트리플루오로아세테이트(2,3-dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxyamide)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propane ammonium trifluoroacetate; DOSPA) 등이 개발되어 있다.

또한, 콜레스테롤(cholesterol) 유도체인 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol; DC-Chol), 디메틸-디옥타데실 암모늄 브로마이드(dimethyl-dioctadecyl ammonium bromide; DDAB), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드(N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride; TMAC), 디옥타데실아미도글리실스페르민(dioctadecylamidoglycylspermine; DOGS) 등이 합성되어 유전자 전달을 목적으로 이용되고 있다. 이들 양이온성 지질들은 4차 아민, 3차 아민, 또는 하이드록시에틸화 4차 아민등이 지질의 헤드 부분에 연결되어 한 개의 양전하를 제공하는 종류와 스페르민(spermine) 또는 폴리라이신(polylysine)이 연결되어 여러 개의 양전하를 제공하는 종류로 구분될 수도 있다.

또 다른 유전자 전달에 사용되는 양이온성 지질은 4차 암모늄염인 디터전트 (detergent)이다. 이들은 단일사슬, 예를 들어, 세트리메틸암모늄 브로마이드(cetrimethylammonium bromide) 또는 이중사슬, 예를 들어, 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecyl ammonium bromide) 디터전트 등이고, 이들은 모두 동물세포에 유전자 전달이 가능하다. 이들 양친매성(amphiphile)에 속하는 아미노기는 4차이고, 스페이서 아암이나 연쇄결합(linker bond)없이 단일사슬이 1차 아민기에 붙어있다. 이들 양친매성들 또한 세포에 독성을 나타낸다.

또 다른 양친매성 물질들로는 DOTMA와 구조가 유사한 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오)부타노일-신-글리세롤(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio) butanoyl-sn-glycerol; DOBT), 콜레스테릴(4'-트리메틸암모니오)부타노이에트 (cholesteryl(4'-trimethylammonino)butanoate; choTB), 1,2-디올레오일-3-썩시닐-신-글리세롤 콜린 에스테르(1,2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerol choline ester; DOSC) 등이 있는데, 이들 양친매성 물질들의 전달효율(transfection activities)은 일반적으로 낮다.

그러나, 1차와 2차 암모늄기를 포함하고 있는 L-5-카르복시스페르민(L-5-carboxyspermine)인 또다른 두 개의 양친매성 물질이 있다. 리포폴리아민 (Lipopolyamine) 이라고도 불리는 이들은 디옥타데실-아미돌로글리실스페르민 (dioctadecyl-amidologlycylspermine; DOGS)과 디팔미토일 포스페이티딜에탄올아미도-스페르민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamido-spermine; DPPES)이다. 이들은 세포독성(cellular toxicity)없이 1차 내분비 세포(primary endocrine cell)를 트랜스펙팅하는데 특히 효율적이다.

한편, 리포폴리라이신(liphopolylysine)이 보고되었는데, 이것은 포스포리피드(N-글루타릴-포스페이티딜 에탄올아민)(phospholipid(N-glutaryl-phosphatidylethanolamine)에 암모늄기로써 폴리라이신을 포함하고 있다. 그러므로, 스페이서 아암은 라이신의 곁사슬(side chain)과 포스포리피드의 헤드 그룹이다. 소수성기는 두 개의 에스테르 결합을 통해 스페이서 아암에 연결된 이중사슬이다. 비록 이것이 트랜스펙션에 효율적이고 세포에 독성이 없을지라도 처리된 세포를 스크래핑 (scraping) 해야만 활성을 나타낸다. 따라서 이것은 분명히 편리한 것도 아니며, 생체내(in vivo) 실험을 행할 수 없다.

리포솜은 농축된 2중 지질(lipid bilayer)로 구성된 미세소포(microscopic vesicle)로써, 구조적으로 긴 튜브에서부터 구형에 이르기까지 다양한 크기와 모양을 가지고 있고, 크기는 대략 몇백 옹거스트롬(Å)에서 수 밀리미터(millimeter)에 이른다. 이중(Bilayer)구조는 일반적으로 각각의 라멜라(lamella)를 서로 분리시키는 수용액층과 집중적으로 밀집되어 있는 라멜라들로 구성되어 있다. 소포(Vesicle)의 직경은 보통 약 20∼30,000nm사이이고, 라멜라들 사이의 액정 필름(liquid film)은 대략 3∼10nm이다. 리포솜(liposome)은 그들의 전체적인 크기와 라멜라 구조의 성질에 따라 크게 3가지로 구성된다. 즉, 멀티-라멜라 소포(multi-lamellar vesicle; MLV), 작은 유니-라멜라 소포(small uni-lamellar vesicle; SUV), 큰 유니-라멜라 소포(large uni-lamellar vesicle; LUV) 이다.

SUV는 직경이 대략 20∼50nm이고, 수용액 부분을 둘러싸고 있는 단일 이중 지질(single lipid bilayer)로 구성되어 있다. 유니-라멜라 소포(Uni-lamellar vesicle)는 또한 직경이 약 50∼600nm의 크기로 제조될 수 있다. 유니-라멜라 소포가 균일한 크기를 갖는 단일 구획 소포(single compartmental vesicle)인 반면,10,000nm까지 크기가 크게 변화하는 MLV는 구조가 다-구획 구조(multi-compartmental)이며, 한개 이상의 이중구조(bilayer)를 포함하고 있다. 큰 직경을 갖는 LUV 리포솜은 약 600∼30,000nm 범위이고, 한개 이상의 이중구조를 포함할 수 있다.

리포솜은 여러가지 방법으로 제조될 수 있지만, 흔히 다음의 3가지 방법이 사용된다.

첫째, 초음파 분산(ultrasonic dispersion)에 의한 방법으로 MLV의 현탁액(suspension)에 금속 프루브(metal probe)를 직접 담가 제조하며, 흔히 SUV 제조에 사용된다. 둘째, MLV 리포솜의 제조방법으로, 적당한 유기용매에 지질을 녹인 후 가스 또는 공기에 의해 용매를 제거한다. 그리하여 용기표면에 남은 건조된 지질의 얇은 막에 수용액을 넣고 흔들면 지질 집합체(lipid aggregate) 또는 리포솜 형태로 지질을 분산시키는 방법이다. 셋째, LUV 리포좀의 제조방법으로, 증류수나 몇가지 종류의 수용액으로 지질의 얇은 막을 서서히 수화시키는 방법이다. 또다른 방법은 냉동건조 (lyophilization)시켜 필름으로 만든다. 상기 필름은 다시 휘발성 용매에 녹여, 냉동시키고 다시 냉동건조 장치에서 용매를 제거한다. 약물(drug)를 포함하고 있는 약제학적 조성물(phamarceutical formulation)을 제조하기 위해서는 약물 용액 (drug solution)이 냉동건조된 지질에 첨가되고, 그것에 의하여 리포솜이 형성된다. 리포솜 제조에 관한 다양한 방법들은 문헌이나 특허 등에 많이 발표되고 있다 (Felgner, P.L. and Ringold, G.M., Nature, 337, 387∼388, (1989).; WO93/05162, 미국특허 제5,994,317호; 미국특허 제6,056,938호).

이와 같이 넓은 범주에 있어서의 리포솜은 한 개 또는 그 이상의 지질로부터 제조된다. 비록 양이온(cationic), 중성(neutral), 음이온(anionic) 등의 지질들이 리포솜 제조에 이용될 수 있다고 여겨지지만, 양으로 하전된 리포솜은 지금까지 완전하게 알려지지는 않았지만, 몇가지 문제점을 가지고 있다. 현재까지 양이온성 리포솜 제조에 사용되었던 아민은 화학적으로 불안정하여 소포(vesicle)의 저장안정성 (short shelf life)이 좋지않다. 또다른 아민인 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(dimethy1 dioctadecy1 ammonium bromide)는 리포솜 구조를 구성하는 이중구조의 최적 형성을 위한 적당한 분자결합 구조가 결여되어 있었다.

여러 가지 생물학적 물질들이 해당 물질과 지질을 접촉시킨 후 리포솜을 형성하도록 함으로써, 리포솜에 의한 캡슐화(encapsulation)을 수행해 왔다. 이러한 방법에 있어서의 공통적인 문제점은 리포솜으로 캡슐화된 물질은 일반적으로 50%이하, 보통은 20%이하라는 점이고, 따라서 캡슐화되지 않은 물질을 제거하기 위한 또다른 단계가 필요하다는 것이다. 더욱이, 캡슐화되지 않은 물질을 제거한 후에, 캡슐화된 물질의 리포솜이 결여될 수 있다는 것이다. 따라서 리포솜의 안정성 (stability) 문제는 이 분야에서 매우 중요하다.

한편, 리포솜은 세포안으로 DNA를 도입하기 위해 사용되어 졌고, 현미주사법 (microinjection), 원형질체 융합법(protoplast fusion), 리포좀 융합법(liposome fusion), 칼슘 인 침전법(calcium phosphate precipitation), 일렉트로포레이션 (electroporation), 레트로바이러스(retrovirus) 등의 많은 DNA전달 방법들이 사용되어 왔다. 이들 방법들은 모두 몇가지 문제점들을 가지고 있다. 즉, 큰 규모의 생물학적 또는 치료법상의 프로토콜(protocol)로 편리하고도 효율적으로 이용하기에는 너무나도 비효율적이며, 독성이 있고, 복잡하기 때문이다. 예를 들어, 칼슘 인 침전법은 1/10⁴∼1/10⁷cell 만을 전달할 수 있기 때문에 너무 효율이 떨어진다. 현미주사법은 효율적이지만, 수많은 세포 또는 많은 환자들에게 적용하기엔 실질적으로 불가능하다. 원형질체 융합법은 칼슘 인 침전법보다 더 효율적이지만, 프로필렌 글리콜이 필요하고 이는 세포에 독성을 지닌다. 일렉트로포레이션 법은 효율은 좋지만 특별한 장치가 필요하다. 레트로바이러스는 충분히 효율적이지만 환자에게 바이러스를 도입해야 하므로 감염이나 암이 염려된다. 리포솜 또한 사용되어져 왔지만 칼슘 인 침전법보다 그렇게 효율이 좋지는 않았었다. 가장 바람직한 전달방법은 독성이나 감염성 물질의 개입없이 매우 높은 효율을 가져야하고, 정교한 기구없이도 수행될 수 있도록 단순해야 한다.

이에 본 발명에서는 상술한 문제점을 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과, 독성이나 감염성 물질의 개입없이 매우 높은 효율을 가질 뿐만 아니라, 정교한 기구없이도 수행할 수 있는 양이온성 지질을 발견하였고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포내로 음이온성 분자물질, 즉, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 또는 생물학적 활성 약물 등을 효과적으로 전달할 수 있는 양이온성지질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 양이온성 지질을 이용하여 세포내로 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 또는 생물학적 활성 약물 등을 효과적으로 전달하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양이온성 지질은 하기 화학식 1로 표시된다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 상기 양이온성 지질의 전달방법은 (a) 다른 지질과 복합체를 형성하는 유효량의 상기 양이온성 지질을 포함하는 조성물과 음이온성 분자물질을 접촉시켜 지질 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 상기 지질 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.

도 1은 Ecoli.의 RNA 또는 DNA에 의한 오염이 없음을 나타내는 나(裸) pCMV-p53 플라즈미드 DNA의 전기영동 사진으로, 대부분의 DNAs는 환형의 슈퍼코일 플라즈미드 DNA로 구성되고, 도면내의 번호는 DNA 배치(batch)의 일련번호이며, M은 λ Hind III 마커(marker)이다.

도 2는 pCMV-p53 플라즈미드 DNA의 결합을 테스트한 DNA 전기영동(0.8% 아가로스 겔) 사진으로서,

레인(Lane) 1은 사이즈 마커(size marker; 1kb ladder)이고,

레인 2는 RNA, 나(裸) DNA, 염색체(chromosomal) DNA에 의한 오염이 없는 전기이동(migration)을 나타내는 나(裸) pCMV-p53 플라즈미드 DNA이며,

레인 3은 pCMV-p53 플라즈미드 DNA와 본 발명에 따른 지질 : DOPE 리포좀(1 : 1 몰비)의 복합체이고,

레인 4는 pCMV-p53 플라즈미드 DNA와 본 발명에 따른 지질 : DOPE 리포좀(1 : 2 몰비)의 복합체이며,

레인 5는 DNA의 전기이동이 없고, DNA 및 리포좀의 완전한 결합을 나타내는 pCMV-p53 플라즈미드 DNA와 본 발명에 따른 지질 : DOPE 리포좀(1 : 4 몰비)의 복합체이고,

레인 6은 DNA의 전기이동이 없고, DNA 및 리포좀의 완전한 결합을 나타내는 pCMV-p53 플라즈미드 DNA와 본 발명에 따른 지질 : DOPE 리포좀(1 : 6 몰비)의 복합체이며,

레인 7은 pCMV-p53와 본 발명에 따른 지질 : DOPE : PLL(무게비로 1 : 3 : 0.375)의 복합체이다.

도 3는 본 발명에 따라 제조된 지질 : DOPE (1 : 1 몰비) 리포좀의 주사전자 현미경(Scanning electron microscopy(SEM)) 사진이다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 양이온성 지질은 하기 화학식 1로 표시된다.

화학식 1

상기 식에서 y는 1 내지 20 사이의 자연수이고; R₁∼R₃는 서로 같거나 다른 수소, 탄소수 1∼10 사이의 알킬 또는 하이드록시 알킬기, 또는 탄소수 7∼11 사이의 아릴 또는 알알킬기이며; R₄는 콜레스테롤 라디칼이고; X는 약학적으로 허용 가능한 음이온이다. 좀 더 바람직하게는 y는 1 내지 12 사이의 자연수이고; R₁∼R₃는 1개 이상의 수소 또는 탄소수 2∼5 사이의 알킬 히드록시알킬이며; X는 Br, Cl, I, CH₃CO₂또는 CF₃CO₂이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1과 같은 양이온성 지질은 실험실적으로 동물세포에 대해 효율이 좋은 비-바이러스성 전달제이다. 이러한 양이온성 지질은 음이온성 분자물질, 예를 들어, 음이온계의 DNA와 안정한 이온결합에 의한 복합체 입자를 형성함으로써 세포막 융합이나 자연적인 엔도시토시스에 의한 세포내로의 수송이 가능하다(P.L. Felgner, Adv. Drug Delivery Review, 5, 163(1990)). 이때DNA의 음이온 부분이 양이온계 지질의 양이온 부분과 결합되면서 DNA 분자사슬에 코팅되면 밖으로 위치하게 된 지질이 소수성 결합에 의하여 스스로 뭉쳐져서 DNA 분자를 조밀한 입자상으로 만든다. 이 입자는 전체적으로 양이온성을 갖게 되고 그 입자의 크기는 수백 나노미터 정도의 직경을 갖게 된다. 이러한 양이온계 DNA/지질 입자가 음이온계 세포막과 비특이적 (nonspecific)으로 작용하여 막의 구조를 불안정하게 함으로써 세포안으로 들어가게 된다. 세포안에서는 엔도좀(endosome)에 포접되어 라이소좀(lysosome)으로의 수송중, 세포질내로 탈출에 이은 핵 염색체로의 이동에 의하여 유전자가 발현된다.

본 발명에 따른 양이온성 지질은 하나 이상의 다른 지질과 복합체를 형성할 수 있으며, 본 발명의 지질을 포함하는 조성물과 음이온성 분자물질을 접촉시켜 음이온성 분자물질을 담지할 수 있다. 이렇게 얻은 지질 복합체를 세포와 접촉시켜 세포에 음이온성 분자물질을 전달할 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 지질로는 DOPE, DOPC(Dioleoyl Phosphatidyl Choline), PC(Phosphatidyl Choline), mPEG-콜레스테롤 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예 8에서와 같이 합성한 mPEG-콜레스테롤을 적당량 혼합하여 리포솜을 제조하면 생체내(in vivo)에서 단백질이나 RES(Reticular endotherial system) 등에 의해 덜 소실되어 오랫동안 체내에 머물게 하여 약효를 유지할 수 있다. 아울러, 본 발명이 적용 가능한 세포로는 HeLaS 3, HepG 2, Hep 3B, NIH 3T3 또는 COS 7 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 양이온성 양성 지질들은 하기 실시예 8에서와 같이 리포좀으로 만들고, 이를 실시예 10에서와 같이 DNA 또는 약물과 혼합하여 복합체를 형성하며, 실시예 12에서와 같이 상기 복합체를 생체외에서 세포에 도포하거나 생체내에서는 특정 목적 부위에 가까운 정맥을 통해 주사하거나 전신 투여하여 우수한 전달 효과를 나타낼 수 있다.

이와 같이 본 발명의 양이온성 지질들은 제조 단가가 저렴하고, 높은 수율로 순도 높게 얻어질 수 있고, 음이온성 분자물질, 즉, DNA, RNA, 단백질(protein), 펩타이드(peptide), 약물(Drug) 등을 세포에 전달에 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

콜레스테릴 메질레이트의 제조

기계적 교반기와 온도계, 그리고 냉각기가 설치된 1000mL 4구 플라스크에 콜레스테롤 (200g, 0.52mol)과 건조한 피리딘 600mL을 넣고, 0℃가 될 때까지 교반한다. 반응물이 0℃가 되면 메탄술포닐 클로라이드(114.5g, 1mol)을 30분간 적가한다. 적가가 끝난 후 얼음중탕 속에서 10시간동안 교반한다. 에테르 1000mL에 반응물을 녹인 후, 0∼5℃로 냉각된 증류수 : 진한 염산(600 : 400mL) 용액으로 발열이 되지 않도록 주의하여 여러번 나누어 씻어준 후, 증류수만으로 산성이 없어질 때까지 씻어준다(pH=7.0). 무수 황산마그네슘으로 에테르층을 건조(약 3시간)한후 농축시킨다. 아세토니트릴로 재결정하여 흰색의 침상결정 (210g, 87.4%, mp95℃)을 얻었다. 에테르 대신 염화메틸렌으로 추출하면 TLC에 안 올라가는 불순물 스팟(spot)이 나타나 정제가 덜 된다. 이것은 아세토니트릴 재결정 후에도 남는다.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

4.42-4.62(m,1H, CH₃SO₃CH)

3.0(s, 3H, CH ₃SO₃-)

콜레스테릴 트리에틸렌글리콜의 제조

건조된 아세토니트릴 600mL와 건조된 1,4-디옥산 50mL가 담겨진 1000mL 플라스크에 상기 콜레스테릴메질레이트(30g, 64.6mmol)와 감압증류로 정제한 트리에틸렌글리콜 210g(1.4mole, 21eq)을 넣고, 질소로 환류하면서 45∼55℃에서 24시간 반응시킨 후, TLC로 반응 종결여부를 확인한다. 반응물을 디에틸에테르로 녹여 5% 탄산나트륨 1000mL로 씻고 증류수로 여러번 씻어준다. 무수 황산마그네슘으로 건조 후 증발 건조한다. 미 반응 트리에틸렌글리콜과 미량의 제거반응 생성물을 분리하기 위해 에테르 : 메탄올(9.5 : 0.5) 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼을 이용하여 분리였다. 수득율(27g, 80.6%)

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.6-3.8(m, 12H, TEG)

3.0-3.2(m, 1H, HO(CH₂CH₂O)₃CH-)

콜레스테릴 트리에틸렌글리콜 메질레이트의 제조

콜레스테릴 메질레이트의 제조방법과 유사한 방법으로 제조하였으며, 에테르 또는 에테르 : 메탄올(9.75 : 0.25)를 이용해 TLC 전개시 단일 스팟이었으며, 연미색의 반 고상으로 얻어졌다. 수득율 26.7g, 86%.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

4.3(m, 2H, CH₃SO₃CH ₂CH₂O-)

3.5-3.8(m, 10H, CH₃SO₃CH₂CH ₂(OCH ₂CH ₂)₂-)

3.0(s, 3H, CH₃SO₃-)

디메틸아미노테트라에톡시콜레스테롤의 제조

칼슘하이드라이드로 건조한 톨루엔 300mL과 무수탄산칼륨을 이용하여 건조한 디메틸에탄올아민(5.2g, 58mmol) 및 포타슘 부톡사이드(6.53g, 58mmol)을 넣고 질소 환류하면서 30℃에서 1시간동안 교반하였다. 진공펌프로 톨루엔을 완전히 증류해낸 후, 건조한 아세트니트릴 400mL과 소량의 건조된 톨루엔으로 녹인 콜레스테릴트리에틸렌글리콜메질레이트(26.7g, 45mmol)을 녹인 용액을 반응 용기가 충분히 식은 후 부었다. 즉시 용액은 엷은 황갈색으로 변하였고 실온에서 18시간 교반하였다. 아세토니트릴을 감압증류하고 에테르 1000mL로 반응물을 녹인 후 10% 탄산나트륨 500mL로 씻고, 증류수 1000mL로 염기성이 없어질 때까지(pH 7.0) 씻어준다.무수 황산마그네슘으로 건조 후 에테르를 감압 증류한다. 농축된 반응물은 에테르 : 메탄올 (495mL : 5mL) 용액과 에테르 : 메탄올(400mL : 100mL)용액을 사용하여 실리카겔 컬럼으로 정제하였다. 이렇게 모아진 생성물은 60℃의 오일중탕 속에서 5시간동안 진공건조 하였다. 연한 갈색의 점도가 높은 액체로 단계 수득율은 14g, 53%이었다.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.0-3.2( m, 1H, -(CH₂CH₂O)₃-CH-)

2.2(s, 6H, (CH₃)₂N-)

N-(테트라에톡시콜레스테릴)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드의 제조

이렇게 하여 얻어진 3-(N,N-디메틸아미노테트라에톡시)콜레스테롤 (11g, 18.6mmol)을 건조된 아세토니트릴 5mL에 녹여 고압 반응기에 넣는다. 이 고압 반응기를 드라이아이스에 담아 냉각시킨 후 클로로메탄 50mL을 넣고, 반응용기를 밀폐시키고 70℃의 오일중탕 속에서 48시간동안 반응시킨다. 얻어진 생성물은 건조된 아세토니트릴을 이용하여 재결정한다. 수득율(9.4g, 78%)

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, C=CHof cholesterol)

3.9(s, 2H, (CH₃)₃NCH ₂-)

3.6(s, 9H, (CH ₃)₃N-)

하기 반응식 1에 상기 실시예 1에 따른 반응과정을 나타내었다.

실시예 2

2-브로모에톡시콜레스테롤의 합성

건조된 아세토니트릴 200mL에 콜레스테릴메질레이트(31 g, 66.7 mmol)과 2-브로모에탄올 (14.2 ml, 198 mmol)를 서서히 넣어준 후 60℃에서 24시간 교반하였다. 용매를 감압 증류하여 제거시키고 증류수 500 mL를 넣은 후, 디에틸에테르 1500mL로 추출하였다. 유기층을 증류수로 여러번 씻은 다음 무수 MgSO₄로 건조, 농축 후 헥산 : 에틸아세테이트(20 : 1) 용액을 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리하여 흰색 결정 (18g, 54.7%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.8(t, 2H, BrCH ₂CH₂-O-)

3.5(t, 2H, BrCH₂CH ₂O-)

3.1(m, 1H, BrCH₂CH₂OCH-)

N-콜레스테릴옥시에틸-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드의 합성

건조된 아세톤 300 mL에 3-(2-브로모에틸)콜레스테롤(36.6 g, 74.1 mmol)과 N,N-디메틸 에탄올아민 (37.3 ml, 370 mmol)을 동시에 넣어준 후 50℃에서 48시간동안 교반하였다. 생성된 결정을 여과, 건조 후 클로로포름 : 메탄올 (6 : 1)용액을 사용하여 실리카겔 컬럼으로 분리한 다음, 다시 에탄올로 재결정하여 흰색의 결정 (31.1g, 72%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

5.0(s, 1H,HOCH₂CH₂N(CH₃)₂-)

3.4(s, 6H, HOCH₂CH₂N(CH ₃)₂-)

상기 실시예 2의 반응과정을 하기 반응식 2에 나타내었다.

실시예 3

N-[3-(콜레스테릴)옥시에틸]-N,N-디메틸-N-[2-(하이드록시)프로필]암모늄 브로마이드의 제조

건조된 3-(2-브로모에틸)콜레스테롤(6g, 0.01mole)과 건조한 N,N-디메틸아미노-2-프로판올 (47.9g, 44eq)을 건조한 아세톤 200mL에 녹여 35∼40℃에서 48시간동안 교반하였다. 정반응이 진행되면서 아세톤 용액에 흰색의 고체가 형성되었고, 이를 TLC(헥산 : 에테르 / 4 : 1)로 반응 완결여부를 확인하였다. 반응물은 아세톤 약 150mL 정도 감압 증류한 후 생성된 흰색의 고체는 여과하였다. 여기서 얻어진 고체는 40℃에서 2시간동안 진공 건조한 후, 아세토니트릴 200mL과 무수에탄올 8mL을 이용하여 재결정하였다. 얻어진 흰색의 고체는 클로로포름 : 메탄올(7 : 3)용액으로 실리카겔 컬럼을 이용하여 분리한 후, 무수에탄올로 재결정 하였다. 수득율 2.5g, 42%이었다.

¹H NMR(CDCl3, ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.8(m, 1H, CH₃(OH)CHCH₂-)

3.4(s, 6H, CH₃(OH)CHCH₂N(CH₃)₂-)

1.1(d, 3H, CH₃(OH)CHCH₂-)

상기 실시예 3의 반응과정을 하기 반응식 3에 나타내었다.

실시예 4

N-{2-[3-(콜레스테릴옥시)에틸]}-N,N,N-트리에틸암모늄 브로마이드의 제조

3-(2-브로모에틸)콜레스테롤 5g(0.01mole)과 건조한 아세톤 250mL이 들어있는 500mL 플라스크에 사용직전 정제한 트리에틸아민 50mL을 넣고 35∼40℃에서 48시간동안 교반한다. 정반응이 진행되면서 건조한 아세톤 용액에 흰색의 고체가 형성되었고, 반응용액을 TLC로 확인하여 반응완결 여부를 판단하였다. 얻어진 흰색의 고체는 클로로포름 : 메탄올(7 : 3) 혼합용매로 실리카겔 컬럼을 이용하여 분리하였다. 분리된 생성물을 모아 무수 에탄올로 재결정하여 흡습성 흰색의 고체를 얻었다. 재결정 후 수득율은 2.1g, 35.6%이었다.

¹H NMR(CDCI₃,ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.5(m, 8H, (CH₃CH ₂)₃NCH ₂-)

1.3(t, 9H, (CH₃CH₂)₃N-)

상기 실시예 4의 반응과정을 하기 반응식 4에 나타내었다.

실시예 5

N-{2-[3-(콜레스테릴옥시)에틸]}-N,N,N-트리메틸암모늄 브로마이드의 제조

3-(2-브로모에틸)콜레스테롤 5g(0.01mole)과 건조한 아세톤 250mL이 들어있는 500mL 플라스크에 사용직전 정제한 트리메틸아민 50mL을 넣고 35∼40℃에서 48시간동안 교반한다. 정반응이 진행되면서 건조한 아세톤 용액에 흰색의 고체가 형성되었고, 반응용액을 TLC로 확인하여 반응완결 여부를 판단하였다. 얻어진 흰색의 고체는 클로로포름 : 메탄올(7 : 3) 혼합용매로 실리카겔 컬럼을 이용하여 분리하였다. 분리된 생성물을 모아 무수 에탄올로 재결정하여 흡습성 흰색의 고체를 얻었다. 재결정 후 수득율은 2.1g, 35.6%이었다.

¹H NMR(CDCI₃,ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

3.9(s, 4H, -NCH ₂CH ₂O-)

3.5(s, 9H, (CH₃)₃N-)

상기 실시예 5의 반응과정을 하기 반응식 5에 나타내었다.

실시예 6

N-콜레스테릴옥시에틸-N,N,N-트리하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(CETA)의 제조

건조된 아세톤 50 mL에 2-브로모에틸 콜레스테릴 에테르 (5g, 10.13 mmol)과 트리에탄올아민 20mL을 동시에 넣어준 후 50℃에서 48시간 교반하였다. 생성된 결정을 그래스 필터를 사용하여 여과해내고 건조 후 클로로포름 : 메탄올 (4 : 1) 용액으로 실리카겔 컬럼을 사용하여 분리 한 다음 다시 에탄올로 재결정하여 흰색 결정을 얻었다. 수율은 2g, 30%이었다.

¹H NMR(CDCI₃,ppm) : 5.3(t, 1H, 콜레스테롤의 C=CH)

5.0(s, 3H,HOCH₂CH₂)

4.2(t, 6H, HOCH ₂CH₂N-)

3.5∼4.0(m, 8H, (HOCH₂CH ₂)₃NCH ₂CH₂O-)

상기 실시예 6의 반응과정을 하기 반응식 6에 나타내었다.

실시예 7

플라즈미드 DNA 제조

플라즈미드 DNA 분리를 위한 균주로는 pCMV-베타-gal로 형질전환된 DH5α 대장균과, pCIS-CAT로 형질전환된 DH5α대장균을 사용하였고, 플라즈미드 DNA 분리에는 퀴아젠(QUIAGEN) 플라즈미드 정제 키트를 사용하였다. LB-앰피실린 고체배지에서 배양한 콜로니로부터 접종균을 얻어 20㎍/mL 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 접종한 후, 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 퀴아젠(QUIAGEN) 플라즈미드 정제 키트를 사용하여 플라즈미드 DNA를 다음과 같이 분리하였다.

먼저, 배양액을 5,000×g 로 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 10mL의 P1 완충용액으로 재현탁시켰다. 다시 10mL의 P2 완충용액을 넣고 실온에서 5분간 방치한 후 10mL의 P3 완충용액을 넣고 얼음에서 20분간 방치하였다. 4℃, 30,000×g에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 QBT 완충용액으로 평형을 맞춘 컬럼(column)에 넣고 30mL QC 완충용액으로 2번 세척한 후, 5mL QF 완충용액으로 용출시킨 뒤 0.7 부피의 아이소프로판올을 넣고 4℃/20,000×g에서 30분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 70% 에탄올로 DNA를 세척하고 공기중에서 말린 후 증류수에 녹인 다음 UV 스펙트로포토메터로 정량하여 사용하였다. 또한, 얻어진 DNA의 내독소(endotoxin, LPS) 수준(level)은 LAL (limulus amebocyte lysate) 테스트를 실시한 결과, 10EU/mg 이하였으며, 1% 아가로스겔(agarose gel)에 실험(running)하여 재차 환형의 슈퍼코일 프라즈미드 DNA(circular supercoiled plasmid DNA)의 형태를 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 8

양이온성 리포좀의 제조

상기 실시예 1 내지 6에서 얻은 양이온성 지질들은 DOPE 및 mPEG-콜레스테롤과 다양한 몰비로 혼합하여 리포좀 제조가 가능하고 본 실시예에서는 일률적으로 대표적인 몰비를 선택하여 각각의 리포좀을 제조하였으며, 이와 같이 제조한 리포좀을 생체외 트랜스펙션에 이용하였다. 따라서, 대표예로 실시예 1의 지질을 기술하였고, 실시예 2 내지 6의 지질들은 동일한 방법으로 리포좀을 제조하였다.

실시예 1의 양이온성 지질 : DOPE : mPEG-콜레스테롤 (1 : 1 : 0.2, 몰비)과 실시예 2의 양이온성 지질 : DOPE (1 : 1, 몰비)의 비율로 지질을 취해 휘톤 (Wheaton) 2mL 유리 격막 바이알(glass septum vial)에 넣고, 과량의 클로로포름에 녹여 지질들을 혼합한 후, 질소환경에서 거의 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발(rotary evaporation)시켜 지질 필름으로 만들었다. 용매를 완전히 제거하기 위해 지질 필름은 12시간 더 진공건조하였다. 큰 멀티-라멜라 소포(MLV)를 만들기 위해 여기에 엔도톡신이 없는(endotoxin-free) 3차 정제수 1mL을 첨가하고 바이알을 37℃로 하여 밀봉 후 1분간 교반(vortexing)하였다. 작은유니-라멜라 소포(SUV)은 미니-압출기(Avanti Polar Lipids, Inc)를 사용하여 0.1㎛ 폴리카보네이트 막을 30회 반복 통과시켜 제조하였다. 한편, 작은 초음파 처리된 유니-라멜라 소포(SUV)은 질소환경에서 인버트된 컵 초음파기(inverted cup sonicator; Heat systems)를 이용하여 60분간 초음파 처리하였다. 이렇게 하여 제조한 리포좀은 0.22㎛ 필터를 이용해 여과하여 사용 전까지 4℃에 보관하였다. 얻어진 리포좀은 광 스켓터링(Light Scattering) 측정 결과, 입자 크기는 평균 100∼150nm 정도였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 9

DNA/양이온성 리포솜의 결합비율 시험

양이온성 리포솜이 DNA와의 결합여부 및 완전하게 결합하는 비율을 알아보기 위해 각각의 지질들을 하기 비율별로 혼합한 후 전기영동을 실시하였다. DOPE와 실시예 1 내지 6의 지질을 각각 1 : 1(mol/mol)의 비율로 제조한 각각의 양이온성 리포솜은 λHind Ⅲ Marker DNA와 각각 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 : 1의 무게비로 천천히 혼합한 후, 15분간 실온에 방치하였다. 0.8%-아가로스겔에 DNA/리포좀 복합체를 조심스럽게 로딩(loading)한 후, 50V에서 전기영동을 실시하였다. 그 결과, 실시예 1 내지 6의 지질들은 모두 DNA와 탁월한 결합 능력을 나타냈으며, DNA : 양이온성 리포솜의 비가 대략 1 : 4 정도에서 모든 DNA가 리포솜에 의해 완전히 결합되었음을 확인하였고, 이는 복합체의 전체 전하가 양이온을 형성하는 지점임을 의미한다. 또한, 0.2 mole%의 mPEG-콜레스테롤을 함유, 즉, 본 발명의 양이온성 지질 : DOPE : mPEG-콜레스테롤 (1 : 1 : 0.2, 몰비)로 구성된 리포솜들에서도 이와 유사한 결과가 얻어졌다.

실시예 10

생체외 유전자 전달효율 시험을 위한 DNA/양이온성 리포솜 복합체의 제조

플라즈미드 DNA와 리포솜 복합체는 DNA 0.5mL(mg/mL)과 리포솜 0.5∼4mL(mg/mL) 서서히 혼합하여 제조하였다. 이렇게 제조된 복합체는 트랜스펙션전 15분간 실온에서 배양한 후 시험에 사용하였다. 한편, 과량의 양이온성 지질사용으로 복합체는 양전하를 띄게된다. 이로 인해 세포로의 접근을 용이하게 하여 지속적이고도 효율적으로 DNA를 전달할 수 있게 된다.

실시예 11

세포배양

HeLaS3, HepG2, Hep3B, NIH3T3과 COS-7(SV-40 virus transformed monkey kidney cell line) 세포주은 ATCC((American Type Culture Collection), CRL 1651)으로부터 구입하여 사용하였고, 10% w/v 우태아혈청(Gibco BRL, Gaitherburg, Md.)과 100units/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM(Gibco BRL, Gaitherburg, Md.)에 배양하였다. 트랜스펙션을 위해 세포는 6-웰 플레이트(Falcon Ware, Benton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)에 약 60∼80% 정도 균일한 분포로 자라도록 한 후, 상기 실시예 10에서 얻어진 각각의 DNA : 리포좀 복합체를 도입하였다. 각 웰당 pCMV-베타-Gal 1㎍을 지질과 혼합후에 각 웰에 도입한 후 4시간 후에 메디아(media)를 교체하였다. 37℃/CO₂배양기(incubator)에서 X-gal 염색(staining)을 위해서는 48시간, 루시퍼라제 검정 (luciferase assay)을 위해서는 24시간 배양한 후 각각 발현 효율을 측정하는 실험에 이용하였다.

실시예 12

실험실에서 유전자 트랜스펙션(In Vitro Gene Transfections)

각각의 세포를 트랜스펙션 전날 6-웰 플레이트에 1×10⁵/well 개씩 시딩 (seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60∼80%정도 균일하게 성장했을 때 트랜스펙션을 실시하였다. DNA와 각각의 리포솜은 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6의 비율로 혼합 후 실온에서 15분간 방치하였다. 플레이트를 혈청이 포함되어 있지 않은 메디아로 세척하고, DNA : 리포좀 복합체를 각 웰에 도입하였다. 37℃/CO₂배양기에서 4시간 경과 후에 플레이트의 각 웰에 혈청이 포함되어있는 메디아 1mL씩 첨가하고 24시간 또는 48시간동안 배양한다. 세포내 트랜스펙션 프로토콜(Cellular Transfection Protocol)은 다음과 같다.

1. 두 개의 에픈드롭 튜브(ependorp tube)(× 플레이트의 웰 수)에 혈청이 포함되어 있지 않은 배지 100㎕씩을 넣고, DNA와 리포좀을 각 비율별로 넣는다.

2. DNA를 리포좀에 서서히 첨가하고 2∼3회 천천히 피펫팅(pipetting)한 후 15분간 실온에서 방치한다.

3. 10분이 지나면 6-웰 플레이트를 배양기에서 꺼내어 배지를 제거하고, 혈청이 포함되어 있지않은 배지 메디아 2mL씩을 각 웰에 넣어둔다.

4. 200㎕의 DNA/리포좀 복합체 용액이 들어있는 에픈드롭 튜브에 800㎕의 혈청이 포함되어 있지않은 배지를 넣는다.

5. 셀이 잘 씻어지도록 플레이트를 몇번 좌우로 기울여준 후, 플레이트속의 배지를 제거한다.

6. 대조구 웰에 혈청이 없는 메디아 1mL를 첨가한다.

7. 각 웰에 에픈드롭 튜브에 있는 용액(1mL)을 첨가하고, 웰에 고루 퍼지도록 좌우로 기울려 주고, 셀 상태를 현미경으로 관찰한다.

8. 37℃/5%-CO₂배양기에 넣고, 4시간 방치한다.

9. 혈청이 들어있는 메디아 1mL씩을 각 웰에 넣고, 원하는 실험조건에 따라 24시간 또는 48시간동안 방치한 후 다음 실험을 진행한다.

실시예 13

X-Gal 염색을 통한 발현효율 측정

X-gal 염색을 위해 실시예 12에서 얻은 세포를 우선 PBS로 2회 세척한 다음, 세포를 0.5% 글루타알데하이드 PBS 용액에서 15분 동안 실온에서 고정하였다. 고정용액을 제거하고 다시 PBS로 2회 세척한 후, X-gal(Stratagene, USA) 용액으로 3∼5시간 37℃에서 염색하였다. X-gal 1㎖/㎖ DMSO로 제조한 용액과 X-gal 완충용액 (0.01 Sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 2mM MgCl₂, 5mM ferrocyanide, 5mM ferricyanide, 0.01M PBS)를 혼합한 후 0.45㎛ 필터로 여과하여 사용하였다. 그 결과 대다수의 세포에서 높은 발현 효율을 나타내었으며, COS 7, Hep 3B, NIH 3T3 세포에서 가장 발현 효율이 높았으며, 전체 세포수 대비 대략 25% 이상의 세포에서 X-gal 염색이 되었다.

실시예 14

CAT 분석

셀을 200mM Tris-HCl(pH7.4) 100㎕ 에 넣는다. 몇 차례의 냉동/해빙 후 상층액 50㎕을 취하여¹⁴C-표지된 클로르앰페니콜(chloramphenicol)(0.1μCi; 특이활성, 47μCi/mmol; 1 Ci = 37 GBq)를 포함하는 Tris-HCl 40㎕에 첨가하였다. 37℃에서 5분후에 4mM 아세틸 CoA 20㎕을 첨가하였다. 37℃에서 1시간후, 클로르앰페니콜과 아세틸화 유도체를 에틸 아세테이트로 추출하고, TLC로 분리하여 방사선 사진(autoradiograph)을 만들었다. 방사선 사진은 LKB UltroScan 농도계 (densitometer)로 분석하였다. 그 결과, 양이온성 리포좀과 DNA의 복합체 처리구에서 대조구보다 높은 CAT 활성을 보였다.

실시예 15

전자현미경사진촬영

시료를 초음파 분산기를 써서 물속에 분산시켜 소포를 만들고 시료 수용액과 2% 우라닐아세테이트(uranyl acetate)와 1 : 1로 섞어 착색한다. 슬라이드 글라스위에 시료용액 0.02mL과 우라닐아세테이트(2%용액) 0.02mL을 시료용액에 떨어뜨리고 잘 섞어준다. 여기서 약간을 취하여 포름바(formvar)막으로 코팅된 그리드(grid)위에 시료용액을 떨어뜨리고 3시간 동안 자연건조시킨 다음, 전자 현미경 사진을 촬영한다. 이때 건조시간을 짧게하면 전자 현미경 촬영시 전자빔을주사할 때 포름바 막이 파열된다. 따라서 건조는 오래 할수록 좋으며 24시간 정도 상온에서 건조시키는 것이 알맞다. 도 3에서와 같이, 전자 현미경 사진 촬영 결과 본 발명에서 개발된 양이온성 지질들은 수용액상에서 평균 직경 100∼150nm의 구 모양의 다중막구조를 이룸을 알 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 양이온성 양성지질은 다가의 양이온을 포함하고 있어 유전자 등의 생물학적 활성 물질들을 세포내로 탁월하게 전달할 수 있으며, 중한 독성이나 불안정성을 갖지 않으므로 임상에서 유전자 치료에 적합한 약물전달 체계가 될 수 있다. 또한, 비교적 제조 및 정제가 수월하여 상업성 또한 뛰어나다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질.

화학식 1

상기 식에서 y는 1 내지 20 사이의 자연수이고; R₁∼R₃는 서로 같거나 다른 수소, 탄소수 1∼10 사이의 알킬 또는 하이드록시 알킬기, 또는 탄소수 7∼11 사이의 아릴 또는 알알킬기이며; R₄는 콜레스테롤 라디칼이고; X는 약학적으로 허용 가능한 음이온이다.
제1항에 있어서, 상기 X는 Br, Cl, I, CH₃CO₂또는 CF₃CO₂인 것을 특징으로 하는 양이온성 지질.
(a) 다른 지질과 복합체를 형성하는 유효량의 제1항에 따른 양이온성 지질을 포함하는 조성물과 음이온성 분자물질을 접촉시켜 지질 복합체를 형성시키는 단계; 및

(b) 상기 지질 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포에 음이온성 분자물질을 전달하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 부가적인 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포에 음이온성 분자물질을 전달하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 부가적인 지질인 DOPE, DOPC, PC, mPEG-콜레스테롤 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택됨을 특징으로 하는 세포에 음이온성 분자물질을 전달하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 음이온성 분자물질은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 또는 생물학적 활성 약물인 것을 특징으로 하는 세포에 음이온성 분자물질을 전달하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 세포가 HeLaS 3, HepG 2, Hep 3B, NIH 3T3 또는 COS 7인 것을 특징으로 하는 세포에 음이온성 분자물질을 전달하는 방법.