KR100457970B1

KR100457970B1 - 경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 황칠 추출물, 황칠분획물 및 이를 함유한 약학 조성물

Info

Publication number: KR100457970B1
Application number: KR10-2002-0015621A
Authority: KR
Inventors: 정세영
Original assignee: 주식회사 디피바이오텍
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: KR20030075999A

Abstract

본 발명은 경조직 재생 촉진 효과를 가지는 황칠 추출물에 관한 것으로, 조골세포 및 치주인대세포 등의 알칼리 포스파타제 활성을 증가시킴으로써 경조직 재생 및 증식 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라, 칼슘염 및 인산염의 침착을 촉진시키므로써 높은 경도를 가지는 경조직을 형성시킬 수 있으며, 생약의 하나인 황칠로부터 얻은 추출물 또는 그 분획물을 포함하는 천연유래 약물로서 부작용을 보이지 않으면서 골조송증, 치주질환 등과 같이 경조직 재생 및 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료를 목적으로 기존의 치료제에 대체하여 안심하고 사용할 수 있는 경조직의 재생과 증식을 촉진하는 황칠 추출물과 그 분획물 및 이들이 함유된 약학 조성물을 포함한다.

Description

경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 황칠 추출물, 황칠 분획물 및 이를 함유한 약학 조성물{Dendropanax morbifera Lev. extract, fraction and pharmaceutical composition containing thereof for recovering and proliferating effects on tibial tissue and periodontium ligamental tissue}

본 발명은 황칠 추출물에 관한 것으로, 특히, 조골세포 및 치주인대세포 등의 알칼리 포스파타제 활성을 증가시킴으로써 경조직 재생 및 증식 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라, 칼슘염 및 인산염의 침착을 촉진시키므로써 높은 경도를 가지는 경조직을 형성시킬 수 있는 황칠 추출물과 그 분획물 및 이들이 함유된 약학 조성물을 포함한다.

인체에 존재하는 경조직은 크게 뼈와 치아로 분류되는데, 이와 같은 경조직에 문제가 생겨 발생하는 대표적인 질환으로는 골조송증과 치주질환이 있다.

여기서, 골조송증(osteoporosis)은 일명 골다공증으로 알려져 있는 질환으로서 총골량이 감소하고 뼈에 구멍이 생겨서 약한 충격에 의해서도 뼈가 쉽게 부서지거나 휘어져버리는 증상을 보이는 질환으로서, 노인층에서 흔히 발견되며 대퇴골골절, 척추골절 등의 골절원인이 되고 있다.

미국의 경우 1985년도의 골조송증에 의한 골절이 130만 건이 발생하였고, 이에 70억 달러의 의료비가 지출되었다. 이 질환은 폐경기, 노화, 갑상선이나 부갑상선의 기능항진, 만성신부전 및 부신피질 호르몬의 투여에 의하여 발생된다. 가장 흔한 것은 여성의 폐경기 이후 에스트로겐 (estrogen)의 감소에 의한 것이다.

인체를 구성하는 골조직은 2/3가 무기물이고, 1/3이 유기물질로 구성되어 있고, 전자는 주로 인산칼슘(Calcium Phosphate)이고, 후자는 주로 콜라겐(collagen)이 주성분이다. 또한 골조직에는 조골세포(Osteoblast), 파골세포(Osteoclast), 골세포(Osteocytes) 등이 골형성 및 재흡수(resorption)에 관여하고 잇으며, 이중 골을 재생하는데 결정적인 역할을 하는 것이 조골세포이다.

조골세포는 생성되는 골의 표면에 위치하며, 골 형성에 필요한 콜라겐 섬유(collagen fiber) 등을 합성 분비한다. 또한 조골세포의 세포막에는 중성 및 알칼리성 포스파타제(phosphatase)가 많이 분포하고 있으며, 이들에 의하여 PO₄ ^-3/Ca⁺²가 침착되어 뼈의 석회화(calcification), 즉, 뼈의 재생이 진행되는 것이다.

상기와 같은 사실은 조골세포의 수가 많으면 뼈의 재생이 빨리 진행되므로골조송증이 유발되지 않으며 조골세포의 수를 증가시킴으로써 골조송증을 치료할 수 있음을 의미한다.

실제로 골형성을 촉진시키는 많은 물질들의 작용기전이 조골세포의 증식을 유도하는 것임이 알려져 있다.

예를 들면, 성장호르몬 (GH, 즉 growth hormon), 유사 인슐린 성장인자 I (IGF-I, 즉 insulin like growth factor I), 변형 성장인자 베타 (TGF-beta, 즉 transforming growth factor beta) 등은 조골세포의 증식을 촉진시켜 뼈의 성장을 촉진하는 성장인자이며, 골조송증에 치료효과가 있는 에스트로겐도 조골세포의 증식을 촉진한다고 알려져 있다.

한편, 알코올 중독증 환자의 경우 뼈가 쉽게 부서지는 것은 알코올이 조골세포의 증식을 억제하기 때문이며, 노인에 있어서 뼈에 관련된 질환도 적어도 부분적으로는 조골세포의 증식이 감소됨으로써 발생된다.

글루코코르티코이드 호르몬(glucocorticoid hormone)은 천식 치료시 투여하는 물질인데 이것도 조골세포의 증식을 억제하여 골조송증을 유발한다.

현재 골조송증 치료를 위해 임상에서 사용되고 있는 약물로는 에스트로겐, 이프리플라본(Ipriflavone, 즉 7-isopropoxy isoflavone), 비스포스포네이트 (Bisphosphonate), 비타민 K₂, 칼슘 제제, 비타민 D, 칼시토닌 등이 있으며, 이들은 혈중 칼슘농도를 증가시킴으로서 골조송증 치료 효과를 나타낸다.

가장 최근에 천연물에서 분리하여 개발된 이프리플라본은 콩의 주성분인 이소플라본의 합성유도체로서 골아세포의 증식과 분화를 촉진하며, 콜라겐합성과 석회화 결절의 생성을 증가시킨다.

그러나, 상기와 같은 약물들은 여러 가지 부작용을 나타내기 때문에 문제점으로 지적되고 있는데, 대표적으로 나타나는 부작용으로는 다음과 같은 것이 있다.

먼저, 에스트로겐 제제는 발진, 자궁 부정기 출혈, 하복부통, 황달, 오심, 구토, 전신 권태감, 체중증가 등이 부작용으로 나타나며, 난소종대 환자 등에 대하여는 투여가 금기시되고 있다.

비스포스포네이트(예를 들어, 상품명Palmidronate)는 가장 흔히 발생하는 부작용으로 발열이 있으며, 파젯씨병 환자에게서 권태감, 투여부위의 혈전성 정맥염, 저인산혈증 등을 유발시킨다. 또한 투여 초기에는 골통증이 나타나며, 경구 투여시는 용량의존적 오심, 복통 등이 발생한다. 그 외에도 일시적인 백혈구 감소증이 일어난다.

칼시토닌(Elcatonin 및 Salcatonin 포함)은 일반적으로 쇼크 등을 일으킬 수 있으므로 투여 전에 충분히 문진해야 하며 사전에 피내 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 또한 과민반응이 나타날 수 있으며 안면홍조, 열감, 흉부 압박감, 오심, 구토, 식욕부진, 설사, 구갈, 현기증, 저나트륨혈증, 소양감, 천식발작, 빈뇨, 부종 등도 발현한다.

비타민 K₂의 사용에 의해 나타내는 대표적인 부작용으로는 복부 불쾌감이 있으며, 이프리플라본 사용에 따른 부작용으로 복부 불쾌감이 가장 빈번히 발생하며,식욕부진, 오심, 구토, 설사, 발진, 소양 등이 발생한다.

따라서, 상기와 같은 기존 약물의 부작용으로 나타나는 문제점을 해결하기 위하여, 상기 약물들보다 상대적으로 부작용의 발현이 적다고 생각되는 천연물 유래 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 치주질환은 세균에 의한 염증발생으로 치은조직과 치조골의 소실이 초래되어 결과적으로 치아가 발거되는 질환인데, 그 질병의 진행정도에 따라 단계적인 치료법이 이용된다. 상기 치주 질환의 시술원리는 원인제거, 질환에 이환된 연·경조직삭제 및 조직 재생을 도모하는 방법이 적용된다.

치주조직의 이상적 치유를 위해서는 치아와 치조골을 연결하는 치주인대의 재형성이 필요하며, 외과적인 시술이 요구된다. 상기 치유과정에서 가장 중요한 사항은 치주인대세포의 치면에의 우선부착과 함께 조골세포의 증식이다.

이러한 치주인대세포는 조골세포와 유사한 생화학적 특성을 가지며, 조골세포와 치근을 덮는 골조직인 시멘트질(cemetum)로 분화가 되는 다기능성 세포로서 분화되어 경조직을 형성하게 된다. 따라서 세포가 치주인대를 재형성하는데 영향을 미칠 수 있는 미세환경의 개선을 위한 외과적 시술도 중요하지만 치주인대세포 및 조골세포의 증식능 및 활성을 증가시킬 수 있는 방법의 개발은 무엇보다도 중요하다. 최근 이러한 관점에서 다음과 같은 새로운 약물의 개발이 활발히 시도되고 있다.

먼저, 수종의 폴리펩타이드 성장인자(polypeptide growth factor)가 인 비트로(in vitro) 상에서 그 효과가 입증되고 있으나 아직 안정성에 문제가 해결되지않아 임상적용에는 문제점이 있으며, 그 추출과정이 복잡하고 장시간이 소요되며 고가이어서 임상적용이 불가능한 상태이다.

현재까지 국내외에서 치주치료제로서 개발된 천연물 유래 약물로는 옥수수(Zea Mays L.) 추출물이 유일하며 상품명 인사돌 등으로 시판되고 있으나, 이 역시 기전은 밝혀져 있지 않고 단지 임상적인 자료에 의거하여 적용되고 있다.

일본에서는 금은화(金銀花)와 연교(蓮翹)의 추출물을 국소약물송달법으로 치주질환 처치에 사용된 바 있으며 인 비트로 상에서 치은섬유아세포에 대한 효과를 보고한 바 있다. 또한, 골무꽃 뿌리(Scutelariae Radix)는 소염작용 및 해열작용이 있는 것으로 보고되었고, 퀘르시트린(Quercitrin)의 항염증 작용이 보고되기도 하는 등 천연물의 약리작용 규명이 계속되고 있다.

최근 골무꽃 뿌리(Scutelariae Radix), 센텔라 아시아티카(Centella asiatica) 등이 상피증식과 치주인대세포의 활성을 증가시킨다는 보고가 있었고, 홍삼 사포닌이 배양치주인대세포의 성장과 분화에 관한 연구에서 세포증식과 석회화 결절형성을 증가시키며 알카리성 포스파타제(alkaline phosphatase)의 활성도도 증가시킨다는 보고가 있었으며, 대조(Zizyphus Fructus)는 치은섬유아세포와 치주인대세포에 대해 유의할만한 화학주성효과가 있는 것이 밝혀져 있다. 또한 마그놀롤(Magnolol)과 히노키올(Hinokiol)이 염증매개물질인 사이토카인(Cytokine) 생성억제효과가 있는 것으로 밝혀지기도 했다.

그러나, 현재 치주질환에 탁월한 효과를 나타내는 약물로서 개발된 것은 전무한 실정이며, 치주질환 치료를 목적으로 지금까지 연구되어온 것들은 염증치유및 염증반응 억제, 치주인대세포증식, 또는 치은세포증식 효과를 나타내는 물질들에 한정되어 있으며 조골세포의 증식능 및 활성을 증가시킴으로써 치주질환을 치료하고자 하는 시도는 없었다.

따라서, 최근에 국내외적으로 인체에 위해함이 없이 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약물 개발에 대한 관심이 더욱 증가되고 있는 실정이다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기한 문제점들을 해결하고, 또한 조골세포 증식 및 분화효과를 나타내어 골조송증 및 치주질환과 같은 경조직 관련 질환에 부작용 없이 적용할 수 있는 약물을 개발하고자 여러가지 천연물 추출물을 스크리닝한 결과, 황칠로부터 얻은 추출물이 치주인대세포의 증식과 분화를 촉진시키는 효과가 있음을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 골조송증, 치주질환 등과 같은 경조직 재생 및 증식과 관련된 질환을 치료할 수 있으며, 상기 질환을 예방할 수 있는 효과를 가지는 황칠 추출물 및 그 분획물과 이를 포함하는 경조직 재생 약학 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

도 1 은 본 발명에서 사용한 황칠나무 (Dendropanax morbiferaLev.) 수지 100 g을 사용하여 순차분석한 개요와 분획물의 수득량을 나타낸 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 경조직 재생 촉진 효과를 가지는 황칠 추출물과 그 분획물 및 이를 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물의 제공을 그 기술적 구성상의 특징으로 한다.

두릅나무과에 속하는 황칠나무(Dendropanax morbiferaLev.)는 우리나라의 남부 해안 지역과 제주도에서 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다.

황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며, 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있고, 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다. 또한, 황칠나무가 번열 제거, 술해독, 안질 및 황달치료, 화상치료, 나병에 효과가 있으며 인체에 무해하다는 기록도 전해진고 있다(이시진, 본초강목, 중국문광도서, 1590).

상기와 같은 황칠은 황금색 도막을 형성하는 도료성분인 비휘발성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1%, 고형분 14.4%를 포함하는 구성성분으로 구성되어있다.

상기 방향성분은 주로 세스퀴테르펜류의 β-cubebene, γ-selinene, δ-cadinene으로 이루어져 있으며, 이들 성분이 신경계에 대한 진정작용과 강장작용을 나타낸다고 알려져 있다(고유농수산품목 세계화 대상품목의 연구조사(황칠편), 전라남도, 1996). 또한, 현재까지 밝혀진 약리작용으로는 앞추출물 분획에서 항암작용과 황칠 추출분획에서 α-토코페롤보다 다소 약한 항산화작용이 있음이 밝혀졌다(특허 공개 제 2000-0004499호, 박호근, 1998).

본 발명의 황칠 추출물은 다음과 같은 생약추출 방법에 따라 추출될 수 있다. 먼저 황칠을 추출용매에 넣고 50 ~ 120℃에서 5 ~ 24시간 동안 가온한 다음 추출액을 40 ~ 60℃로 냉각시키고 여과하여 상등액을 취한다. 바람직하게는 수욕조에서 80 ~ 100℃로 온탕하는 방법을 이용한다. 상기와 같은 추출 및 여과조작을 1회 이상 반복 실시하여 얻은 상등액을 모두 합하여 용매를 증발시켜 농축한다.

또는, 황칠을 추출용매에 넣고 상온 또는 4℃ 에서 5 ~ 7일간 냉침하고 여과하여 상등액을 취하는 추출 및 여과조작을 1회 이상 반복실시하여 얻은 상등액을 합하고 용매를 증발시켜 농축하는 방법을 이용할 수도 있다.

상기한 온도 및 시간범위에서 추출하면 본 발명에 적합한 추출물을 획득할 수 있다.

상기와 같은 두 가지 추출방법으로 황칠을 용액상태에서 추출하여 사용할 수 있으며, 추출용매는 알코올, 바람직한 예로서는 50 ~ 100 %의 메탄올 수용액이 있다. 추출 및 여과조작은 3회 반복 실시하는 것이 바람직하며, 농축액은 건조하여 분말상태로 얻을 수도 있다.

또한, 극성 정도에 따른 분획을 얻기 위해 상기 분말상 메탄올 추출물을 유기 용매인 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 추출 및 여과하는 조작을 3회 반복하여 실시하여 농출액을 수득하는 것이 바람직하며, 상기 수득된 농축액은 건조하여 액상 또는 분말상태로 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용한 황칠나무 (Dendropanax morbiferaLev.) 수지 100 g을 사용하여 순차분석한 개요와 분획물의 수득량을 다음 첨부도면 도 1 에 나타내었다.

본 발명에 따르는 경조직 재생 촉진 효과를 가지는 황칠 추출물 또는 그 분획물은 조골세포 및 치주인대세포의 증식을 촉진시키고 상기 세포들의 알칼리 포스파타제 활성을 증가시킴으로써 경조직 재생 및 증식 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라, 충분한 경도를 갖는 경조직을 형성시킬 수 있는 특징이 있다.

따라서 경조직 재생 또는 경조직 증식의 감소 현상과 관련이 있는 여러가지 질환에 대한 직접 또는 보조 치료제로서 사용할 수 있으며, 적용할 수 있는 질환으로는 골조송증, 치주질환 등이 있다.

또한 본 발명의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 치약 또는 가글링용액에 첨가함으로써 치주질환 예방 목적으로 사용할 수 있으며, 부란성 알껍질의 강화를 목적으로 하는 사료의 첨가물로써 사용할 수도 있다.

본 발명에 따르는 경조직 재생촉진제 조성물은 상기의 황칠 추출물 또는 그 분획물만으로 구성될 수 있으며 또한 기타의 약효성분 및 약제학적 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 예를 들어 본 발명의 약학 조성물을 치주질환(예컨대, 치주염, 치근염 등)에 사용할 경우 항염증 효과를 갖는 약물을 함께 포함시켜 투여하면 보다 탁월한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 임상적으로 투여시에 약제학적으로 허용되는 불활성 담체와 본 발명의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시킨 약학 조성물을 제조하여 투여할 수 있다.

상기 약학 조성물의 적합한 제형으로는 정제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌약제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기한 목적에 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 붕해제 등으로 작용할 수 있는 물질 중의 어느 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

경조직 재생 또는 증식 관련 질환 치료 목적으로 사용됨에 있어서, 본 발명의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물은 초기에는 하루에 황칠 추출물 또는 분획추출물을 체중 kg당 건조분말로서 0.01 ~ 0.10 g을 투여할 수 있으며, 그러나 투여량은 환자의 필요정도, 치료되어야할 상태의 정도, 그리고 사용될 화합물에 따라 변할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하고자 하는 바, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 다음 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서, 다음 실시예의 기재내용으로 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 단, 본 명세서 및 실시예에 기재된 %는 용량%를 의미한다.

실시예 1

황칠 100 g을 80 % 메탄올(메탄올:물=4:1) 500 ml에 넣고 환류 냉각기를 장치한 후 95 ~ 100 ℃ 수욕조에서 12시간 동안 온탕하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각시키고 여러 겹의 거즈로 여과하여 상등액을 취하였다. 이와 같은 추출 및 여과 조작을 3번 반복하여 상등액을 합하고 회전증발장치(rotary evaportor)를 이용하여 감압 하에서 메탄올을 완전히 증발시켜 농축한 다음 소량의 증류수에 용해하였다.

실시예 2

상기 실시예 1에서 최종적으로 얻은 황칠 추출물 농축액을 -80℃에서 얼린 후 동결건조하여 분말을 얻었다.

실시예 3

황칠 100 g을 80% 메탄올 (메탄올:물=4:1) 500ml에 넣고 실온에서 1일간 또는 4℃에서 7일간 냉침한 후 여러 겹의 거즈로 여과하여 상등액을 취하였다. 이와 같은 추출 및 여과 조작을 3번 반복하여 얻은 상등액을 합하고 회전증발장치 (rotary evaportor)를 이용하여 감압 하에서 메탄올을 완전히 증발시켜 농축한 다음 이를 소량의 증류수에 용해하였다.

실시예 4

상기 실시예 3에서 얻은 황칠 추출물 농출액을 -80℃에서 얼린 후 동결건조하여 분말을 얻었다.

실시예 5

상기 실시예 4에서 얻은 황칠 추출물의 건조분말을 분액여두에 넣고 용매인 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 실온에서 1일간 추출한 후 여러겹의 여과지로 여과하여 상등액을 취했다. 이와 같은 추출 및 여과조작을 3번 반복하여 수득한 상등액을 합하고 회전증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 감압하에서 용매를 완전히 증발하여 농축하였다.

실시예 6

상기 실시예 5에서 최종적으로 얻은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물 분획물을 -80℃에서 얼린 후 동결건조하여 분말을 얻었다.

실시예 7 : 정제의 제조

상기 실시예 2에 따라 제조된 황칠 추출물 또는 그 분획물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다. 정제에 사용된 구성성분과 그 사용량은 다음과 같다.

실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물 5.0 ㎎

락토오스 BP 150.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎

실시예 8 : 캡슐제의 제조

상기 실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 체질한 다음 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐중에 충전하여 캡슐을 제조하였다. 사용된 구성성분과 그 사용량은 다음과 같다.

실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물 5.0 ㎎

전분 1500 100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

실시예 9 : 시럽제의 제조

정제수 500 ㎖에 백당을 용해시키고, 별도의 용기에 카르복시메칠셀룰로오스나트륨는 따로 정제수 400 ㎖에 용해시킨 다음 상기 백당을 용해시킨 용액과 혼합한 다음 메칠파라벤과 프로필파라벤을 가하여 용해시킨 후 에탄올을 가한 다음 정제수를 전체 용액의 용량이 1000 ㎖가 되도록 하였다. 여기에 체질한 실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 현탁시켜 시럽제를 얻었다. 사용된 구성성분과 그 사용량은 다음과 같다.

실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물 5.0 g

백당 637.5 g

카르복시메칠셀룰로오스나트륨 2.0 g

메칠파라벤 0.28 g

프로필파라벤 0.12 g

에탄올 20 ㎖

실시예 10 : 파스타제 (치약) 의 제조

실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물과 옥수수 전분을 체질하고 백색 바셀린에 가하여 전질을 균등해질 때까지 연화시켜 파스타제를 제조하였다. 사용된 구성성분과 그 사용량은 다음과 같다.

실시예 2의 황칠 추출물 또는 그 분획물 50.0 g

옥수수 전분 50.0 g

백색 바셀린 100.0 g

실시예 11 : 가글링 용액의 제조

실시예 1의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 정제수에 용해하고, 이것에 박하수 및 정제수를 가해서 전량으로 한 후 여과하여 가글링 용액을 얻었다. 사용된 구성성분과 그 사용량은 다음과 같다.

실시예 1의 황칠 추출물 또는 그 분획물 10.0 g (건조분말의 중량으로서)

박하수 50.0 ㎖

정제수 가함 전량 1000.0 ㎖

실시예 12 : 기능성음료의 제조

상기 실시예 1의 황칠 추출물 또는 그 분획물 0.01 중량%와 식용색소 0.05 중량%, 오렌지 에센스 0.05 중량%, 과당 7.0 중량%, 구연산 0.1중량%, 비타민 C 0.05 중량%를 포함하는 일반 기능성 음료 베이스를 첨가한 조성물을 제조한 다음 정제수를 첨가하여 음료를 제조하였다.

실시예 13 : 약술의 제조

탈취 정제된 40 중량% 알코올을 증류수로 희석하고, 실시예 1 에 따라 제조된 본 발명의 황칠 추출물 0.01 중량%를 첨가하고, 스테비오사이드, 고과당, 아미노산, 구연산, 소금 등을 첨가하여 알코올 함유 농도 15 내지 30중량%로 제조하였다.

실험예 1 : 사람의 치주 인대 세포의 증식 촉진효과

황칠 추출물 또는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물이 사람의 치주 인대 세포(human periodontal ligament cell) 증식속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

먼저 다음의 방법으로 사람의 치주 인대세포를 배양하였다. 교정치료 목적으로 내원한 환자의 제 1 소구치를 발거하여 200 unit/㎖의 페니실린, 200 ㎍/㎖의스트렙토마이신, 그리고 1 ㎍/㎖의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM(Bulbeccos Modification of Eagles Medium)으로 구성된 생검 배지로 4회 세척하였다.

치근 시작점에서 중앙으로 1/3되는 지점에서 치주 인대 조직을 수술도로 절취하여 직경 35 mm의 배양 접시에 고르게 분포시킨 다음 100 unit/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 0.5 ㎍/㎖의 암포테리신 B가 포함된 DMEM과 10% FBS(Fetal Bovine Serum)로 구성된 배양액을 넣고 37℃ 및 100% 습도의 5% CO₂공기혼합 배양기에서 배양하였다.

치주 인대 세포가 조직절편으로부터 증식되어 밀생할 때까지 3일 간격으로 배양액을 교환하면서 배양하여 접시를 완전히 덮는 단층이 형성되면 0.05% 트립신/0.02% EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetate)를 처리하여 배양접시로부터 세포를 박리하고 1:3의 비율로 계대배양한 다음 5 ~ 7 세대의 세포를 본 실험에 사용하였다.

상기의 배양액 0.5 ㎖(사람이 치주 인대세포 1×10⁴개를 함유)를 24 웰(well) 배양접시(Corning Co., USA)에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 배양접시 바닥에 완전히 부착된 상태를 확인한 후 상층액을 제거하였다. 세포 배양접시를 하나의 대조군과 6개의 실험군으로 나누어 대조군에는 약물을 주입하지 않고 6개의 실험군에는 각각 황칠 추출물 및 이를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 용매로 하여 순차적으로 분획한 분획물을 황칠 추출물 또는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물로 하여 1 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 각각의 배양접시에 주입하였다. 대조군과 실험군은 계대배양액을 사용하여 배양하였다.

배양 2일째와 14일째에 각각의 배양접시에서 배양액을 버리고 인산완충된 생리식염수(PBS, 즉 phosphate buferred saline)로 세척하고 0.05% 트립신(trypsin)/0.02% 이디티에이(EDTA)(Gibco, USA)로 처리한 후 세포를 배양접시로부터 완전히 분리 수거하여 트리판 블루(trypan blue)로 염색하고 도립현미경 (Olympus Co. Japan) 상에서 혈구세포측정기를 이용하여 세포수를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 1과 같았다.

	세포수 (×10,000 세포/㎖)
	세포배양 2일째	세포배양 14일째
대조군	2.46±0.215	7.15±0.184
황칠 추출물	3.65±0.426^*	16.21±1.735^*
헥산 분획물	2.89±0.447	8.25±0.963
클로로포름 분획물	4.05±0.635^*	22.35±2.034^**
에틸아세테이트 분획물	4.36±0.548^*	24.11±2.112^**
부탄올 분획물	2.66±0.354	12.03±3.250^**
물분획물	4.26±0.711^**	20.52±1.635^**
배지 중 황칠 추출물 또는 그 분획물의 농도는 1 ㎍/㎖이다.* : p<0.05** : p<0.01

상기 표 1 에 나타낸 바와 같이, 약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바, 황칠 추출물이 2일째 약 50%, 14일째 2배이상의 세포증식 효능을 보였으며, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 물 분획물의 경우, 2일째 80%, 14일째 3배 이상의 세포증식을 보였다.

따라서, 본 발명에 따르는 황칠 추출물과 그 분획물이 치주인대세포의 증식을 현저히 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 작용은 소실된 치주인대세포의 재생 효과를 나타내게 된다.

실험예 2: 사람의 치주 인대 세포를 이용한 알칼리성 포스파타제 활성 증가효과 실험

황칠 추출물 또는 그 분획물이 사람의 치주 인대 세포가 갖고 있는 알칼리성 포스파타제의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

상기 실험예 1에서와 동일한 방법으로 사람의 치주 인대세포로부터 세포를 채취하고 배양하였다. 초기 밀생상태의 치주인대세포에 트립신(trypsin)처리하여 그 수를 측정한 후 24 웰 조직배양 접시(well tissue culture plates)(Corning, USA)에 각 웰당 1×10⁵개의 세포를 접종하고 대조군에는 계대배양액으로 하여 배양하였으며, 실험군에는 각각 황칠추출물 또는 그 분획물로서 1 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 배지에 주입하고 배양 2일째와 14일째에 배양액을 버리고 인산완충된-생리식염수로 3회 세척한 다음 세포층에 라이시스(lysis) 완충액(0.02% Nonident P-40)을 1 ㎖ 첨가하여 30초간 초음파 분쇄기 (Ultrasonic Dismembrator Model-300, Fisher사, 미국)로 분쇄한 다음 300 ㎕를 취하여 알칼리성 포스파타제의 활성을 측정하였다.

알칼리성 포스파타제 활성의 측정은 베쎄이(Bessay) 등의 방법과 버쉬(Burch) 등의 방법을 참고로 하여 다음과 같이 실시하였다. 표준용액으로는 파라니트로페놀(paranitrophenol)을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤 1N NaOH를 넣어 반응을 중단시켰다. 이것을 410 ㎚에서 분광광도계(Shimatsu사, 일본)로 흡광도를 측정하고, 그 단위를 nmol/30min/㎎ protein, 즉 IU로 하여 알칼리성 포스파타제의 활성치를 나타내었다. 그 결과를 다음 표 2 에 나타내었다

	알칼리성 포스파타제의 활성 (IU)
	세포배양 7일째	세포배양 10일째
대조군	1.02±0.08	1.62±0.29
황칠 추출물	1.31±0.17^*	2.24±0.25^*
헥산 분획물	0.98±0.06	1.42±0.41
클로로포름 분획물	1.38±0.09'	2.97±0.25^*
에틸아세테이트 분획물	1.29±0.12^**	3.02±0.35^*
부탄올 분획물	0.89±0.15	1.69±0.18
물분획물	1.22±0.10^*	3.13±0.40^*
^배지 중 황칠 추출물 또는 그 분획물의 농도는 1 ㎍/㎖이다. : p<0.05** : p<0.01

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 결과, 7일째에는 약간의 증가만 보였으나, 10일째에는 황칠 추출물이 약 58%, 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 분획물이 약 2배에 가까운 ALP 활성증가를 보였다.

따라서 본 발명에 따르는 황칠 추출물 또는 그 분획물은 치주인대세포의 알칼리성 포스파타제의 활성을 현저히 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 작용은치주 인대 세포의 조골세포로의 분화를 촉진시켜 골재생 촉진효과를 나타내게 된다.

실험예 3: 사람의 치주 인대 세포를 이용한 석회화 결절 형성능 실험

황칠 추출물 또는 그 분획물이 사람의 치주 인대 세포의 석회화 결절 형성능(calcified nodule formation)에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

석회화 결절 형성능은 치주인대 세포를 배양하여 다음의 방법으로 시행 하였다. 본 실험예에서 사용된 백서의 두개관 세포(Rat Calvarial Cell)는 쥐의 두개골에서 분리한 조골세포로서 뼈의 생성작용 연구에 일반적으로 사용되는 세포이다.

배양접시에 상기 백서두개관세포를 분주하고 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산, 10 mM β-글리세오포스페이트(glyceophosphate) 및 10^-8M 덱사메타손(dexamethasone)이 포함된 DMEM 배지에서 세포를 배양하였다. 세포가 배양된 각각의 배지에 황칠추출물 또는 그 분획물로서 1 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 배지에 주입하고 12일간 배양한 후 배지를 제거하였다. 1.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)용액으로 약 2시간 고정하고 칼슘침착 부위를 확인하기 위하여 알리자린 레드 S(Alizarin red S)용액으로 염색하고 0.1mM 인산완충액-생리식염수로 여러번 세척한 후 2% 라이트 그린 SF(Light Green SF)로 대조 염색하였다. 도립 현미경을 사용하여 1.5×1.5 cm²격자내에 염색된 석회화 결절수를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 3에 나타내었다.

	세포배양 14일째에 형성된 석회화 결절의 수**
대조군	26
황칠 추출물	35
헥산 분획물	22
클로로포름 분획물	41
에틸아세테이트 분획물	48
부탄올 분획물	19
물분획물	34
^배지 중 황칠 추출물 및 그 분획물의 농도는 1 ㎍/㎖이다.^*석회화결절수는 2회 반복실험의 평균치를 나타내었다.

상기 표 3 에 나타낸 바와 같이, 약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바, 실시예 1에서 얻은 황칠 추출물이 치주인대세포의 석회화 결절의 형성을 증가시켰으며 이러한 효과는 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 분획물에서 더욱 증가되었다.

따라서, 본 발명에 따르는 황칠 추출물 또는 그 분획물은 골표면에 칼슘의 침착을 촉진시킴으로써 골 강도의 증가 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 황칠 추출물 또는 그 분획물은 조골세포의 증식을 촉진시키고 경조직의 석회화를 촉진시킴으로써 경조직 증식 및 재생 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라 경조직으로서 기능을 다 할 수 있는 형태의 즉 충분한 경도를 갖는 경조직을 형성시킨다.

따라서, 본 발명의 황칠 추출물 또는 그 분획물을 포함하는 약제는 부작용을 보이지 않으면서 탁월한 경조직 재생 및 증식 효과를 갖고 있기 때문에 골조송증, 치주질환 등과 같이 경조직 재생 및 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료를 목적으로 기존의 치료제에 대체하여 안심하고 사용할 수 있는 경조직 재생촉진제 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 황칠 추출물 또는 그 분획물은 조골세포 증식 작용이 탁월하므로 알껍질을 강화할 목적으로 사용되는 부란성 가축의 사료 첨가제로서 이용될 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 황칠 추출물 또는 그 분획물은 약제학적으로 허용되는 불활성 담체와 혼합하여 경구 또는 비경구 투약이 가능한 제형으로 제조함으로서 경조직 재생 및 증식을 위해 용이하게 사용할 수 있게 된다.

Claims

황칠나무(Dendropanax morbiferaLev.)의 수지를 알코올 용매로 추출한 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 추출물.
제 1 항에 있어서, 상기 황칠 추출물은 상기 황칠나무 수지를 알코올에 넣고 50 ~ 100℃에서 5 ~ 24시간 동안 온탕하여 얻은 추출액을 40 ~ 60℃로 냉각시켜 잔사를 여과한 상등액을 증발농축시킨 농축액임을 특징으로 하는 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 황칠 추출물은 상기 황칠나무 수지를 알코올에 넣고 4 ∼ 20℃ 에서 5 ~ 7 일간 냉침시켜 잔사를 여과한 상등액을 증발농축시킨 농축액임을 특징으로 하는 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 황칠 추출물은 상기 황칠나무 수지를 알코올에 넣고 50 ~ 100 ℃에서 5 ~ 24시간 동안 온탕하여 얻은 추출액을 40 ~ 60℃로 냉각시켜 잔사를 여과한 다음 상등액을 증발농축시킨 후 건조시켜 얻은 분말임을 특징으로하는 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 황칠 추출물은 상기 황칠나무 수지를 알코올에 넣고 4 ~ 20 ℃에서 5 ~ 7 일간 냉침시켜 잔사를 여과한 다음 상등액을 증발농축시킨 후 건조시켜 얻은 분말임을 특징으로 하는 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 추출물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한항의 황칠 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 용매로 하여 실온에서 순차적으로 반복 추출한 다음 각 용매별 상등액을 증발 농축시킨 분획물 중 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물로 이루어진 군에서 선택되는, 경조직의 재생 및 증식효과를 가지는 황칠 분획물.
제 1 내지 제 5 항 중 어느 한항의 황칠 추출물 및 약제학적으로 허용되는 불활성 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 약학 조성물.
제 6 항의 황칠 분획물 및 약제학적으로 허용되는 불활성 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 경조직 재생 및 증식 효과를 가지는 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 및 붕해제 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경조직의 재생 및 증식 효과를 가지는 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 및 붕해제 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경조직의 재생 및 증식 효과를 가지는 약학 조성물.