KR100498664B1 - Cre매개부위특이적재조합을이용한항체의제조 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 면역글로불린 좌위를 갖는 세포의 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 Cre 매개 부위 특이적 재조합 및 상동성 재조합을 이용한다. 이 방법은 먼저 lox 부위를 면역글로불린 좌위에 도입하는 단계 및 Cre 매개 체내 재조합을 통한 유전자 변형을 도입하기 위한 표적으로 사용하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 형질감염(transfection)된 세포에 의해 변형된 항체 분자를 생성시키는 재조합 DNA 벡터 및 부위 특이적 재조합 방법을 사용하여 변형된 유전자 좌위로부터 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 예를 들면 항체분자의 불변 영역 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 치환시켜 변형 항체 분자를 형성하는데 있어서, 면역글로불린 좌위를 변형시키기 위한 Cre 매개 부위 특이적 재조합의 용도에 관한 것이다. 한 특징은 면역글로불린의 특정 불변 영역이 다른 종류의 불변 영역으로 대체되어 변형된 이소타입을 갖는 변형 항체를 생성시키는, 항체 생성 임파양 세포 자체에서 항체 유전자의 종류간 교환 (class-switching)에 관한 것이다. 또다른 특징은 가변 영역 또는 그 일부가 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 대체 또는 교환되는, 가변 영역 또는 그 일부의 변형에 관한 것이다.
척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 구조 단위는 분자량이 약 23,000 달톤인 2개의 동일한 "경쇄" 폴리펩티드 및 분자량이 53,000 내지 70,000 달톤인 2개의 동일한 "중쇄"로 구성된다. 4개의 사슬은 "Y" 형태로 디술파이드 결합에 의해 연결되고, 이 형태에서 경쇄는 Y의 입에서 시작하여 Fab로 명명된 분지 영역 또는 "분지"부로 이어진다. 중쇄는 종에 따라 상이한 몇몇 아종을 갖는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε)으로 분류되고, 긴 불변 영역을 갖는 중쇄의 특성에 따라 항체의 "종류"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 분류한다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 종류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 서로 공유결합하고 2개의 중쇄 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마 또는 B 세포에 의해 생성되는 경우에 디술파이드 공유 결합에 의해 서로 결합된다.
각각의 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열은 Y 상부의 N 말단으로부터 하부의 C 말단에 걸쳐있다. N 말단은 스스로 결합하는 항원에 대해 특이적인 가변 영역 (V)을 포함하고 그 길이는 약 100 아미노산이고, 항체에 따라 경쇄 및 중쇄 사이에 차이가 있다. 가변 영역은 각 사슬에서 사슬의 나머지 길이에 걸쳐있는 불변 영역 (C)에 연결된다. 연결은 약 12개의 아미노산을 코딩하는 경쇄 유전자 내의 연결 (J) 영역으로 알려진 연결 서열을 통하여 발생하고, 이와 함께 약 25개의 아미노산을 코딩하는 중쇄 유전자 내의 분지 (D) 영역과 연결 (J) 영역의 조합으로서 게놈 수준에서 관찰된다. 사슬의 나머지 부분, 즉 불변 영역은 항체의 특이성 (즉, 항체가 결합하는 항원)을 갖는 특정 종류 내에서는 변하지 않는다. 불변 영역 또는 종류는 상보성 및 기타 세포 반응의 활성화를 포함하여 항체의 수반하는 효과기 기능을 결정하는 반면에, 가변 영역은 자신이 반응하는 항원을 결정한다.
콜러 (Kohler) 및 밀스테인 (Milstein)에 의해 모노클로날 항체의 제조를 위한 세포 융합 기술이 개발되어 많은 개개의 면역글로불린 종을 대량 생산하였다. 이들 모노클로날 항체 대부분은 쥐 계에서 생성되었고, 따라서 쥐 모노클로날 항체가 인간 면역 시스템에 의해 외부 에피토프로서 "인식"되어 "중화"되지 않도록 하기 위해 특정 방법으로 변형되지 않는 한 인간 치료제로서의 유용성이 제한되었다.
상기 문제에 대한 한 방법으로 외부 에피토프로서 더 잘 "인식"되지 않고 모노클로날 항체를 인간에 사용함으로써 발생하는 문제를 극복할 수 있는, 인간 또는 "인간화" 모노클로날 항체의 개발이 시도되었다. 인간 B 세포 하이브리도마 생성 모노클로날 항체의 응용은 암, 바이러스 및 미생물 감염증, 항체 생성 저하에 따른 B 세포 면역결핍증, 및 기타 면역계 질병 및 질환의 치료에 큰 전망을 주고 있다.
그러나, 인간 모노클로날 항체의 개발에 있어 몇가지 장애가 존재한다. 예를 들면, 암 진단 및 치료를 위한 인간 종양 항원을 인식하는 모노클로날 항체에 있어서 이들 종양 항원 중의 많은 항원은 인간 면역계에 의해 외부 항원으로 인식되지 않기 때문에 이들 항원은 인간에서 면역원성일 수 없다.
인간 모노클로날 항체에 대한 다른 문제는 세포 배양에서 수득한 대부분의 상기 항체가 하나의 종류 또는 이소타입인 IgM 형이라는 것이다. 특정 상황에서 특정 이소타입의 모노클로날 항체는 상기한 바와 같이 이소티압이 상보성 및 기타 세포 반응의 활성화를 포함하여 항체의 수반하는 효과기 기능을 결정하기 때문에 그의 진단 또는 치료 효용의 측면에서 다른 이소타입의 모노클로날 항체보다 바람직할 수 있다. 예를 들면, 항체 매개 세포분해에 대한 연구로부터 서브타입 γ2a 및 γ3의 비변형 마우스 모노클로날 항체가 γ1 이소타입의 항체보다 표적 세포의 용균시에 일반적으로 보다 효과적이라는 것이 알려졌다. 이러한 상이한 효능은 γ2a 및 γ3의 표적 세포의 세포분해적 파괴에 보다 적극적으로 참여하는 능력에 기인한 것으로 생각된다. 쥐 모노클로날 항체의 특정 이소타입은 초기 융합으로부터 선택함으로써 직접 제조하거나, 종류간 교환 변이체를 단리하는 "시브 (sib) 선택" 기술을 사용하여 상이한 이소타입의 모노클로날 항체를 분비하는 모 하이브리도마로부터 2차적으로 제조할 수 있다 (Steplewski et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653; Spira et al., 1984, J Immunological Methods 74:307).
그러나, IgG형의 인간 모노클로날 항체가 요구되는 경우에는 IgM형의 항체를 생성하는 대부분의 세포로부터 IgG 또는 다른 종류의 항체를 생성하는 소수의 세포를 찾아내어 단리하기 위해 세포 분류법 (cell sorting)이라는 지리한 기술을 사용할 필요가 있었다. 따라서, 소정의 또는 요구되는 항원 특이성을 갖는 목적 항원을 위해 단리된 항체 생성 세포에서 항체 종류를 교환하는 효율적인 방법에 대한 필요성이 존재한다.
DNA를 포유동물 세포에 도입하여 면역글로불린 유전자, 특히 인간 및 비인간 부분을 포함하는 키메라 (chimera) 면역글로불린 분자를 생성시키기 위해 면역글로불린 유전자를 발현시키는 최근의 방법을 기초로 하여 인간에 사용하기 위한 모노클로날 항체에 관련된 상기 문제에 대한 다양한 해결 방법이 개발되었다. 보다 구체적으로는, 키메라 항체의 항원 결합 (가변) 영역은 비인간 공급원 (예를 들면 쥐)에서 유래한 것이고, 키메라 항체의 불변 영역 (면역글로불린에 생물학적 효과기 기능을 부여)은 인간 공급원으로부터 유래한 것이다. 이러한 "인간화" 키메라 항체는 비인간 항체 분자의 항원 결합 특이성 및 인간 항체 분자에 의해 부여된 효과기 기능을 가져야 한다.
일반적으로, 키메라 항체는 하기 단계로 이루어지는 방법 (반드시 나타낸 순서로 실시해야 하는 것은 아님)에 의해 통상 제조되었다: (1) 항체 분자의 항원 결합부 코딩 유전자 세그먼트의 확인 및 클로닝; 이 유전자 세그먼트 (중쇄에 있어서의 VDJ, 경쇄에 있어서의 VJ, 또는 보다 간단하게는 가변 영역)는 cDNA 또는 게놈 공급원으로부터 수득할 수 있다; (2) 불변 영역 코딩 유전자 세그먼트 또는 그의 목적 부분의 클로닝; (3) 완전한 키메라 항체가 전사 및 번역가능 형태로 코딩되도록 하기 위한 가변 영역과 불변 영역의 라이게이션; (4) 이 구조체의 선별가능 마커 및 적합한 유전자 조절 영역을 포함하는 벡터 내로의 라이게이션; (5) 이 구조체의 세균 내에서의 증폭; (6) DNA의 진핵세포, 가장 흔하게는 임파구와 같은 포유동물 배양 세포 내로의 도입 (형질감염); (7) 선별가능 마커를 발현하는 세포의 선별; (8) 목적 키메라 항체를 발현하는 세포의 선별; 및 (9) 항체에 대한 적합한 결합 특이성 및 효과기 기능의 시험.
키메라 단백질을 제조하기 위해 상기 방법을 사용하여 여러가지 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 제조하였다. 또한, 항원 결합 영역을 코딩하는 서열에 새로운 서열을 결합시켜 여러가지 상이한 효과기 기능을 갖게 하였다. 이중 몇몇은 효소(Neuberger et al., 1984, Nature 312:604), 다른 종의 면역글로불린 불변 영역 및 다른 면역글로불린 사슬의 불변 영역(Sharon et al., 1984, Nature 309:364; Tan et al., 1985, J. Immunol. 135:3565-3567)을 포함한다. 또한, 노이베르거(Neuberger) 등의 PCT 출원 공개 제WO86/01533호(1986)에는 키메라 항체의 제조법이 기재되어 있고, 주로 사용되는 기술 중에서 "종류간 교환"의 개념을 언급하고 있다.
1989년 3월 28일에 허여된 카빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호에는 재조합 세포 배양법으로 제조된 불변-가변 영역 키메라를 포함하는 변형 및 천연 면역글로불린이 기재되어 있다. 이 면역글로불린은 소정의 항원에 면역학적으로 결합할 수 있는 가변 영역을 포함한다. 개시된 벡터 및 방법은 광범위한 원핵 및 진핵 생물을 포함하여 다양한 숙주 세포에 사용하기 적합하다.
1993년 4월 13일에 허여된 펠 (Fell) 등의 미국 특허 제5,202,238호에는 재조합 DNA 벡터 및 체내 상동성 재조합법을 사용하는 키메라 항체의 제조 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 (a) 항체 분자의 항원 결합 부위는 불변 상태이지만 항체 분자의 불변 영역 또는 그 일부는 치환되거나 변형되어 목적 항원 특이성을 갖는 항체를 생성시키는 세포주; 또는 (b) 항체 분자의 불변 영역은 불변 상태이지만 항체 분자의 가변 영역 또는 그 일부는 치환되거나 변형되어 목적 효과기 기능을 보일 수 있는 목적한 종류의 항체를 생성시키는 세포주에서 상동성 재조합법을 통하여 표적 유전자를 변형 시키기 위해 신규 재조합 DNA 벡터를 사용한다. 그러나, 보고된 재조합 효율은, 인간 대응물로 마우스 중쇄 불변 영역을 치환시키려는 수회의 시도에서 선별가능 마커 유전자를 사용하여 재조합 게놈을 회수한 경우에도 0.39% 내지 0.75%로 비교적 낮다.
쿠처라파티(Kucherlapati) 등의 PCT 출원 공개 제WO91/10741호(1991년 7월 25일 공개) 및 제WO94/02602호(1994년 2월 3일 공개)에는 포유동물 숙주의 적합한 면역원을 사용한 면역화에 의해 생존가능한 비영장류 포유동물 숙주에서 생성된 이종개체의 특이적 결합 단백질 또는 항체가 개시되어 있다. 특히, 이들 공개 문헌에는 효모 인공 염색체(YAC)를 사용하여 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 좌위로 처리된 마우스로부터 항원 특이적 인간 모노클로날 항체의 생성이 기재되어 있다. 이러한 마우스는 인간 항원을 포함하여 마우스 면역계에 의해 정상적으로 인식되는 항원을 사용한 면역화에 반응하여 인간 항체를 완전하게 생성시키고, 이들 마우스의 B 세포는 통상의 하이브리도마 생성 방법을 통하여 인간 모노클로날 항체를 생성하는 하이브로도마의 제조에 사용된다. 트랜스제닉(transgenic) 쥐 하이브리도마로부터 완전한 인간 항체의 생성이 인간 모노클로날 항체 생성시 종전의 문제들 중 많은 문제를 해결하지만, 예를 들어 발현을 증강시키거나 효과기 기능을 변형시키기 위해 항체를 생성하는 세포에서 상기 좌위를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.
1990년 9월 25일 허여된 사우어(Sauer) 등의 미국 특허 제4,959,317호에는 진핵세포에서 lox 부위로 명명된 서열에서 DNA의 부위 특이적 재조합이 일어나게 하는 방법이 기재되어 있다. 제1 및 제2 lox 부위를 포함하는 DNA 서열은 진핵세포에 도입되어 Cre(일반적으로 플라스미드로부터 리컴비나제(recombinase)의 일시 발현에 의해 생성됨)로 명명된 리컴비나제와 상호작용하여 lox 부위에서 재조합이 일어난다. 진핵세포의 예로는 효모 세포 및 마우스 세포주의 단층 배양액을 들 수 있다. Cre 매개 재조합의 비율은 바이러스 및 플라스미드 사이에 반복된 재조합 시도에서 2-3% 내지 22%이었고, lox 부위에 인접한 효모 leu2 유전자의 결실의 경우에는 98%이었다. 그러나, 임파양 세포에서의 재조합 또는 면역글로불린 좌위의 조작에 대해서는 사우어 등에 의해 기술되지 않았다.
구 (Gu) 등의 문헌 [Cell 73:1155-1164, 1993]에는 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 J 영역 및 중쇄 좌위 내의 인트론 인핸서가 배 간세포로부터 결실된 마우스 계통을 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 이들은 LPS 및 IL4로 활성화된 이형 접합체 변이주 B 세포에서 재조합에 의해 형성된 면역글로불린 이소타입을 분석하였다. 이들은 항체 생성 세포가 아닌 간세포에서 단지 중쇄 좌위를 변형시키고, 키메라 또는 변형 항체를 생성시키는 항체 생성 세포에서 유전자 서열의 새로운 조합을 생성시키는 것이 아니라 결실에 의해 중쇄 좌위를 단지 변형시키기 위해 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하였다.
존슨(Johnson) 등의 국제 출원 공개 제WO93/19172호(1993년 9월 9일 공개) 및 문헌[Waterhouse et al., Nucleic Acids Res (1993) 21:2265-2266]에는 파지 벡터에서 항체의 조합 라이브러리의 생성을 위해 재조합을 실시하기 위한 Cre 매개 부위 특이적 재조합의 사용이 기재되어 있다. 후자의 문헌에서 존슨, 워터하우스 및 그 동료들은 A 및 B로 명명된 2개의 파지 벡터를 예로 들었는데, A는 제1 항체의 경쇄(및 다른 항체로부터의 중쇄)를 코딩하고 B는 제1 항체의 중쇄를 코딩한다. 양 벡터에서 가변 중쇄(VH) 유전자에는 2개의 loxP 부위가 인접하여 존재하는데, 그 중 하나는 벡터 내의 재조합으로 인해 VH 유전자가 절단되지 않도록하는 변이 loxP 부위이다. Cre 발현 파지로 대장균(E. coli)을 감염시킴으로써 Cre 리컴비나제가 체내에 공급되는 경우에 벡터 A 및 B는 변이 또는 야생형 loxP 부위 사이의 재조합에 의해 함께 통합되어 키메라 플라스미드를 생성시킬 수 있다. 또한, 재조합은 2개의 야생형 또는 2개의 변이 loxP 부위 사이에서 발생하여 본래의 벡터 A 및 B 또는 2개의 새로운 벡터인 E 및 F를 생성시킬 수 있다. 따라서, A 및 B의 중쇄는 E 및 F로 대체되고, E는 파지 유전자 3 단백질(g3P)의 N 말단에 대한 융합체로 나타나는 제1 항체의 Fab 단편을 코딩한다. 저자들은 이 방법이 파지 벡터 A의 경쇄 레파토리 및 파지 벡터 B의 중쇄 레파토리를 제공함으로써, 파지 발현 항체의 매우 큰 조합 레파토리를 생성시킬 수 있어야 함을 지적하였다. 그러나, 이들 2개의 문헌에는 개시된 특정 박테리오파지 벡터의 중쇄 유전자의 교환 외에 다른 목적을 위한 Cre 매개 부위 특이적 재조합의 사용이 기재되어 있지 않고, 구체적으로는 항체 생성 세포 게놈에서 면역글로불린 서열의 어떠한 변형도 제시하지 않고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 항체 생성 세포 게놈에서의 면역글로불린 좌위의 변형을 위한 Cre 매개 부위 특이적 재조합의 신규 용도를 제공하는 것이다.
도 1은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 한 실시형태 (방법 A)의 모식도이다. 이 방법은 변형되는 불변 영역 유전자에 인접한 하나의 lox 부위의 삽입만을 필요로 한다.
도 2는 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 다른 실시형태 (방법 B)의 모식도이다. 이 방법은 변형되는 불변 영역의 측면에 존재하는 항체 생성 세포의 게놈 내에 통합된 2개의 lox 부위를 사용한다.
도 3은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 한 실시형태 (방법 C)의 모식도이다. 이 방법도 변형되는 불변 영역 유전자에 인접한 하나의 lox 부위의 삽입만을 필요로 한다. 그러나, lox 부위는 항체를 발현하는 세포가 수득되는 트랜스제닉 동물의 게놈 내로 삽입된다.
발명의 실시 형태
정의
본원에서 사용된 하기 용어는 단수형 또는 복수형을 불문하고 아래에 나타낸 의미를 갖는다.
면역글로불린 좌위: 항체 분자의 불변 영역 또는 가변 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 분자의 발현을 조절하는 조절성 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
중쇄에 해당되는 면역글로불린 좌위는 V, D, J 및 교환 영역 (소위 인트론이라는 개재 서열 포함)의 전부 또는 일부 및 형질감염되는 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 중쇄 불변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접하는 인접 서열을 포함할 수 있고, 불변 영역 (인트론 포함) 내에 또는 불변 영역 하류에 위치하는 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 경쇄에 해당되는 면역글로불린 좌위는 V 및 J 영역, 형질감염되는 항체 생성 세포에 의해 발현되는 경쇄 불변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접하는 이들의 상류 인접 서열 및 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있고, 불변 영역 (인트론 포함) 내에 또는 불변 영역 하류에 위치하는 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 중쇄 가변 영역에 해당되는 면역글로불린 좌위는 V, D, J 영역 (인트론 포함)의 전부 또는 일부 및 형질감염되는 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 중쇄 가변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접하는 인접 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 경쇄 가변 영역에 해당되는 면역글로불린 좌위는 V 및 J 영역 (인트론 포함) 및 형질감염되는 항체 생성 세포에 의해 발현되는 경쇄 가변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접하는 인접 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
변형 항체: (a) 불변 영역 또는 그의 일부가 변형, 치환 또는 교환되어 항원 결합 부위 (가변 영역)이 상이하거나 변형된 종류, 효과기 기능 및(또는) 종의 불변 영역에 결합하거나, 또는 변형 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들면 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 결합되거나, 또는 (b) 가변 영역 또는 그 일부가 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변형, 치환 또는 교환된 항체 분자.
변형 서열: (a) 변형 항체 분자를 형성하기 위해서 항체 분자의 불변 영역 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 변형 또는 대체시키는 번역 생성물 또는 (b) 면역글로불린 좌위 서열의 발현을 변화시키기 위해서 면역글로불린 좌위 서열의 조절 서열의 전부 또는 일부를 변형 또는 치환시키는 하나 이상의 조절성 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열. 이 조절 서열은 예를 들면 프로모터, 인핸서, 인트론, 교환 서열, 리보솜 결합 서열 등을 포함할 수 있고, 항체 분자의 영역을 대체하는 번역 생성물을 코딩하는 서열에 더해지거나 또는 이 서열 대신에 존재할 수 있다. 적합한 조절성 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 선별된 항체 생성 세포에 사용되는 적합한 조절성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 방법에 중요하지 않다. 항체 생성 세포에서 면역글로불린 서열의 발현 변형을 위한 바람직한 조절 서열은 마우스 중쇄 인핸서 서열, 마우스 카파 (κ) 사슬 인핸서 서열, 또는 몰로니 무린 백혈병 바이러스, 로우스 육종 바이러스 또는 비장 병소 형성 바이러스에서 유도된 프로모터를 포함한다.
변형 서열은 항체 생성 세포 또는 배 간세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 본 발명의 재조합 DNA 표적 벡터 내에 삽입된다. 항체 불변 영역의 전부 또는 일부의 변형을 위해 본 발명의 변형 서열은 특정 효과기 기능, 종류 및(또는) 기원 (예를 들면 인간 면역글로불린 또는 다른 종의 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 불변 영역)을 갖는 면역글로불린 불변 영역 또는 면역글로불린 불변 영역의 활성 또는 특성을 변형시키는 불변 영역의 일부, 및 변형 항체 분자에 새로운 기능을 부여하는 다른 분자, 예를 들면 효소, 독소, 생물학적 활성 펩티드, 성장 인자, 억제제, 접합가능 펩티드 링커 등을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항체 가변 영역의 전부 또는 일부의 변형을 위해 본 발명의 변형 서열은 상이한 항원 친화성 및 특이성을 갖는 상이한 가변 영역을 코딩하는 면역글로불린 가변 영역 또는 면역글로불린 가변 영역의 활성 또는 특성을 변형시켜 생성되는 변형 항체가 항원에 대한 보다 큰 친화성 및 특이성을 갖게 하는 가변 영역의 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
변형 서열은 부분적으로는 발현되는 변형 항체 분자의 사용 목적에 따라 선택된다. 예를 들면, 인간의 치료용으로 사용될 것이라면 변형 서열은 바람직하게는 표적 종양 세포를 죽이기 위한 독소와 같은, 인간 치료를 위한 목적 효과기 기능을 갖는 종류의 인간 불변 영역을 코딩할 수 있다. 항체의 기존 효과기 기능의 개선 또는 변형이 요구되는 경우에는, 생성되는 변형 항체 분자에 개선되거나 변형된 효과기 기능을 부여하는 서열로 불변 영역의 일부를 대체할 수 있다. 예를 들면, 세포 독성 약물의 영상화 또는 표적 세포로의 전달에 사용되는 항체와 같이 순환계로부터 항체의 소실 속도를 저하시키는 것이 바람직한 경우에는 γ2 중쇄의 Fc 수용체에 대한 결합을 제거하는 변이를 함유하는 γ2 중쇄 영역으로 인간 γ2 중쇄 영역의 일부를 대체할 수 있다.
효소, 독소, 약물, 호르몬 또는 성장 인자의 체내 표적으로의 전달이 요구되는 경우에 효소, 독소, 약물, 호르몬 또는 성장 인자 또는 이들의 접합을 위한 적합한 링커를 코딩하는 변형 서열을 사용한다. 변형 항체가 진단 분석에 사용되는 경우, 예를 들면 표지 항체가 이용되는 경우에 효소 또는 그의 기질을 코딩하는 변형 서열을 사용할 수 있다. 이러한 효소/기질계는 반응시에 착색 생성물을 생성시키는 것, 예를 들면 베타-갈락토시다제, 알칼린 포스파타제, 양고추냉이 퍼록시다제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 결과의 변형 항체는 추가의 변형, 예를 들면 효소, 약물, 독소, 호르몬, 성장 인자 등의 화학적 부착이 있거나 없는 방법에서 표지 항체로 사용될 수 있다.
항체 가변 영역의 전환에 사용되는 변형 서열은 목적 항원을 인식하는 항체 분자의 가변 영역의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이 서열은 관련 또는 전혀 관련되지 않은 항원을 인식하는 항원 결합 영역을 코딩할 수 있다. 항원 결합 또는 특이성의 개선 또는 변형이 요구되는 경우에는, 가변 영역의 일부를, 생성되는 변형 항체 분자에 개선되거나 변형된 결합 또는 특이성을 부여하는 서열로 치환시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 경쇄 및(또는) 중쇄 유전자 내에 2개의 상이한 가변 영역을 함유하도록 세포를 변형시킴으로써 양특이적 (bi-specific) 항체, 즉 2개의 상이한 가변 영역을 갖는 항체를 생성시키는 세포의 제작에 유용하다. 이러한 경우에 있어서, 야생형 및 비양립성 변이 lox 부위가 동일한 게놈 내에 통합되는 경우에, 문헌 [예를 들면 Johnson et al., PCT 출원 공개 WO93/19172호]에 기술된 바와 같은 목적 통합 부위와 양립성인 부위를 포함하는 벡터를 사용하여 특정 변형 서열을 이들 부위 중의 어느 하나에 선택적으로 삽입할 수 있다.
Cre: lox 부위(하기 정의 참조)에서 DNA의 부위 특이적 재조합을 실시하는 리컴비나제인 cre 유전자의 효소 발현 생성물. 하나의 cre 유전자는 예를 들면 본원에 참고로 포함된 문헌 [Abremski et al., Cell, 32:1301-1311 (1983)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 박테리오파지 P1로부터 단리할 수 있다.
lox 부위: cre 유전자의 발현 생성물인 "Cre"가 부위 특이적 재조합을 촉매할 수 있도록하는 뉴클레오티드 서열. LoxP 부위는 당업계에 공지된 방법에 의해 박테리오파지 P1로부터 단리할 수 있는 34 염기쌍의 뉴클레오티드 서열이다. 박테리오파지 P1로부터 LoxP 부위를 단리하기 위한 한 방법은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3398 (1982)]에 기술되어 있다. LoxP 부위는 8개의 염기쌍 스페이서 영역에 의해 분리된 13 염기쌍의 인버티드 반복체 2개로 구성된다. LoxP의 삽입 반복체 및 스페이서 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
다른 적합한 lox 부위에는 대장균으로부터 단리된 뉴클레오티드 서열인 LoxB, LoxL 및 LoxR 부위가 포함된다. 이들 서열은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3398 (1982)]에 개시되어 있다. 바람직하게는, lox 부위는 LoxP 또는 LoxC2이다. LoxC2의 삽입 반복체 및 스페이서 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
ACAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
본원에 참고로 포함된 존슨 등의 PCT 출원 공개 제WO93/19172호에는 VH 유전자가 2개의 loxP 부위에 인접해 있으며, 그중 한개의 loxP 부위가 loxP 부위의 스페이서 영역 내 제7위치의 G가 A로 치환되어 벡터 내의 재조합이 단지 VH 유전자를 절단하지 못하도록 하는 변이 loxP 부위 (loxP 511)인 파지 벡터를 기재하고 있다. 그러나, 2개의 loxP 511 부위는 Cre 매개 재조합을 통하여 재조합될 수 있고, 따라서 하나 이상의 야생형 lox 부위의 존재 하에 선택적으로 재조합될 수 있다. loxP 511의 삽입 반복체 및 스페이서 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
ATAACTTCGTATA ATGTATAC TATACGAAGTTAT
또한, lox 부위는 당업계에 공지된 다양한 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, lox 부위 생성을 위한 합성 기술은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Ito et al., Nuc. Acid Res., 10:1755 (1982) 및 Ogilvie et al., Science, 214:270 (1981)]에 기재되어 있다.
Cre 매개 부위 특이적 재조합: 하기 3가지 사건을 포함하는, 2개의 양립성 lox 부위 사이의 재조합의 과정:
1. lox 부위에 인접한 미리 선택된 DNA 세그먼트의 결실,
2. lox 부위에 인접한 미리 선택된 DNA 세그먼트 뉴클레오티드 서열의 역위, 및
3. 상이한 DNA 분자에 위치한 lox 부위에 근접한 DNA 세그먼트의 상호 교환. DNA 세그먼트의 상기 상호 교환은 DNA 분자의 어느 하나 또는 두 개 모두가 환상인 경우에 통합을 야기한다. 따라서, lox 표적 벡터는 본 발명에 따라 벡터 내의 lox 부위를 사용한 재조합에 적합한 한 개의 lox 부위를 갖는 항체 생성 세포의 게놈 내로 변형 서열을 삽입(즉, 통합)시키기 위해 사용되는 경우에, lox 표적 벡터는 환상 DNA 분자로 구성된다. 또한, lox 부위가 인접한 선형 DNA 세그먼트도 측면에 위치하는 lox 부위 사이의 재조합에 의한 환상 세그먼트의 형성 및 이 환상 세그먼트의 한 개의 lox 부위를 포함하는 DNA 분자 내로의 통합에 의해 한 개의 lox 부위를 포함하는 DNA 분자 내에 삽입될 수 있다.
표적 서열: 전환되는 면역글로불린 좌위 영역의 측면에 위치하거나 인접하는 세포의 게놈 내 DNA 서열에 상동성인 서열. 측면에 위치하거나 인접하는 서열은 좌위 자체 내에 또는 항체 생성 세포의 게놈 내 코딩 서열의 상류 또는 하류에 존재할 수 있다. 표적 서열은 lox 부위와 같은 세포 게놈 내로 삽입되는 서열이 벡터의 표적 서열의 측면에 위치하도록 항체 생성 세포의 형질감염에 사용되는 재조합 DNA 벡터 내에 삽입된다.
항체 생성 세포 또는 배 간세포의 경우, 불변 영역의 전부 또는 일부의 치환 또는 이 내부로의 삽입을 지시하는 중쇄 재조합을 위한 표적 서열은 V, D, J, 및 교환 영역 (인트론으로 불리는 개재 서열 포함) 및 형질감염된 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 중쇄 불변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접한 인접 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 불변 영역 (인트론 포함) 내에 또는 이 영역의 하류에 존재하는 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역의 전부 또는 일부의 치환 또는 이 영역 내로의 삽입을 지시하는 경쇄 재조합을 위한 표적 서열은 V 및 J 영역, 이들의 상류 인접 서열, 및 형질감염된 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 경쇄 불변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접한 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 불변 영역 (인트론 포함) 내에 또는 이 영역의 하류에 존재하는 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역의 전부 또는 일부의 치환 또는 이 내부로의 삽입을 지시하는 중쇄 재조합을 위한 표적 서열은 V, D, J 영역 (인트론 포함) 및 형질감염된 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 가변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접한 인접 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가변 영역의 전부 또는 일부의 치환 또는 이 영역 내로의 삽입을 지시하는 경쇄 재조합을 위한 표적 서열은 V 및 J 영역 (인트론 포함), 및 형질감염된 항체 생성 세포에 의해 발현되는 특정 경쇄 가변 영역 유전자와 결합하거나 이 유전자에 인접한 인접 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상동성 표적 벡터를 위한 표적 서열은, 일반적으로 관련 표적 서열의 체내에서 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통해 lox 부위가 게놈 서열내로 삽입시, 이에 의해 형질감염 세포에서 발현되는 항체 분자의 아미노산 서열이 변형되지 않도록 상기 서열로부터 추가로 선택된다. 이 방법은 lox 부위 (및 임의로, 선별가능 마커 유전자와 같은 추가의 서열)의 삽입 후에 목적 항체를 생성시키는 면역글로불린 유전자의 적절한 전사 및 번역을 유지시킨다. 그러나, 일부 경우에는 항체 분자의 아미노산 서열이 삽입에 의해 변형되지만 항체는 요구되는 목적을 위한 충분한 기능성을 계속 유지하도록 lox 부위 및 다른 서열을 면역글로불린 좌위 서열 내로 삽입할 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Waterhouse et al., Nucleic Acids Res (1993) 21:2265-2266]에는 34 염기쌍 lox 부위에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 통하여 파지 단백질에 연결된 IgM 또는 IgG 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 서열이 기재되어 있다. 이 구조체는 파지 입자가 기능성 항체 결합 부위를 드러내는 방식으로 파지 단백질에 융합된 항체 가변 영역을 생성시킨다. 기능성 항체 영역은 lox 부위에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 통하여 파지 단백질에 연결된 IgM 또는 IgG 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 상기 구조체 또는 이와 유사한 구조체를 사용하여 독소와 같은 다른 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
벡터: 벡터는 항체 생성 세포의 형질전환 또는 형질감염에 사용될 수 있는, 자기 복제 가능 여부와 관계없이 플라스미드, 바이러스, 및 다른 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다.
상동성 표적 벡터: 표적 서열 및 다른 서열, 특히 lox 부위 및 임의로 선별가능 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터로서, 상동성 표적 벡터로 형질감염된 항체 생성 세포 또는 배 간세포에서 상동성 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 면역글로불린 좌위를 변형시키기 위해 사용된다. 상동성 표적 벡터는 일반적으로 목적 상동성 재조합 사건을 증가시키기 위해 선형 DNA 분자 형태로 항체 생성 세포를 형질감염시킨다.
lox 표적 벡터: lox 부위 및 임의의 다른 서열, 특히 항체 생성 세포에서 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 이용하여 면역글로불린 좌위를 변형시키는데 사용된 변형 서열 및 임의로 선별가능 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터. lox 표적 벡터의 lox 부위는 변형 서열에 의해 변형되는 면역글로불린 좌위의 영역에 인접한, 항체 생성 세포나 배 간세포의 게놈 서열로 삽입(상동성 표적 벡터를 통해)된 다른 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합하다. 항체 생성 세포나 배 간세포의 게놈에서 면역글로불린 좌위에 있는 단일 lox 부위로의 변형 서열의 통합은 변형 서열의 추가에 의한 상기 영역의 변형을 초래한다. 변형되는 영역에 인접한 2개의 lox 부위를 포함하는 게놈으로의 변형 서열의 통합은 변형 서열에 의한 상기 영역의 치환을 초래한다.
항체 생성 세포: 상동성 표적 및 lox 표적 벡터는, 이 벡터의 표적 서열에 상동성인 서열(들)을 포함하고 (a) 목적 항원 특이성 또는 친화성; (b) 목적 불변 영역; 또는 (c) 높은 분비 수준, 대규모 배양 적합성 등과 같은 다른 요구되는 특질을 갖는, 면역글로불린 분자를 생성시킬 수 있는 세포의 형질감염에 사용된다. 상기 세포에는 바람직한 특이성, 친화성 또는 효과기 기능을 갖는 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마 및 면역글로불린의 중쇄 및(또는) 경쇄의 발현을 억제하는 변이를 자체에 갖는 하이브리도마 세포가 포함된다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서 항체 생성 세포는 예를 들면 쿠처라파티 (Kucherlapati) 등의 PCT 출원 공개 제WO91/10741호 (1991년 7월 25일 공개) 및 PCT 출원 공개 제WO94/02602호 (1994년 2월 3일 공개)에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자로 처리된 마우스의 B 세포로부터 유도된 하이브리도마이다. 상기 마우스는 인간 항원을 포함하여 마우스 면역계에 의해 정상적으로 인식되는 항원에 대한 면역 반응으로 인간 항체를 생성시키고, 통상의 하이브리도마 생성 방법에 의해 상기 마우스로부터의 B 세포를 사용하여 인간 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 제조할 수 있다. 상기 트랜스제닉 마우스로부터의 하이브리도마를 사용하는 한 특정 실시형태에서, 트랜스제닉 마우스에서 인간 면역글로불린 좌위를 포함하는 게놈 서열은 본 발명 방법에 의해 하이브리도마에서 변형되는 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하거나 이 영역 내에 삽입된 lox 부위를 추가로 포함한다. 상기 lox 부위는, 예를 들면 쿠처라파티 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 좌위를 트랜스제닉 마우스로부터의 배 간세포의 게놈 내로 삽입하기 위해 사용되는 벡터 내로의 통합에 의해 쥐 배 간세포의 게놈 내로 삽입하기 전에 인간 면역글로불린 좌위에 인접하여 삽입되거나 이 좌위 내에 삽입된다. 통상의 재조합 DNA 방법을 사용하여, 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 항체 생성 세포에서 본 발명 방법에 의해 궁극적으로 변형되는 면역글로불린 좌위에 인접하거나 이 좌위 내에 삽입되도록 상기 벡터에 lox 부위를 통합시킨다.
또한, 항체의 생산을 위한 본 발명 방법의 실시에 적합한 항체 생성 세포에는 본원에 참고로 포함된 카빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 원핵 및 진핵 생물 모두의 숙주 세포가 포함된다.
하기 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다:
DHFR: 디히드로폴레이트 리덕타제
gpt: 구아노신 포스포릴 트랜스퍼라제 유전자
Neo: 네오마이신 내성 유전자
Hyg: 히그로마이신 내성 유전자.
면역글로불린 좌위를 변형시키기 위한 본 발명의 방법
본 발명은 항체 생성 임파양 세포 내에서, 예를 들면 항체 유전자의 불변 영역이 다른 종류의 불변 영역으로 대체되는 항체 유전자의 종류간 교환에 의해 변형 또는 "교환된" 이소타입을 갖는 항체를 생성시키기 위해서 면역글로불린 좌위를 조작하는, Cre 매개 부위 특이적 재조합의 신규 용도에 관한 것이다. 결과의 세포는 변형 항체의 대규모 생성에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 항체 생성 세포의 면역글로불린 좌위의 게놈 서열 내에 목적하는 위치에서 표적 유전자를 변형시키는 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 변형 항체 분자를 발현하는 세포, 또는 변형 항체 분자를 발현하는 임파양 세포주를 생성시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 하나 이상의 lox 부위를 포함하는 DNA 서열은 먼저 상동성 재조합에 의해 항체 생성 세포의 게놈 내로 도입된다. lox 부위(들)은 변형 영역으로 전환되는 항체 생성 세포의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하여 삽입된다. 그 후, 하나 이상의 통합된 lox 부위를 갖는 게놈을 함유하는 세포는 (a) 통합된 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 lox 부위, 및 (b) 변형 서열을 갖는 DNA 분자로 형질감염된다. 이어서, 게놈 및 벡터 lox 부위는 Cre 리컴비나제(통상, 플라스미드로부터의 리컴비나제의 일시 발현에 의한)와 상호작용하여 lox 부위 사이의 재조합을 생성시켜 변형 서열이 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 게놈 서열 내로 삽입되고, 이에 의해 게놈 서열의 목적 부분이 변형 부분으로 전환된다.
이 방법에서, lox 부위와 Cre의 상호작용은 일반적으로 플라스미드로부터의 일시 발현된 리컴비나제에 의해 실시된다. Cre와의 일시적인 상호작용은 재조합을 제한된 수로 발생시켜 다중 lox 부위를 함유하는 구조체를 생성시키고자 하는 경우에 특히 바람직한데, 그 이유는 과도한 Cre 매개 재조합은 상기 구조체로부터의 바람직하지 않은 결실을 생성시키는 경향이 있기 때문이다.
본 발명의 방법을 사용하여 항체 분자의 아미노산 서열은 적합한 "상동성 표적 벡터" 및 "lox 표적 서열"을 사용한 항체 생성 세포의 형질감염 및 lox 부위와 Cre 리컴비나제의 상호작용에 의해 변형시킬 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서 목적 항원 특이성 및 친화성을 코딩하는 면역글로불린 좌위를 포함하는 세포주는 lox 부위 및 "변형 서열"을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 본 발명의 lox 표적 벡터로 형질감염된다. 변형 서열은 항체 생성 세포에 의해 발현되는 항체 분자의 불변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 목적 분자를 코딩한다. 상기 실시형태를 위한 변형 서열의 예는 상기한 것이다.
상기 실시형태에서 lox 부위는 "표적 서열"이 형질감염되는 세포주에 의해 코딩되는 면역글로불린의 불변 영역을 코딩하는 성숙 유전자 내에 또는 이 유전자에 인접하여 염색체에서 발견되는 DNA 서열에 상동성인 상동성 표적 벡터를 사용하여 항체 생성 세포의 게놈 DNA 내에 통합된다. 형질감염 후, 항체 생성 세포 내에서의 상동성 재조합이 일어날 것이고, 이들 재조합 사건 중에서 일부는 lox 부위를 목적 위치에서 항체 생성 세포의 게놈 DNA 내로 통합시킬 것이다. 이어서, lox 표적 벡터와 하나 이상의 통합된 lox 부위 사이의 Cre 매개 부위 특이적 재조합은 면역글로불린 좌위의 불변 영역 전부 또는 일부를 lox 표적 벡터의 변형 서열로 치환시키고, 따라서 형질감염된 세포에 의해 변형 항체 분자가 발현된다. 불변 영역 유전자의 치환 정도 (즉, 전부 또는 일부)는 물론 세포의 면역글로불린 좌위 내의 통합된 lox 부위(들)의 위치 및 lox 표적 벡터 변형 서열의 특성에 따라 상이하다.
본 발명의 다른 측면에서 목적 불변 영역을 코딩하는 면역글로불린 좌위를 포함하는 임파양 세포주는 변형되는 게놈 내의 가변 영역에 인접하는 lox 부위를 삽입하기 위해 상동성 표적 벡터로 형질감염된 후, 목적 항원 특이성 또는 친화성을 갖는 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 변형 서열을 포함하는 lox 표적 벡터로 형질감염된다. 형질감염 및 lox 부위와 Cre 사이의 상호 작용 후에 임파양 세포주 내에 Cre 매개 재조합이 발생할 것이고, 이들 재조합 사건 중의 일부는 면역글로불린의 가변 영역의 전부 또는 일부를 변형 서열로 대체시켜 형질감염된 세포에 의해 변형 항체 분자가 발현될 것이다.
변형 항체를 발현하는 형질감염체를 찾아낸 후에 본 발명의 실시는 형질감염체의 배양 단계 및 모노클로날 항체의 단리를 위해 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 상등액으로부터 변형 항체 분자를 단리하는 단계를 포함한다. 별법으로, 형질감염된 세포는 동물의 복수액 중에서 배양될 수 있고 모노클로날 항체의 단리를 위해 공지된 기술을 사용하여 회수할 수 있다.
본원에서 기술된 항체 생성 세포의 면역글로불린 좌위에 대한 모든 변형은 항체 생성 세포를 본 발명의 상동성 표적 벡터를 사용하여 형질감염시킴으로써 먼저 lox 부위를 항체 생성 세포의 게놈 내로 도입시켜 만들 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용하기 적합한 lox 부위를 포함하는 게놈을 갖는 항체 생성 세포는 생식세포주의 DNA 내로 통합된 lox 부위를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터의 B 세포의 하이브리도마를 제조함으로써 생성시킬 수 있다. 이들 마우스는 본원에 참고로 포함된 쿠처라파티 등의 PCT 출원 공개 제WO91/10741호 (1991년 7월 25일 공개) 및 PCT 출원 공개 제WO94/02602호 (1994년 2월 3일 공개)에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 상기 트랜스제닉 마우스는 당업계에 공지된 다른 트랜스제닉 마우스 제조 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 트랜스제닉 마우스의 제조에 사용되는 배 간세포는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 및 추가로 궁극적으로 상기 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 항체 생성 세포에서 변형되는 인간 면역글로불린 좌위 (예를 들면 중쇄 유전자)의 영역 내에 인접하거나 이 영역 내에 통합되는 lox 부위를 포함하는 구조체로 통상의 방법에 의해 형질전환된다. 항체 생성 세포는 예를 들면 통상의 하이브리도마 생성 방법에 의해 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다.
lox 부위를 삽입하기 위한 상동성 표적 벡터의 용도
본 발명의 방법에서 lox 부위를 포함하는 DNA 서열은 먼저, 예를 들면 본원에 참고로 포함된 펠 (Fell) 등의 미국 특허 제5,202,238호에 기술된 상동성 재조합을 통하여 유전자 삽입을 위한 공지 방법을 사용하여 상동성 표적 부위 특이적 재조합에 의해 항체 생성 세포 또는 배 간세포의 게놈 내로 도입된다. 본 발명의 방법에서 lox 부위(들)은 궁극적으로 변형 영역으로 전환되는 항체 생성 세포 또는 배 간세포의 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하여 삽입된다.
본 발명의 표적 벡터 (즉, 상동성 표적 또는 lox 표적 벡터)는 lox 부위 및(또는) 변형 서열 및(또는) 표적 서열을 포함하는 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 등을 포함하는 재조합 DNA 벡터를 포함한다. 상세하게 설명한 바와 같이, 변형 서열은 많은 조절 서열 또는 목적 구조 생성물을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있고, 표적 서열은 전환되는 항체 분자의 종류 및 형질감염되는 세포 종류에 따라 상이할 수 있다. 본 발명의 표적 벡터는 형질감염체의 스크리닝 및 선별을 돕기 위해 약물 내성을 부여하는 효소 등을 포함하는 선별가능 마커를 코딩하는 추가의 유전자를 포함할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 벡터는 상기 마커와의 동시 형질감염에 사용될 수 있다.
재조합의 빈도를 증가시킬 수 있는 다른 서열에는 또한 상동성 표적 벡터가 포함될 수 있다. 이러한 유전자에는 진핵 또는 원핵 재조합 효소, 예를 들면 RecA, 토포이소머라제, Rec1을 코딩하는 유전자 또는 Chi와 같은 재조합을 증강시키는 다른 DNA 서열이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상동성 재조합에 의해 생성되는 키메라 유전자의 전사를 증강시키는 서열도 본 발명의 벡터에 포함될 수 있고, 이러한 서열에는 메탈로티오닌 프로모터 (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42)와 같은 유도가능 성분 등을 포함될 수 있다. 또한, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 같은 상이한 단백질도 재조합 빈도를 증가시키기 위해 형질감염에 사용될 수 있다.
항체의 변형을 위해, 표적 서열의 조성은 경쇄 또는 중쇄의 가변 또는 불변 영역 유전자의 전부 또는 일부를 대체하기 위해 사용되는 상동성 표적 벡터 및 형질감염되는 숙주 세포의 종에 따라 상이할 수 있다. 보다 구체적으로는, 표적 서열은 대체 또는 변형되는 불변 또는 가변 영역의 코딩 영역 또는 그 일부에 인접하거나 측면에 존재하는 서열에 상동성이다.
예를 들면, 척추동물 염색체에서 성숙 중쇄 유전자는 그 5' 말단에서 VDJ 영역, 즉 가변 영역 (V), 분지 영역 (D) 및 결합 영역 (J), 결합 영역에 뒤이은 발현되지 않는 나머지 J 영역 (J 영역의 수는 종에 따라 상이함), 및 인트론 서열로 구성된다. 이 유전자의 중앙 및 3' 부분은 각각 그 자신의 인접 교환 영역과 결합하는 상이한 종류 (예를 들면, 뮤, 델타, 감마, 엡실론, 알파)의 하나일 수 있는 불변 영역 엑손 (인트론 및 비번역 서열이 측면에 위치하거나 산재함)으로 구성된다. 따라서, 항체 생성 세포의 중쇄 유전자에서 상동성 재조합에 의한 lox 부위의 표적 삽입에 사용되는 표적 서열은 lox 부위의 삽입을 위한 목적 위치에 따라 항체 유전자의 임의의 부위에 상동성인 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 불변 영역의 대체를 지시하는 lox 부위의 삽입을 위한 표적 서열은 V, D 또는 J로 시작하는 교환 영역을 포함하거나 포함하지 않고 임의의 영역까지 걸치는 서열에 상동성인 서열을 포함할 수 있고, 그에 따라 표적 벡터의 제작시에 예를 들면 변형 서열의 코딩 영역의 5' 위치에 존재할 것이다. 사용될 수 있는 실제 표적 서열은 표적 숙주 세포의 종 및 표적 숙주 세포에 의해 발현되는 항체의 종류에 따라 상이할 수 있다.
일부 적용예에서 lox 부위는 궁극적으로 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형되는 항체의 아미노산 서열을 변형시킴이 없이 상동성 재조합에 의해 게놈 서열 내로 삽입된다. 항체 생성 세포의 성숙 중쇄 유전자를 수반하는 경우에 lox 부위는 이들 유전자의 적합하게 위치한 비번역 부분 내에, 예를 들면 5' 말단의 발현되지 않는 나머지 J 영역 및 인트론 서열; 및 유전자의 중앙 및 3' 부분의 불변 영역 인트론 및 비번역 서열 내에, 이러한 삽입이 목적 중쇄 분자의 발현을 붕괴시키지 않는 한, 삽입될 수 있다.
염색체 내의 중쇄 항체 유전자의 배열과는 대조적으로 성숙 경쇄 유전자는 그 5' 말단의 VJ 영역, 인트론 서열 및 하나의 불변 영역 엑손으로 구성된다. 따라서, 항체 생성 숙주 세포의 경쇄 유전자에 상동성 재조합에 의해 lox 부위를 삽입하기 위해 사용되는 표적 서열은 목적 변형에 따라 유전자의 임의의 부분에 상동성인 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 경쇄 불변 영역의 대체를 지시하는 표적 서열은 경쇄의 불변 영역의 코딩 영역에 선행하는 인트론 서열을 통하여 적합한 V 및 J의 전부 또는 일부에 걸치는 서열에 상동성일 수 있다. 이러한 표적 서열은 상동성 표적 플라스미드에 예를 들면 경쇄의 불변 영역의 코딩 영역에 선행하는 인트론 서열과 같은 경쇄 유전자의 비번역 서열 내로 lox가 통합되도록 lox 부위의 5' 위치에 적절하게 존재할 것이다. 표적 서열의 실제 뉴클레오티드 서열은 표적 숙주 항체 생성 세포의 동물 종에 따라 상이할 수 있다.
유사한 방식으로, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 Cre 매개 치환을 위한 lox 부위의 삽입을 지시하는 표적 서열은 가변 영역의 측면에 위치하는 적절한 영역의 전부 또는 일부에 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 또한, 어떠한 경우에도 표적 서열은 발현되는 단백질이 목적한 방식으로 변형되도록 가변 또는 불변 영역의 일부만이 치환되는 엑손 내 영역의 측면에 위치하는 코딩 영역 서열을 포함할 수 있다.
Cre 매개 부위 특이적 재조합의 사용
본 발명의 항체 생성 방법에서 하나 이상의 통합된 lox 부위를 갖는 게놈을 포함하는 세포는 lox 표적 벡터, 즉 일반적으로 통합된 lox 부위와의 Cre 매개 부위 특이적 재조합에 적합한 lox 부위를 포함하는 DNA 분자로 형질전환되고, 이어서 lox 부위가 Cre 리컴비나제와 상호작용하여 lox 부위에서 재조합을 생성시킨다. lox 부위의 위치 및 배향은 본원 및 본원에 참고로 포함된 사우어 (Sauer) 등의 미국 특허 제4,959,317호에서 설명된 바와 같이 재조합의 특성을 결정한다.
lox 부위, 표적 서열 및 변형 서열 외에, 본 발명의 상이한 표적 벡터는 성공적으로 형질전환된 항체 생성 세포의 스크리닝 및 선별을 돕는 선별가능 마커를 코딩할 수 있다. 적합한 마커 유전자에는 약물 내성 유전자, 예를 들면 hyg, gpt, neo 및 DHFR (상기 "약어"에서 정의됨) 등을 포함한다.
DNA 서열 (예를 들면 lox 표적 벡터 또는 상동성 표적 벡터)를 항체 생성 세포로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 하나 또는 제한된 수의 항체 생성 세포의 DNA에 서열을 도입한 후 상기 세포 또는 세포들을 성장시켜 적합한 세포의 군락을 형성시키기 위한 DNA 벡터의 사용을 포함한다. 바람직하게는, DNA 서열은 DNA 서열을 가지면서 선택된 진핵세포를 형질전환시킬 수 있는 플라스미드에 의해 도입된다. DNA 서열을 선택된 항체 생성 세포에 도입하기 위해 사용되는 특정 벡터는 중요하지 않다.
바람직한 실시형태에서, DNA 서열은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-467 (1973)]에 기술된 CaPO4 전이 방법에 따라 포유동물 세포에 도입된다. 특히 임파양 세포주의 형질감염은 인산칼슘 침전, 전기천공(electroporation), 미세주사 (microinjection), 리포좀 융합, RBC 고스트 (ghost) 융합, 원형질 융합 등의 당업계에 공지된 많은 방법에 의해 실시할 수 있다. 상동성 재조합을 위해 상동성 표적 벡터는 형질감염 세포에서 상동성 재조합의 가능성을 증가시키기 위해서 형질감염 전에 표적 서열 내에서 제한효소로 분해하여 선형화시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 Cre는 lox 부위와 상호작용하여 부위 특이적 Cre 매개 재조합을 생성시키기 위해 도입된다. 한 실시형태에서 Cre는 미세주사에 의해 세포에 직접 도입된다. 바람직한 실시형태에서 cre 유전자는 조절성 뉴클레오티드 서열의 조절하에 항체 생성 세포로 도입된다. 적합한 조절성 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 선택된 항체 생성 세포와 함께 사용되는 조절성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 방법에 중요하지 않다. 포유동물 세포에 적합한 조절성 뉴클레오티드 서열의 부분적인 목록은 몰로니 육종 바이러스의 긴말단반복체[Bolchlinger and Diggelmann, Mol. Cell Bio., 4:2929-2931 (1984)]; 마우스 메탈로티오네인-1 (MT-1) 프로모터[Pavlakis and Hamer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:397-401 (1983)]; 로우스 육종 바이러스의 긴말단반복체[Gorman dt al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)]; 및 SV40의 초기 영역 프로모터[Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982)]를 포함한다. 사우어 등의 미국 특허 제4,959,317호는 포유동물 세포에서 Cre를 발현하기 위한 플라스미드인 MT-1 프로모터 상류에 cre 유전자를 함유하는 플라스미드 pBS31을 기재하고 있다. CdCl2를 사용한 MT-1 프로모터의 활성화는 상기 벡터로 형질감염된 세포에서 cre 유전자의 발현에 영향을 끼친다.
lox 부위는 비대칭 뉴클레오티드 서열이기 때문에 동일한 DNA 분자 상의 2개의 lox 부위가 서로에대해 동일하거나 반대의 배향을 가질 수 있다. 동일한 배향을 갖는 lox 부위 사이의 재조합은 2개의 lox 부위 사이에 위치하는 DNA 세그먼트의 결실 및 본래 DNA 분자의 생성 말단 사이의 결합을 야기한다. 결실된 DNA 세그먼트는 환상 DNA 분자를 형성한다. 본래 DNA 분자 및 결과의 환상 분자는 각각 하나의 lox 부위를 포함한다. 동일한 DNA 분자 상의 반대 배향의 lox 부위 사이의 재조합은 2개의 lox 부위 사이에 위치한 DNA 세그먼트의 뉴클레오티드 서열의 역위를 야기한다. 또한, 2개의 상이한 DNA 분자 상에 위치한 lox 부위에 근접한 DNA 세그먼트의 상호 교환은 발생하여 2개의 새로운 재조합 DNA 분자를 생성시킬 수 있다. 이러한 모든 재조합 사건은 cre 유전자 생성물에 의해 촉매된다.
재조합체의 스크리닝 및 선별
성공적인 표적 유전자 변형에 대한 최종 시험은 세포에 의한 변형 항체의 생성이다. 적합하게 통합된 벡터 서열로 형질감염된 세포의 검출은 통합된 서열의 특성에 따라 많은 방법으로 실시할 수 있다. 시험 벡터가 선별가능 마커를 포함하는 경우, 형질감염 세포의 초기 스크리닝은 마커를 발현하는 세포를 선별하는 것이다. 예를 들면, 약물 내성 유전자를 사용하는 경우에, 내성 유전자가 없는 세포에 치사작용을 하는 약물을 함유하는 선별 배지에서 성장하는 형질감염체를 초기 스크리닝에서 찾아내는 것이다. 제2 스크리닝은 상동성 표적 벡터의 lox 부위가 통합된 형질감염체 또는 변형 항체를 발현하는 lox 표적 벡터의 변형 서열이 통합된 형질감염체를 찾아내는 것이 필요하다.
제2 스크리닝 프로토콜은 삽입된 서열의 특성에 따라 상이하다. 예를 들면, 통합된 lox 부위는 시험관 내에서 단리된 세포 DNA에 Cre로 처리한 후, 사우어 등의 미국 특허 제4,959,317호에 기재된 바와 같은 적합한 제한효소를 사용한 서던 블롯 분석법에 의해 검출된다. 별법으로, 상동성 표적 벡터로 형질감염된 세포에 대해서는 통합된 lox 부위를 함유하는 것으로 생각되는 특정 유전자 영역의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의한 lox 부위의 삽입 여부를 시험하고, 통상의 방법에 따라 lox 부위의 존재 여부에 대한 증폭 DNA를 (예를 들면 크기 또는 서열에 의해) 검사한다. 또다른 방법에서는, lox 부위 삽입의 확인은 본 발명의 lox 표적 벡터에 의해 운반되는 변형 서열의 정확한 통합의 효율을 시험함으로써 간접적으로 실시된다.
상이한 항체 종류 또는 종의 불변 영역을 코딩하는 변형 서열의 발현은 예를 들면 특정 면역글로불린 종류 및(또는) 종에 특이적인 항체를 사용한 면역분석법에 의해 검출된다. 별법으로, 생체분석은 변형 서열에 의해 부여되는 특정 효과기 기능을 시험하기 위해 실시된다. 효소, 독소, 성장 인자 또는 기타 펩티드와 같은 생물학적 활성 분자를 코딩하는 변형 서열의 발현은 특정 생물학적 활성에 의해 분석되고, 예를 들면 형질감염된 세포 생성물은 적합한 효소 기질 또는 독소, 성장 인자, 호르몬 등의 표적을 사용하여 시험된다. 별법으로, 이들 변형 서열 생성물은 변형 서열 생성물에 특이적인 항체를 사용하여 면역학적으로 분석된다.
펠 등의 미국 특허 제5,202,238호에 기재된 방법을 변형하여 통합된 lox 부위를 갖는 항체 생성 세포를 상기 문헌에 기재된 인간 불변 영역 서열을 포함하는 lox 표적 벡터로 형질감염시킨 후 플라스크 중의 선별 배지에 배양하였다. 선별에 충분한 시간(대부분의 경우 약 2주) 후에 생존 세포를 항체 생성 세포에 의해 본래 생성되는 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 리신과 같은 독소가 결합된 항체로 처리하였다. 성공적으로 형질감염되지 않은 세포는 쥐 불변 영역 서열을 함유하는 항체를 계속 발현하고 항-쥐 면역글로불린 항체에 접합된 독소에 의해 치사된다. 목적 인간 불변 영역 서열을 포함하는 변형된 항체를 발현하는 세포는 생존할 것이고, 계속해서 연질 아가 중에 배양되고 항인간 면역글로불린 항체의 오버레이에 의해 확인된다.
또한, 변형 서열을 발현하는 형질감염체는 예를 들면 펠 등의 상기 문헌 또는 카폰 (Capon) 등의 상기 문헌에 기재된 통상의 면역학적 결합 방법을 통하여 적합한 항원 또는 리간드 인식 여부에 대해 시험된다. 항체 서열이 변형될 예정의 세포는 본래 기능성 항체를 생성할 수 없지만 (예를 들면 경쇄만을 생성할 수 있기 때문에), 본 발명의 임의의 표적 벡터로 형질감염된 후에 유용한 형질감염체를 기능성 항체를 찾아내는 당업계에 공지된 분석법, 예를 들면 CDC, ADCC, 또는 면역침전 반응에 의해 확인된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
쥐 하이브리도마 세포에서 생성된 인간 항체의 "종류간 교환"
도 1은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 한 실시형태 (방법 A)의 모식도이다. 변형되는 세포는 변형 불변 영역으로 전환되는 인간 불변 영역 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 임파양 세포주 (하이브리도마)에서 유도된 것이다. 이 세포주는 예를 들면 펠 등의 상기 문헌에 기재된 바와 같은 상동성 재조합 방법을 사용하여 통합된 인간 불변 영역 유전자를 함유하는 벡터로 쥐 하이브리도마의 형질전환에 의해 생성될 수 있다. 또한, 상기 세포주는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자로 처리된 마우스로부터의 항원 특이적 인간 모노클로날 항체의 생성이 기술된 쿠체라파티 등의 PCT 출원 공개 제WO91/10741호 (1991년 7월 25일 공개)에 기재되어 있다. 이들 마우스로부터의 B 세포는 통상의 하이브리도마 생성 방법을 통하여 인간 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 제조에 사용된다.
방법 A의 본 발명의 방법은 변형되는 불변 영역 유전자에 인접한 하나의 lox 부위의 통합만을 필요로 한다. 이 방법에서, 제1 lox 부위는 게놈 DNA와 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 변형 불변 영역 (인간 Cγ)로 전환되는 불변 영역 유전자 (인간 Cμ)에 인접하여 통합된다. 이어서, 제2 lox 부위 및 선별가능 마커 유전자 (DHFR)을 포함하는 벡터 (환상 DNA로 구성됨)는 세포내로 도입되고 lox 부위는 Cre와 일시적으로 상호작용한다. Cre는 상기한 바와 같이 cre 유전자를 일시 발현하는 벡터의 동시 형질감염에 의해 제공된다. 게놈 내의 lox 부위와 환상 벡터 상의 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합은 선별가능 마커 유전자 (DHFR)과 함께 변형 서열 (Cγ)을 게놈 내로 삽입시킨다. DHFR 및 Cγ 유전자의 측면에 위치하는 2개의 lox 부위를 갖는 목적 형질감염체는 추가의 Cre 발현의 부재시에 안정하고 DHFR 마커 유전자의 발현 (즉, 도 1에서 "MetR"로 나타낸 약물 메토트렉세이트에 내성)으로 선별하여 수득된다. 각각의 형질감염 및 선별 단계 후에 면역글로불린 좌위의 목적 변형에 대한 확인은 상기한 바와 같이 PCR 증폭과 같은 통상의 유전자 분석에 의해 제공된다.
도 2는 항체 생성 세포의 게놈에 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역 및 2개의 lox 부위을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 다른 실시형태 (방법 B)의 모식도이다. 이 방법은 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 변형 불변 영역 (Cγ)로 전환되는 게놈 서열 (인간 Cμ)의 불변 영역 유전자의 측면에 위치하는 2개의 lox 부위를 삽입하는 단계를 포함한다. 도 2에 도시한 바와 같이, 세포는 각각 2개의 lox 부위를 삽입하기 위한 2개의 상동성 표적 벡터로 순차적으로 또는 동시에 형질감염된다. lox 부위의 삽입에 사용되는 각각의 벡터는 도 2에 도시한 바와 같이 hyg 선별가능 마커 유전자 (즉, 히그로마이신 내성에 따른 선별 "HygR", 및 neo 선별가능 마커 유전자 (즉, "G418R"로 표시되는 약물 G418 내성에 따른 선별)의 사용에 의해 상이한 선별가능 마커 유전자를 포함한다. 삽입된 lox 부위 2개 모두를 갖는 재조합체는 양 마커를 연속적으로 또는 동시에 선별함으로써 수득된다. 어떠한 경우에도, 2개의 상동성 표적 벡터의 적합한 통합의 결과는 2개의 삽입된 lox 부위가 전환되는 유전자 (Cμ)의 측면에 위치하고, 또한 lox 부위 삽입에 사용된 각각의 선별가능 마커 유전자의 측면에도 삽입된 lox 부위가 존재한다는 것이다.
이어서, 추가의 lox 부위, 변형 서열 (Cγ) 및 제2 선별가능 마커 유전자 (DHFR)을 포함하는 벡터 (환상 DNA로 구성됨)로 세포가 형질감염되고 lox 부위가 Cre와 상호작용한다. Cre는 상기한 바와 같이 cre 유전자를 일시 발현하는 벡터를 동시 형질감염시킴으로써 제공된다. 변형 서열은 lox 부위와 벡터의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 제2 선별가능 마커 유전자와 함께 게놈 서열 내로 삽입되고 lox 부위 중의 어느 하나는 게놈 서열에 삽입된다. 이어서, 도 2에 도시한 바와 같이, 몇몇 세포에서 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 제1 마커 유전자 (hyg), 제2 마커 유전자 (neo) 및 전환되는 유전자 (Cμ)의 절단에 의해 전환되는 불변 영역 유전자 (Cμ)에 인접한 lox 부위에 변형 서열을 통합시킨다. 따라서, 목적 형질감염체는 도 2에서 제3 마커 유전자 (DHFR)을 발현하고 제1 및 제2 마커 유전자를 발현하지 않는, 즉 메토트렉세이트에 내성("MetR")이고, 약물 G418 감수성 ("G418s") 및 히그로마이신 감수성 ("Hygs")인 형질감염체를 선별함으로써 수득된다.
문헌 [Simonsen and Levinson, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495-2499]에서 야생형 유전자보다 약물 메토트렉세이트에 대한 친화성이 더 낮은 것으로서 기술된 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (*DHFR)의 변이형을 사용하여 정상 DHFR 유전자를 보유하는 세포를 선별한다. 메토트렉세이트의 농도를 단계적으로 증가시켜 DHFR 및 연결된 유전자를 증폭시킴으로써, 연결된 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생성을 동시에 증가시켰다. 따라서, 변이형 DHFR 마커 유전자는 유전자 증폭을 통하여 면역글로불린의 수준을 상승시키는 이점을 제공한다.
실시예 2
통합된 lox 부위를 포함하는 쥐 하이브리도마 세포에서 생성된 인간 항체의 "종류간 교환"
도 3은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 변형 불변 영역을 갖는 인간 항체 분자를 발현하는 세포를 생산하기 위한 본 발명 방법의 또다른 실시형태 (방법 C)의 모식도이다. 변형되는 세포는 변형 불변 영역으로 전환되는 인간 불변 영역 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 임파양 세포주 (하이브리도마)에서 유도된 것이다. 제1 lox 부위는 변형 불변 영역 (인간 Cγ)으로 전환되는 불변 영역 유전자 (인간 Cμ)에 인접하여 통합된다. 보다 구체적으로는, 방법 C는 Cμ 인핸서 서열 (Eμ), Cμ 엑손 "I"의 서열 (Iμ) 및 인간 Cμ 영역의 Cμ 교환 서열의 5' 쪽에 존재하는 lox 부위를 보여준다.
상기 세포주는 벡터 내의 불변 영역 유전자가 통상의 유전공학 방법에 의한 lox 부위의 삽입에 의해 변형되는 상기 펠 등의 문헌에 기재된 상동성 재조합 방법을 사용하여 통합되는 인간 불변 영역 유전자를 포함하는 벡터로 쥐 하이브리도마를 형질전환시켜 생성시킬 수 있다. 또한, 상기 세포주는 통상의 하이브리도마 생성 방법에 의해 상기와 같이 생색세포주 DNA 내로 통합된 lox 부위를 포함하는 트랜스제닉 마우스로부터 B 세포의 하이브리도마를 제조함으로써 생성시킬 수 있다.
방법 C에서 본 발명의 방법은 변형되는 불변 영역 유전자에 인접한 하나의 lox 부위의 통합만을 필요로 한다. 이 방법에서, 제2 lox 부위 및 선별가능 마커 유전자 (DHFR)를 포함하는 벡터 (환상 DNA로 구성됨)로 세포를 형질감염시키고 lox 부위는 상기한 바와 같이 Cre와 일시적으로 상호작용한다. 게놈 내의 lox 부위와 환상 벡터 상의 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합은 선별가능 마커 유전자 (DHFR)를 갖는 변형 서열 (Cγ)을 게놈 내로 삽입시킨다. DHFR 및 Cγ 유전자의 측면에 위치하는 2개의 lox 부위를 갖는 목적 형질감염체는 추가의 Cre 발현의 부재시에도 안정하고, DHFR 마커 유전자의 발현 (즉, 도 3에 "MetR"로 나타낸 약물 메토트렉세이트 내성)을 통하여 선별함으로써 얻을 수 있다. 각각의 형질감염 및 선별 단계 후의 면역글로불린 좌위의 목적한 변형은 상기한 PCR 증폭과 같은 통상의 유전자 분석에 의해 확인한다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 자코보비츠, 아야
즈세보, 크리스티나 엠.
(ii) 발명의 명칭: Cre 매개 부위 특이적 재조합을 이용한 항체의 제조
(iii) 서열수: 3
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 셀 제네시스, 인크.
(B) 거리: 레이크사이드 드라이브 322
(C) 도시: 포스터 시티
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 94404
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현 출원 데이타:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 1995년 3월 29일
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 이름: 만델, 사라린
(B) 등록번호: 31,853
(C) 참조/문서 번호: CELL20
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호: (415) 358-9600 X345
(B) 팩스: (415) 349-7392
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 34 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명:
[서열 1]
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 34 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명:
[서열 2]
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 34 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명:
[서열 3]
본 발명은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 면역글로불린 좌위의 변형에 의해 게놈 서열로부터 목적 항체를 발현하는 세포의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 특히 면역글로불린 좌위의 변형을 위해 상동성 재조합만을 사용하여 항체 생성 세포에서 직접 면역글로불린 좌위를 변형시키는 종래의 방법에 비해 재조합 효율의 증가라는 이점을 제공한다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 변형 면역글로불린 좌위를 포함하는 세포의 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하고,
(a) (i) 제1 lox 부위 및 (ii) 제1 lox 부위가 체내에서 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 게놈 서열 내에 삽입되도록 하기 위해 변형 영역으로 전환되는 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접한 제1 DNA 서열에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제1 상동성 표적 벡터로 항체 생성 세포를 형질감염시키는 단계;
(b) (i) 제1 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 제2 lox 부위, 및 (ii) 면역글로불린 좌위의 상기 영역을 변형 영역으로 전환시키는 변형 서열을 포함하는 lox 표적 벡터로 상기 세포를 형질감염시키는 단계;
(c) lox 부위를 Cre와 상호작용시켜 변형 서열을 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 게놈 서열 내로 삽입시키고, 이에 의해 면역글로불린 좌위의 영역을 변형 영역으로 전환시키는 단계; 및
(d) 면역글로불린 좌위의 영역이 변형 영역으로 전환되고 항체 분자를 생성시키는 형질감염체의 선별 단계를 포함한다.
상기 방법의 한 바람직한 실시형태에서 lox 표적 벡터는 마커 유전자가 세포 내에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 선별가능 마커 유전자를 더 포함한다. lox 부위가 Cre와 상호작용할 때 마커 유전자는 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 변형 서열과 함께 게놈 서열 내로 삽입된다. 이 실시형태에서 형질감염체의 선별은 마커 유전자의 발현에 대한 선별을 포함한다.
본 발명 방법의 제2의 바람직한 실시형태는 단계 (b) 전에, (i) 제1 및 제2 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 제3 lox 부위, (ii) 세포에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 제1 선별가능 마커 유전자, 및 (iii) 전환되는 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접한 제2 DNA 서열에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제2 상동성 표적 벡터로 세포를 형질감염시키는 추가의 단계를 더 포함한다. 이 실시형태에서 전환되는 유전자의 측면에는 제1 및 제2 DNA 서열이 존재하고, 제3 lox 부위 및 제1 마커 유전자가 체내에서 게놈 DNA와 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 게놈 DNA 내에 삽입된다.
또한, 상기 바람직한 제2 실시형태에서 제2 표적 벡터는 세포내에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 제2 선별가능 마커 유전자를 더 포함한다. lox 부위가 Cre와 상호작용할 때 제2 마커 유전자는 적합한 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 변형 서열과 함께 게놈 유전자 내로 삽입된다. 이 실시형태에서 형질감염체의 선별은 제2 마커 유전자의 발현에 대한 선별을 포함한다. 본 발명의 상기 실시형태의 다른 변형 형태에서, lox 부위가 Cre와 상호작용시 변형 서열 및 제2 마커 유전자가 게놈에 삽입된 후에 제1 마커 유전자 및 전환되는 영역은 Cre 매개 부위 특이적 재조합에 의해 결실되기 때문에 형질감염체에 대한 선별은 제1 마커 유전자를 발현하지 않는 형질감염체에 대한 선별을 추가로 포함한다.
본 발명 방법의 일부 실시형태에서 변형 서열은 게놈 서열의 면역글로불린 유전자의 변화된 발현을 제공하기 위해서 게놈 서열의 면역글로불린 유전자의 조절성 서열의 전부 또는 일부를 치환시키는 조절성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형 서열은 변형 항체 분자를 형성시키기 위해서 항체 분자의 불변 영역 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 번역 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 후자의 실시형태의 일부에서 변형 영역으로 전환되는 면역글로불린 좌위의 영역은 불변 영역 유전자를 포함하고 변형 서열은 상기 불변 영역 유전자에 의해 생성된 항체의 불변 영역의 전부 또는 일부를 변형 불변 영역으로 대체시킨 번역 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
때로, 게놈 서열의 불변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자이고 변형 불변 영역 유전자는 상이한 인간 불변 영역을 코딩한다. 변형 불변 영역 유전자는 경쇄 유전자 또는 중쇄 유전자를 포함할 수 있다. 변형 불변 영역을 갖는 항체 분자를 발현하는 세포를 생성시키기 위한 본 발명 방법의 다양한 실시형태에서 변형 불변 영역 유전자는 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 링커 또는 변형된 중쇄 효과기 기능을 갖는 변이 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명 방법의 일부 실시형태에서 항체 분자를 발현하는 세포는 임파양 세포주의 세포이다. 이 임파양 세포주는 쥐, 인간 또는 키메라 항체를 생성하는 쥐 하이브리도마 세포주일 수 있다. 일부 실시형태에서 하이브리도마 세포주는 인간 면역글로불린 유전자의 발현에 의해 인간 항체를 생성한다. 한 특정 실시형태에서 세포는 인간 면역글로불린 유전자의 발현에 의해 인간 항체를 생성하는 쥐 임파양 세포이다. 상기 실시형태의 한 변형에서 게놈 서열의 불변 영역 유전자는 뮤 (μ) 종류의 인간 불변 영역 (C) 유전자, 즉 Cμ 유전자이고, 변형 서열은 인간 C 감마 (Cγ) 불변 영역 유전자를 포함한다.
다른 측면에서 본 발명은 상기 본 발명 방법에 의해 생성되는, 변형 면역글로불린 좌위를 포함하는 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 면역글로불린 좌위의 영역을 변형시키기 위한, 항체 분자를 코딩하는 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하거나 이 영역 내에 통합된 lox 부위를 갖는 세포의 게놈 서열로부터 항체 분자를 발현하는 세포를 생성하는 방법이다. 이 방법은 (a) (i) 제1 lox 부위 및 (ii) 제1 lox 부위가 체내에서 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 게놈 서열 내에 삽입되도록 하기 위해, 변형 영역으로 전환되는 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접한 제1 DNA 서열에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제1 표적 벡터로 항체 생성 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가로 전환되는 영역에 인접한 게놈 DNA 내에 삽입된 lox 부위를 갖는 형질전환체의 선별 단계 (b)를 포함한다. 이 선별은 체내에서 게놈 DNA와 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 게놈 서열 내에 lox 부위를 삽입하기 위해 사용된 벡터에 하나 이상의 선별가능 마커 유전자를 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 상기 특징의 또다른 면은 상기 본 발명의 방법에 의해 생성되는, 항체 분자를 코딩하는 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하거나 이 영역 내에 통합된 lox 부위를 갖는 항체를 발현하는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 인간 중쇄 면역글로불린 좌위의 적어도 기능성 부분 또는 인간 경쇄 면역글로불린 좌위의 적어도 기능성 부분을 포함하는 게놈을 포함하는 트랜스제닉 비영장류 포유동물의 배 간세포에 관한 것이다. 상기 간세포의 게놈에서 lox 부위는 상기 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하거나 이 영역 내에 통합된다. 바람직한 실시형태에서 이 간세포는 쥐 간세포이다.
본 발명의 관련 측면은 인간 중쇄 면역글로불린 좌위의 적어도 기능성 부분 또는 인간 경쇄 면역글로불린 좌위의 적어도 기능성 부분을 포함하는 게놈을 포함하는 트랜스제닉 비영장류 포유동물이다. 이 간세포의 게놈에서 lox 부위는 상기 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 영역에 인접하거나 이 영역 내에 통합된다. 바람직한 실시형태에서 이 트랜스제닉 포유동물은 쥐이다.
본 발명의 다른 측면을 아래에 설명한다.
Claims (13)
- (a) (i) 제1 lox 부위 및 (ii) 상기 제1 lox 부위를 체내에서 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 변형 영역으로 전환되는 상기 게놈 서열의 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 삽입시키기 위해 상기 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 위치한 제1 DNA 서열에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제1 상동성 표적 벡터로 항체 생성 세포를 형질감염시키는 단계;(b) (i) 상기 제1 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 제2 lox 부위, 및 (ii) 면역글로불린 좌위의 상기 영역을 상기 변형 영역으로 전환시키는 변형 서열을 포함하는 lox 표적 벡터로 단계 (a)의 상기 세포를 형질감염시키는 단계;(c) lox 부위를 Cre와 상호작용시켜 상기 변형 서열을 상기 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 상기 게놈 서열 내로 삽입시키고, 이에 의해 면역글로불린 좌위의 상기 영역을 상기 변형 영역으로 전환시키는 단계; 및(d) 면역글로불린 좌위의 상기 영역이 상기 변형 영역으로 전환되고 상기 항체 분자를 생성시키는 형질감염체의 선별 단계를 포함하며, 면역글로불린 좌위를 변형시키기 위해서 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하는, 변형 면역글로불린 좌위를 포함하는 세포의 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포의 생성 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 lox 표적 벡터가, 상기 세포에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 선별가능 마커 유전자를 추가로 포함하여, 단계 (c)에서 lox 부위와 Cre의 상호작용시에 상기 마커 유전자가 상기 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 상기 변형 서열을 갖는 상기 게놈 서열로 삽입되고, 단계 (d)에서 상기 형질감염체 선별 단계가 상기 마커 유전자를 발현하는 형질감염체의 선별을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (b) 전에(i) 상기 제1 및 제2 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 제3 lox 부위,(ii) 상기 세포에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 제1 선별가능 마커 유전자, 및(iii) 상기 제3 lox 부위 및 상기 제1 마커 유전자가 체내에서 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 상기 게놈 서열 내로 삽입되도록, 전환되는 상기 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 영역에 인접한 제2 DNA 서열 (전환되는 상기 영역의 측면에는 상기 제1 및 제2 DNA 서열이 존재함)에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제2 상동성 표적 벡터로 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 추가의 단계를 포함하고,단계 (b)에서, 상기 lox 표적 벡터가, 상기 세포에서 발현되도록 조절 영역에 작동가능하게 연결된 제2 선별가능 마커 유전자를 추가로 포함하여, 단계 (c)에서 lox 부위와 Cre의 상호작용시에 상기 제2 마커 유전자가 상기 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 상기 변형 서열을 갖는 상기 게놈 서열로 삽입되고,단계 (d)에서 상기 형질감염체 선별 단계가 상기 제2 마커 유전자를 발현하는 형질감염체를 선별을 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 단계 (c)에서 lox 부위와 Cre의 상호작용시에 상기 변형 서열 및 제2 마커 유전자가 상기 게놈 서열 내에 삽입된 후에 상기 제1 마커 유전자 및 전환되는 상기 영역이 Cre 매개 부위 특이적 재조합에 의해 결실되고,단계 (d)에서 상기 형질감염체 선별이 상기 제1 마커 유전자를 발현하지 않는 형질전환체의 선별을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 변형 영역으로 전환되는 면역글로불린 좌위의 상기 영역이 불변 영역 유전자를 포함하고, 상기 변형 서열이 a) 상기 게놈 서열의 면역글로불린 좌위의 조절성 서열의 전부 또는 일부를 대체하여 상기 면역글로불린 좌위의 발현을 변화시키는 조절성 뉴클레오티드 서열, b) 항체 분자의 불변 영역 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 대체하여 변형된 항체 분자를 형성하는 번역 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 c) 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자 또는 링커를 코딩하는 서열 중의 하나를 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, a) 상기 게놈 서열의 상기 불변 영역 유전자가 쥐 불변 영역 유전자를 포함하고 상기 변형 서열이 인간 불변 영역 유전자 또는 그 일부를 포함하거나, b) 상기 게놈 서열의 상기 불변 영역 유전자가 인간 불변 영역 유전자를 포함하고 상기 변형 서열이 상이한 인간 불변 영역 유전자 또는 그 일부를 포함하거나, c) 상기 게놈 서열의 상기 불변 영역 유전자가 인간 Cγ 유전자를 포함하고 상기 변형 서열이 인간 Cμ 불변 영역 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 항체 분자를 발현하는 상기 세포가 인간 면역글로불린 좌위의 발현에 의해 인간 항체를 생성하는 쥐 하이브리도마 세포주인 방법.
- (a) 제1항의 방법에 의해 제조할 수 있는, 변형 면역글로불린 좌위를 포함하는 게놈 서열로부터 항체를 발현하는 세포를 이 세포가 상기 항체를 발현하는 조건 하에 배양하는 단계, 및(b) 상기 세포에 의해 발현된 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 세포로부터 항체의 생성 방법.
- (a) (i) 제1 lox 부위 및 (ii) 상기 제1 lox 부위를 게놈 DNA와의 부위 특이적 상동성 재조합을 통하여 게놈 서열에 삽입시키기 위해 변형 영역으로 전환되는 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 위치한 제1 DNA 서열에 상동성인 표적 서열을 포함하는 제1 상동성 표적 벡터로 항체 생성 세포를 시험관내에서 형질감염시키는 단계; 및(b) 전환되는 상기 영역의 5'의 상기 게놈 DNA에 상기 lox 부위가 삽입된 형질감염체를 선별하는 단계를 포함하며, Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 면역글로불린 좌위 영역을 변형시키는 데 사용하는, 항체 분자를 코딩하는 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 삽입된 lox 부위를 포함하는 게놈의 항체 코딩 서열을 발현하는 세포의 생성 방법.
- 제9항의 방법에 의해 수득가능한, 항체 분자를 코딩하는 상기 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 lox 부위를 갖는 상기 세포의 게놈 서열로부터 상기 항체를 발현하는 세포.
- (a) (i) 상기 제1 lox 부위와의 Cre 매개 재조합에 적합한 제2 lox 부위 및 (ii) 변형 서열을 포함하되, 상기 제2 lox 부위가 상기 변형 서열의 5'에 위치한 lox 표적 벡터로 제9항의 단계 (b)에서 선별된 세포를 형질감염시키는 단계;(b) lox 부위를 Cre와 상호작용시켜 상기 변형 서열을 상기 lox 부위의 Cre 매개 부위 특이적 재조합을 통하여 상기 면역글로불린 좌위 내로 삽입시키고, 이에 의해 변형된 면역글로불린 좌위를 형성하는 단계; 및(c) 면역글로불린 좌위의 상기 영역이 상기 변형 면역글로불린 좌위로 전환되어 상기 항체 분자를 생성하는 형질감염체를 선별하는 단계를 포함하며, Cre 매개 부위 특이적 재조합을 사용하여 상기 변형되는 면역글로불린 좌위 영역의 5'에 제1 lox 부위를 포함하는 게놈 서열에 통합된 항체 생성 세포의 면역글로불린 좌위 영역을 변형시키는 방법.
- 제11항의 방법에 의해 수득가능하며, 변형된 면역글로불린 좌위 내에 통합된 변형 서열의 5'에 lox 부위를 포함하는, 변형된 면역글로불린 좌위를 게놈에 통합시켜 포함하는 항체 생성 세포.
- (a) 제12항에 따른 세포를, 상기 세포가 항체를 생성하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및(b) 상기 세포에 의해 생성된 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 면역글로불린 좌위를 게놈에 통합시켜 포함하는 세포로부터 항체를 생성하는 방법.
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