KR100426544B1 - 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법및 그 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물 - Google Patents
혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법및 그 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간이나 동물의 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법 및 그 방법에 사용되는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 다이싸이오쓰레이톨과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르를 함유하는 핵산 추출용 조성물을 바이러스 핵산을 추출하고자 하는 혈청이나 혈장과 혼합하고, 상기 혼합물을 가열한 후 냉각하고, 이를 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 바이러스 핵산의 추출에 사용되는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 인간이나 동물의 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법과 그 추출 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 다이싸이오쓰레이톨(Dithiothreithol, DTT)과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르(Ethylphenolpolyethyleneglycoether, Nonidet P40)를 함유하는 핵산 추출용 조성물을 바이러스 핵산을 추출하고자 하는 혈청이나 혈장과 혼합하고, 그 혼합물을 가열하고 냉각한 후 원심분리하는 단계를 포함하는, 인간이나 동물의 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법 및 그 추출 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물에 관한 것이다.
사람 또는 동물의 혈액에는 많은 바이러스가 존재할 수 있다. 그 중피시알(PCR: Polymerase Chain Reaction (중합효소연쇄반응)) 법을 이용하여 혈액 내의 백혈구 또는 적혈구가 아닌 혈청 및 혈장을 사용하여 진단할 수 있는 바이러스는 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), G형 간염 바이러스(HGV), 에이즈 바이러스(HIV), 루벨라 바이러스(Rubella), 인푸루엔자 바이러스(Influenza) 등이 있다. 이때 피시알을 수행하기 위해서는 반드시 해당 바이러스의 핵산, 즉 DNA 또는 RNA를 추출하여야만 바이러스 검사를 할 수 있다.
종래에, 원핵세포와 진핵세포 또는 복잡한 생물 샘플로부터 핵산을 추출하기 위해 전통적으로 사용해 온 것은 페놀과 클로로포름과 같은 유기 용매이다. 이를 사용한 핵산추출은 단백질 분해효소로 효소학적으로 소화하고, 이온 계면활성제로 세포를 깬 다음, 페놀이나 페놀/클로로포름 혼합물로 핵산을 추출한다. 상기 추출에 따라 유기용매 상과 물 상이 분리되고, 물 쪽으로 분배된 핵산을 알콜로 침전시킴으로써 추출된 핵산을 분리할 수 있다. 그러나 페놀이나 페놀/클로로포름 혼합물은 인간 피부를 파괴하고 위험한 폐기물로 간주되므로, 조심스럽게 다루어야 하고 잘 폐기해야 한다. 게다가 추출 과정은 시간이 많이 들고 번거로운 과정이다. Marmur는 J.Mol. Biol. 3:208- 218 (1961)에서 효소처리, 계면활성제 첨가, 그리고 페놀 또는 페놀/클로로포름과 같은 유기 용매를 사용하여 원핵생물에서 DNA를 추출하고 정제하는 과정에 대해 기술하였다.
한편, 케이오트로픽 염(chaotrophic salt)은 뉴클레이즈(nuclease)와 프로테이즈(protease)를 저해한다는 사실로 인하여, 세포를 깨서 용액 상으로 핵산을 분비시키는 경우, 구아니디움 싸이오시아네이트(GnSCN)와 같은 케이오트로픽 물질을 널리 사용하고 있다. 이에 대해, Chirgwin 등은 Biochemistry 18:5294-5 299(1979)에서 구아니디움 싸이오시아네이트(Guanidium thiocyanate) 와 2-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 하에서 세포를 균질화하고, 에탄올 침전이나 세슘클로라이드(CsCl) 침전에 의해 RNA를 분리하는 것을 기재하고 있다. 그러나, 이온 계면 활성제와 케이오트로프는 양립할 수 없고, 높은 몰농도의 염을 사용할 때 핵산은 수상(aqueous phase)으로 쉽게 분리되기 어렵기 때문에, 이 케이오트로픽 염으로부터 핵산을 분리하기가 어렵다는 것이 밝혀졌다.
핵산 분리 과정 동안에 뉴클레이즈를 효과적으로 저해하는 능력은 특히 시작 물질이 혈액과 같이 복잡한 경우에 매우 중요하다. Brownhill 등은 Biochem.J.73:434(1959)에서 벤토나이트(bentonite)가 뉴클레이즈의 저해제임을 보고하였고, Fraenkel-Conrat 등은 Virology 14:54-58(1961)에서 토바코 모자이크 바이러스를 정제하는 과정에서 리보뉴클레이즈를 저해하기 위해 벤토나이트를 사용하는 방법을 개발하였다. 이후 연구원들은 RNA를 정제하는 과정에서 리보뉴클레이즈 활성을 감소하기 위하여 벤토나이트와 페놀과 클로로포름을 혼합하여 사용하는 것을 보고하였다.
그러나 상기의 방법들 중 페놀이나 페놀/클로로포름과 같은 독성 물질을 사용하는 경우에는 생명체나 환경에 위험한 영향을 미치게 되고, 케이오트로픽 물질을 사용하는 경우에는 이들 물질로부터 핵산을 분리하기가 용이하지 않다. 그 밖에도 상기의 방법들을 사용하는 경우에는 그 추출 과정에 시간과 노력의 소비가 많다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하여 비세포성 생체액, 바람직하게는 혈장이나 혈청으로부터 바이러스 핵산을 간단하고 신속하게 추출하기 위한 핵산 추출용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 추출용 조성물을 이용하여, 비세포성 생체액, 바람직하게는 혈장이나 혈청으로부터 바이러스 핵산을 간단하고 신속하게 추출하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 간단하고 신속하게 추출되는 핵산을 피시알에 적용함으로써, 용이하게 바이러스의 핵산을 진단하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
도 1은 B형 간염 바이러스의 피시알(PCR) 결과 사진이다.
도 2는 C형 간염 바이러스의 피시알(PCR) 결과 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 한 측면은 다이싸이오쓰레이톨, 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 및/또는 비이온계 계면활성제인 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트를 함유하는, 혈액으로부터 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 바람직하게, 인간 또는 동물의 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산을 추출하는데 사용할 수 있다.
상기 조성물로 추출 가능한 바이러스는 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), G형 간염 바이러스(HGV), 에이즈 바이러스(HIV), 루벨라 바이러스(Rubella), 및 인푸루엔자 바이러스(Influenza) 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로, 상기 조성물은 1몰의 다이싸이오쓰레이톨을 0.5∼5.0 부피%로 함유하고, 10% 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르를 0.5∼5.0 부피%로 함유한다.
상기 조성물이 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트를 더 포함하는 경우, 이들의 최종 농도는 각각 0.5∼5.0 부피%인 것이 바람직하다.
바이러스 핵산이 DNA인 경우에는 상기 조성물을 증류수에 희석하고, 바이러스 핵산이 RNA인 경우에는 상기 조성물을 디이피시(DEPC: Diethyl Pyrocarbonate) 처리된 증류수에 희석하는 것이 바람직하다.
바이러스 핵산이 RNA인 경우 디이피시를 처리한 증류수를 사용하는 이유는, RNA분해효소는 여러 가지 처리에도 안정하나 디이피시를 처리하면 그 활성이 제거되기 때문에, 추출되는 RNA의 안정성을 위하여 사용한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 바이러스 핵산을 추출하고자 하는 혈청 또는 혈장을 상술한 본 발명에 따른 핵산 추출용 조성물과 혼합하고, 혼합된 용액을 가열하고, 가열한 용액을 냉각하고, 냉각된 용액을 원심분리하는 단계를 포함하여 구성되는, 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산을 추출하는 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따라 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산을 추출하는 방법은, 종래 단백질 분해 효소로 분해하는 과정 대신, 간단히 본 발명에 따르는 핵산 추출용 조성물을 혈청 또는 혈장과 혼합하여 가열하는 단계로 대체할 수 있고, 그 후 별도 추출액의 첨가 없이, 상기 가열된 용액을 냉각 및 원심분리함으로써 그로부터 바로 핵산을 추출할 수 있는 방법으로서, 핵산 추출을 위한 전체 공정을 대단히 간소화하고, 그에 따른 시간 및 노력을 절약할 수 있도록 하는 방법이다.
상기 본 발명에 따른 방법에서, 혈청 또는 혈장과 핵산 추출용 조성물의 혼합액을 가열하는 단계는 80∼120℃의 온도에서 2∼10분간 가열하고, 상기 원심분리하는 단계는 10,000∼15,000rpm에서 2∼10분간 원심분리하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기의 실시예에서 특별한 언급이 없는 경우에는 상온에서 실시한 것이다.
실시예 1
(바이러스 DNA 핵산 추출용 조성물의 제조)
하기의 다이싸이오쓰레이톨은 0.01M 초산 나트륨(pH 5.2)에 녹인 후 필터로 걸러서 사용하였다. 초산 나트륨은 초산 나트륨을 3차 증류수에서 초산으로 pH를 5.2로 맞춘 후 고압 멸균하여 사용하였다.
하기의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르는 단백질 용해와 Taq 중합효소(Polymerase)를 안정화하는 역할을 하는 것으로서, 10% 원액을 사용하였다.
하기의 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트와 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트는 비이온계 계면활성제이며, 원액을 사용하였다.
실시예 1-1
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 및 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 원액 10㎕를 증류수에 희석하여, 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예1-2
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 원액 10㎕, 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트(Polyoxyethylene sorbi tan monolaurate,Tween 20) 원액 10㎕를 증류수에 희석하여 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예 1-3
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 원액 10㎕, 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween 80) 원액 10㎕를 증류수에 희석하여 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예 2
(바이러스 RNA 핵산 추출용 조성물의 제조)
실시예 2-1
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 및 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르원액 10㎕를 디이피시 처리한 증류수에 희석하여 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예 2-2
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 원액 10㎕, 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 10㎕를 디이피시 처리한 증류수에 희석하여 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예 2-3
1M의 다이싸이오쓰레이톨 10㎕, 10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 원액 10㎕, 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트 원액 10㎕를 디이피시 처리한 증류수에 희석하여 전체 부피를 1000㎕로 만든 후 동결시켰다.
실시예 3
(바이러스 핵산의 추출 방법)
1) B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈액을 채취하고, 이를 원심분리하여 적혈구, 백혈구 등의 고형분을 제거한 혈청 또는 혈장에, 동량의 상기 실시예에서 제조된 핵산 추출용 조성물을 넣어 잘 섞었다.
2) 상기 혈청 또는 혈장 및 핵산 추출용 조성물의 혼합액이 들어 있는 용기를, 온도를 95℃로 맞추어 놓은 수조에 넣어 2분간 가열하였다.
3) 가열된 혼합액을 꺼내어 준비된 얼음에서 냉각하였다.
4) 13,000rpm에서 4분간 원심 분리하여 분리된 상층액을 얻었다.
실시예 4
(피시알)
위와 같은 과정을 통하여 얻은 상층액 중 일부를 피시알에 사용하거나, 또는 피시알 반응액을 위의 용기에 바로 첨가하여 피시알을 시행하였다.
피시알의 조성 및 반응 조건은 아래의 표와 같았다.
실시예 4-1: B형 간염 바이러스의 피시알
표 1은 B형 간염 바이러스의 피시알의 조성 및 반응 조건에 관한 것이다.
[표 1] B형 간염 바이러스의 피시알 조성 및 반응 조건
실시예 4-2: C형 간염 바이러스의 알티-피시알
표 2는 C형 간염 바이러스의 피시알 조성 및 반응 조건에 관한 것이다. C형 간염바이러스의 피시알은 알티-피시알(RT-PCR)로 RNA로부터 리버스 트랜스크립테이즈를 사용하여 피시알을 수행하였다.
[표 2] 알티-피시알 조성 및 반응 조건
상기의 방법에 의해 피시알을 수행하고 그 결과를 아가로스 젤(agarose gel)전기영동을 통하여 알아보았다. 전기 영동의 조건은 2% 아가로스 젤에서 100V, 3분간 전기영동을 하였다.
전기 영동을 한 후 밴드의 유무를 통하여 B형 간염바이러스나 C형 간염바이러스의 핵산이 추출되었는지의 여부를 관찰하였다.
상기의 과정에 의해 바이러스의 핵산이 분리된 결과를 도 1과 2에서 나타내고 있다.
도 1에서는 B형 간염바이러스의 피시알 결과 사진을 보여준다. M은 ФX 174/Hae Ⅲ의 분자량 표준 마커를 나타내고, 1-10 레인은 256bp의 HBV 양성 검체이고 11-15 레인은 B형 간염바이러스 음성검체를 나타낸다. 도 1에서 나타난 바와 같이 본 발명을 사용하여 DNA를 추출하고, DNA 바이러스인 B형 간염 바이러스의 피시알을 시행하여 보았더니, 10개의 양성(1-10번)에서 모두 양성이 나타났으며, 음성 대조군 5개(11번-15번)에서는 음성의 결과를 보였다.
또한, 도 2에서는 C형 간염바이러스의 피시알 결과 사진을 나타낸다. 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명을 사용하여 RNA를 추출하고, RNA 바이러스인 에이치씨브이(HCV)의 피시알을 시행하여 보았더니, 10개(1번-10번)의 양성에서 모두 양성이 나타났으며, 음성 대조군 5개(11번-15번)에서는 음성의 결과를 보였다.
상기 실시예에 따른 핵산 추출용 조성물을 사용하여 바이러스의 핵산을 추출하는데 소요되는 시간은 5-10분 정도였다. 이는 일반적으로 사용하는 상품화된 추출 키트, 예를 들어 Molecular Research Center, Inc.의 TRI REAGENT BD 키트를 사용하여 RNA를 추출하는 경우 약 60분 이상 소요되고 DNA를 추출하는 경우 약 30분이상 소요되는 것에 비하면, 약 1/8 정도의 시간에 핵산을 추출할 수 있는 방법이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산의 추출 방법은 추출 과정이 빠르고 간단하여 기술 및 오염에 의한 결과의 이상을 최소화 할 수가 있고, 핵산 분해 효소에 대한 영향도 상대적으로 적게 받아 전체적으로 양호한 핵산을 얻을 수 있는 장점도 있다.
한편, 핵산 추출시 다이싸이오쓰레이톨, 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트의 상기 세 가지 물질을 모두 사용한 경우 효과가 가장 좋았고, 다이싸이오쓰레이톨과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르를 혼합하여 사용하는 경우에도 핵산 추출이 용이하지만, 다이싸이오쓰레이톨과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르와 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트를 함께 사용한 경우에 명확한 상층액을 얻을 수 있었다.
상기 본 발명의 구성에 따르면, 단순히 본 발명에 따른 핵산 추출용 조성물을 혈청 또는 혈장과 혼합하여 가열하고, 이를 냉각한 후 원심분리하여 상층액을 직접 피시알 반응에 적용시킴으로써, 혈청 또는 혈장으로부터 핵산, 특히 질병과 관련된 바이러스 핵산의 존재 여부를 간단하고 신속하게 판단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 추출 방법은 그 절차가 간단할 뿐만 아니라 핵산분해효소에의 노출 시간도 줄여서, 핵산의 안정화에 기여하여 보다 완전한 핵산 서열을 갖는 핵산의 수율을 높일 수 있다.
Claims (8)
1M 다이싸이오쓰레이톨 0.5∼5.0 부피%와,
10%의 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 0.5∼5.0 부피%, 및
나머지 양의 증류수 또는 디이피시 처리 증류수를 함유하는 핵산 추출용 조성물.
제 1 항에 있어서, 0.5∼5.0 부피%의 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노오레이트를 더욱 포함하는 핵산 추출용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 인간 또는 동물의 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산을 추출하는데 사용하는 핵산 추출용 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 바이러스는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV), G형 간염 바이러스(HGV), 에이즈 바이러스, 루벨라 바이러스, 및 인푸루엔자 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 추출용 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 바이러스 핵산이 DNA인 경우, 상기 조성물은 다이싸이오쓰레이톨과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 및 증류수를 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 바이러스 핵산이 RNA인 경우, 상기 조성물은 다이싸이오쓰레이톨과 에틸페놀폴리에틸렌글리코에테르 및 디이피시 처리된 증류수를 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
a) 혈청 또는 혈장을 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 추출용 조성물과 혼합하는 단계,
b) 상기 혼합 용액을 80∼120℃ 온도에서 2∼10분간 가열하는 단계,
c) 상기 가열 용액을 냉각하는 단계, 및
d) 상기 냉각된 용액을 10,000∼15,000rpm에서 2∼10분간 원심분리하는 단계를 포함하는, 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산을 추출하는 방법.
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR910001034A (ko) * | 1989-06-08 | 1991-01-30 | 후지따 아쓰시 | 핵산 정제용 조성물 |
| US5231015A (en) * | 1989-10-18 | 1993-07-27 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme |
| WO1996005922A1 (en) * | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Wemo Nederland B.V. | Method and device for the deformation of plate material |
| US5612473A (en) * | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
| US5945515A (en) * | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
| KR20010047426A (ko) * | 1999-11-19 | 2001-06-15 | 성동제 | 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산의 추출방법과 그핵산 추출용 조성물 |
-
2000
- 2000-12-08 KR KR10-2000-0074610A patent/KR100426544B1/ko not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR910001034A (ko) * | 1989-06-08 | 1991-01-30 | 후지따 아쓰시 | 핵산 정제용 조성물 |
| US5231015A (en) * | 1989-10-18 | 1993-07-27 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme |
| US5543305A (en) * | 1989-10-18 | 1996-08-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods of extracting deoxyribonucleic acids without using a proteolytic enzyme |
| WO1996005922A1 (en) * | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Wemo Nederland B.V. | Method and device for the deformation of plate material |
| US5945515A (en) * | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
| US5612473A (en) * | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
| KR20010047426A (ko) * | 1999-11-19 | 2001-06-15 | 성동제 | 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스 핵산의 추출방법과 그핵산 추출용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| [Biosci Biotechnol Biochem. 1996 Oct;60(10):1565-70] * |
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