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KR100491095B1 - 에프에이에스수용체들및다른단백질들의기능조절인자들 - Google Patents

에프에이에스수용체들및다른단백질들의기능조절인자들 Download PDF

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KR100491095B1
KR100491095B1 KR10-1998-0700354A KR19980700354A KR100491095B1 KR 100491095 B1 KR100491095 B1 KR 100491095B1 KR 19980700354 A KR19980700354 A KR 19980700354A KR 100491095 B1 KR100491095 B1 KR 100491095B1
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다비드 월러치
마크 볼딘
타냐 곤차로브
유리 브이. 골트세브
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예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
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Abstract

본 발명은, MORT-1 단백질에 결합하가나 상호작용하고 차례로 FAS 수용체의 세포내 도메인 또는 p55 수용체에 결합하는 다른 단백질인 TRADD에 결합함으로써, FAS 수용체 또는 p55 수용체를 수반하는 세포들에 대한 FAS 수용체 리간드 또는 TNF 효과를 조절 또는 매개할 수 있는 단백질들을 제공한다. 나아가 단백질 분해 활성을 갖는 MORT-1-결합 단백질들의 단백분해 효소를 방해하는 펩티드 억제인자들 및 그들을 고안하는 방법을 제공한다.

Description

에프에이에스 수용체들 및 다른 단백질들의 기능 조절인자들
본 발명은 일반적으로 TNF/NGF 수퍼패밀리 수용체들에 속해 있는 수용체들 및 그들의 생물학적 기능들의 조절에 관한 것이다. TNF/NGF 수퍼패밀리 수용체들은 p55 및 p75 종양괴사인자 수용체들(TNF/Rs, 본원에서는 이하 p55-R 및 p75-R라고 명명됨) 및 FAS 리간드 수용체(FAS/APO1 또는 FAS-R 이라고도 불림, 본원에서는 이하 FAS-R이라고 명명됨)와 같은 수용체들 및 기타들을 포함한다. 더욱 상세하게 말하자면, 본 발명은 단백질 MORT-1(또는 FADD)에 결합하는 신규한 단백질에 관한 것으로서, 더욱 상세히 말하자면, 본원에서 MACH로 명명된 MORT-1 결합 단백질에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 일반적으로, MORT-1 및 MORT-1에 직접 또는 간접적으로 결합하는 다른 단백질의 기능을 조절 또는 매개할 수 있는 신규한 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 MACH, 그의 준비 및 용법에 관한 것으로서, MACH의 다양한 신규한 이소폼들 및 그들의 준비 및 용법도 포함한다.
종양괴사인자(TNF-α)와 림포톡신(TNF-β)(이하에서는 TNF는 TNF-α와 TNF-β 양자를 말하는 것임)은, 단핵 식균세포에 의해 주로 생성되고 세포들에 대하여 많은 효과들을 갖는 다기능 선구-염증성 시토킨들(pro-inflammatory cytokines)이다[참조: Wallach, D.(1986): Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; 및 Beutler and Cerami(1987)]. TNF-α 및 TNF-β 양자는 특정 세포표면수용체들에 결합함으로써 그들의 효과를 개시한다. 그 효과들 중 어떤 것은 생물체에게 이로운 것일 수 있다: 그들은 예를들면 종양세포 또는 바이러스에 감염된 세포를 파괴하고 과립성 백혈구(granulocytes)의 항균활성을 증진시킬 수 있다. 이러한 방식으로 TNF는 종양 및 감염인자에 대한 생물체의 방어에 기여하고 상처의 회복에 기여한다. 따라서 TNF는 항-종양인자로 사용될 수 있는데, 이러한 적용에서 TNF는 종양세포 표면위에 있는 수용체에 결합하여 종양세포의 사멸을 유도하는 반응들을 개시한다. TNF는 또한 항-감염인자로 사용될 수 있다.
그러나 TNF-α 및 TNF-β 양자는 또한 해로운 효과도 가지고 있다. TNF-α의 과도한 생산이 몇몇 질환에서 주요한 병원성 역할을 한다는 증거가 있다. 예를들면, 주로 맥관계에서 TNF-α의 효과는 패혈쇼크증세의 주요 원인인 것으로 알려져 있다[참조: Tracey et al., 1986]. 어떤 질병에서는 TNF가 지방세포의 활동을 억제하고 식욕부진을 일으킴으로써 과다체중감소(영양불량: cachexia)를 일으키고, 따라서 TNF-α는 카케틴(cachetin)이라 불린다. TNF는 또한 류머티스성 질환에서 조직에 손상을 입히는 매개자로[참조: Beutler and Cerami, 1987] 또는, 이식편-대-숙주반응(graft-versus-host reaction)에서 관찰되는 손상의 주요 매개자로[참조: Piquet et al., 1987] 묘사되기도 하였다. 또한 TNF는 염증진행과정 및 다른 많은 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.
독립적으로 발현되는 별개의 두 수용체들인 p55 TNF-R와 p75 TNF-R는 TNF-α 및 TNF-β 양자와 특이적 결합을 하여 앞서 언급한 TNF의 생물학적 효과를 개시 및/또는 매개한다. 이 두 수용체는, 다른 신호전달을 할 것이라 암시하는, 구조적으로 비유사한 세포내 도메인들을 가지고 있다[참조 Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; 및 Heller et al., 1990]. 그러나 예를들면 p55 TNF-R 및 p75 TNF-R의 세포내 신호전달에 관여하는 다양한 단백질들 및 가능성 있는 다른 인자들과 같은 세포메카니즘들은 아직 밝혀지지 않았다. 종국적으로 TNF에 대하여 관찰되는 세포반응을 나타내는 원인인, 캐스캐이드 반응들(cascade reations)의 시작을 초래하는 것은, 바로 리간드 즉 TNF (α 또는 β)가 수용체에 결합한 후에 일반적으로 일어나는 세포내 신호전달이다.
상기 언급한 TNF의 세포파괴성 효과에 대해, 지금까지 연구되어 온 대부분의 세포에서 이러한 효과는 p55 TNF-R에 의해 주로 촉발된다. p55 TNF-R의 세포외 도메인(리간드 결합 도메인)에 대한 항체들은, 항체에 의한 수용체 교차-결합(receptor cross-linking) 효율성와 관련 있는 세포파괴성 효과를 촉발할 수 있는데[EP 412486 참조], 이것은 세포내 신호전달 과정의 발생에 있어서 첫단계로 믿어진다. 더욱이 돌연변이 연구[참조 Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993]는 p55 TNF-R의 생물학적 기능이 이 수용체의 세포내 도메인의 완전성(integrity)에 의존한다는 것을 밝혔고, 따라서 TNF의 세포파괴성 효과를 일으키는 세포내 신호전달의 개시는 p55 TNF-R의 둘 이상의 세포내 도메인들간의 결합의 결과로 일어나는 것이라고 제시되었다. 또한, TNF(α와 β)는 호모 삼합체(homotrimer)로 존재한다. 따라서, 수용체 분자들에 결합하여 수용체 분자들을 교차결합하게하는, 즉 수용체 응집을 야기하는 활성에 의하여, TNF가 p55 TNF-R을 통한 세포내 신호전달을 유도한다고 제시되었다.
TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리의 다른 일원인 FAS 수용체(FAS-R)는 또한 FAS 항원으로도 명명되는데, 다양한 조직에서 발현되며, TNF-R 및 NGF-R을 포함한 다수의 세포표면수용체들과 상동성을 갖는 세포표면단백질이다. FAS-R는 아폽토시스(apoptosis)라는 방식으로 세포 사멸을 매개하고[Itoh et al., 1991], FAS-R은 자동반응성(autoreactive) T세포의 음성 선택인자(negative selector)로서의 역할을 하는 것으로 보인다. 즉, T세포 성숙기 동안, FAS-R은 자기-항원들을 인식하는 T세포들의 아폽토시스성 세포사멸을 매개한다. 또한 FAS-R 유전자(lpr)내 돌연변이들은, 사람의 자기면역질병인 전신성 홍반성 루푸스(sustemic lupus erythematosus: SLE)와 유사한 마우스의 림프세포 증식증을 야기시킨다고 알려졌다[Watanabe-Fukunaga et al., 1992]. FAS-R의 리간드는, 다른 것들 중에서도 킬러 T세포(또는 세포독성 T 림포사이트-CTLs)에 의해 운반되는 세포-표면 결합 분자인 것으로 보인다. 따라서 상기 CTLs가 FAS-R을 갖는 세포와 접촉하는 경우 CTLs는 FAS-R을 갖는 세포의 아폽토시스성 세포 사멸을 유도할 수 있다. 더욱이 FAS-R에 특이적인 모노클로날 항체가 제조되었는데, 상기 모노클로날 항체는, 사람 FAS-R을 코딩하는 cDNA에 의해 형질전환된 마우스세포들을 포함하여 FAS-R을 갖는 세포들에 아폽토시스성 세포사멸을 유도할 수 있다[Itoh et al., 1991].
몇 개의 림포사이트들의 세포독성 효과들은, 세포 사멸을 촉발하는 능력을 갖으며 광범위하게 있는 세포표면 수용체 FAS-R(CD95)과 림포사이트-생산된 리간드의 상호작용에 의해 매개되는데, T 림포사이트들외에도 다양한 다른 정상세포들도 그들의 표면에 FAS-R을 발현하고 상기 수용체의 촉발에의해 사멸될 수 있다고 밝혀졌다. 비-제어된 상기 치사과정의 유도는 특정 질환들에서의 조직 상해를 야기한다고 생각된다. 예를들면, 급성 간염에서의 간세포들의 파괴가 있다. 따라서, FAS-R의 세포독성 활성을 억제하는 방법들을 모색하면 치료학적 잠재력을 갖을 수 있다.
반대로, 어떤 악성 세포들 및 HIV-감염된 세포들은 그들의 세포표면에 FAS-R을 수반한다고 밝혀졌으므로, FAS-R에 대한 항체 또는 FAS-R 리간드는 상기 세포에서 FAS-R 매개성 세포독성 효과를 촉발시키는데 사용될 수 있고 이에 의해 상기 악성 세포 또는 HIV-감염 세포와 싸울 수 있는 수단을 제공할 수 있다[Itoh et al., 1991참조]. FAS-R의 세포독성 활성을 증대시키는 또다른 방법들을 모색하는 것 또한 치료학적 잠재력을 가질 수 있다.
TNF(α와 β) 및 FAS-R 리간드에 대한 세포반응을 조절하는 방법이 오랫동안 절실해 요구되어 왔다. 예를들면 상기 언급한 것과 같은 TNF 또는 FAS-R 리간드가 과다 발현되는 질병 상황에서는 TNF 또는 FAS-R 유도성 세포파괴성 효과를 억제하는 것이 바람직하고, 한편 예를들면 상처를 치유하려할 다른 상황에서는 TNF 효과를 증진시키는 것이 바람직하고, 종양세포나 HIV-감염 세포에서는 TNF-R 매개 효과를 증대시키는 것이 바람직하다.
본 출원인들의 실험실에서는, 항-TNF 항체들을 사용하여 TNF가 그 수용체에 결합하는 것을 억제하거나, 또는 수용성 TNF 수용체들(본래 수용체의 수용성 세포외 도메인임)을 사용하여 TNF가 세포표면-결합된 TNF-Rs에 결합하는 것과 경쟁시키는 방식으로, TNF의 해로운 효과를 조절하기 위한 여러 가지 접근을 시도하여 왔다[예컨데 유럽특허출원번호 EP 186833, EP 308378, EP 398327 및 EP 412486 참조]. 더욱이 TNF가 그 수용체에 결합하는 것이 TNF-유도성 세포효과에 필요하다는 사실에 기초하여, 본 출원인들은 TNF-Rs의 활성을 조절함으로써 TNF 효과를 조절하려는 접근을 시도하여 왔다[예를들면 EP 568925 참조].
간단히 말하자면, EP 568925는 TNF-Rs에 있어서의 신호도입 및/또는 절단을 조절하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 펩티드들 또는 다른 분자들이 수용체 그자체와 또는 수용체와 상호작용하는 효과인자 단백질과 상호작용하여, TNF-Rs의 정상적인 기능을 조절한다. EP 568925에서는, p55 TNF-R의 세포외 도메인, 세포막통과(transmembrane) 도메인 및 세포내 도메인에 돌연변이를 가지는 다양한 p55 TNF-Rs 돌연변이체의 제조 및 그 특성이 기재되어 있다. 이와같은 방법으로 p55 TNF-R의 상기 도메인 내에 있는 영역들이, TNF 수용체의 기능 즉, 리간드(TNF)의 결합 및 종국적으로 세포에 대한 관찰되는 TNF 효과의 원인이 되는 신호도입 및 세포내 신호전달에 필수적임을 밝혀 내었다. 나아가, TNF-R의 상기 도메인에 있는 다양한 영역들에 결합할 수 있는 단백질, 펩티드 또는 다른 인자들을 분리하고 동정하는 여러 접근방법들이 설명되어 있으며, 상기 단백질들, 펩티드들 및 다른 인자들은 TNF-R의 활성을 조절하는데 관여할 것이다. 상기 단백질들 및 펩티드들을 코딩하는 DNA 서열들을 분리하고 클로닝하기 위한 접근들; 상기 단백질들과 펩티드들이 생산을 위한 발현 벡터들을 제작하기 위한 접근들; TNF-R와 또는 TNF-R의 다양한 영역에 결합하는 상기 단백질들 및 펩티드들과 상호작용하는 항체 또는 그의 단편의 생산하기 위한 다양한 접근들도 또한 EP 568925에 설명되어 있다. 그러나 EPO 568925에는 TNF-Rs(예를들면 p55 TNF-R)의 세포내 도메인에 결합하는 실질적인 단백질들 및 펩티드들에 관하여 설명되어 있지 않으며, TNF-Rs의 세포내 도메인에 결합하는 상기 단백질 또는 펩티드를 분리하고 동정하기 위한 효모 이중-하이브리드 (yeast two-hybrid) 접근법에 관해서도 설명되어 있지 않았다. 유사하게 지금까지 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 단백질들 또는 펩티드들에 대해 개시되어 있지 않았다.
따라서 TNF의 효과 또는 FAS-R 리간드의 효과를 억제하고자 할 경우에는 세포표면에서 TNF-Rs 또는 FAS-R의 양 또는 활성을 감소시키는 것이 바람직하고, 반면 TNF 효과 또는 FAS-R 리간드 효과를 증대하고자 할 경우에는 TNF-Rs 또는 FAS-R의 양 또는 활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 이와같은 목적을 위해, p55 TNF-R 및 p75 TNF-R 양자의 프로모터들이 서열화되고 분석되었으며, 많은 핵심 서열 모티프들이 다양한 전사조절인자들에 특이적이라는 것이 밝혀져서, TNF 수용체의 숫자를 줄이기 위해서는 프로모토들로부터의 전사를 억제하고 또는 TNF-R의 숫자를 증가시키기 위해서는 프로모토들로부터의 전사를 강화시킴으로써 이러한 TNF-Rs의 발현을 프로모터 수준에서 제어할 수 있다[EP 606869 및 WO 9531206 참조]. FAS-R 유전자의 프로모터 수준에서의 FAS-R의 제어에 관한 연구는 아직 보고된 바가 없다.
종양괴사인자(TNF) 수용체, 및 구조적으로-관련된 수용체 FAS-R이, 백혈구-생산된 리간드에 의한 자극에 의해 세포내에서 세포자신의 사멸을 유도하는 파괴적인 활성을 개시한다고 알려져 있음에도 불구하고, 그러한 개시기작은 여전히 이해되어 있지 않다. 돌연변이 연구에 의하면, FAS-R 및 p55 TNF 수용체(p55-R)에 있어서 세포독성에 관한 신호전달은 그들의 세포내 도메인들 안에 있는 독특한 영역들과 관련있다고 한다[Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993 참조]. 이러한 영역들( '사멸 도메인' )은 서열 유사성을 갖는다. FAS-R 및 p55-R 양자의 '사멸 도메인'은 자가결합하는 경향이 있다. 그들의 자가결합은 확실힌 신호전달의 개시에 필요한 수용체 응집을 명백히 촉진시키고[참조 Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995], 수용체가 높은 수준으로 발현되면 리간드-비의존성 신호전달을 일으킬 수 있다[참조 Boldin et al., 1995],
따라서, WO 9531544 및 본 발명의 이전에는, 세포내 신호전달 과정을 매개함으로써, 세포에 대한 TNF 효과 또는 FAS-R 리간드 효과와 같은 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리에 속하는 리간드의 효과를 조절하는 단백질이 제공되지 않았으며, 상기 신호전달은, FAS-IC 뿐만 아니라 TNF-Rs의 세포내 도메인 즉 p55 TNF-R 세포내 도메인 및 p75 TNF-R 세포내 도메인(각각 p55-IC, p75-IC라 함)과 같이 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리에 속하는 수용체의 세포내 도메인들(ICs)에 의해서 대부분 조절되는 것으로 보인다.
몇 개의 림포사이트들의 세포독성 효과들은, FAS-R(CD-95)과 림포사이트-생산된 리간드의 상호작용에 의해서 매개되는데, FAS-R은 광범위하게 발생하는 세포표면 수용체로 세포사멸을 촉발하는 활성을 갖는다[Nagata and Golstein, 1995 참조]. 단핵 식균세포들에 의한 세포사멸에는, 리간드-수용체 커플 즉, FAS-R 및 그의 리간드와 구조적으로 관련이 있는, TNF 및 그의 수용체 p55-R(CD120) 연결이 관여한다[Vandenabeele et al., 1995]. 다른 수용체-유도성 효과들과 같이, TNF 수용체들 및 FAS-R에 의한 세포 사멸 유도는 일련의 단백질-단백질 상호작용들을 통해 일어나는데, 리간드-수용체 결합으로부터 종국적인 효소성 효과인자 기능들의 활성화로까지 이끄는데, 어떤 경우에는 이러한 특정 수용체들이 세포사멸을 초래한다. 이전 연구들은, 세포사멸의 신호전달을 개시하는 비-효소성 단백질-단백질 상호작용들을 밝혀내었다: 수용체들에의 삼합체 TNF 또는 FAS-R 리간드 분자들의 결합, 그 결과로 인한 그들의 세포내 도메인들의 상호작용들[Brakebucsh et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993], 상기 상호작용은 자가-결합하는 사멸-도메인 모티프들의 성향에 의해 증대된다는 사실[Boldin et al., 1995a], 및 수용체들의 세포내 도메인들에 두 개의 세포질 단백질들(서로 결합할 수도 있음)의 유도성 결합 - FAS-R에 MORT-1(FADD)의 결합[Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995] 및 p55-R에 TRADD의 결합[Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996]. 효모 이중-하이브리드 스크린 절차를 통해 밝혀진 세 개의 단백질들은, FAS-R 및 p55-R의 세포내 도메인에, 즉 상동성 영역들의 이종-결합을 통해, 수용체들에 의한 세포-사멸 유도에 관여하는 "사멸 도메인"영역에서 결합하고, 또한 독립적으로 세포사멸을 촉발할 수 도 있다. 이중 하나는 단백질 MORT-1[Boldin et al. 1995b]으로, FADD라고도 알려져 있으며[Chinnaiyan et al., 1995], FAS-R에 특이적 결합을 한다. 두 번째 단백질은 TRADD로[또한, Hsu et al., 1995, 1996 참조], p55-R에 결합한다. 세 번째 단백질은 RIP로[또한, Stanger et al., 1995 참조], FAS-R 및 p55-R 양쪽 모두에 결합한다. FAS-R 및 p55-R에 대한 이들의 결합외에도 이러한 단백질들은 또한 서로 상호간에 결합할 수 있어서, FAS-R 및 p55-R간의 기능적 "교차-대화" ( "cross-talk" )를 제공한다. 이러한 결합들은 보존적인 서열 모티프로서 수용체들 및 그들의 결합단백질들이 공유하는 "사멸 도메인 모듈"을 통해 일어난다. 게다가, 비록 효모 이중-하이브리드 시험에서 MORT-1는 자발적인 FAS-R에 결합한다고 보여주었지만, 포유류 세포들에서 상기 결합은 오직 수용체 자극 후에만 일어났는데, 이는 MORT-1이 FAS-R 신호전달의 개시 사건들에 참가한다는 것을 제시하는 것이다. MORT-1은 효소 활성에 전형적인 어떠한 모티프도 갖고 있지 않으므로, 세포사멸을 촉발하는 MORT-1의 능력은, MORT-1 자체의 내재성 활성이 관련되는 것처럼 보이지 않고, 오히려 MORT-1에 결합하여 신호전달 캐스캐이드중 더 다운스트림에서 활동하는 다른 단백질들을 활성화시키는데 관련있는 것처럼 보인다. 분자중 N-말단 부분이 결핍된 MORT-1 돌연변이체의 세포성 발현은 FAS/APO1(FAS-R) 또는 p55-R에 의한 세포독성 유도를 억제하는 것으로 보였는데[Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996], 이는 상기 N-말단 영역이 단백질-단백질 상호작용들을 통해 상기 양 수용체들의 세포사멸 효과에 대한 신호전달을 전달한다는 것을 제시하여 준다.
최근 연구들은, 다양한 생리학적 세포사멸 과정들의 개시에, Caenorhabditis elegans 프로테아제 CED3 및 포유류 인터루킨-1β 전환 효소(ICE)와 구조적으로 관련이 있는 세포질 타이올 프로테아제 그룹을 연루시켜왔다[Kumar, 1995 and Henkart, 1996]. 또한, 상기 패밀리의 프로테아제(들)는 FAS-R 및 TNF-R에 의해 유도되는 세포-독성에 참여할 수 있다는 몇 개의 암시들이 존재하여왔다. 프로테아제들의 특이적인 펩티드 억제인자들 및 그들의 기능을 차단하는 두 개의 바이러스-코딩된 단백질들인 우두 단백질 crmA 및 바쿨로바이러스 p35 단백질이 상기 세포-독성으로부터 세포를 보호한다고 밝혀졌다[Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995]. CED3/ICE 패밀리의 프로테아제에 의해 매개되는 특정 세포성 단백질들의 급속한 절단이, FAS-R 및 TNF-Rs의 자극후에 바로 세포들에서 관찰되었다. 지금까지, CED3/ICE-관련된 프로테아제의 동정 또는, 수용체들에 의한 상기 프로테아제(들)의 활성화 메카니즘에 대해서는 어떠한 정보도 전혀 없었다.
도 1은, 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현시험에 의해 검정된 것과 같이, 형질전환된 효모들안에서 FAS-IC와 MORT-1의 상호작용 및 MORT-1의 자가-결합을 보여주고 있다.
도 2는 예비적인 뉴클레오티드(서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)를 도식적으로 묘사한 것으로서, '사멸 도메인' 이 밑줄쳐져 있으며, 위치 49의 밑줄쳐진 메티오닌 잔기(굵고 밑줄쳐진 M)는 가능성있는 번역 개시 부위(translation start site)이다. 별표는 번역 정지 코돈(뉴클레오티드 769-771)을 가리킨다. 각 줄의 시작과 중간에는, 서열의 시작(5 'end)에 따라 뉴클레오티드서열과 아미노산 서열의 상대적인 위치를 가리키는 두 개의 숫자들이 제공되어 있으며, 첫 번째 숫자는 뉴크레오티드를 표시하고 두 번째 숫자는 아미노산을 표시한다.
도 3은, cDNA 클론으로부터 얻은 MORT-1-결합 단백질의 예비적이고 부분적인 뉴클레오티드 서열이다.
도 4A-C는 MACH cDNA 및 그의 코딩된 단백질을 도식적으로 표시한다: 도 4A는 두 개의 MACH 비정지-해독틀(ORF-A 및 ORF-B)을 코딩하는 MACH cDNA의 구조를 보여주고 있으며, ORF-B의 빗금쳐진 부위는 MORT-1단백질과 상동성을 갖는 영역을 나타낸다; 도 4B는 MACH ORF-B 영역에 대한 추론된 아미노산 서열(서열번호 5)을 보여주고 있으며, 밑줄쳐진 아미노산 잔기들은 MORT-1과 상동성이 있는 영역(도 4A의 빗금친 영역에 해당)이다; 도 4C는 전체 MACH cDNA 분자(MACHβ1으로 명명된 것)의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 보여주고 있다.
도 5는 트랜스펙션된 효모 세포들안에서의 MORT-1 및 MACH의 상호작용을 나타내는 결과들을 도시하고 있다.
도 6은, MACH를 코딩하는 테트라사이클린-제어된 발현 벡터들로 트랜스펙션된 HeLa 세포들에 있어서의 세포사멸 효과의 리간드-비의존성 촉발을, 루시페라제(luc, 음성적 대조군), FAS-IC, MORT-1과 같은 다른 단백질들을 코딩하는 상기 벡터들로 트랜스펙션된 상기 세포들 및 MORT-1 및 MACH를 코딩하는 벡터들로 동시-트랜스펙션된 세포들에 있어서의 효과들과 비교하여, 그래프로 도시한 것이다.
도 7A 및 7B는 MACHβ1의 아미노산 서열(서열번호 5)을 보여주고 있으며(도 7A), 도 7B는 MACHβ1, MORT-1 및 PEA-15에 있어서 MORT 모듈의 서열 상동성을 보여주고 있다(서열번호 6).
도 8은 수용체, 및 Fas/APO1 및 p55의 세포사멸 유도에 참여하는 표적 상호작용들을 도식적으로 표현한 것이고, 사멸 도메인 모듈은 줄무늬로 표시되었고, MORT 모듈은 회색으로 표시되어 있으며 CED3/ICE 영역은 검정색으로 표시되어 있다.
도 9A-C는 MACHβ1 및 그의 결실 돌연변이체의 MORT-1와의 생체외 상호작용을 설명하는 결과들을 나타낸 것이다. 도 9A는 항-FALG 항체를 사용하여 세포용해물로부터의 면역침강반응에 의해 단백질들의 발현 및 그들의 분자 크기들을 평가한 것이다. 도 9B는 글루타티온-아가로스 비드들에 흡착되어 있는 GST-MORT-1에 대한 단백질들의 친화 결합(대조군으로, GST 또는 Fas-APO1의 세포내 도메인에 융합된-GST에 대한 단백질들의 친화 결합)을 보여주고 있다. 도 9C는 다양한 특이항체들을 사용한 다양한 MORT-1 및 MACH 융합 구조물들의 면역침강반응의 결과들을 보여 주고 있다.
도 10은 다양한 MACH 이소폼들을 도식적으로 표현한 것이다.
도 11은 MACH의 이소폼들인, MACHα1(서열번호 7), MACHβ1(서열번호 8) 및 MACHβ3(서열번호 8)과, CED3/ICE 프로테아제 패밀리중 잘 알려진 다양한 일원인 CED-3(서열번호 9), Ich-11/Nedd2(서열번호 10), ICErelⅢ(서열번호 11), Tx/Ich2/ICErelⅡ(서열번호 12), ICE(서열번호 13), CPP-32(서열번호 30), Mcn2α(서열번호 31)를 체계적이고 동시 선형적인 아미노산 정렬을 보여주고 있다. 아미노산 잔기들은 각 서열의 왼쪽 및 오른쪽 양쪽에서 번호매겨져있다. 점선들은 적절한 정렬의 위한 서열상 공백들이다. CED3/ICE 프로테아제 패밀리중 적어도 3개의 일원들 안에서 공통적인 아미노산들에 상자를 그렸다. CED3/ICE 상동성 영역의 업스트림에 있는 MORT 모듈들도 상자를 그려졌다. MORT 모듈 영역의 다운스트림에 있으며 다양한 MACH 이소폼들안에서 다양하게 있는 4개의 아미노산 블록들(블록 1-4)은 상단에 더 표시되어있다. CED3/ICE 상동성 영역안에 있으며, X-선 결정 분석에의해 촉매활성이 있는 것으로 암시되는 ICE안에 있는 아미노산들은 다음과 같이 표시되어 있다: ICE안의 His237, Gly238 및 Cys285에 해당하며 촉매반응에 관여는 것으로 추정되는 잔기들은 정렬아래에 폐원(●)들로 표시되어 있다. ICE안의 Arg179, Gln283, Arg341 및 Ser347에 해당하며 P1의 Asp의 카르복실레이트 측쇄를 위한 결합 포켓(bindind pocket)을 구성하는 잔기들은 정렬아래에 개원(○)들로 표시되어 있다. ICE안에 있는 Cys285에 해당하는 잔기들의 업스트림에 있는 Ala잔기들 및, 상기 Cys의 다운스트림에 있는 Arg 및 Gly 잔기들은 전에 기재된 CED3/ICE 패밀리의 프로테아제 모두에서 보존되어 있다. 기질의 P1-P4 잔기들에 인접한 잔기들은 정렬들 아래에 세모로 표시되어 있다(△). 이미 알려졌고 전에 짐작되었던 Asp-X 절단 부위들 및, MACH에서 비슷한 위치에 있는 것으로 알려진 가능성있는 부위들에 상자를 그렸다. ICE의 p20 및 p10 서브유니트들과 CPP32의 p17 및 p12 서브유니트들의 N- 및 C-말단은 화살표에 의해 표시되어 있다. 단백질들의 C-말단은 별표(*)로 표시되어 있다.
도 12A-F는 15분(도 12A), 30분(도 12B), 60분(도 12C), 90분(도 12D), 180분(도 12E)에서의 MACHα1의 프로테아제 활성을 나타내는 결과들의 표시하고 있다. 도 12F는 기질의 특정 농도에서 규정시간을 넘어서의 프로테아제 활성을 보여주고 있다.
도 13A 및 13B는 MACHα에 있는 CED3/ICE 상동성 영역의 프로테아제 활성을 보여주고 있다. 도 13A는, MACHα1에 있는 CED3/ICE 상동성 영역[단백질의 Ser217부터 C-말단까지]의 GST-융합 단백질을 발현하는 E. coli의 추출물들(■)에 의한, PARP-서열-유래된 형광발색 기질인 Ac-DEVD-AMC(50μM)의 절단 반응속도론이다. 이는 전체-길이 MACHα1의 GST-융합 생산물들을 발현하는 박테리아의 추출물들(○)에 의한, Cys360이 Ser으로 치환된 CED3/ICE 상동성 영역의 GST-융합 생산물들을 발현하는 박테리아이 추출물들(▽)에 의한, 또는 CED3/ICE 상동성 영역의 두 개의 가능성 있는 프로테아제 생산물들[Ser217 부터 Asp373까지(△) 및 Ser375부터 Asp479, 단백질의 C-말단까지(▲)]중 하나의 GST-융합 생산물들을 발현하는 박테리아의 추출물에 의해서는 절단이 결여된 것과 비교되어 있다. 도 13B는 Ac-DEVD-AMD의 절단의 기질-농도 의존성을 보여주고 있다. MACHα1 CED3/ICE 상동성 영역(■)의 GST-융합 단백질을 발현하는 E. coli의 추출물들과 함께 180분동안 기질이 항온배양되었다. 요오드아세트산(5mM, □)존재하에서 추출물에 의한 상기 기질의 절단이 억제되었다. Ac-YVAD-AMC, 즉 IL-1β 전구체에 있는 ICE 절단 부위에 해당하는 형광발색 기질은 절단되지 않았다(●).
도 14A-D는 MACHα1 및 MACHα2에 의해 매개되는 세포 사멸을 보여주고 있다.
도 15는 MACHα1 및 MACHα2에 의해 매개되는 세포사멸을 그래프로 표시한 것이다.
도 16A-D는 세포 사멸이 유도되거나 억제된 세포들의 모폴로지(morphology)를 보여주고 있다.
도 17은 비-기능성 CED3/ICE 영역을 함유하는 MACHα분자들이 p55-R에 의한 세포 사멸 유도를 억제하는 것을 그래프로 보여주고 있다.
도 18은 비-기능성 CED3/ICE 영역을 함유하는 MACHα분자들이 FAS/APO1에 의한 세포 사멸 유도를 억제하는 것을 그래프로 보여주고 있다.
도 19는 FAS/APO1을 순간적으로 발현하는 HeLa 세포들의 사멸을 보여주고 있다.
[발명의 개요]
본 발명의 목적은, FAS-R의 세포내 도메인에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있고, 그 수용체에 FAS리간드이 결합함으로써 개시되는 세포내 신호전달 과정들에 영향을 주는, 신규한 단백질들을 제공하는 것이며, 그의 모든 이소폼들, 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은, 신호전달과정을 억제하는데, 더욱 구체적으로는 바람직할 때 세포-독성을 억제하는데 사용될 수 있는, 상기 신규한 단백질들, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들에 대한 길항제들(예를들면, 항체들, 펩티드들, 유기 화합물들 또는 몇 개의 이소폼들)을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명의 목적은, 수용체 활성의 조절에 관여할 수 있는 부가적인 단백질들 또는 인자들, 예를들면, 신규한 단백질들을 절단하여 그들을 생물학적으로 활성있게 하는 다른 프로테아제들을 분리 및 특성파악하기 위해, 및/또는 상기 신규한 단백질들, 유사체들, 단편들 및 유도체들이 결합하여 그들의 기능에 관여하는, 신호전달에서 더 업스트림에 있는 다른 수용체들(예를들면, FAS-Rs 또는 관련된 수용체들)을 분리 및 특성파악하기 위해, 상기 신규한 단백질들, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, MACH 프로테아제들에 결합하거나 상호작용하여 그들의 단백질 분해 활성을 억제하기 위하여 세포들 안으로 도입될 수 있는 억제인자들을 제공하는 것이다.
게다가, 본 발명의 목적은, 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체들을 준비하기 위한 항원들로써 상기 언급된 신규한 단백질들, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들을 사용하는 것이다. 상기 항체들은 반대로, 예를들면, 세포추출물들 또는 형질전환된 세포계와 같은 다른 출처들로부터 상기 신규한 단백질들을 정제하는데 사용될 수 있다.
나아가, 상기 항체들은 진단 목적으로 예를들면, FAS-R 또는 다른 관련된 수용체들에 의해 매개되는 비정상 기능의 세포성 효과들과 관련된 질환들을 동정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 신규한 단백질, 그의 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 포함하는 약학적 조성물들뿐만 아니라, 상기 언급된 항체들 또는 다른 길항제들을 포함하는 약학적 조성물들을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 발견된 신규한 단백질인 MACH는 MORT-1에 결합 또는 상호작용할 수 있고, MORT-1은 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있다. 아마도 MACH는, 세포표면에 있는 FAS-R에 FAS 리간드가 결합함으로써 개시되는 세포-사멸 과정의 한 효과인자 구성요소로서 역할을 할 것인데, 이는 적어도 몇 개의 이소폼들의 MACH가 활성있는 세포내 프로테아제들이라는 사실에 의한 것이다. CED3/ICE 패밀리의 프로테아제들은 FAS-R에 의해 촉발되는 아폽토시스 과정에 연루되어 있다. MORT-1(또는 FADD)는 FAS-R이 활성화되면 상기 수용체의 세포내 도메인에 결합하고, 본 발명의 신규한 MACH 단백질들은 MORT-1에 결합한다. 본 발명에 따라 클론되고 특성파악된 MACH 단백질은, 실질상 다중 이소폼들로 존재하는데, 이들 이소폼들의 몇 개는 프로테아제 활성을 갖는 CED3/ICE 상동성 영역(단백분해 영역)을 갖으며 세포들에서 발현될 때 세포사멸을 야기시킨다. 따라서, FAS-R에 의한 상기 신규한 CED3/ICE 동족체(즉, 단백분해 도메인을 갖는 다양한 MACH 이소폼들)의 활성화(MORT-1 상호작용을 경유함)는 FAS-R-매개성 세포-사멸 과정의 효과인자 구성요소를 이루는 것처럼 보인다.
게다가, MACH는 또한 세포표면에 있는 p55-R에 TNF가 결합함으로써 개시되는 세포-사멸 과정의 효과인자 구성요소로써 역할을 하는 것으로 보이는데, 이는 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 단백질[Hsu et al., 1995]인 TRADD에 MORT-1의 결합하고, 이에 뒤따라 또는 이와함께 MACH가 MORT-1에 결합하고, 세포사멸을 초래하는데 관련된 활성 프로테아제로써 MACH를 활성화시키는 것과 같이 간접적인 메카니즘에 의한 것처럼 보인다.
MACH는, 특히 MACHα1 이소폼은, CED3/ICE 프로테아제들의 기능에 중요한 서열 특징들을 모두 나타내며, 가능성있는 유일한 조직/세포 특이성 방식의 활성을 갖도록 하는 몇 개의 특유한 서열 특징들을 나타낸다는 것 또한 주목하여야 한다.
MORT-1[ '수용체 독성의 매개자' 임, Boldin et al., 1995b]은 전에는 HF1으로 명명되었으며, FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있다. 상기 FAS-IC-결합 단백질은, 세포표면에서 FAS-R 리간드의 결합후에 일반적으로 일어나는 세포내 신호전달 과정을 조절하는 매개자 또는 조절인자로써의 역할을 하는 것처럼 보인다. FAS-IC-결합 특이성에 부가하여, MORT-1은 또다른 특징들을 보여준다(제1 실시예 참조). 예를들면, MORT-1은 p55-TNF-R 및 FAS-R의 "사멸 도메인" (DD) 영역들(p55-DD 및 FAS-DD)과 상동성이 있는 영역을 가지고 있으며, 따라서 자가-결합도 할 수 있다. MORT-1은 또한 스스로 세포독성을 활성화시킬 수 있는데, 이러한 활성은 그것의 자가-결합 능력과 관련있을 가능성이 있다. "사멸 도메인" 상동성 서열을 함유하고 있는 MORT-1(HF1)의 영역(MORT-DD, MORT-1의 C-말단 부분에 있음)과 동시-발현되면 강력하게 FAS-유도성 세포 사멸을 방해할 수 있다는 것이 현재 밝혀졌으며, 이는 FAS-IC의 "사멸 도메인" 에 결합할 수 있는 능력으로부터 예상할 수 있다. 나아가, 같은 실험조건에서, MORT-DD 영역을 함유하지 않은 MORT-1의 부분(MORT-1의 N-말단 부분, 아미노산 1-117, "MORT-1 머리" )과 동시-발현되면, FAS-유도성 세포사멸에 어떠한 방해도 줄 수 없으며 있다고 하더라도 FAS-유도성 세포 독성을 약간 강화할 뿐이다.
따라서, MORT-1은 또한 세포내 신호전달 과정에 관여하는 다른 단백질들에 결합할 것처럼 보인다. 따라서, 이러한 MORT-1-결합 단백질들은, MORT-1의 활성을 매개 또는 조절하는 방식으로 세포상 FAS-R 리간드 효과의 간접적인 매개자 또는 조절인자들로서의 역할을 할 수 있다; 또는 상기 MORT-1-결합 단백질들은, 상기 언급한 바와같이 세포독성을 활성화시키데 독립적인 활성을 갖는 MORT-1의 활성을 매개 또는 조절하는 방식으로 MORT-1-연관된 세포내 신호전달 과정의 직접적인 매개자 또는 조절인자들로서 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 MORT-1-결합 단백질들은, MORT-1-관련된 또는 FAS-R-관련된 신호전달과정에 관여할 수 있거나 다른 세포내 신호전달 과정들의 요소일 수 있는 부가적인 단백질들, 펩티드들, 인자들, 항체들 등을 분리, 동정 및 특성파악하기 위한 표준 스크린 공정들에 사용될 수 있다. 상기 MORT-1-결합 단백질들은 분리되어졌으며 본원에 기재되어 있다(제2 실시예 및 제3 실시예 참조). 본원에서 MACH로 명명되어진, 상기 MORT-1-결합 단백질들이 처음으로 클론되고, 서열화되었으며 부분적으로 다음과 같은 성질들을 갖는다고 특성파악되어졌다: MACH cDNA는 ORF-B 비정지-해독틀(open-reading frame)을 코딩하고 있다; MACH는 매우 강력하고 특이적인 방식으로 MORT-1에 결합하다; MORT-1에 있는 MACH 결합 부위는 MORT-1 "사멸 도메인" 모티프의 업스트림에 있다; MACH의 ORF-B 영역은 MORT-1-상호작용하는 부분이다; 그리고 MACH는 자가-결합할 수 있고 스스로 세포-독성을 유도할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 언급한 바와같이, MACH가 실질적으로 많은 이소폼들로 존재한다고 보인다. 게다가 상기 언급된 MACH ORF-B는 사실상 본원에서 MACHβ1으로 명명되는 MACH 이소폼들중 하나이다(하기 참조).
따라서, 본 발명은, MORT-1과 결합 또는 상호작용할 수 있고, FAS-R 또는 p55-TNF-R에 의해 매개되는 세포내 효과들을 매개할 수 있는, 단백질, 그의 유사체들 또느 단편들을 코딩하는 DNA서열을 제공한다.
특히, 본 발명은 다음으로 구성된 그룹 중에서 선택된 DNA서열을 제공한다:
(a) 천연 MORT-1 결합 단백질의 코딩영역에서 유래된 cDNA서열
(b) 중간정도의 스트린젼트 조건에서 (a)의 DNA와 하이브리드화할 수 있고 생물학적으로 활성이 있는 MORT-1 결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열들; 및
(c) (a)와 (b)에서 정의된 DNA 서열의 유전암호와 같은 결과로 퇴화되어 있고, 생물학적으로 활성이 있는 MORT-1 결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열들.
본 발명의 상기 DNA 서열의 또다른 구체적인 실시예는, 본원에서 명명되어진 MACH 이소폼들인 MACHα1, MACHα2, MACHα3, MACHβ2, MACHβ1, MACHβ3, MACHβ4 및 MACHβ5중에서 선택되는 적어도 하나의 MACH 단백질의 이소폼을 코딩하는 서열 중 적어도 일부분을 포함하는 DNA 서열이다.
본 발명의 DNA 서열의 또다른 구체적인 실시예는 상기 언급한 바와 같은 다음을 코딩하는 DNA 서열들이다:
(a) 서열번호 7, 5 및 8에 각각 기재된 아미노산 서열을 가진 MACHα1, MACHβ1 및 MACHβ3 중에서 선택되어진 MACH 이소폼 및 이들 중 하나의 유사체들 및 단편들;
(b) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 가진 MACHα1 및 그의 유사체들 및 단편들;
(c) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가진 MACHβ1 및 그의 유사체들 및 단편들;
(d) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 가진 MACHβ3 및 그의 유사체들 및 단편들.
본 발명은, 본 발명의 상기 서열 중 임의의 하나에 의해 코딩되고, MORT-1과 결합 또는 상호작용할 수 있으며, FAS-R 또는 p55 TNF-R에 의해 매개되는 세포내 효과를 매개할 수 있는, MORT-1-결합 단백질 및 그의 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예는, MACHα1, MACHα2, MACHα3, MACHβ1, MACHβ2, MACHβ3, MACHβ4 및 MACHβ5로 이루어진 그룹중 적어도 하나의 MACH 이소폼으로부터 선택되어진, 그의 아미노산 서열들중 적어도 일부분을 갖는, MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들이다.
또한 본 발명은, 상기 MORT-1-결합 단백질 및 본 발명의 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 코딩하며, 본 발명의 상기 DNA 서열을 함유하고 있고, 적당한 진핵 또는 원핵 숙주세포들에서 발현될 수 있는 벡터들; 상기 벡터들을 함유하는 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주세포들; 및 상기 MORT-1결합 단백질, 유사체들, 단편들 또는 유도체들의 발현에 적당한 조건들하에서 상기 형질전환된 숙주 세포들을 키우는 단계, 상기 단백질을 얻는데 필요한 상기 단백질의 번역후-수정하는 단계 및 상기 형질전환된 세포들의 배양배지로부터 또는 상기 형질전환된 세포들의 세포 추출물들로부터 상기 발현된 단백질, 유사체, 단편들 또는 유도체들을 추출하는단계로 이루어진, MORT-1-결합 단백질 또는 본 발명의 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 정의된 것들은 MACH 단백질의 모든 이소폼들을 포함하고자 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질 및 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들에 특이성이 있는, 항체들 또는 그의 유도체들 또는 단편들을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명에 따른 상기 DNA 서열들 또는 그들이 코딩하는 단백질들의 다음과 같은 다양한 용법들을 제공한다:
(ⅰ) FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법에 있어서,
FAS-R의 세포내 도메인에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있거나 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 TRADD에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있고, 따라서 상기 FAS-R 또는 p55 TNF-R의 활성을 조절/매개할 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 MORT-1-결합 단백질, 유사체들, 단편들 또는 유도체들로 상기 세포들을 처리하되,
상기 세포의 상기 처리 단계는, 세포내 도입에 적합한 형태로서 상기 하나이상의 단백질들, 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 상기 세포내로 도입하는 단계, 또는 상기 하나이상의 단백질들, 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 코딩하는 DNA 서열이 상기 세포내에서 발현되는 방식으로 상기 세포내로 상기 서열을 삽입할 수 있는 벡터로서 상기 서열을 운반하는 적합한 발현벡터의 형태로 상기 DNA 서열을 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포상에서 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법.
(ⅱ) 상기 (ⅰ)에 있어서, 세포들의 상기 처리 단계는, 세포내 도입에 적당한 형태로 MORT-1-결합 단백질, 또는 그의 유사체, 단편들 또는 유도체들을 상기 세포들 안으로 도입하는 단계, 또는 상기 MORT-1-결합 단백질, 또는 그의 유사체, 단편들 또는 유도체를 코딩하는 DNA 서열이 상기 세포내에서 발현되는 방식으로 상기 세포내로 상기 서열을 삽입할 수 있는 벡터로서 상기 서열을 운반하는 적합한 벡터의 형태로 상기 DNA 서열을 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포상 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법.
(ⅲ) 상기 (ⅱ)에 있어서, 세포들의 상기 처리는 다음 단계들로 구성되어진 재조합 동물 바이러스 벡터로 상기 세포에 트랜스펙션시키는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) FAS-R- 또는 p55-R-수반 세포의 표면상에 있는 특정 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질(리간드)를 코딩하는 제1 서열 및 상기 세포에서 발현되는 경우 상기 FAS-R 또는 p55-R의 활성을 조절/매개할 수 있는 MORT-1-결합 단백질, 및 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들중에서 선택된 단백질을 코딩하는 제2 서열을 가지는 재조합 동물 바이러스 벡터를 제작하는 단계;
(b) (a)의 상기 벡터로 상기 세포들을 감염시키는 단계.
(ⅳ) FAS-R 또는 p55-R를 수반하는 세포들에 대하여 FAS-R 리간드 또는 TNF의 효과를 조절하는 방법에 있어서,
본 발명에 따른 항체들 또는 그의 활성 단편 또는 유도체로 상기 세포들을 처리하되,
상기 처리 단계는 상기 항체들, 그의 활성 단편들 또는 유도체들을 함유하는 적당한 조성물을 상기 세포들에 적용시키는 것으로서,
상기 세포들의 MORT-1-결합 단백질 또는 그의 분획들이 세포외 표면에 노출될 때는 상기 조성물을 세포외용으로 제형하고, 상기 MORT-1-결합 단백질이 세포내에 존재할 때는 상기 조성물을 세포내용으로 제형하는 것을 특징으로 하는, FAS-R 또는 p55-R를 수반하는 세포들 상에서 FAS-R 리간드 또는 TNF의 효과를 조절하는 방법.
(ⅴ) FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
본 발명의 MORT-1-결합 단백질 서열의 적어도 일부분의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열로 상기 세포들을 처리하되,
상기 올리고뉴클레오티드 서열은 MOTR-1-결합 단백질의 발현을 방해할 수 있는 것을 특징으로 하는, FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법.
(ⅵ) 상기 (ⅴ)에 따라, 다음 단계들을 포함하는 종양 세포들 및 HIV-감염된 세포들 또는 다른 질병 세포들을 치료하기 위한 방법:
(a) 특이적인 종양 세포 표면 수용체 또는 HIV-감염된 세포 표면 수용체 또는 다른 질병 세포들에 의해 수반되는 수용체에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 제1 서열 및, 상기 종양, HIV-감염된, 또는 다른 질병 세포에서 발현될 때 상기 세포들을 죽일 수 있는, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 유사체들, 단편들 및 유도체들중에서 선택되어진 단백질을 코딩하는 제2 서열을 가지는 재조합 동물 바이러스 벡터를 제작하는 단계; 및
(b) (a)의 상기 벡터로 상기 세포를 감염시키는 단계.
(ⅶ) 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과을 조절하는 방법에 있어서,
라이보자임 공정을 적용하되,
본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 세포성 mRNA 서열와 상호작용할 수 있는 라이보자임 서열을 코딩하는 벡터를 상기 라이보자임 서열이 발현되는 형태로 상기 세포내로 도입하는 것으로서,
라이보자임 서열이 세포에서 발현될 때 라이보자임 서열이 세포성 mRNA 서열과 상호작용하고 상기 mRNA 서열을 절단하여 결과적으로 상기 세포들내에서 상기 MORT-1-결합 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과을 조절하는 방법.
(ⅷ) 본 발명에 따른 방법으로부터 선택된 방법에 있어서,
서열을 코딩하는 상기 MORT-1-결합 단백질은,
차례로 FAS-IC에 특이적으로 결합하는 MORT-1에 특이적으로 결합할 수 있거나, 차례로 TRADD에 결합하고 차례로 p55-IC에 결합하는 MORT-1에 특이적으로 결합할 수 있는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 MACH 이소폼들, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들을 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
(ⅸ) MORT-1 단백질에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 단백질들을 분리 및 동정하는 방법에 있어서,
효모 이중-하이브리드 공정을 적용하되,
상기 MORT-1 단백질을 코딩하는 서열은 제1 하이브리드 벡테에 의해 운반되고 cDNA 또는 게노믹 DNA 라이브러리로부터의 서열은 제2 하이브리드 벡터에 의해 운반되고,
그리고 나서 상기 벡터들은 효모 숙주 세포들을 형질전환시키는데 사용되고, 양성적으로 형질전환된 세포들이 분리된 후, 상기 제2 하이브리드 벡터를 추출함으로써, 상기 MORT-1 단백질에 결합할 수 있는 단백질 즉, MORT-1-결합 단백질들을 코딩하는 서열을 수득하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질들을 분리 및 동정하는 방법
(ⅹ) 상기 (ⅰ)-(ⅸ)중 어느 하나에 따른 방법에 있어서,
상기 MORT-1-결합 단백질은 본원에서 MACHα1로 지정된 MACH 이소폼, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들인 것을 특징으로 하는 방법.
(ⅹⅰ) 상기 (ⅰ)-(ⅸ)중 어느 하나에 따른 방법에 있어서,
상기 MORT-1-결합 단백질은 본원에서 MACHβ1로 지정된 MACH 이소폼, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들인 것을 특징으로 하는 방법.
(ⅹⅱ) 상기 (ⅰ)-(ⅸ)중 어느 하나에 따른 방법에 있어서,
상기 MORT-1-결합 단백질은 본원에서 MACHβ3로 지정된 MACH 이소폼, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들인 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 다음과 같은 것중 어느 하나를 포함하는 것으로서 세포들 상 FAS-R 리간드- 또는 TNF-효과의 조절을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다:
(ⅰ) 본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질 및 그의 생물학적 활성 단편들, 유사체들, 유도체들 또는 이들의 혼합물;
(ⅱ) 세포표면 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 코딩하고, 본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편들 또는 유사체들을 코딩하는 재조합 동물 바이러스 벡터; 및
(ⅲ) 본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질 서열의 안티센스서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 (ⅱ)의 재조합 동물 바이러스 벡터의 제2 서열일 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열.
본 발명은 또한 다음의 것들을 제공한다:
Ⅰ. 세포에 대한 MORT-1-유도성 효과 또는 MORT-1-결합 단백질-유도성 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
상기 (ⅰ)-(ⅹⅰ)중 어느 하나의 방법에 따라, MORT-1-결합 단백질들, 그의 유사체들, 단편들 또는 유도체들로, 또는 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들 또는 단편들을 코딩하는 서열들로 상기 세포들을 처리하되,
상기 처리는 결론적으로 상기 MORT-1-매개성 효과 및 그로인한 FAS-R 또는 p55-R-매개성 효과도 또한 강화 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 세포들에 대한 MORT-1-유도성 효과 또는 MORT-1-결합 단백질-유도성 효과를 조절하기 위한 방법.
Ⅱ. 상기 방법에 있어서, 상기 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체, 단편 또는 유도체는 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 자신에 결합하는데에 관여하는 MORT-1-결합 단백질의 부분이고, 또는 상기 MORT-1-결합 단백질 서열은 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 자신에 결합하는데에 관여하는 MORT-1-결합 단백질의 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
Ⅲ. 상기 방법에 있어서, 상기 MORT-1-결합 단백질은 MACHα1, MACHβ1 및 MACHβ3에서 선택되어진 MACH 이소폼들 중 어느 하나로서, 상기 MACH 이소폼은 세포들에 대한 MORT-1-관련된 효과를 강화할 수 있고 따라서 세포들에 대한 FAS-R- 또는 p55-R-관련된 효과를 강화할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
상기-언급된 모든 것뿐만아니라, 하기 상세한 설명에서와 같이, MACH는 MORT-1 비의존성 방식으로 세포들 또는 조직들을 치료하는데 사용될 수 있다. MORT-1-결합 단백질들의 분리, 동정 및 특성파악은, 단백질들을 분리 및 동정하는데 사용되는 임의의 표준 스크린법들에 의해 수행될 수 있으며, 예로는, 효모 이중-하이브리드 방법, 친화 크로마토그래피 방법, 및 상기 목적을 위해 사용되는 잘 알려진 다른 표준 공정들이 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면들 및 실시예들은 하기 본 발명의 상세한 설명과 같이 제공된다.
전체적으로 사용되는 다음의 용어들에 주의 해야 한다: "세포들에 대한 FAS-리간드 또는 TNF 효과의 조절" ; 및 "세포들에 대한 MORT-1 또는 MORT-1-결합 단백질 효과의 조절" 은 생체내( in vivo )처리뿐만 아니라 생체외( in vitro )처리도 포함하는 것으로 이해된다.
[발명의 상세한 설명]
일측면에서 본 발명은, MORT-1에 결합 또는 상호작용할 수 있고 따라서 MORT-1이 결합하는 FAS-R 수용체의 세포내 도메인에 결합할 수 있거나, 또는 MORT-1이 결합하는 단백질 TRADD[제2 실시예 또는 상기 언급한 것 참조]이 결합하는 p55 TNF-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는, 신규한 MORT-1-결합 단백질들에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 MORT-1 결합 단백질들은 FAS-R의 매개자 또는 조절인자인 것으로 생각되며, 예를들면, FAS-리간드가 FAS-R에 결합함으로써 개시되는 신호전달 과정에서 어떤 역할을 갖고 있거나, 마찬가지로 TNF가 p55-R에 결합함으로써 개시되는 신호전달 과정에 어떤 역할을 갖고 있다. 본 발명의 MORT-1-결합 단백질들은 새롭게 발견된 MACH 이소폼들을 포함하며, 상기 단백질들의 아미노산 및 DNA 서열들은 DNA 또는 아미노산 서열들의 데이터 은행인 '유전자은행' 또는 '단백질은행' 에 나타나 있지 않는 새로운 서열들이다.
더욱 상세하게는 본 발명에 따라 몇 개의 선충 프로테아제 CED3의 포유류 동족체들이 개시되었다. 이들은 MACH 이소폼들(MACHα 및 MACHβ 이소폼들)로 명명되었으며, 가깝게 관련되어는 있지만, 구조 및 기질 특이성에서 차이점을 보이며 포유류 세포들에서는 다소 다른 기능들을 수행할 수 있다. 게다가, 프로테아제들의 두 개의 다른 활성들이 알려졌다. ICE의 주요 역할은 IL-1β 전구체를 공정하는 것처럼 보이는 반면, CED3은 분명히 계획된 세포 사멸의 효과인자로써의 역할을 하는 것처럼 보인다. 또한, 상기 후자의 역할은 또한 포유류 동족체들중 적어도 몇 개(몇개의 MACH 이소폼들)의 역할로 나타난다. MACHα의 아미노산 서열은 CPP32와 큰 유사성을 보여주며, 가장 유사하다고 알려진 CED3의 포유류 동족체이다. MACH의 기질 특이성은 또한 CPP32와 비슷하고, 다만 MACHα1은 CPP32보다 더 제한된 기질 특이성을 갖고 있다. CPP32는 선호적으로 폴리(ADP 라이보스) 폴리머라제(PARP)에 있는 절단 부위에 해당하는 기질 펩티드를 절단하고, 또한 IL-1β 전구체안에 있는 ICE 절단 부위에 해당하는 펩티드에 대하여 프로테아제 활성을 가진다. 그러나 MACHα1는 단독으로 PARP-유도된 서열을 절단할 수 있다. CPP32 및 CED3에 대한 MACHα1의 이러한 관계들 및 ICE와의 비유사성은, MACHα1는 CED3과 유사하게 세포 사멸의 조절인자로써의 역할을 한다는 개념과 일치한다. 그러나 MACHα1는 CED3 및 CPP32뿐만아니라 CED3/ICE 패밀리의 다른 모든 일원들과는 구별되는 몇 개의 서열 특징들을 나타낸다. CED3/ICE 상동성 영역의 업스트림에 있는 MACHα1의 C-말단 부분은 전혀 다른 동족체들의 어느 것과도 유사성이 없다. 또한, 상기 단백질의 CED3/ICE 상동성 영역에 몇 개의 독특한 서열 특징들이 있다. 이러산 차이들은, MACHα1가 상기 패밀리의 분리된 진화 가지에 속하며, 따라서 그것의 세포 사멸에 대한 기여는 전에 설명된 CED3/ICE 동족체들과는 다소 다르다는 것을 제시한다.
중요한 차이는, 프로테아제의 기능을 조절하는 방법에 관한 것일 수 있다. 발생적으로 관련된 세포 사멸 과정들 및 수용체-유도성 면역 세포용해 모두에 관여하므로, CED3/ICE 패밀리의 프로테아제에 의한 단백질들의 절단은, 세포안에서 형성된 신호들 및 세포표면수용체들로부터 나오는 신호들 양쪽에 의한 조절을 받을 여지가 있다. 발생적 세포 사멸 과정들에 있어서, 상기 프로테아제들의 활성화는 유전자 발현에 영향을 주는 메카니즘들에 관여하여, 프로테아제의 합성을 강화하도록 하고, 그들의 아폽토시스 효과를 상쇄하는 BCL-2과 같은 단백질들의 합성을 감소하도록 초래한다. 그러나, FAS-R 또는 TNF 수용체들에 의해 촉발되는 세포독성의 경우에도 확실히 해당되는 것은 아니다. 단백질 합성 활성이 완전히 억제되고(그러면 세포들은 더 효과적으로 사멸된다) 이러한 조건하에 자극-의존성이 남아있는 때는 TNF 또는 FAS-R 리간드에 의해 세포들은 사멸될 수 있다. TNF 수용체들 및 FAS-R에 의한 CED3/ICE 패밀리의 프로테아제의 활성화는 단백질-합성-비의존성 메카니즘에 의해 일어날 수 있다. MACHα1의 독특한 서열 성질들은 MACHα1이 상기 메카니즐에 참여하도록한다.
출원인들이 알고있는 바로는 지금까지 다른 어떤 프로테아제도 직접적으로 또는 어댑터 단백질(adapter protein)을 통해 세포표면수용체의 세포내 도메인과 연결되어있다고 밝혀지지 않았다. 다른 효소 활성들을 갖는 수용체-연결된 단백질들이 작용하는 방식으로부터 추론하면, MORT1에 대한 MACHα1의 결합이 FAS-R의 촉발에 따른 MACHα1 프로테아제-활성을 자극하도록 할 것처럼 보인다. 또한, p55-R에 결합하는 TRADD에 대한 MORT-1의 결합을 통해, p55-R에 의한 프로테아제가 활성화될 수 있다.
CED3/ICE 패밀리의 다른 일원들은, 자가-절단 또는 상기 패밀리의 다른 프로테아제들의 영향들에 의해 오직 단백분해 공정된 후에만 완전한 활성을 나타낸다고 밝혀졌다[Kumar, 1995; Henkart, 1996 참조]. 전체-길이 CED3/ICE 상동성 영역을 발현하는 세포들에 있어서 세포독성이 결여되는 것과는 반대로, MACHα1로부터의 두 개의 잠재력있는 주요 자가-절단 생산물들의 동시-발현으로부터 초래되는 세포독성 효과는, MACHα1도 또한 오직 공정된 후에만 완전한 활성을 갖는다는 가능성과 일치한다. 전체 길이 영역을 발현하는 박테리아의 용해물들에서 관찰되는 효소 활성은, 이러한 조건들하에서 생산되는 단백질의 자가 공정 또는 어떤 박테리아 프로테아제들에 의한 공정을 분명하게 반영하고 있다. 어떤 방식으로 이러한 공정이 포유류 세포내에서 일어나는지 그리고 어떻게 FAS-R 및 p55-R의 촉발에 의해 야기시키는지는 알려져 있지 않으며, MACHα1의 프로테아제 활성에 의해 FAS-R- 및 TNF-유도성 세포독성에 어떤 관련있는 기여를 하는지도 명확하지 않다. 상기 기여의 평가는, CED3/ICE 상동성 영역이 결여된 MACHβ1의 발현이 현저한 세포독성을 초래한다는 사실과 연루되어 있다. 생각건대, 이러한 세포독성은 MACHα1에 결합하는 MACHβ1의 능력을 반영한다. 상기 능력 때문에, 트랜스펙션된 MACH 분자들은 응집되면 트랜스펙션된 세포의 내재성 MACHα1 분자들에 있어서 입체배좌 변화(conformational change)를 일으키게 할 수 있다. 이러한 메카니즘은, MACH의 업스트림에서 작용하는 분자들(MORT-1, TRADD 또는 p55-R 또는 FAS-R중 어느 하나의 세포내 도메인)이 세포내에서 과다-발현될 때 관찰되는 세포독성을 또한 설명할 수 있다. 그러나, 현재 MACH 또는 그것의 업스트림에서 작용하는 분자들의 발현이 유도될 때 관찰되는 세포독성은, MACH에 있는 CED3/ICE 상동성 영역의 프로테아제 활성외에도 FAS-R 및 p55-R 세포독성 효과에 참여한다고 믿어지는 다른 메카니즘들(예를들면, 중성 또는 산성 스핑고미엘리나제(sphingomyelinase)의 활성화)의 활성화 또한 반영한다는 것을 배제할 수 없다. 또한 CED3/ICE 상동성 영역의 단백질 분해 활성이 세포독성 유도외에도 다른 기능들을 수행한다는 것을 배제할 수 없다. MACHα1의 기능은 MACHα1의 활성화시 절단되는 내재성 기질 단백질들의 동정에 의해 더 확실하게 얻어질 수 있다. 뜻하는대로 MACHα1의 활성을 제거하는 방법들을 찾으면 (예를들면 억제성 분자들의 발현을 통해) 또한 상기 단백질의 기능 이해할 수 있도록 할 것이며 원하는 때에 그 활성을 조절하는 방법으로 사용될 것이다.
MACHα1을 발현하는 세포들안에 상기 단백질을 포함하여 상기 프로테아제의 자연적인 억제인자들이 존재할 수 있다. CED3/ICE 패밀리의 다른 일원들 중 몇 개에 대한 얼터너티브 스플라이스된(alternative splced) 이소폼들의 존재는 상기 프로테아제들의 기능을 생리학적으로 제한하는 방법을 이루는 것처럼 보인다. 이러한 다른 프로테아제들의 이소폼들 중 몇 개는, 전체-길이 이소폼들과 함께 불활성인 이질이량체(heterodimer)를 형성함으로써, 전체-길이 이소폼들의 자연적인 억제인자로서 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 것은 MACH의 어떤 이소폼들에도 해당할 것이며, 예를들면 가능성있는 N-말단의 절단 부위가 결여된 MACHα3 및 CED3/ICE상동성 영역이 결여된 MACHα1 돌연변이체들이 있다. 상기 억제성 이소폼들의 발현은 FAS-R 및 TNF 세포독성에 대항하는 세포의 자가-보호의 메카니즘을 구성할 수 있다. MACH 이소폼들의 광범위한 이질성(heterogeneity)는 CED3/ICE 패밀리의 다른 프로테아제들에서 관찰되는 이질성을 크게 초과하여, 상기 단백질의 활성 폼의 기능을 매우 정교하게 조율하도록 할 것이다. 또한, 몇 개의 MACH 이소폼들은 다른 기능들을 할 가능성이 있다. MORT1 및 MACHα1 양쪽에 결합하는 MACHβ1의 능력은 이러한 이소폼들중 몇 개 및 아마도 다른 MACH 이소폼들이 효소적으로 활성이 있는 이소폼들의 기능에 대해서 억제성 효과가 아닌 강화시키는 효과를 가질 가능성을 보여준다. 또한, 어떤 이소폼들은 세포독성과 관련된 역할을 하는 것이 아니라 오히려 FAS-R 및 TNF의 다른 비-세포독성 효과들과 관련있는 분자들의 도킹부위(docking site)들로서의 역할을 할 가능성을 보여준다.
FAS-R 및 TNF 수용체들이 세포 사멸을 야기시키는 독특한 능력뿐만아니라, TNF 수용체들이 다양한 다른 조직-손상 활성들을 촉발하는 능력 덕분에, 상기 수용체들 기능의 변형은 생명체에 특히 해로울 수 있다. 게다가 상기 수용체들의 과도 및 부족한 기능은 다양한 질환의 병적 증상의 원인이 되는 것처럼 보여져 왔다. 상기 수용체들의 신호전달 활성에 참여하는 분자들을 동정하고, 상기 분자들의 기능을 조절하는 방법을 모색하는 것은 상기 질환들에 대한 새로운 치료학적 접근들의 잠재성있는 열쇠이다. FAS-R 및 TNF 독성에서 MACHα1의 주요한 역할이라 예상되는 면에 있어서, CED3/ICE 패밀리의 다른 몇 개의 일원들에서 수행되어 왔던 것처럼, 상기 분자의 단백분해 기능을 억제할 수 있는 약제를 고안하는 것은 특히 중요한다. MACHα1 분자에 포함되어 있는 CED3/ICE 동족체의 독특한 서열 특징들은, CED3/ICE 패밀리의 다른 일원들이 관여하는 생리적 세포 사멸 과정들을 방해하지 않으면서 과도한 면역-매개성 세포독성으로부터 보호할 수 있는 약제를 고안하도록 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열들에 의해 코딩되는 MORT-1-결합 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 MORT-1-결합 단백질의 생물학적 활성있는 유사체들, 단편들 및 유도체들을 코딩하는 DNA 서열들 및 이들에 의해 코딩된 유사체들, 단편들 및 유도체들에 관한 것이다. MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 있어서 하나이상의 코돈을 제거, 첨가, 또는 다른 것으로 치환함으로써, 천연 단백질에 대하여 적어도 한 개의 아미노산 잔기의 변화를 갖는 유사체를 얻는 표준 공정[SamBrook et al., 1989 참조]에 의해서 상기 유사체들, 단편들 및 유도체들이 준비된다.
MORT-1-결합 단백질에 "실질적으로 해당하는" 폴리펩티드 또는 단백질은, MORT-1-결합 단백질뿐만아니라 MORT-1-결합 단백질의 유사체들인 폴리펩티드들 또는 단백질들을 포함한다.
MORT-1-결합 단백질에 실질적으로 해당하는 유사체들은, MORT-1-결합 단백질의 아미노산 서열중 적어도 하나이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 제거 및/또는 첨가되어, 그로인한 단백질 결과물이 해당하는 MORT-1-결합 단백질과 같거나 또는 더 높은 생물학적 활성을 실질적으로 나타내는 폴리펩티드들이다.
MORT-1-결합 단백질에 실질적으로 해당하기 위해서는, MACH 이소폼들과 같이 MORT-1-결합 단백질들의 서열에 있어서의 변화들은 일반적으로 상대적으로 중요하지 않다(minor). 변화들의 숫자는 10개 이상일 수 있으나, 10개정도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5개정도이며, 가장 바람직한 것은 3개정도의 변화들이다. MORT-1-결합 단백질들에 실질적으로 해당하는 잠재력있는 생물학적 활성 단백질들을 찾기위해 어떠한 기법도 사용될 수 있으며, 이러한 기법중 하나는, 몇 개의 수정들을 초래하는, 단백질을 코딩하는 DNA에 대한 일상적인 돌연변이유발법의 사용이다. 그리고나서, 상기 클론들에 의해 발현되는 단백질들은 MORT-1 결합 및/또는 FAS-R 및 p55-R 매개성 활성에 대하여 스크린될 수 있다.
"보존적인" 변화들은 단백질의 활성을 변화시킨다고 예상되지 않는 변화들이고, 일반적으로 단백질의 크기, 전하 또는 입체배좌를 실질적으로 변화시킨다고 예상되지 않고 따라서 그의 생물학적 성질들을 변화시킨다고 생각되지 않는 것으로 스크린되는 것들이다.
MORT-1-결합 단백질들의 보존적인 치환들은, 상기 폴리펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 보존적으로 다른 아미노산으로 치환된 유사체를 포함한다. 상기 치환들은 바람직하게는 표ⅠA에 나타난 바와 같이 하기 목록에 따라 수행되어지며, 상기 치환들은 일상적인 실험을 통해 제공되며, 구조상 및 기능상 성질들이 수정되나 MORT-1-결합 단백질의 특징적인 생물학적 활성을 유지하는 합성된 폴리펩티드 분자을 제공한다.
택일적으로, MORT-1-결합 단백질의 다른 그룹의 치환들은 폴리펩티드에 있는 적어도 하나이상의 아미노산 잔기가 제거되고 다른 잔기가 표ⅠB에 따라 그 장소에 삽입되는 것이다. 폴리펩티드안에 만들어질 수 있는 치환들의 타입들은, [Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798]의 표1-2 및 [Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Preperties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983]의 도3-9에 나타나 있는 바와 같이 다른 종의 상동성 단백질사이에 있는 아미노산 변화들의 빈도 분석에 기초될 수 있다. 상기 분석에 기초하여, 선택적이고 보존적인 치환들이 본원에 정의된 바와같이 다음 5개 그룹들중 하나 안에서 교환된다:
상기 괄호안에 있는 세 개의 아미노산 잔기들은 단백질 구조에 있어서 특별한 역할들을 갖는다. Gly은 측쇄가 없는 유일한 잔기이고 따라서 사슬에 유연성을 준다. 그러나 이것은 α-나선과 다른 2차 구조를 형성하도록 증진시키는 경향이 있다. Pro는 별난 기하학을 갖기 때문에, 사슬을 단단하게 속박하며, 일반적으로 β-회전-유사성 구조들(β-turn-like structures)을 증진시키는 경향이 있다. 어떤 경우에는 Cys는 단백질 접힘(protein folding)에 중요한 이황화물결합 형성에 참여할 수 있다. Schulz et al., supra,는 상기 그룹 1 및 2를 병합시키고자 한 것을 주목하라. 또한 Tyr의 수소결합 잠재성 때문에 Try는 Ser, Thr 등과 강한 유사성을 갖는다.
예를들면 상기 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 보존적인 아미노산 치환들은 본 발명의 기술분야에 잘려져 있으며, 아미노산 치환후에도 폴리펩티드의 생물학적 및 구조적 성질들을 유지할 것이라고 생각된다. 본 발명에 따른 대부분의 결실들 및 치환들은 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 특징들에 있어서 근본적인 변화를 생산하지는 않는 것들이다. "특징" 은 비-포함된 방식(non-inclusive manner)으로 정의되며, 예를들면 α-나선 또는 β-시트(β-sheet)와 같은 2차구조에 있어서의 변화들 및 예를들면 MORT-1의 결합 또는 세포상 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과의 매개와 같은 생물학적 활성에 있어서의 변화들 양쪽을 의미한다.
본 발명에 있는 용법을 위한 MORT-1-결합 단백질들의 유사체들을 얻기위해 사용될 수 있는 단백질들내의 아미노산 치환들을 만드는 예들로는, Mard et al.의 미국 특허 RE 제33,653호, 제4,959,314호, 제4,588,585호 및 제4,737,462호; Koths et al.의 제5,116,943호, Namen et al.의 제4,965,195호; Chong et al.의 제4,879,111호; 및 Lee et al.의 제5,017,691호에 나타난 바와같이 모든 알려진 방법 단계들을 포함한다;그리고 라이신 치환된 단백질들은 미국 특허 제4,904,584호에 나타나있다[Shaw et al.].
상기 설명한 바와같이 MORT-1-결합 단백질의 활성을 심각하게 변화시키지 않는 보존적인 치환들외에도, MORT-1-결합 단백질들의 유사체들의 생물학적 활성을 증가시키는, 보존적인 치환들 또는 덜 보존적이고 더 무작위적인 변화들이 본 발명의 범위안에 있도록 한다.
치환 또는 결실의 정확한 효과가 확인되는 때, 당해 기술분야의 당업자는 치환(들), 결실(들) 등이 일상적인 결합 또는 세포 사멸 분석들에 의해 평가될 것이라고 생각할 것이다. 상기 표준 시험을 사용한 스크린닝에는 부정당한 실험이 관여되지 않는다.
수용할 수 있는 유사체들은 적어도 MORT-1에 결합할 수 있는 능력을 유지하는 것이며, 따라서 상기 언급한 바와 같이, FAS-R 및 p55-R의 활성(예를들면, 적어도 몇 개의 MACH 이소폼들의 단백질 분해 활성에 의한 것)을 매개하는 것이다. 상기 방법에 있어서 소위 우성-음성적 효과를 갖는 유사체들 즉, MORT-1에 대한 결합에 있어서, 또는 이어서 일어나는 신호전달 또는 상기 결합후의 프로테아제 활성에 있어서 어느 하나에 결점이 있는 유도체가 생산될 수 있다. 상기 유사체들은 예를들면 천연 MORT-1-결합 단배질들과 경쟁함으로써 FAS-리간드-효과를 억제하는데 사용될 수 있다. 예를들면 , MACH 이소폼들인 MACHα2 및 MACHα3은, 이러한 MACH이소폼들을 활성화시키는데 중요하다고 보이는 MORT-1에 대한 활성(프로테아제) MACH 이소폼들의 결합과 경쟁함으로써, MACH 활성을 억제하는 "자연적인" 유사체들이다. 일단 활성 MACH 이소폼들이 MORT-1에 결합할 수 없으면, FAS-R 및 p55-R에 의해 매개되는 세포내 신호전달 과정들이 그로인해 또한 억제될 것이다. 마찬가지로, FAS 리간드 또는 TNF 효과를 강화시키는 역할을 하는 소위 우성-양성적인 유도체가 생산될 수 있다. 이들은 MORT-1-결합 성질이 같거나 더 우수하고, 자연적인 MORT-1-결합 단백질들의 신호전달상 같거나 더 우수하다.
일반적인 수준에서 이러한 유사체들은, 일반적으로 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 DNA에 있는 뉴클레오티드의 위치-지정된 돌연변이유발후, 유사체를 코딩하는 DNA를 생산하고, 그에 따라 DNA를 합성하고, 재조합 세포 배양에서 폴리펩티드를 발현하는 것에 의해서 준비된다. 전형적인 유사체들은 자연적으로 생기는 단백질과 성질상 같거나 증가된 생물학적 활성을 나타낸다[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY, 1989].
본 발명에 따른 MORT-1-결합 단백질, 또는 같은 폴리펩티드를 코딩하나 알려진 유전자 코드의 퇴화성에 의해 허용되는 변화들 때문에 천연 서열과 다른 뉴클레오티드는, 먼저 준비된 유사체 또는 천연 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 DNA의 위치-특이성 돌연변이유발에 의해 준비될 수 있다. 위치-특이성 돌연변이유발은, 가로지르는 결실-접합점의 양쪽에서 안정된 2중쇄를 형성하는, 충분한 크기 및 서열 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공하기 위하여, 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 코딩하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열들 및 충분한 숫자의 인접 뉴클레오티드들을 사용함으로써 유사체들을 생산할 수 있다. 일반적으로, 변화된 서열의 양쪽 각각에 5-10개의 상보적인 뉴클레오티드들이 갖는, 길이가 약 20-25개의 뉴클레로티드인 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 위치-특이성 돌연변이유발은 본 발명의 기술분에에서 잘 알려져 있으며, [Adelman et al., DNA2:183(1983)]와 같은 간행물에 예시되어 있으며, 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
위치-특이성 돌연변이유발 기법은 일반적으로 1본쇄 및 2본쇄 형식 양쪽으로 존재하는 파아지 벡터(phage vector)를 사용한다. 위치-지정된 돌연변이유발에 유용한 일반적인 벡터들은 예를들면 M13 파아지와 같은 벡터들을 포함하며, [Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)]에 개시되어 있으며, 본원에 참고문헌에 합체되어 있다. 상기 파아지는 상업적으로 즉시 얻을 수 있고, 그들의 용법은 본 발명의 기술분야의 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 선택적으로, 1본쇄 파아지 본제원점을 함유하는 플라스미드 벡터들[Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3, 1987]이 1본쇄 DNA를 수득하는데 사용될 수 있다.
일반적으로 본원에 따른 위치-지정된 돌연변이유발은, 먼저 관련된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 벡터의 서열안에 포함하는, 1본쇄 벡터들을 수득함으로써 수행되어진다. 원하는 돌연변이된 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가, 자동화된 DNA/올리고뉴클레오티드 합성에 의해 준비된다. 상기 프라이머는 1본쇄 단백질-서열-함유한 벡터에 연결되고, E.coli 폴리머라제 Ⅰ 클리나우 단편과 같은 DNA-중합 효소로 처리되면, 돌연변이-포함되는 쇄의 합성이 완성된다. 따라서, 돌연변이된 서열 및 두 번째 쇄는 원하는 돌연변이를 갖게 된다. 그리고나서 상기 이종듀플렉스(heteroduplex) 벡터로 E. coli JM101 세포들같은 적절한 세포들을 형질전환시키고, 돌연변이 서열 배열을 갖는 재조합 벡터들을 포함하는 클론들을 선별한다.
상기 클론이 선별된 후, 돌연변이된 MORT-1-결합 단백질이 제거되고 적당한 벡터, 일반적으로 적절한 숙죽의 트랜스펙션에 사용될 수 있는 전이 또는 발현 벡터에 옮긴다.
따라서, MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 핵산이, PCR 및 화학적 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 알려진 DNA 또는 RNA 증폭 기법들을 사용하여, 생체외, 위치 그대로 및/또는 생체내에서 또한 검출, 수득 및/또는 수정될 수 있다. 반복된 DNA 폴리머라제 반응들에 의해 특정 DNA 서열들을 증폭(숫자상 증가)되도록 PCR이 사용된다. 상기 반응은 클론닝을 대신하여 사용될 수 있다; 필요한 것은 핵산 서열을 알아내는 것이다. PCR을 수행하기 위하여 관심있는 서열에 상보적인 프라이머를 고안한다. 그리고 나서, 프라이머는 자동화된 DNA 합성에 의해 생산된다. 프라이머들이 유전자의 임의의 부분과 하이브리드되도록 고안될 수 있기 때문에, 상보적인 염기상에 있어서 불일치들(mismatches)이 관용될 수 있는 조건들을 만들어 낼 수 있다. 상기 불일치된 영역들의 증폭을 통해 돌연변이된 생산물이 합성될 수 있고, 결국 새로운 성질들을 갖는 펩티드를 만들어 낼 수 있다[즉, 위치 지정된 돌연변이유발]. 예를들면, Ausubel, supra, Ch, 16도 참조하라. 또한 상보적인 DNA (cDNA) 합성과 쌍을 이루어(coupling), 역전사효소를 사용한 PCT를 통해, RNA가 클로닝없이 프롤락틴(prolactin) 수용체의 세포외 도메인의 합성을 위한 출발물질로 사용될 수 있다.
나아가, PCT 프라이머는 새로운 제한 부위들(restriction sites) 또는, 종결코돈들이 증폭된 유전자 분절(gene segement)의 말단들과 같은 다른 특징들을 합체하도록 고안될 수 있다. 증폭된 유전자 서열의 5' 및 3' 말단에 있는 제한 부위들의 이러한 배치를 통해, MORT-1-결합 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자 분절들이 벡터들안에 있는 다른 서열들 및/또는 클론닝 부위들에 연결(ligation)되도록 고안될 수 있다.
PCR 및 다른 RNA 및/또는 DNA 증폭 방법들은 본 발명의 기술분야에 잘 알려져 있으며, 부적절한 실험없이, 본원에 나타난 기술 및 지침에 기초하여 본 발명에 사용될 수 있다. 알려진 DNA/RNA 증폭 방법들은 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 및 관련된 증폭 공정들[Mullis et al.의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor et al.의 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 제5,091,310호; Gyllinsten et al.의 제5,066,584호; Gelfand et al.의 제4,889,818호; Silver et al.의 제4,994,370호; Biswas의 제4,766,067호; Ringold의 제4,656,134호; 및 Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications], 2본쇄 DNA 합성을 위한 주형으로써 표적 서열의 안티센스 RNA를 사용한 RNA 매개성 증폭[Malek et al.의 미국특허 제5,130,238호, 상표 NASBA임]을 포함하되, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 및 참고문헌의 전체 내용들은 본원의 참고문헌으로 포함되어 있다.
유사한 방식으로, MORT-1-결합 단백질들의 생물학적 활성 단편들(예를들면, MACH 이소폼들의 활성단편들)은 MORT-1-결합 단백질들의 유사체들에 관하여 상기 언급한 바와같이, 준비될 수 있다. MORT-1-결합 단백질들의 적당한 단편들은 MORT-1 결합 능력을 유지하고 상기 언급한 바와같이 FAS-R 및 p55-R의 생물학적 활성을 매개할 수 있는 것이다. 따라서, 유사체들에 관하여 상기 언급한 바와같이, 우성-음성적 또는 우성-양성적 효과들 갖는 MORT-1-결합 단백질 단편들이 준비될 수 있다. 이러한 단편들은 본 발명의 특정 클라스의 유사체들을 대표한다는 것을 주목하여야 한다. 즉, 이러한 단편들은 상기 언급된 임의의 원하는 활성들을 갖는 분획 또는 단편과 같은, 전체 MORT-1-결합 단백질 서열로부터 유래된 MORT-1-결합 단백질들의 정의된 분획들이다. 상기 단편은 예를들면 펩티드일 수 있다.
마찬가지로, 유도체들은, MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들 또는 단편들의 하나이상의 아미노산 잔기들의 측쇄들을 표준 수정함으로써, 또는 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들 또는 단편들을 본 기술분야에서 잘 알려진 항체, 효소, 수용체등과 같은 다른 분자에 접합함으로써, 준비될 수 있다. 따라서, 본원에 사용되는 "유도체들" 은, 잔기들의 측쇄들로써 나타나는 기능성 기들(functional groups), 또는 N- 또는 C-말단기들로부터, 당업계에 알려진 방법들에 의해 준비될 수 있는 유도체들을 포함하며, 본 발명에 포함되어 있다. 유도체들은 카르복실레이트 또는 포스페이트 잔기들과 같은 화학적 부분을 갖을 수 있어서, 분획이 MORT-1-결합 단백질들과 같은 또는 더 우수한 생물학적 활성을 갖도록 한다.
예를들면, 유도체들은, 암모니아 또는 1차나 2차 아민들과의 반응에 의한, 카르복실기의 지방족 에스터, 카르복실기의 아민, 아실부분들과 함께 형성된 아미노산 잔기들의 N-아실 유도체들 또는 자유 아미노 기들(예를들면, 알카노일 또는 카르보사이클릴 아로일 기들), 또는 아실부분들과 함께 형성된 자유 하이드록시 기의 O-아실 유도체들(예를들면, 세릴 또는 트레오닐 잔기들의 것들)을 포함할 수 있다.
용어 "유도체들" 은 한 아미노산이, 20개의 일반적인 천연 아미노산들중 하나로 바뀌지 않는 유도체들만을 포함하는 것을 의미한다.
비록 MORT-1-결합 단백질은 단백질 또는 폴리펩티드이지만 그것은 아미노산 잔기들의 서열이다. 본원에 있는 정의들에 따라, MORT-1-결합 단백질의 전체 서열을 포함하는 더 큰 서열로 이루어진 폴리펩티드는, 부가된 것들이 본 발명의 기본적이고 신규한 특징들에 영향을 주지 않는한, 즉 MORT-1-결합 단백질의 생물학적 활성을 유지 또는 증가시키거나, 단백질 또는 폴리펩티드가 MORT-1-결합 단백질의 생물학적 활성을 갖도록 절단될 수 있다면, 상기 폴리펩티드의 범위안에 포함되는 것으로 의미된다. 따라서, 예를들면 본 발명은 다른 아미노산들 또는 펩티드들을 갖는 MORT-1-결합 단백질의 융합 단백질들의 포함하는 것을 의미한다.
신규한 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들, 및 유도체들은 다음 예들과 같이 가능한 많은 용도들을 갖고 있다:
(ⅰ) 신규한 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들, 및 유도체들은, 증대된 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과가 바람직한 상황에서는, 예를들면 FAS-R 리간드- 또는 TNF-유도성 세포독성이 바람직한 경우인 항-암용, 항-염증용, 또는 항-HIV용과 같은 상황에서는, MORT-1 및 그로 인한 FAS-R 리간드 또는 TNF의 기능을 모방하거나 증대시키는데 사용될 수 있다. 이러한 경우, FAS-R 리간드 또는 TNF 효과 즉 세포독성효과를 증대시키는, MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들 또는 유도체들은 본질적으로 알려진 표준 공정들에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를들면, MORT-1-결합 단백질이 세포내 단백질이고 오직 FAS-R리간드 또는 TNF 효과가 바람직한 세포들에만 도입되어야할 때, 이 단백질을 상기 세포들안으로 특이성있게 도입하는 시스템이 필요하다. 이러한 방법 중 하나는, 다음과 같은 두 개의 유전자를 그 DNA에 도입될 재조합 동물 바이러스, 예를들면, Vaccinia에서 유래된 것을 만들어 내는 것이다: 세포들에 의해 특이적으로 발현되는 세포표면단백질에 결합하는 리간드를 코딩하되, (예를들면, 어떤 세포들(CD4 림포사이트 및 이와 관련된 백혈병들)에 특이적으로 결합하는 AIDs(HIV) 바이러스 gp120 단백질, 또는 FAS-R이나 p55-R을 운반하는 세포들에 특이적으로 결합하는 다른 리간드가 있으며) 그로인해 재조합 바이러스 벡터가 FAS-R- 또는 p55-R-수반 세포에 결합할 수 있도록하는 상기 리간드를 코딩하는 유전자; 및 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 유전자. 따라서, 바이러스 표면상의 상기 세포-표면-결합단백질 발현은 바이러스가 종양세포 또는 다른 FAS-R- 또는 p55-R-운반세포에 특이성있게 도달하게 하고, 그후 MORT-1-결합 단백질 코딩 서열이 바이러스를 통해 상기 세포들 안으로 도입되고, 상기 세포들에서 일단 발현되면 FAS-R-리간드 또는 TNF 효과를 증대시켜 종양세포 또는 죽이고자 하는 다른 FAS-R- 또는 p55-R-수반세포를 사멸시킨다. 이러한 재조합 동물 바이러스 제조는 표준공정들[예를들면 Sambrook et al., 1989 참조]에 의한다. 다른 가능성은, 세포들에 의해 흡수되어 그 안에서 발현될 수 있는 올리고뉴클리오티드의 형태로 MORT-1-결합 단백질 서열(예를들면, 임의의 MACH 이소폼들의 서열)을 도입시키는 것이다.
(ⅱ) 신규한 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들 및 유도체들은, 예를들면, 패혈증 쇼크에서의 조직 상해, 이식편-대-숙주반응 또는 급성 간염의 경우와 같이, FAS-R 또는 p55-R 세포내 신호전달을 유도하는 FAS-R 리간드 또는 TNF를 차단하는 것이 바람직한 경우에는, FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 상황에서는, 예를들면 상기 세포에 표준공정에 따라 MORT-1-결합 단백질에 대한 안티센스 코딩 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들을 도입할 수 있는데, 상기 올리고뉴클레오티드는 MORT-1 단백질 또는 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역을 효과적으로 차단시켜 그 발현을 차단하여 FAS-R 리간드- 또는 TNF-효과를 억제시킨다. 바이러스에 의해 운반되는 제2 서열이 상기 올리고뉴클레오티드인 것으로 하여, 상기 올리고뉴클리오티드들은 상기 재조합 바이러스 접근방식에 의하여 세포들내로 도입될 수 있다.
또 다른 가능성은 MORT-1-결합 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 세포내 신호전달 활성을 억제하는 것이다.
FAS-R리간드 또는 TNF 효과를 억제하는 또다른 방법으로는 최근 발전된 라이보자임 접급법에 의한 것이다. 라이보자임은 특이적으로 RNA를 절단하는 촉매성 RNA 분자들이다. 라이보자임은 선택된 표적 RNA들, 예를들면 본 발명의 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 mRNA를 절단하도록 조작할 수 있다. 이러한 라이보자임은 MORT-1-결합 단백질 mRNA에 특이적인 서열을 갖고 있어, 이 mRNA와 상호작용(상보적인 결합)을 할 수 있고 mRNA을 절단하여 결국엔 MORT-1-결합 단백질의 발현을 감소(또는 완전히 소실)시키며, 감소된 발현의 수준은 표적세포에서의 라이보자임 발현 수준에 의해 좌우된다. 선택된 상기 세포(예를들면 FAS-R 또는 p55-R을 가지는 세포)안으로 라이보자임을 도입하기 위해서는 이러한 목적으로 보통 사용되는 플라스미드, 동물 바이러스(레트로바이러스) 벡터들과 같은 적절한 벡터가 이용될 수 있다(상기 (ⅰ)를 참조. 여기서 바이러스가, 제2 서열로서, 선택된 라이보자임 서열을 코딩하는 cDNA을 가짐)[라이보자임들에 관련된 방법등은 다음을 참조; Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al.,1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 and Koizumi et al., 1993].
(ⅲ) MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들, 및 유도체들은, 같은 클라스의 다른 단백질들, 예를들면 FAS-R 세포내 도메인이나 기능적으로 관련된 수용체들에 결합하는 단백질들, 또는 MORT-1 및 그로인해 FAS-R 및 p55-R과 같은 기능적으로 관련된 수용체들에 결합하여 세포내 신호 전달과정에 관여하는 단백질들을 분리하고 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 적용에서, 상기 언급된 효모 이중-하이브리드 시스템이 사용될 수 있거나, 비-스트린젠트 서던 하이브리드화 및 PCR을 사용하여 최근 발전된 시스템이 사용될 수 있다[Wilks et al., 1989]. Wilks et al.간행물에는, 비-스트린젠트 서던 하이브리드화 및 의심되는 키나제 서열인 키나제 모티프의 알려진 서열에 기초한 PCR을 적용함으로써, 두 개의 추정되는 단백질-타이로신 키나제의 동정 및 클론닝이 기재되어 있다. 이러한 접급은 본 발명에 따라, MORT-1-결합 단백질(예를들면, 임의의 MACH 이소폼들)의 서열을 사용하여 관련있는 MORT-1-결합 단백질들의 서열을 동정 및 클론하는데 사용될 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들 또는 유도체들을 이용하는 또 다른 접근은, 그들이 결합할 수 있는 다른 단백질들이나 인자들, 예를들면 MORT-1, 또는 세포내 신호전달 과정에 관여하는 다른 단백질들이나 인자들을 분리하고 동정하기 위한 친화 크로마토그래피의 방법들에 사용하는 것이다. 상기 적용에서, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들, 또는 유도체들은, 각각 친화 크로마토그래피 매트릭스(matrix) 에 부착될 수 있고, 세포추출물들, 또는 세포내 신호전달 과정에 관여한다고 생각되는 분리된 단백질 또는 인자들과 접촉될 수 있다. 친화 크로마토그래피 공정 후, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편, 또는 유도체들에 결합할 수 있는 다른 단백질들 또는 다른 인자들이 용출, 분리 및 특성파악될 수 있다.
(ⅴ) 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 그의 유사체들, 단편들, 또는 유도체들은, 이들에 특이적인 항체를 생산하기 위한 면역항원(항원)으로 사용될 수 있다. 이러한 항체들은 또한 MORT-1-결합 단백질, 그 유사체 또는 단편들을 생산하는 형질전환된 세포 추출물 또는 세포주들로부터 MORT-1 단백질(예를들면, MACH 이소폼들)을 정제하는 목적으로도 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 항체들은, 예를 들면 과도한 또는 불충분한 FAS-R 리간드- 또는 TNF-유도성 세포 효과들과 같은 FAD-R 리간드 또는 TNF 시스템의 비정상적인 기능과 관련된 질환들을 밝혀내기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 따라서 만일 이러한 질환들이 MORT-1 단백질 또는 MORT-1-결합 단백질과 관련있는 기능부전적인 세포내 신호전달 시스템과 관련되어 있다면, 이러한 항체들은 중요한 진단용 도구로서 사용될 수 있다.
임의의 잘 알려진 표준 스크린 공정들을 사용하여 본 발명의 MORT-1-결합 단백질(예를들면, MACH 이소폼들)이 분리, 동정 및 특성파악될 수 있다는 것 또한 주목하여야 한다. 예를들면, 상기 공정중들 하나로서 본원에서 설명된 바와같이(제1 실시예), 효모 이중-하이브리드 공정이 MORT-1 단백질 및 이어서 본 발명의 MORT-1-결합 단백질들(제2 실시예-제3 실시예)을 동정하는데 사용되었다. 상기 및 하기에 언급한 것과 마찬가지로, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질을 분리, 동정 및 특성파악하거나, MORT-1 결합 단백질이나 본 발명의 MORT-1-결합 단백질들에 결합할 수 있는 부가적인 단백질들, 인자들, 수용체들 등을 분리, 동정 및 특성파악하기 위하여, 당업계에 잘 알려진 친화 크로마토그래피, DNA 하이브리드화 공정등과 같은 다른 공정들이 사용될 수 있다.
상기 설명한 바와같이, MORT-1-결합 단백질은, MORT-1-결합 단백질들에 예를들면, MACH 이소폼들에 특이적인 항체들을 만드는데 사용될 수 있다. 이러한 항체들 또는 그의 단편들은 하기에 상세하게 설명된 바와같이, 사용될 수 있으며, 항체들 및 그의 단편들의 적용들은 MORT-1-결합 단백질들에 특이성이 있는 것으로 이해된다.
적어도 몇 개의 MACH 이소폼들(상기 및 하기 제3 실시예 참조)이 CED3/ICE 패밀리의 프로테아제들과 관련된 프로테아제라는 본 발명에 따른 연구결과들에 기초하여, 다음의 특이성 의학 적용들(specific medical applications)이 MACH 이소폼들에 대해 계획된다: 다른 CED3/ICE 프로테아제들의 특이성 있는 억제인자들이 이미 존재하며, 이들중 몇 개는 세포 투과성이 있으며, 효과적으로 계획된 세포 사멸 과정들을 차단할 수 있다고 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따라 FAS-R 리간드- 또는 TNF-유도성 세포 사멸을 방해할 수 있는 억제인자들을 고안할 수 있으며, 이 과정에 MACH 프로테아제 이소폼들이 관여한다. 나아가, 상기 신규한 MACH 프로테아제들의 독특한 서열 특징들의 면에서, TNF- 및 FAS-R 리간드-유도성 효과들에 매우 특이성이 있는 억제인자들을 고안할 수 있는 것다고 보인다. 본 발명의 연구결과들은 또한 "치사 프로테아제" ( "killing protease")가 FAS-R 리간드 및 TNF에 반응하여 활성화되는 메카니즘을 연구하는 방법을 제공하며, 이는 상기 활성화 정도를 제어할 수 있는 약제들의 개발을 수반한다. 상기 약제들이 도울 수 있는 질환들이 많이 있다. 이들중에서는, 간에서의 급성 손상이 FAS-R 리간드 매개성 간세포들의 사멸을 반영하는 것처럼 보이는 급성 간염; 당뇨병을 초래하는 췌장의 β-랑겔한스 세포들의 사멸과 같은, 자가면역-유도성 세포 사멸; 이식편 거부반응에 있는 세포들의 사멸(예를들면, 신장, 심장 및 간); 다발성 쉴레로시스(multiple sclerosis)에 있어서 뇌에 있는 희돌기교세포들의 사멸; AIDS 바이러스의 증식 및 그로인한 AIDS질환을 야기하는 AIDS-방해성 T 세포 자멸이 있다.
상기 및 하기 언급한 바와같이, 두 개의 MACH 이소폼들인 MACHα2 및 MACHα3은 MACH 프로테아제 이소폼들의 "자연적인" 억제인자들의 역할을 할 수 있고, 따라서 이들은 상기 언급된 상기 MACH 프로테아제들의 특이성있는 억제인자들로써 사용될 수 있는 것처럼 보인다. 마찬가지로, 펩티드들, 유기화합물들, 항체들 등과 같은 다른 기질들도 또한 스크린될 수 있어서 MACH 프로테아제들을 억제할 수 있는 특이성 약제들을 얻을 수 있다.
어떻게 MACH 프로테아제들의 펩티드 억제인자들이 고안되어지고 스크린되는가에 대한 비-제한된 실시예는, ICE 또는 ICE-유사성 프로테아제들의 펩티드 억제인자들, ICE의 기질 특이성 및 펩티드 합성을 사용하는 에피토스 분석의 전략들에 관한 이전 연구들에 기초한 것이다. ICE에 의한 펩티드 절단에 효과적인 최소한의 필요조건으로는, P1 위치에는 아스파라진산의 강한 선호를 가진 그리고 P1 위치의 오른쪽에는 충분한 메틸아민을 가진, 절단 부위의 왼쪽 4개의 아미노산들이 관여한다는 것이 밝혀졌다[Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992]. 나아가, 형광발색 기질 펩티드(테트라펩티드)인 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-쿠마릴-7-아민) [생략해서, Ac-DEVD-AMC]은, 아폽토시스 과정들에서뿐만아니라 FAS-R 자극후에 바로 세포들에서 절단되는 것으로 밝혀진 폴리 (ADP-라이보스) 폴리머라제 (PARP)에 있는 서열에 해당하며[Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994], CPP32(CED3/ICE 프로테아제 패밀리의 일원)에 의해 효과적으로 절단된다. 기질의 P1 위치에 있는 Asp은 중요한 것처럼 보이고, 네 번째 아미노산 잔기로 Asp을 갖으며 처음 세 개의 잔기 위치들에는 다양한 아마노산 조합들을 갖는 테트라펩티드들은, 예를들면 고체 지지체들에 있는 많은 펩티드들이 항체들과 특이성있는 상호작용을 하는지 스크린하는 Geysen에 의해 개발된 방법에 의해, MACH 프로테아제의 활성 부위에 결합하는지에 대해 즉시 스크린될 수 있다[Geysen, 1985; Geysen et al., 1987]. 특이성있는 펩티드들에 대한 MACH 프로테아제들의 결합은, MACH 프로테아제의 방사선표지 등과 같이 본 발명의 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 다양한 검출 방법들에 의해 검출될 수 있다. Geysen's의 상기 방법은 각 작업일당 적어도 4000 펩티드들을 시험할 수 있는 것으로 보인다.
CED3/ICE 패밀리 프로테아제들의 다른 일원들이 관여하는 생리학적인 세포 사멸 과정들을 방해하지 않고 MACH 프로테아제들을 선택적으로 억제하는 펩티드 억제인자들을 고안하는 것은 유익할 수 있기 때문에, 상기 설명된 바와같은 분석에 있어서 MACH 프로테아제들에 결합하는 펩티드들의 풀이 형광발색 기질 펩티드로써 합성되어, 다른 CED3/ICE 프로테아제들에 의해 절단되지 않으면서 MACH 프로테아제들에 의해 선택적으로 절단되는지에 대하여 시험될 수 있다. MACH 프로테아제들에 의해 선택적으로 절단된다고 확인된 펩티드들은 수정되어, 세포 투과성을 강화하고 가역적 또는 비가역적으로 MACH의 세포 사멸 활성을 억제할 수 있도록 할 수 있다. Thornberry et al.(1994)는, (아실옥시) 메틸 케톤 Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2,6-(CF3)2]Ph 테트라펩티드가 유력한 ICE의 불활성인자라는 것을 밝혀내었다. 마찬가지로, Milligan et al.(1995)은 클로로메틸케톤(비가역적으로) 또는 알데하이드(가역적으로) 기들을 갖는 테트라펩티드 억제인자들은 ICE를 억제한다고 밝혔다. 게다가, 벤질옥시카르복실-Asp-CH2OC(O)-2,6-디클로로벤젠 (DCB)이 ICE를 억제하는 것처럼 보여졌다[Mashima et al., 1995]. 따라서, MACH 프로테아제들에 선택적으로 결합하는 테트라펩티드들은, 예를들면 알데하이드기, 클로로메틸케톤, (아실옥시) 메틸 케톤 또는 하나의 CH2OC(C)-DCB 기를 갖도록 수정되어, MACH 프로테아제 활성의 펩티드 억제인자를 만들어 낼 수 있다.
다른 CED3/ICE 프로테아제의 특이성있는 억제인자들은 세포 투과성이 있는데, 펩티드 억제인자의 세포 투과성은 강화될 필요가 있을 것이다. 예를들면, 펩티드들은 화학적으로 수정되고 유도되어, 그들의 세포막을 가로지르는 투과성을 강화하고 상기 세포막을 가로질러 또는 세포질 안으로 상기 펩티드들이 수송되기 쉽도록 할 수 있다. Muranishi et al.(1991)은, 라우릭산(lauric acid)으로 타이로트로핀-분비 호르몬의 유도체를 만들면, 우수한 세포막 통과성 특징을 갖는 지방친화성 라우로릴 유도체(lauroyl derivative)를 형성한다고 밝혔다. Zacharia et al.(1991)은 또한, 메티오닌을 산화하여 설폭사이드를 형성하는 것 및 케토메틸렌 이소에스터 (COCH2)로 펩티드 결합을 치환하는 것은 세포막을 통한 펩티드들의 수송을 용이하게 한다고 밝혔다. 이들은 본 발명의 기술분야의 당업자들에게 잘 알려진 수정들 및 유도방법중 단지 몇 개에 해당한다.
나아가, MACHα1 및 MACHα2의 세포 사멸 활성을 억제할 수 있는, 약제 또는 펩티드 억제인자들은, 세포안으로 도입이 용이한 분자들과 접합 또는 복합체를 이룰 수 있다.
미국특허 제5,149,782호는, 세포막을 통과하여 수송되도록, 푸조제닉 폴리펩티드들(fusogenic acid), 이온채널 형성 폴리펩티드들, 다른 막 폴리펩티드들, 및 장쇄 지방산들(예를들면, 미리스틴산, 팔미틴산)과 같은 막 혼합제(membrane blending agent)에 분자를 접합시키는 것을 개시하고 있다. 상기 막 혼합제들은 분자 접합체들이 세포막의 지질 이중막안으로 삽입되도록 하여 세포질내로의 도입을 용이하게 한다.
Low et al., 미국특허 제5,108,921호는, 수용체 매개성 엔도사이토시스 활성의 메카니즘을 통해, 단백질들 또는 핵산들과 같은 그러나 이들에 한정되지 않는 분자들을 막통과 운송하기 위한 유용한 방법들을 재검토하였다. 상기 수용체 시스템들은 갈락토스, 만노스, 만노스 6-인삼염, 트란스페린, 무시알로당단백질(asialoglycoprotein), 트란스코발라민(비타민 B12), α-2 마크로글로불린들, 인슐린 및 표피성장호르몬(EGF)과 같은 다른 펩티드 성장 인자들을 인식하는 것들도 포함한다. Low et al.는, 바이오틴 및 엽산염에 대한 수용체들과 같은 영양 수용체들(nutrient recepter)이 대부분의 세포들의 막표면들에 있는 바이오틴 및 엽산염 수용체들의 위치와 다중성 및 연결된 수용체 매개성 막통과 수송 과정들(the associated receptor mediated transmembrane transport processes)덕분에 세포막을 가로지르는 수송을 강화시키는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 알려주고 있다. 따라서, 세포질안으로 운반되는 화합물 및 리간드 사이에 형성된 복합체가 바이오틴 또는 엽산염 수용체들을 갖는 세포막과 접촉하여, 수용체 매개성 막-통과 수송 메카니즘을 개시하고 원하는 화합물이 세포안으로 도입되도록한다.
ICE는 P2 위치에서 광범위한 치환을 관용할 수 있는 능력을 갖고 있다고 알려져 있으며, 광범위한 치환들에 대한 상기 관용은, 유력하면서 매우 선택적인, 바이오틴 꼬리를 함유하는 친화 표지를 개발하는데 사용되었다[Thornberry et al., 1994]. 결론적으로, P2 위치뿐만아니라 가능성있는 테트라펩티드 억제인자의 N-말단은, 바이오틴 분자의 첨가와 같이 수정되거나 그 유도체를 생성하여, 이러한 펩티드 억제인자들의 세포막 통과성을 강화할 수 있다.
게다가, 원하는 펩티드 서열을 리더/시그날 펩티드 서열과 융합하여 "키메라 펩티드" 를 만드는 것은 상기 "키메라 펩티드" 가 세포막을 가로질러 세포질안으로 수송될 수 있게한다는 것이 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 기술분야의 당업자에 의해, 본 발명에 따른 MACH 단백질 분해 활성의 펩티드 억제인자들은, 펩티드모방성 약제들 또는 억제인자들도 포함하며, 이들은 아마 더 안정된 억제인자들을 고안하기 위해 MACH 프로테아제에 결합하는지 즉시 스크린될 수 있다.
상기 논의된 바와같이 세포막들을 통과하는 펩티드 억제인자들의 수송을 용이하게 하거나 강하하는 상기 방법들은, MACH 이소폼들 자체뿐만아니라 그들의 세포내 효과들을 발현하는 다른 펩티드들 및 단백질들에도 적용될 수 있다.
본원 전체를 통해 언급된 항체에 대해 단어 "항체"는 폴리클로날 항체들, 모노클로날 항체(mAbs)들, 키메라 항체들, 항이디오타이프(anti-Id) 항체들, 용해가능한 또는 결합한 형태로 표지될 수 있는 항체들 뿐만아니라, 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술등과 같이 공지된 기술에 의해 제공되는 이들의 단편들을 포함하는 의미이다.
폴리클로날 항체들은 한 항원으로 면역시킨 동물의 혈청에서 가져온 항체분자들의 이질적인 군집이다. 모노클로날 항체는 항원들에 특이적이고 실질적으로 유사한 에피토프 결합 위치들을 갖는 실질적으로 동질적인 군집을 함유한다. MAbs는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수득된다. 예로써 Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497(1975); 미국 특허 제4,376,110호; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); and Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992, 1993)을 참조한다. 상기 참고문헌의 내용은 본원에서 전체적으로 인용되어 있다. 이러한 항체들은 IgG, IgM,IgE, IgA, GILD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클라스와 이들의 임의의 서브클라스일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 생체외, 자연 그대로(in situ), 생체내에서 배양될 수 있다. 많은 양의 생체내 또는 생체외 생산은 이것을 현재 바람직한 생산방법으로 만들었다.
키메라 항체들은 쥐의 mAb로부터 유래된 가변부위 및 사람 면역글로불린의 불변부위를 갖는 동물과 같이, 다른 동물종들로부터 서로 다른 분획들이 유래된 다른 분자이다. 키메라 항체들은 적용에 있어선 주로 면역성을 감소시키는데 이용되고, 생산에 있어선 수득율을 증가시키는데 이용된다. 예를들면, 쥐의 mAbs는 하이브르도마들로부터 높은 수득률을 갖으나 사람에서는 더 높은 면역성을 갖으므로 사람/쥐 키메라 mAbs들이 이용된다. 키메라 항체들과 그들의 생산 방법들은 당업계에 알려져 있다[참조 Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA81"6851-6855(1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646(1984); Cabilly et al., European Patent Application 125023(1984.11. 14.발행); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., 유럽특허출원 제171496호 (1985. 2. 19.발행); Morrison et al., 유럽특허출원 제173494호 (1986. 5. 5.발행); Neuberger et al., PCT 출원 WO 8601533,(1986. 5. 13. 발행); Kudo et al., 유럽특허출원 제184187호 (1986. 6. 11.발행); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074(1986); Robinson et al., International Patent Application No. WO8702671(1987. 5. 7.발행); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443(1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218(1987); Better et al., Science 240:1041-1043(1988); 및 Harlow and Lane, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, supra]. 이 참고문헌들은 여기에서 참고로 전체적으로 삽입되어 있다.
항-이디오타이프 (항-Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원-결합 위치와 연관이 있는 독특한 결정기들을 인식하는 항체이다. Id-항체는, 항-Id가 준비되는 mAb로 mAb의 원천으로 같은 종이고 같은 유전자타입인 동물(마우스 계통)을 면역시킴으로서 준비할 수 있다. 이렇게 면역된 동물은 이러한 이디오타이프 결정기에 대한 항체(항-Id 항체)를 생산함으로써 이 이디오타이프 결정기를 인식하고 이에 반응할 것이다. 예로, 본원에서 참조에 의해 전체적으로 삽입되어 있는 미국특허 제4,699,880호를 참조하라.
항-Id 항체는 또한 또 다른 동물에서의 면역반응을 유도하는 "면역항원" 으로 이용될 수 있고, 소위 항-항-Id 항체라고 불리는 항체를 생산한다. 상기 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프가 동일할 수 있다. 따라서 mAb의 이디오타이프 결정기에 대한 항체들을 이용함으로서 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론들을 동정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 MORT-1-결합 단백질, 이의 유사체들, 단편들 또는 유도체들에 대해 만들어진 mAbs는 BALB/c 마우스같은 적합한 동물에서 항-Id 항체를 유도하는데 이용될 수 있다. 이와같이 면역된 마우스의 지라세포들은 항-Id mAbs를 분비하는 항-Id 하이브리도마들을 생산하는데 이용될 수 있다. 더욱이 항-Id mAb는 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH)과 같은 운반체에 연결될 수 있고 부가적인 BALB/c 마우스를 면역시키는데 이용될 수 있다. 이런 마우스로 부터 나온 혈청은 상기 MORT-1-결합 단백질, 유사체들, 단편들 또는 유도체들의 에피토프에 특이적인 원래의 mAb의 결합 성질을 갖는 항-항-id 항체를 함유할 것이다.
따라서 항-Id mAbs는 그들 자신의 이디오타이프인 에피토프들을 가지거나 또는 GRB 단백질-α와같이 검정되는 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프" 들을 가지고 있다.
단어 "항체" 는 또한 항원에 결합할 수 있는 완전한 분자 및 예를들면 Fab와 F(ab')2 와 같은 이의 단편 양자를 포함하는 의미이다. Fab와 F(ab')2 단편은 완전한 항체에서 Fc 단편을 결실하고 있어 순환에서 완전한 항체보다 더 빨리 순환으로 부터 제거되고, 완전한 항체보다 비-특이적 조직 결합을 적게 가질 수 있다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)).
Fab와 F(ab')2 및 본 발명에 유용한 항체의 다른 단편들은 여기서 개시된 완전한 항체 분자에 대한 방법으로 MORT-1 단백질을 검출하고 양을 재는데 이용될 수 것이다. 이러한 단편들은 파파인(papain)(Fab단편을 생산하기 위해) 또는 펩신[F(ab')2 단편을 생산하기 위해]같은 효소들을 이용하여 단백질분해효소의 절단에 의해서 전형적으로 생산된다.
만일 항체가 특이적으로 한 분자와 상호작용하여 상기 분자를 그 항체에 결합시킬 수 있다면 그 항체는 그 분자에 "결합할 수 있다" 고 한다. 용어 "에피토프" 는 항체에 의해 인식될 수 있고 그 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 분자의 분획을 의미한다. 에피토프들 또는 "항원의 결정기" 는 아미노산들 또는 당 측쇄 사슬들 같이 분자의 화학적으로 활성적인 표면 원자단들로 보통 구성되어 있고 특이적인 전하 특성들뿐만 아니라 특이적인 삼차원 구조 특성들을 가지고 있다.
"항원" 이란 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 분획으로 부가적으로는 동물이 상기 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 유도할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 갖을 수 있다. 상기에서 언급한 특이적인 반응이란 항원이 매우 선택적인 방법으로 이에 상응하는 항체와 반응하고 다른 항원에 의해 야기되는 다른 많은 항체와는 반응하지 아니할 것을 의미한다.
본 발명에 유용한 항체들, 항체들의 단편들은 시료내의 MORT-1-결합 단백질을 양적으로 또는 질적으로 검출하거나 본 발명의 MORT-1-결합 단백질이 발현되는 세포의 존재여부를 검출하는데 이용될 수 있다. 이것은 광학현미경검사법, 유동세포혈구검출법 또는 형광측정계검출법과 연결하여 형광으로 표지된 항체를 사용하는 면역형광법(하기 참조)에 의해서 수행된다.
본 발명에 유용한 상기 항체들 (또는 그의 단편들)은 역사적으로 면역형광법 또는 면역전자현미경으로 본 발명의 MORT-1-결합 단백질을 생체내에서 검출하는데 사용될 수 있다. 생체내 검출은 환자로부터의 조직표본을 제거하고 그 표본에 본 발명의 표지된 항체를 제공함으로써 수행될 수 있다. 상기 항체(또는 단편)는 바람직하게는 생물학적 시료에 표지된 항체(또는 단편)를 적용하거나 입힘으로써 제공된다. 이러한 절차의 이용을 통해서 MORT-1-결합 단백질의 존재뿐만아니라 검사되는 조직상에서의 MORT-1-결합 단백질의 분포를 결정할 수 있다. 본 발명을 이용하면, 이와같은 위치 그대로의(in situ) 검출을 얻기위해, 본 분야에서 통상의 지식을 가진자는, 조직학적 방법(염색절차 같은)의 임의의 다양한 방법을 용이하게 파악할 수 있을 것이다.
이러한 본 발명의 MORT-1-결합 단백질의 측정법은 전형적으로 MORT-1-결합 단백질을 동정할 수 있는, 검출할 수 있게 표지된 항체의 존재하에서, 생물학적 체액, 조직 추출물, 림포사이트 또는 백혈구 같은 신선하게 수확된 세포 또는 조직배양에서 항온배양된 세포과 같은 생물학적 시료를 항온배양하는 단계, 및 당업계에서 잘 알려진 많은 기술들중 어느 하나에 의해 항체를 검출하는 단계를 포함하고 있다.
생물학적 시료는 니트로셀룰로우스 같은 고체상 지지체 또는 운반체로 처리하거나 세포, 세포입자 또는 용해성 단백질을 움직이지 못하게 할 수 있는 다른 고체 지지체 또는 운반체로 처리된다. 그리고 나서 상기 지지체나 운반체는 적절한 완충액으로 세척되고, 상기 언급한 바와 같이 본 발명에 따라서 검출할 수 있게 표지된 항체로 처리한다. 그리고 나서 고체상 지지체 또는 운반체를 완충액으로 두 번 세척하면 결합되지 못한 항체가 게거될 수 있다. 상기 고체상 또는 운반체에 결합된 항체의 양은 통상적인 방법으로 검출한다.
"고체상 지지체", "고체상 운반체", "고체 지지체", "고체 운반체", "지지체" 또는 "운반체" 는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 지지체 또는 운반체를 의미한다. 잘 알려진 지지체 또는 운반체로는 유리, 폴리스타이린, 폴리프로필린, 폴리에틸린, 덱스트린, 나일론 아밀라제, 천연의 또는 수정된 셀룰로우스, 폴리아크릴아미드, 반려암과 자철광을 포함한다. 운반체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 어느정도는 용해성이거나 불용해성일 수 있다. 연결된 분자들이 항원 또는 항체에 결합할 수 있도록 상기 지지체 물질은 실질적으로 가능한 구조상 입체배치를 실질상 가진다. 따라서 지지체 또는 운반체의 입체배치는 구슬과 같은 구형, 시험관의 내부표면 또는 막대기의 외부표면과 같은 원통형이다. 또한, 상기 표면은 종이, 실험 막대조각 등같이 납작할 수도 있다. 바람직한 지지체 또는 운반체는 폴리스타이린 비드들을 포함한다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 항체 또는 항원의 결합에 적합한 다른 운반체를 알 수 있거나 일상적인 실험방법을 이용하여 그것을 확인할 수 있다.
상기와 같이 본 발명에서 주어진 많은 항체의 결합 활성은 공지의 방법에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 일상적인 실험방법을 이용하여 각 결정에 대한 운용 조건 및 최적의 분석조건을 결정할 수 있을 것이다.
세척, 휘저음, 흔듬, 여과 등의 다른 단계들은 관레적으로 또는 특별한 상황에 맞게 필수적으로, 분석에 부가될 수 있다.
본 발명에 따라 검출 가능하도록 표지된 항체의 이용방법 중 하나는 효소에 항체를 연결하여 효소면역분석법(EIA)에 이용하는 것이다. 이 효소는 이후 적당한 기질에 노출되었을 때 기질과 반응하여 예컨대 분광학적, 형광분석적 혹은 시각적 수단으로 검출 가능한 화학적 부분을 생산한다. 검출 가능한 향체의 표지로 이용되는 효소는 말레이트 탈수소효소, 스태필로코커스 핵산분해 효소, 델타-5-스테로이드 이성질화 효소, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성질화 효소, 홍당무 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다아제, 리보핵산 분해효소, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜리나아제를 포함하고, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이 검출는 효소에 대하여 색깔을 나타내는 기질을 채택하는 색분석법으로 수행될 수 있다. 또한 검출는 유사하게 제조된 표준들과 기질의 효소반응 정도를 시각으로 비교함으로써 수행될 수 있다.
검출는 다양한 다른 면역분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 항체들 또는 항체 단편들을 방사성 표지함으로써 방사면역분석법(RIA)을 통하여 R-PTPase를 검출할 수 있다. RIA에 관한 좋은 기술은 Work. T. S. et al.의 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company,NY(1978)에서 간행된 것으로 Chard, T.에 의하여 "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"라고 제목붙여진 장의 특별한 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 방사성 동위원소는 감마(γ) 계측기 또는 신틸레이션 계측기 또는 자동방사 감광법과 같은 수단으로 검출될 수 있다.
본 발명에 따라 형광물질로 항체를 표지하는 것 또한 가능하다. 형광표지된 항체가 적절한 파장의 광선에 노출되는 경우 그 존재는 형광에 의해서 검출될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광표지물질은 풀루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민이다.
항체는 또한 152E 또는 다른 랜타나이드 계열과 같은 형광발광 금속을 이용하여 표지될 수도 있다. 이들 금속들은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 이용하여 항체에 부착될 수 있다.
항체는 또한 화학발광물질과 결합하여 검출가능하도록 표지될 수 있다. 화학발광물질-꼬리표가 달린 항체의 존재는 그 후 화학반응도중에 발생하는 발광의 존재를 검출하여 결정된다. 특별히 유용한 화학발광 표지물질의 예로는 루미놀, 이소루미놀, 서로매틱 아크리디늄에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살산에스케르가 있다.
유사하게, 생물발광 물질도 본 발명의 항체를 표지하는데 이용된다. 생물발광은 생물계에서 발견되는 화학발광의 한 형태로서 촉매활성이 있는 단백질이 화학발광반응의 효과를 증대시키는 것이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출하여 결정된다. 표지목적으로 중요한 생물발광 물질은 루시페린, 루시페라제 및 아쿠오린이다.
본 발명의 항체분자는 "이중-위치(two-site)" 또는 "샌드위치" 분석법이라고도 알려진 면역측정 분석법에 이용되도록 적용될 수 있다. 전형적인 면역측정 분석법에서는, 표지되지 않은 일정량의 항체(또는 항체 단편)가 고체 지지체 또는 운반체에 결합되고 검출 가능하도록 표지된 일정량의 수용성 항체가 부가되어 고체상 항체, 항원 및 표지된 항체 간에 형성된 3중 복합체의 검출 및/또는 정량을 가능하게 한다.
전형적이고 바람직한 면역측정 분석법은 고체상에 결합된 항체가 먼저 시험대상 시료와 접촉하여 고체상 항체-항원 이중 복합체를 형성함으로써 시료로부터 항원을 추출해내는 "전향(foaward)" 분석법을 포함한다. 적당한 항온배양기간 이후 고체 지지체 또는 운반체는 액체 시료의 잔존물을 제거하기 위하여 세척되는데, 반응하지 않은 항원과, 만약 존재한다면 미지의 양의 표지된 항체(이것은 "리포터 분자"로 기능한다)를 함유하는 용액과 접촉한 물질이 세척된다. 표지된 항체가 고체 지지체 또는 운반체에 결합된 항원과 표지되지 않은 항체를 통하여 복합체를 형성하도록 하는 제2 항온배양기간 이후 고체 지지체 또는 운반체는 두 번 세척되어 반응하지 않은 표지된 항체를 제거하였다.
본 발명의 항체로서 유용한 또다른 형태의 "샌드위치" 분석법에서, 소위 "동시" 그리고 "역" 분석법이 이용된다. 동시분석법은 고체 지지체 또는 운반체에 결합된 항체 그리고 표지된 항체가 모두 동시에 시험대상 시료에 부가되는 단일 배양단계를 포함한다. 배양이 완료된 후 고체 지지체 또는 운반체는 액상 시료의 잔존물 및 복합체를 형성하지 않은 표지된 항체를 제거하기 위하여 세척된다. 고체 지지체 또는 운반체에 결합된 표지된 항체의 존재는 그후 일반적인 "전향" 샌드위치 분석법에서 결정된다.
"역" 분석법에서, 처음에는 표지된 항체 용액이 액체시료에 순차적으로 부가되고 적당한 항온배양기간이 사용된 후 다음에는 고체 지지체 또는 운반체에 결합된 표지되지 않은 항체가 부가된다. 제2 항온배양 이후 고체상은 일반적인 방식으로 세척되어 시험대상 시료의 잔존물과 반응하지 않은 표지된 항체의 용액이 제거된다. 고체 지지체 또는 운반체와 결합된 표지된 항체의 결정은 그후 "동시" 그리고 "전향" 분석법으로 결정된다.
본 발명의 MORT-1-결합 단백질들은 표준 재조합 DNA 공정에 의해 생산될 수 있으며[예를들면, Sambrook, et al., 1989 and Ansabel et al., 1987-1995, supra 참조], 여기서 당업계에 잘 알려진 적당한 진핵 또는 원핵 숙주 세포들은 상기 단백질들을 코딩하는 서열들을 함유하는 적절한 진핵 또는 원핵 벡터들에 의해 형질전환된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질들을 생산하기 위한 상기 발현 벡터 및 형질전환된 숙주들에 관한 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 단백질들은 또한 그들의 생물학적 활성있는 유사체들, 단편들 및 유도체들을 포함하며, 이들을 포함하는 벡터들은 또한 이러한 단백질들의 유사체들 및 단편들을 코딩하는 벡터들을 포함하고, 형질전환된 숙주들은 상기 유사체들 및 단편들을 생산하는 숙주들을 포함한다. 형질전환된 숙주들에 의해 생산되는 이러한 단백질들의 유도체들은 상기 단백질들 또는 그들의 유사체들 또는 단편들의 표준 수정법에 의해 생산되는 유도체들이다.
본 발명은 또한 MORT-1-결합 단백질들을 코딩하는 재조합 동물 바이러스 벡터들을 포함하는 약학적 조성물들에 관한 것으로서, 상기 벡터는 또한 특정 표적 세포(예를들면, 암세포들)에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질들을 코딩하여 MORT-1-결합 단백질 서열들이 세포안으로 삽입되도록 지도한다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은, 활성성분으로 (a) MORT-1-결합 단백질 서열의 안티센스 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 (b) MACH 이소폼들의 단백질 분해 활성을 억제하는 약제를 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물들은 의도하는 목적을 성취하기 위해 충분한 양의 활성 성분을 포함한다. 게다가, 약학적 조성물들은, 약학적으로 수용할 수 있는 적당한 캐리어들을 함유하되, 상기 캐리어들은, 활성 화합물들을 약학적으로 사용할 수있는 제제들로 공정하기 용이하게 하며 당업계의 당업자에게 잘 알려진 환자들에게 투여하기 위해 상기 제제들을 안정화시킬 수 있는 부형제들 및 보조제들을 포함한다.
MORT-1-결합 단백질 MACH는 다른 조직들에서 현저하게 다른 수준으로 현저하게 다른 이소타입들의 패턴으로 발현된다. 이러한 차이들은 아마도 Fas/APO1-리간드 및 TNF 에 대응하여 조직-특이성 특징들에 기여하는 것같다. 다른 CED3/ICE 동족체들의 경우에서와 같이(Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995), 불완전한 CED3/ICE영역들을 포함하는 MACH 이소폼들(예를들면 MACHα3)은, 동시-발현된 MACHα1 또는 MACHα2 분자들의 활성에 대하여 억제성 효과를 갖는다고 밝혀졌다; 그들은 또한 Fas/APO1 및 p55-R에 의해 사멸 유도를 차단하다고 밝혀졌다. 세포들에서 상기 억제성 이소폼들의 발현은 Fas/APO1- 및 TNF-매개성 세포독성에 대하여 세포의 자가-방어 메카니즘에 기여할 수 있다. CED3/ICE 패밀리의 임의의 다른 프로테아제들에서 관찰되는 것보다 훨씬 초과하는, MACH 이소폼들의 광범위한 이질성은 활성 MACH 이소폼들 기능의 매우 정교한 조율에 기여할 것이다.
또한, 어떤 MACH 이소폼들은 다른 기능들을 수행할 가능성이 있다. MACHβ1이 MORT1 및 MACHα1 양쪽에 결합하는 능력은, 상기 이소폼이 실질적으로 효소학적으로 활성이 있는 이소폼들의 활성을 강화할 수 있다는 것을 제시한다. 상기 이소폼으로 트랜스펙션된 293-EBNA 및 MCF7 배양세포들에서 관찰되는 온화한 세포독성 및, HeLa 세포들에서 발휘되는 더 심각한 세포독성 효과는, 트랜스펙션된 MACHβ1 분자들에 결합하는 내재적으로-발현되는 MACHα1의 활성을 반영하는 것처럼 보인다. 상상컨대, 어떤 MACH 이소폼들은, 또한 Fas/APO1 및 TNF 수용체들의 또다른 비-세포독성 효과들에 관여하는 분자들의 도킹 부위들(doking sites)로써 작용할 수 있다.
세포 사멸을 야기하는 Fas/APO1 및 TNF 수용체들의 독특한 능력뿐만아니라, 다른 조직-손상 활성들을 촉발하는 TNF 수용체들의 능력 때문에, 이러한 수용체들의 기능에 있어서 변형들은 생명체에 특히 해로울 수 있다. 게다나, 이러한 수용체들의 과도한 그리고 결핍된 기능은 모두 다양한 질환들의 병적 증상에 기여하는 것으로 보여진다[Vassalli, 1992; Nagata and Golstein, 1995]. 수용체들의 활성을 신호전달하는데 참여하는 분자들을 동정하고, 이러한 분자들의 활성을 조절하는 방법을 밝혀내는 것은 신규한 치료학적 접근들을 제시할 수 있다. Fas/APO1- 및 TNF-매개성 독성에서 MACHα의 중요한 역할을 한다고 생각되는 점에서, CED3/ICE 패밀리의 다른 어떤 단백질들에 대하여 하는 것과 같이, MACHα의 단백분해 기능을 차단할 수 약제들을 고안하는 것은 특히 중요한 것처럼 보인다[Thornberry et al., 1994; Miller et al., 1995; Mashima et al., 1995; Milligan et al., 1995; Enari et al., 1995; Los et al., 1995]. MACHα안에 있는 CED3/ICE 동족체들의 독특한 서열 특징들은 그것의 활성에 특이적으로 영향을 주는 약제를 고안하도록 할 수 있게 하였다. 상기 약제들은, CED3/ICE 패밀리의 다른 일원들이 관여하는 생리학적 세포-사멸 과정들을 방해하지 않으면서, MACHα가 관여하는 과도한 면역-매개성 세포독성으로부터 방어할 수 있도록 한다.
본 발명의 다른 측면들은 다음의 실시예들로부터 나타난다.
본 발명은 실시예들 및 수반되는 도들에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이나, 이들에 전혀 한정되지는 않는다.
하기 제1 실시예 및 제2 실시예에서 설명된 바와같이, MORT-1 및 MORT-1 결합 단백질에 대하여 (ⅰ) 이중-하이브리드 스크린 및 이중-하이브리드 β-갈락토시타제 발현 시험; (ⅱ) 단백질들의 유도된 발현, 대사적으로 표지하기 및 면역침강반응; (ⅲ) 생체외 결합; (ⅳ) 세포독성의 검정;및 (ⅴ) 노던 및 서열 분석들의 공정들은, MACH 및 그의 이소폼들이 분리, 클론닝 및 특성파악하는데에도 (몇개의 수정들과 함께) 똑같이 적용할 수 있다는 것을 또한 주목하여야 한다. 따라서 이러한 공정들은 하기 제3 실시예에 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 MACH의 분리, 클론닝 및 특성파악에도 동일 공정들의 완전히 개시로써 해석될 수 있다.
[제1 실시예: FAS-R 의 세포내 도메인에 결합하는 MORT-1 단백질의 클로닝 및 분리]
<(ⅰ)이중-하이브리드 스크린 및 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현 실험>
FAS-R의 세포내 도메인과 상호반응하는 단백질들을 분리하기 위하여 효모 이중-하이브리드 시스템이 사용된다[Fields and Song, 1989]. 간단하게 말하면, 이중-하이브리드 시스템은, DNA 결합 도메인과 활성화 도메인의 두 분리된 도메인들을 가지는 GAL4와 같은 진핵 전사 활성인자의 복원에 의하여 생체내에서 특정한 단백질-단백질 상호작용들을 검출하는 효모-기초 유전 검정이다. GAL4의 DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인이 함께 발현되어 결합되는 경우 GAL4 단백질이 복원되어 업스트림의 활성화 서열에 결합할 수 있게 되고 이번에는 이 서열이 프로모터를 활성화시키고, 이 프로모터는 lac Z 혹은 HIS3 같은 리포터 유전자의 발현을 제어하는데 이러한 리포트 유전자의 발현은 배양 세포들내에서 용이하게 관찰할 수 있다. 이 시스템에서 단백질들과 상호작용하는 후보(candidate)로서의 유전자들이 별개의 발현 벡터들내로 클로닝된다. 한 발현 벡터에서 한 후보 단백질의 서열은 GAL4 DNA-결합 도메인의 서열을 가진 상태에서 클로닝되어, GAL4 DNA-결합 도메인을 갖는 하이브리드 단백질을 생성하고, 다른 발현벡터에서 제2 후보 단백질의 서열은 GAL4-활성화 도메인을 가진 상태에서 클로닝되어 GAL4 활성화 도메인을 갖는 하이브리드 단백질을 생성한다. 두 하이브리드 벡터들은 업스트림 GAL4 결합 위치의 조절 하에서 lacZ 또는 HIS3 리포터 유전자를 갖는 효모 숙주 균주로 동시-형질전환된다. 두개의 하이브리드 단백질이 발현되고 두 개의 하이브리드 단백질이 서로 상호작용할 수 있는 형질전환된 숙주 세포들(cotransformants)만이 리포터 유전자를 발현할 수 있을 것이다. lacZ 리포터 유전자의 경우에는 lac Z 유전자를 발현하는 숙주 세포는 X-gal이 배양액에 첨가되는 경우 푸른색으로 변할 것이다. 따라서 푸른 콜로니들은 두 클로닝된 후보 단백질들이 서로 작용할 수 있다는 사실을 가리킨다.
이런 이중-하이브리드 시스템을 사용해서 세포내 도메인 FAS-IC을, 벡터 pGBT9(미국의 CLONTECH에 의해 제공되어진, GAL4 DNA-결합 도메인을 수반함, 하기 참조)내로 분리해서 클로닝하면 GAL4 DNA-결합 도메인을 갖는 융합단백질을 생성한다. FAS-R을 pGBT9내로 클로닝할 때는 FAS-R의 전길이 cDNA 서열을 코딩하는 클론[WO 9531544]을 사용해서 표준공정에 의해 다양한 제한효소를 사용하여 세포내 도메인(IC)을 절단하고 표준공정에 의해 세포내 도메인(IC)을 분리하고 다중 클로닝 부위 위치(MCS)안에서 상기 제한효소와 상응하는 적절한 제한효소에 의해 열려 있는 pGBT9으로 IC를 삽입한다. FAS-IC는 완전한 FAS-R 중에 잔기175-319로부터 확장되어 있고, FAS-IC인 잔기175-319를 함유하는 분획을 pGBT9 벡터에 삽입한다는 것에 주의해야 한다.
그리고나서, 상기 하이브리드(키메라) 벡터들은, GAL4 활성화 도메인을 갖으면서 pGAD GH 벡터내로 클론된 사람 HeLa 세포들에서 얻은 cDNA 라이브러리와 함께, HF7c 효모 숙주 균주로 동시-트랜스펙션된다(상기 언급된 모든 벡터, pGBT와 HeLa 세포 cDNA 라이브러리를수반하는 pGAD GH, 및 효모균주는 MATCHMAKER 이중-하이브리드 시스템 #PT1265-1의 일부로서 미국의 Clontech Laboratories, Inc.로부터 구입함). 동시-트랜스펙션된 효모들은 히스티딘이 결여된 배양액(HIS- 배양액)에서의 생장능력으로 선택되었는데 이 때 생장한 콜로니들은 양성 형질전환체들임을 나타낸다. 그리고나서 선택된 효모 클론들이 lacZ 유전자를 발현시킬 수 있는 능력이 있는지 즉, LAC Z 활성이 있는지 시험되는데, 배양 배지에 X-gal을 첨가하면 lacZ 유전자에 의해 코딩된 효소인 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)에 의해 X-gal을 이화시켜 푸른색의 생성물을 형성한다. 따라서 푸른색의 콜로니들이 lacZ 유전자의 활성을 나타낸다. lacZ 유전자의 활성을 위해서, GAL4 전사 활성인자는 형질전환된 클론에서 활성 형태로 존재하여야 한다. 즉 상기 하니브리드 벡터에 의해 코딩된 GAL4 DNA-결합 도메인은 다른 하이브리드 벡터에 의해 코딩된 GAL4 활성화 도메인과 적절히 결합되는 것이 필요하다. 이러한 결합은 GAL4 도메인의 각각에 융합된 두 단백질이 서로 안정적으로 상호작용(결합)할 수 있을 경우에만 가능하다. 따라서, 분리된 His+ 및 푸른색의 (LAC Z+) 콜로니들은, FAS-IC를 코딩하는 벡터 및 FAS-IC에 안정적으로 결합할 수 있는 사람 HeLa 세포 유래의 단백질 생성물을 코딩하는 벡터로 동시에 트랜스펙션된 콜로니들이다.
상기 His+ 및 LAC Z+ 효모 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 상기 플라스미드 DNA를 일반적인 방법에 의해 E. coli 균주 HB101로 전기영동하고, Leu+ 및 엠피실린 저항성 형질전환체의 선택한다. 이러한 형질전환체는 AmpR 및 Leu2의 코딩 서열들을 모두 가지는 하이브리드 pGAD GH 벡터를 수반하는 것이다. 따라서 이러한 형질변형체는 FAS-IC에 결합할 수 있는 새로이 동정된 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 클론들이다. 그리고 나서 플라스미드 DNA를 상기 형질전환된 E. coli로부터 분리하고 다음과 같이 재분석한다:
(a) 상기에서 설명된 바와 같이, 상기 플라스미드 DNA를 원래의 FAS-R 세포내 도메인 하이브리드 플라스미드(FAS-IC를 수반하는 하이브리드 pGTB9)로 효모 균주 HF7내로 재형질전환시킨다. 대조군들로는 무관한 단백질 코딩 서열들을 갖는 벡터들, 예를들면, pACT-라민 또는 pGBT9만이 FAS-IC-결합단백질(즉, MORT-1)-코딩 플라스미드와 함께 동시형질전환하기 위하여 사용된다. 그리고나서 동시형질전환된 효모는 His- 배지에서만 또는 각각 다른 수준들의 3-아미노트리아졸(3-amonotriazole)로 성장이 시험된다;그리고
(b) 플라스미드 DNA와 원래의 FAS-IC의 하이브리드 플라스미드 및 (a)에서 설명한 대조군 플라스미드를 균주 SFY526인 효모 숙주 세포내로 재형질전환시키고 LAC Z+ 활성(β-gal 형성의 효율성 즉, 푸른색 형성)을 결정한다.
상기 실험 결과, 콜로니들의 색에 의해 검정되듯이, His- 배지에서 콜로니들의 성장 패턴은 LAC Z 활성의 패턴과 동일함이 나타난다. 즉 His+ 콜로니 또한 LAC Z+ 이다. 더욱이, GAL4 전사 활성인자를 사용하여 HF-7 효모 숙주 세포보다 더 좋은 LAC Z 유도가능성을 갖는 SFY526 효모 숙주들안으로 GAL4 DNA-결합 도메인 및 활성화-도메인 하이브리드체들을 트랜스펙션시킨 후에 액체 배지(바람직한 배지 조건)에서의 LAC Z 활성을 검정한다.
상기 공정을 이용해서 "수용체-유도성 독성의 매개자" 로 MORT-1로 명명되는 단백질이 동정, 분리 및 특성파악된다.
더욱이, 상기의 많은 2개의-하이브리드-β-갈락토시다아제 발현 시험에 있어서 β-갈락토시다아제 발현은 바람직한 필터 분석으로도 검정된다는 것이 또한 언급되어야 한다. 상기 스크리닝에서 약3x106 cDNA중 5개가 삽입된 MORT-1을 포함하고 있다고 밝혀졌다. 이렇게 분리된 클론된 MORT-1 cDNA 삽입체는 표준 DNA 서열화 방법으로 서열분석 된다. MORT-1의 아미노산 서열(서열번호: 2)은 상기 DNA서열로부터 유추된다. 상기 cDNA 삽입체에의해 코딩되어지는 상기 단백질들에서 잔기들의 숫자매기기는 Swiss-Prot 데이터 은행에서와 같다. 결실 돌연변이체들은 PCR에 의해서 제공되고 점돌연변이체는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발에의해서 제공된다(Current Protocols in Molec. Biol., 1994).
<(ⅱ) 단백질의 유도성 발현, 대사적으로 표지 및 면역침강반응>
FLAG 옥토펩티드(octopeptide)에 N-링크된 MORT-1(FLAG-MORT-1; Eastman Kodak, New Haven, Ct., USA), FAS-IC, FAS-R, p55-R, FAS-R의 막간과 세포내 도메인(아미노산 153-319)에 융합된 p55-R의 세포외 도메인(아미노산 1-168)을 포함하는 키메라, 및 대조군으로써의 역할을 하는 루시퍼라아제 cDNA가 HeLa 세포들에서 발현된다. 발현은, 테트라사이클린에 의해 네어되는 트란스엑티베이터(transactivator)를 발현하는 HeLa 세포 클론(HtTA-1)에서 테트라사이클린에 의해 조절되는 발현벡터를 사용하여 수행된다[Gossen and Bujard, 1992; Boldin et al., 1995 참조]. 트랜스펙션하고 18시간 후에, [35S]메티오닌 및 [35S]시스테인으로 대사적으로 표지하고[DUPONT, Wilmington, De., USA and Amersham, Buckinghamshire, England] 메티오닌과 시스테인은 없으나 2% 투석된 태아 송아지 혈청으로 보충된 'Dulbecco'의 수정된 독수리 배양에서 37℃에서 4시간동안 항온배양한다. 그리고 나서 상기 세포들을 RIPA 완충용액(10 mM 트리스-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 0.1% SDS 및 1mM EDTA)에 용해하고 상기 용해액을 무관한 토끼 항혈청(3㎕/㎖) 및 단백질 G 세파로스 비드(Pharmacia, Uppsala, Sweden; 60㎕/㎖)로 항온배양하므로써 용해액이 미리 제거된다. FLAG 옥토펩티드(M2; Eastman Kodak), p55-R(#18과 #20;[Engelmann et al., 1990]) 또는 FAS-R(ZB4;Kamiya Southand Oaks, Ca., USA)에 대한 마우스 모노클로날 항체들(5㎕/분취량)와 함께 또는 대조군으로 마우스 항체들에 필적하는 아이소타이프으로 용해액 0.3㎖ 분취량을 4℃에서 1시간동안 항온배양하고 단백질 G 세파로스 비드들(30㎕/분취량)로 1시간 더 항온배양하는 방식으로 해서 면역침강반응을 수행한다.
<(ⅲ)생체외 결합>
야생형 FAS-IC 또는 돌연변이 FAS-IC와 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)를 융합시키고 글루타티온-아가로즈 비드들에 흡착시킨다[참조: Boldin et al., 1995; Current protocols in molecular biology, 1994; Frangioni and Neel, 1993]. 대사적으로-표지된 FLAG-MORT-1 융합 단백질이 GST-FAS-IC에의 결합하는 것은 대사적으로 [35S]메티오닌(60μCi)로 표지되고 FLAG-MORT-1을 발현하는 HeLa 세포의 추출물로 4℃에서 2시간동안 상기 비드를 항온배양함에 의해 검정된다. 상기 추출물들은 50mM 트리스-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.1% NP-40, 1mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 20㎍/ml 아프로토닌(aprotonin), 20㎍/ml 레우펩틴(Leupeptin), 10mM 소디움 플루오라이드 및 0.1mM 소디움 바나데이트(1ml/5×105세포)를 함유하는 완충용액내에서 제조된다.
<(ⅳ)MORT-1의 유도된 발현에 의해 촉발된 세포독성도의 검정>
MORT-1, Fas-IC, p55-IC 및 루시퍼라제 cDNA를 테트라사이클린-제어된 발현 벡터내로 삽입하고 SV40 프로모터[참조: pSBC-2 벡터(Dirks et al, 1993)]의 제어하에 있는, 분비된 췌장 알칼리 포스파타제 cDNA와 함께 HtTA-1 세포들(HeLa 세포주)[참조: Gossen and Bujard, 1992]로 트랜스펙션시킨다. 세포 사멸은 트랜스펙션후 40시간 후에 뉴트랄-레드-업테이크 분석(neutral-red uptake assay)[Wallach, 1984참조]으로 검정되거나, 트랜스펙션된 cDNA을 발현하는 상기 세포의 사멸을 특이적으로 검정하기 위해서는 항온배양의 마지막 5시간에서 성장배지로 분비된 췌장 알칼리 포스파타제의 양을 결정[Berger et al., 1988참조]함에 의하여 검정된다.
FAS-IC에 결합하는데 관여하는 MORT-1 단백질 영역을 분석하기 위한 또다른 실험에서는 테트라사이클린-조절된 발현 벡터(pUHD10-3)를 사용하여 테트라사이클린-제어된 트란스액티베이터(HtTA-1)을 함유하는 HeLa 세포들에서 다음과 같은 단백질들이 일시적으로 발현된다: 사람 FAS-R 단독; 사람 FAS-R과 MORT-1의 N-말단부위(아미노산1-117, "MORT-1 머리" ); 사람 FAS-R과 '사멸 도메인' 상동성 영역(아미노산130-245, "MORT-1 DD", IL 112742 참조)을 함유하는 MORT-1의 C-말단부위; FLAG-55.11 (FLAG 옥타펩타이드의 N-말단에 융합되고 p-55-IC-특이적 결합 단백질인, 단백질 55.11의 아미노산 309-990, IL 109632 참조). 트랜스펙션하고 12시간후에 상기 세포를 트립신으로 처리하고 농도 30,000 세포/well에서 재-접종한다. 24시간 더 항온배양한 후, 10 g/ml 사이클로핵사미드존재하에서, FAS-R의 세포외 도메인에 대한 모노클로날 항체(monoclonal antibody CH-11, Oncor)의 다양한 농도에서(0.001-10 ㎍/ml 모노클로날 항체) 상기세포를 6시간동안 처리한다. 그리고 나서 뉴트랄-레드 업테이크 분석으로 세포생존능력을 결정하고, 그 결과는 사이클로헥사미드 단독으로(항-FAS-R 모노클로날 항체 CH-11 부존재) 항온배양한 세포에 비교된 생존가능한 세포 %로 나타난다.
<(ⅴ) 노던(Northern)분석 및 서열 분석>
폴리 A+ RNA는 HeLa 세포의 총 RNA(Oligotex-dT mRNA kit. QIAGEN, Hilden, Germany)로부터 분리된다. MORT-1 cDNA를 프로브로 사용한 노던분석은 일반적인 방법[Boldin et al., 1995 참조]으로 수행한다. 다이디옥시 체인 종결 방법에 의해 MORT-1의 뉴클리오티드 서열을 양방향으로 결정한다.
이중-하이브리드 공정에 의해 클로닝된 MORT-1 cDNA의 서열분석은 MORT-1 cDNA가 신규한 단백질을 코딩한다는 것을 나타낸다. FAS-IC에 대한 MORT-1("수용체-유도된 독성의 매개자")의 결합 특이성을 더 검정하기위해서 및 MORT-1이 결합하는 FAS-R의 특정 영역은 규명하기 위해서 수행된 이중-하이브리드 시험에 의하여 다음과 같은 사실을 이끌어 낸다(도1):(a) MORT-1 단백질은 사람 FAS-IC와 마우스 FAS-IC 양자에 결합하나 TNF/NGF 수용체 패밀리의 세 개의 수용체들을 포함한, 몇개의 다른 실험용 단백질에는 결합하지 않는다;(b) 생체외 및 생체내 양자에서의 신호전달을 못하는, FAS-R의 '사멸 도메인' 의 위치 225 (Ile)에서의 치환 돌연변이(lprcg 돌연변이)[Watanabe-Fukunaga et al., 1992; Itoh and Nagata, 1993 참조]는 또한 MORT-1이 FAS-IC에 결합하는 것을 방해한다; (c) FAS-R에 있는 MORT-1 결합-위치는 FAS-R의 '사멸도메인' 안에 있다; (d) MORT-1은 자기자신에도 결합한다. 이러한 자가-결합 및 FAS-R에 대한 MORT-1의 결합은 상기 단백질(MORT-1)의 다른 영역이 관여한다: 잔기 1-117에 대응하는 MORT-1 단편은 전길이 MORT-1에 결합하나 단편자체 또는 상기 FAS-IC 에는 결합하지 않는다. 반대로 잔기 130-245에 해당하는 MORT-1단편은 FAS-R에 결합하나 MORT-1에는 결합하지 않는다(도1). 더욱이 p55-R 의 '사멸 도메인' 영역이 p55-IC의 자가-결합에 결정적인 것과 같이, FAS-R의 '사멸 도메인' 영역이 FAS-IC의 자가-결합에 결정적이다라는 결과가 도1로부터 명백하다. 이러한 '사멸 도메인' 의 양쪽 끝에서의 결실은 이의 자가-결합 능력에는 영향을 주지 않으나, 반면 이 '사멸 도메인' 안에서의 결실은 상기 자가-결합 능력에 영향을 미친다. MORT-1의 경우에는 FAS-IC에 대한 MORT-1의 결합은 또한 FAS-R의 전길이 '사멸 도메인' 에 좌우되는 반면, FAS-IC 결합에는 FAS-R '사멸도메인' 의 바깥 영역에는 좌우되지 않는다.
상기 도1에는 β-갈락토시다제 발현 필터 분석에 의해 검정되는 바와 같이 트랜스펙션된 SFY526 효모안에 있는 Gal4 DNA 결합 도메인 및 활성화-도메인(pGBT9 및 pGAD-GH) 구조물에 의해 코딩되는 단백질들의 상호작용이 도시되어 있다. DNA-결합-도메인 구조물들은 4개의 사람 FAS-IC 구조물, 위치225에서 Ile를 Leu로 치환하는 돌연변이(I225N) 또는 Leu을 Ile로 치환하는 돌연변이(I225A)을 갖는 두개의 전길이 구조물을 포함하는 4개의 마우스 FAS-IC 구조물, 3개의 MORT-1 구조물들을 포함하는데, 이들 모든 구조물은 도1의 왼쪽 옆에 도시되어 있다. 활성화-도메인 구조물은, MORT-1의 분획이 DNA-결합-도메인 구조물에서와 같은 3개의 MORT-1 구조물; 및 FAS-IC의 분획이 상기 DNA-결합 도메인 구조물에서와 같은 전길이 사람 FAS-IC 구조물을 포함한다. 라민, 사이클린 D 및 '비어있는' Gal4 (pGBT9)벡터뿐만아니라, 사람 p55 TNF 수용체의 세포내 도메인(p55-IC, 잔기 206-426), 사람 CD40의 세포내 도메인(CD40-IC, 잔기 216-277) 및 사람p75 TNF 수용체의 세포내 도메인 (p75-IC, 잔기 287-461)들은 DNA-결합 도메인 구조물의 형태로서 음성 대조군의 역할을 한다. SNF1 와 SNF4 는 DNA-결합-도메인 구조물(SNF1)과 활성-도메인 구조물(SNF4)의 형태로 양성 대조군의 역할을 한다. "비어있는" Gal4벡터(GAD-GH)는 또한 활성 도메인 구조물의 형태로 음성 대조군의 역할을 한다. 부호 "++" 및 "+"는 분석에서 30분 및 90분내에 강한 색깔이 나타난 것을 표시한다; "-"는 24시간내에 색깔이 나타나지 않은 것을 표시한다. 결과가 주어지지 않은 조합들은 시험되지 않은 것이다.
MORT-1의 N-말단에서 FLAG 옥타펩티드와 융합된 MORT-1분자들 (FLAG-MORT-1)의 발현에 의해 HeLa 세포에서 크기가 약 27, 28, 32 및 34 kD인 별도의 4개의 단백질을 수득했다. FLAG-MORT-1 융합단백질로 트랜스펙션된 HeLa 세포들의 추출물로부터의 나온 단백질 및 대조군으로 루시페라제 cDNA로 트랜스펙션된 HeLa 세포들의 추출물로 부터의 단백질에 대한 면역침강반응을 수행함으로써, 생체외에서의 MORT-1과 Fas-IC의 상호작용이 관찰되었다. 상기 면역침강반응은 항-FLAG항체들을 사용하여 수행되었다. MORT-1과 FAS-IC간의 생체외 상호작용도 확인되었는데, 여기서 MORT-1은 트랜스펙션된 HeLa 세포의 추출물로 부터 얻은 [35S]메티오닌-대사적으로-표지된 MORT-1-FLAG 융합단백질의 형태로 있고, FAS-IC는 E.coli에서 생산되고 FAS-IC의 위치225에 치환 돌연변이를 갖는 융합단백질을 포함하는 사람 및 마우스 GST-FAS-IC 융합단백질의 형태로 있다. GST-융합 단백질들은 글루타티온 비드들에 부착시키고 MORT-1-FLAG 융합 단백질을 포함하는 추출물과 상호작용시킨 다음 SDS-PAGE를 수행한다. SDS-PAGE 후 오토래디오그래피하여, 트랜스펙션된 HeLa 세포로 부터 생산되고 FLAG 옥토펩티드와 융합된 [35S]메티오닌-대사적으로-표지된 MORT-1(FLAG-MORT-1)와 GST, 사람 Fas-IC와 GST가 융합된 단백질(GST-huFas-IC), 마우스 Fas-IC와 GST가 융합된 단백질(GST-mFas-IC), 또는 위치225에서 Ile가 Ala로 치환된 돌연변이를 포함하는 Fas-IC와 GST가 융합된 단백질과의 결합을 검정함으로써 생체외 상호작용을 검정한다. 4개의 모든 FLAG-MORT-1 단백질들은 GST-Fas-IC융합 단백질과 함께 항온배양하면 Fas-IC에 결합하는 능력을 보여준다. 효모 이중-하이브리드 시험(도1)에서와 같이, MORT-1은 lprcg 위치(I225A)에서 치환 돌연변이된 GST-Fas-IC 융합 단백질에 결합하지 않는다.
FLAG-MORT-1 cDNA에 의해 코딩되는 단백질은, HeLa 세포들에서 수용체들과 동시-발현되는 경우, FAS-R 키메라의 세포외 도메인이 p55-R(p55-FAS)의 세포외 도메인으로 치환된 FAS-R 키메라의 세포내 도메인에 결합하는 능력을 갖고 있을 뿐만 아니라, FAS-R 의 세포내 도메인에 결합하는 능력도 갖고 있다. MORT-1과 FAS-IC 단백질들을 코딩하는 구조물로 동시-트랜스펙션된 세포에서 MORT-1과 FAS-IC과의 생체내 상포작용과 그 상호작용의 특이성을 증명하는 다양한 트랜스펙션된 HeLa 세포들의 면역침강반응에 의해 관찰되듯이, 이 경우에는 형질전환된 HeLa 세포에서 즉 생체내에서 MORT-1과 FAS-IC간의 상호작용이다. 따라서 FLAG-MORT-1 융합 단백질은 HeLa 세포들내에서 단독으로, 또는 음성대조군으로서, 사람 FAS-R, FAS-R의 세포외 도메인이 사람 p55-R의 해당영역으로 치환된 FAS-R 키메라(p55-FAS), 또는 사람 P55-R과 함께 발현되고 [35S]시스테인(20μCi/ml) 및 [35S]메티오닌(40μCi/ml)으로 대사적으로 표지되었다. 상기 지시된 항체들을 사용하여 동시-발현되는 수용체와 함께 MORT-1의 교차 면역침강반응을 수행한다. HeLa 세포에서 하기 수용체와 동시-발현되는 경우 FLAG-MORT-1은 FAS-R의 세포내 도메인뿐만 아니라 p55-R의 세포외 도메인과 FAS-R의 세포내 도매인을 갖는 FAS-R-p55-R 키메라의 세포내 도메인에도 결합할 수 있다고 결과들이 제시하여주었다. 더욱이, 상기 트랜스펙션된 세포들로부터의 추출물에서나온 FLAG-MORT-1의 면역침강반응에서도 또한 동시-발현된 FAS-R 또는 동시-발현된 FAS-R이 침강되는 결과가 나왔다. 반대로, 이러한 수용체들의 면역침강반응은 FLAG-MORT-1의 동시-침강의 결과를 가져왔다.
MORT-1 cDNA를 프로브로 사용하는 노던 분석에서는 HeLa 세포내의 단일 하이브리드 전사체를 나타낸다. 트란스펙트된 세포로 부터 나온 폴리 A+ RNA(0.3㎍)를 MORT-1 DNA 하이브리드시킨 노던 블럿(Northern blot)에서는, 이 전사체의 크기(약 1.8kB)는 MORT-1 cDNA의 크기(약 1702 뉴클레오티드)와 근사하다고 밝혀졌다.
서열분석에서, 상기 cDNA는 약 250 아미노산의 비정지 해독틀을 갖는다는 것을 알 수 있다. 도 2는 MORT-1의 잠정적인 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)과 이에 상응하는 아미도산 서열(서열번호 2)을 도시한 것이고 여기서 '사멸 도메인' 모티프는 밑줄쳤으며, 이는 가능성 있는 시작 Met 잔기(위치 49; 굵은글자, 밑줄침)와 번역 종결 코돈(위치 769-771인 코돈 아래에 별표함)이다. 이 '사멸 도메인' 은 잘 알려진 p55-R 의 '사멸도메인' 모티프들(p55-DD) 및 FAS-R '사멸도메인' 모티프들(FAS-DD)과 상동성을 공유한다. MORT-1의 정확한 C-말단 끝을 결정하고 MORT-1의 정확한 N-말단 끝(첫 Met잔기)에 관한 증거를 얻기위해 부가적인 실험을 다음과 같이 수행한다:
상기 언급된 방법을 이용하여 MORT-1의 N-말단에서 FLAG 옥타펩티드와 융합된 MORT-1 분자(FLAG-MORT-1)를 코딩하는 많은 구조물을 만들고 35S-시스테인과 35S-메티오닌을 이용하여 대사적으로 표지되도록 HeLa 세포에서 발현시킨다. MORT-1-코딩된 서열중 다른 분획들을 포함하는 다음과 같은 cDNA에 의해 MORT-1-FLAG분자가 코딩된다;
ⅰ) 뉴클레오티드 1-145(도2 참조)가 결실된 MORT-1 cDNA 의 5 ' 끝에 연결된 FLAG 옥타펩티드 cDNA;
ⅱ) MORT-1의 전길이 cDNA 의 5 ' 끝에 연결된 FLAG 옥타펩티드 cDNA;
ⅲ) 뉴클레오티드 1-145와 뉴클레오티드 832-1701(도2 참조)가 결실되고, 위치 142-144에서의 번역시작을 방해하기위해 이 위치의 GCC코돈을 TCC로 돌연변이 시킨, MORT-1 cDNA 의 5 ' 끝에 연결된 FLAG 옥타펩티드 cDNA.
상기 MORT-1-FLAG 융합단백질을 발현시킨 후 항-FLAG 모노클로날 항체(M2) 또는 대조군으로서 항-p75-TNF-R 항체들(#9)을 사용하여 면역침강반응을 수행하고 SDS-PAGE(10% 아크릴아미드)와 오토라디오그래피를 한다. 상기 FLAG-MORT-1 융합단백질들의 분석 결과들은, MORT-1의 C-말단 끝을 확인하였고, 도2에 있는 서열의 위치 49가 MORT-1의 N-말단 끝일 수도 있다는 증거를 제공하였다.
게다가, MORT-1 의 5- 끝에 융합된 FLAG 옥타펩티드가 존재하지 않은 MORT-1의 부가적인 발현 실험은 Met49가 번역 시작의 효과적인 위치의 역할을 한다는 것을 나타내준다.
'유전자 은행' ('Gene Bank')와 '단백질 은행'('Protein Bank') 데이터베이스에서 검색하면 상기 분리된 MORT-1의 서열에 상응하는 서열이 없음을 알 수 있다. 따라서, MORT-1은 신규한 FAS-IC-특이적 결합 단백질임을 알 수 있다.
p55-IC의 높은 발현은 세포사멸 효과의 시작을 초래한다[Boldin et al., 1995]. HeLa 세포에서 Fas-IC의 발현은 또한 비록 낮은 정도이지만 민감한 분석을 사용해야만 검출할 수 있는 그러한 효과를 갖는다. 각각 MORT-1, 사람 p55-IC 및 FAS-IC에 의해 트랜스펙션된 세포에서의 세포사멸 효과의 리간드 비의존적으로 촉발되는지 분석되었다. 테트라사이클린-조절된 발현 벡터를 사용하면 HeLa 세포의 생존력에 대한, MORT-1, 사람 p55-IC, 사람 FAS-IC, 또는 대조군으로써 루시퍼라제의 일시적인 발현 효과가 검정된다. 테트라사이클린(㎍/ml)의 존재 또는 부존재하에서, 분비되는 태반 알칼리 포스파타제를 코딩하는 cDNA와 함께 이러한 cDNA들을 트란펙션하고 난 40분후에 세포 생존력을 측정한다. 뉴트랄 레드 업테이크 분석으로 세포 생존력을 결정하거나 또는 상기 트란스펙트된 DNA를 발현하는 특정 세포의 생존력을 더욱 자세하게 결정하기 위하여 성장 배지에 분비된 태반 알칼리 포스파타제의 양을 측정한다.
상기 분석은, HeLa 세포들에서의 MORT-1 발현이 FAS-IC 발현보다 더 큰 상당한 세표 사멸을 야기한다는 것을 나타낸다. MORT-1, p55-IC, 및 FAS-IC 모두의 이러한 세포독성 효과들은 이들 단백질 모두에 있는 '사멸 도메인' 영역과 관련된 듯이 보이며, 이러한 '사멸 도메인' 은 자가-결합 경향을 갖고 있어 상기 세포독성 효과를 자극시킬 가능성을 갖고 있다.
상기 언급된 MORT-1의 특성면에서 보면, 즉 세포 사멸 유도에 관련이 있는 FAS-R의 특정 영역에 MORT-1 가 특이적인 결합을 하고, 신호전달을 방해하게 되는, 상기 특정 영역의 구조상 작은 변화(lprcg)가 또한 MORT-1의 결합도 못하게 한다는 사실은 MORT-1 단백질이 세포 사멸의 신호전달 또는 시작에서 한 역할을 수행한다는 것을 알려준다. 따라서, MORT-1은 (ⅰ) MORT-1이 MORT-1자신에도 결합할 뿐만 아니라 FAS-R에도 결합할 수 있는 능력에 의해 FAS-R 자가-결합의 조절인자로서의 역할을 하거나 (ⅱ) FAS-R 신호전달에 관여하는 부가적인 단백질을 위한 도킹 위치(docking site)를 제공하는 역할 즉 MORT-1이 '도킹 '단백질이 되고 따라서 FAS-R 외의 다른 수용체들을 결합하고 (ⅲ) FAS-R 신호전달과 상호작용하는 별도의 신호전달계의 일부를 구성할 수도 있다.
FAS-IC에 관여하는 MORT-1의 영역과 FAS-R-매개된 세포 효과(세포 독성)의 조절을 더욱 자세히 분석하기 위해서는, MORT-1의 분획들('MORT-1 머리', 아미노산 10117, 및 'MORT-1 dd', 아미노산 130-245)(각각)을 코딩하는 벡터들을 HeLa 세포의 동시-트랜스펙션에 대한 사람 FAS-R을 코딩하는 벡터로 사용하여 상기-언급된 실험들을 수행할 수 있다. 이러한 실험들에서 다양한 단백질 및 이 단백질들의 조합은 테트라사이클린-조절된 발현 벡터 pUHD10-3안으로 상기 단백질을 코딩하는 서열을 삽입함으로써 테트라사이클린-제어된 트란스엑티베이터를 포함하는 HeLa 세포(HtTA-1)에서 일시적으로 발현된다. 대조군 트랜스펙션으로 FAS-R만 코딩하는 벡터 및 FLAG-55.11 융합 단백질을 코딩하는 벡터[55.11 단백질은 아미노산 309-900을 포함하는 분획이 (그 N-말단에) FLAG옥타펩티드에 융합된 p55-IC-특이적-결합 단백질임]를 사용한다.
트랜스펙션과 항온배양 기간 후 트랜스펙션된 세포를 다양한 농도로 세포에 의해 발현된 FAS-R의 응집을 유도하는 항-FAS-R 모노클로날 항체(CH-11)로 처리한다. 이러한 항-FAS-R 항체의 결합은 세포 표면에서 FAS-R의 응집을 유도하고(FAS-R 리간드와 비슷함) FAS-IC에 의해 매개되는 세포내 신호전달 경로를 유도하여 결국에는 세포사멸(FAS-R-매개된 세포 독성)을 유도한다. 사용되어진 항-FAS-R 모노클로날 항체 (CH-11)의 농도는 0.01-10㎍/ml의 범위안에 있고 바람직하게는 0.005;0.05;0.5 및 5㎍/ml이다. 상기 세포는 10㎍/ml 사이클로헥사미드의 존재하에서 항-FAS 항체로 처리한다.
상기 분석의 결과들은, 트랜스펙션된 세포에서 FAS-R의 발현은 항-FAS-R 항체의 세포사멸 효과에 대한 증가된 민감성을 알린다("fas"와 "55.11"을 비교). 더욱이 '사멸 도메인' 상동성 영역을 함유하는 MORT-1 및 FAS-R에 있는 영역("fas+MORT-1 dd")을 동시-발현시키면, MORT-1 '사멸 도메인'(DD) 영역의 FAS-R '사멸 도메인' (FAS-DD)에의 결합능력으로 부터 예상할 수 있는 FAS-유도된(즉 FAS-R 매개된) 세포사멸을 강력하게 방해한다. 게다가. MORT-1의 N-말단 부위 및 FAS-R("fas+MORT1 he")의 동시-발현은 FAS-R-매개된 세포 사멸을 방해하지 않고 '있다면' 다소 세포독성을 증대한다(즉 약간 증가된 세포사멸).
따라서, 상기 결과들은 FAS-IC에 결합 및 FAS-IC의 세포-독성 활성의 매개에 관한한 MORT-1 단백질이 두 개의 구별된 영역을 갖고 있다는 것을 보여준다.
그러므로 이러한 결과들은 또한 다른 약학적으로 MORT-1 단백질의 다른 부분(즉, 활성 단편 또는 단편)을 이용하는 기초를 제공한다. 예를들면 MORT-1 의 '사멸 도메인' 영역을 포함하는 MORT-1의 C-말단 부분만을 필수적으로 포함하는 MORT-1의 유사체들, 단편들 또는 유도체들은 FAS-R을 포함하는 세포 또는 조직에서의 FAS-R-매개된 세포독성 효과를 방해하는데 사용될 수 있으므로, 예를들면 급성 간염같은 경우 FAS-R 리간드의 파괴적인 효과로 부터 세포 또는 조직을 보호할 수 있을 것이다. 또는 MORT-1의 N-말단 부분을 필수적으로 갖는 MORT-1 단백질의 유사체들, 단편들 또는 유도체들은 FAS-R을 포함하는 세포 또는 조직에서의 FAS-R-매개된 세포독성 효과를 증대하기 위해 사용될 수 있으므로, 예를들면 종양 세포 및 자동-반응성의(autoreative) T 세포 및 B 세포같은 경우 이러한 세포 또는 조직의 파괴를 증대할 수 있을 것이다. 상기 본원에서 설명한 바와 같이 MORT-1의 다른 영역의 이용은 다양한 재조합 바이러스(예 백시니아)를 사용하여 MORT-1 영역-코딩하는 서열을 처리하고자 하는 특정 세포 또는 조직에 삽입시킴으로서 수행한다.
더욱이, 이러한 MORT-1 영역에 의해 매개되는 바람직한 같은 효과를 얻기위해서 상기 언급된 MORT-1 영역에 상응하는 서열 또는 분자구조를 갖는 항체들, 펩티드들 및 유기물질들과 같은 다양한 다른 분자들을 준비하고 이용하는 것이 가능하다.
게다가, MORT-1은 MORT-1에 결합할 수 있는 다른 단백질들(즉, MORT-1-결합 단백질들)을 특이성 있게 동정, 분리 및 특성파악하는데 사용될 수 있다; 제2 실시예 및 제3 실시예 참조하라.
[제2 실시예: MORT-1 결합 단백질의 분리]
<(ⅰ) 이중-하이브리드 스크린 및 이중-하이브리드 β-갈락토시다제 발현 시험>
제1 실시예에서 설명한 공정과 유사한 방법으로, p55 TNF-R의 세포내 도메인(p55-IC)와 MORT-1을 미끼로 사용하여 사람 B-세포 라이브러리를 스크리닝하면, 2개의 cDNA 클론을 수득하게 되는데, 상기 cDNA는 MORT-1과 p55-IC에 결합할 수 있는 단백질 생산물을 코딩하고 있다. 도 3(서열번호 3)에 나타난 바와 같이, 상기 클론 모두는 5 ' 끝에 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
<(ⅱ) 이중 하이브리드 스크린에서 새롭게 클론된 cDNA의 결합 성질>
상기-언급된 효모 이중-하이브리드 공정을 사용할 때, 신규한 MORT-1-결합 단백질 cDNA를 포함하는 구조물을 "먹이" 로 사용하면, 분리된 반응들에서 많은 "미끼" 구조물이 첨가되어, 상기 cDNA에 의해 코딩되는 MORT-1-결합 단백질의 결합특이성을 결정할 수 있다. 상기 "미끼" 는 MORT-1, MORT-1의 분획(MORT '머리', aa1-117, MORT '꼬리', aa 130-245), p55-IC(206-426 p55) 또는 그의 분획('사멸 도메인', 326-426 p55; 및 '사멸 도메인' 의 업스트림에 있는 다른 분획 즉, 206-326)을 코딩하는 구조물을 포함한다. 그 결과들은 표 2에 나타나 있다.
미끼들의 큰 패널에 클론이 결합하는 이중-하이브리드 β-갈라토시다제 발현시험 결과를 통해, 상기 클론에 의해 코딩되는 단백질은 p55 TNF-R 또는 MORT-1 양쪽의 사멸 도메인에 특이적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있다.
일반적으로, MORT-1-결합 단백질은 세포상 MORT-1 관련 효과들을 직접적으로 조절 또는 매개하는데 사용되거나, FAS-R 리간드 효과가 MORT-1에 의해 조절 또는 매개될 때는 세포상의 FAS-R 리간드 효과를 간접적으로 조절 또는 매개하는데 사용될 수 있다. 본원에서 p55 TNF-R에 대해 특별히 설명되어진 것과 마찬가지로 다른 세포내 단백질 또는, 세포막통과 단백질의 세포내 도메인에 대해서도 위와 같은 것이 적용된다.
MORT-1-결합 단백질은 MORT-1전체에 특이적으로 결합하는 것이나 MORT-1 단백질의 다른 영역들(즉 상기 언급된 MORT-1의 N-이나 C-말단 영역)에 결합하는 것들을 포함한다. 상기 영역들에 특이적으로 결합하는 MORT-1-결합 단백질들은, 상기 영역의 활성을 조절하여, 상기 영역들에 의해 결정되는 MORT-1의 특이적 활성을 조절하는데 사용될 수 있다.
[제3 실시예: MACH 단백질, 다른 MORT-1-결합 단백질의 분리 및 특성파악]
<(ⅰ) 이중-하이브리드 스크린, 이중-하이브리드 β갈락토시다제 시험, 서열화 및 서열 분석>
상기 제1 실시예 및 제2 실시예에 설명되어 있는 공정을 사용하여, 사람 MORT-1 단백질을 코딩하는 전길이 구조물은, 신규한 부가적인 MORT-1-결합 단백질을 코딩하는 cDNA을 분리하기 위하여, 효모 이중-하이브리드 시스템에 있어서 "미끼" 로써 사용되었다. 상기 신규한 단백질은 처음에는 MORT-2로 명명되었으나, 본원의 하기에 설명되어 있는 특징들에 의해, 지금은 MACH[MORT-1 연결된 CED3 동족체(MORT-1 associated CED4 homolog)의 약자]로 재명명되고 언급되었다.
상기 cDNA 클론은 제1 실시예 및 제2 실시예에 설명된 것과 같은 표준 공정들에 의해 서열화되었다. 표준 공정들 및 컴퓨터 프로그램들에 의한 서열분석은(제1 실시예 및 제2 실시예 참조), 상기 cDNA가 신규한 서열을 갖으며, 신규한 단백질을 코딩한다는 것을 보여주었다(DNA도 아미노산 서열도 유전자은행 또는 단백질은행 서열 테이타베이스에서 발견되지 않았다). 게다가, MACH를 코딩하는 cDNA은, MORT-1 단백질의 '사멸 도메인' 모티프의 상부(5 '업스트림) 영역에 강한 상동성을 갖는 ORF-B 비정지 해독틀이라고 밝혀졌다[제1 실시예 참조]. 도 4A-C에서는, ORF-B를 함유하는 MACH cDNA 클론의 그러한 부분의 구조(235 aa 잔기들; 도4A); MACH ORF-B의 추론되는 아미노산 서열(서열번호 5)(도4B); 및 MACH cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)(도4C)를 보여주고 있다. 도4A에서 ORF-B의 빗금쳐진 영역은 MORT-1 '사멸 도메인' 모티프의 업스트림에 있는 MORT-1 영역과 큰 상동성을 공유하는 영역이고, 상기 상동성있는 MACH ORF-B 영역은 도4B에서 밑줄쳐진 아미노산 잔기들로 이루어져 있다.
효모 이중-하이브리드 시험은, MORT-1에 대한 MACH 결합의 특이성을 평가하기 위하여, 특히 MACH가 결합하는 MORT-1의 영역을 정의할 뿐만아니라 MORT-1과 상호작용하는 MACH ORFs을 결정하기 위하여 적용되었으며, 상기 공정들은 상기 제1 실시예 및 제2 실시예에 설명되어 있다. 간단히 말하자면, 다양한 MORT-1 및 MACH 구조물들이, 트랜스펙션된 SFY526 효모세포들안에 있는 Gal4 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인 구조물에 의해 코딩되어 있는 단백질들의 상호작용 시험을 위하여 준비되었으며, β-갈락토시다제 발현 필터 분석에 의해 검정되었다. DNA-결합 도메인 구조물들은 pGBT9 벡터들안에 준비되었고, 활성화 도메인 구조물들은 pGAD-GM 벡터들안에 준비되었다. 활성화 도메인으로는, 전길이 MACH cDNA가 사용되었고(MACH), 이는 오직 ORF-B(MACH B) 영역만을 코딩하는 구조물과 같았다. 대조군 활성화 도메인 구조물들은 전길이 MORT-1 코딩 서열을 함유하는 구조물(MORT 1, 양성 대조군) 및 삽입체가 없는 구조물 즉 "비어있는" 벡터들(pGAD-GM)이다. DNA-결합 도메인 구조물들로는, 전길이 MORT-1 cDNA가 사용되며(MORT 1), 이는 오직 MORT-1 업스트림 영역(MORT- 1DD aa130-245)을 코딩하는 구조물들과 같다. MACH 결합 특이성도 또한 결정하도록 제조된, 대조군 DNA-결합 도메인 구조물들은, 라민(라민), 사람 p75 TNF-R의 세포내도메인의 잔기 287-461(사람 p75-IC), 사이클린 D(cycD), SNF1, 사람 p55 TNF-R의 세포내 도메인의 잔기 206-426(사람 p55-IC), 삽입체가 없는 벡터 또는 "비어있는" pGBT9 벡터들(pGBT9, 음성 대조군)을 코딩하는 구조물들 및, MACH의 ORF-B 영역을 코딩하는 구조물을 포함하였다. 분석에서, 색깔발현이 결정되었고, 색깔발현이 클수록 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인에 의해 코딩된 구조물들 사이의 상호작용이 컸다. 색깔발현이 기호로 그려져 있으며, "+++" 및 "+"는 분석에서 각각 30분 및 90분 안의 강한 색깔 발현을 나타낸 것이고, "---"는 분석시 24시간안에 색깔 발현이 없음을 나타낸다. 상호작용들이 시험되지 않은 경우들은 기호로 표시되지 않았다. 상기 경우에 대한 다양한 상호작용들의 결과들이 표3에 설명되어 있으며 MACH 이소폼들의 다양한 상호작용들은 도5에 도시되어 있다.
따라서, 상기 표3에 나타난 결과들로부터 다음과 같은 사실이 명백하다:
(a) MACH는 매우 강하고 특이성 있는 방식으로 MORT-1에 결합한다;
(b) MORT-1에 있는 MACH 결합부위는 MORT-1에 있는 '사멸 도메인' 모티프 전(업스트림)에 있으며, 즉 MORT-1의 aa 1-117에 의해 정의되는 MORT-1의 영역안에 있다;
(c) MACH의 ORF-B 영역은 MACH 단백질의 MORT-1-상호작용 영역이다.
(d) MACH ORF-B 영역은 자가-결합할 수 있다.
<(ⅱ) MACH 단백질의 자가-결합 능력에 의해 매개되는 세포-독성 효과들>
MACH가 자가 결합할 수 있다는, 상세하게는 MACH의 ORF-B 영역이 자가-결합한다는 관찰결과, 및 이전에 p55 TNF-R 및 FAS-R의 세포내 도메인에서 관찰되고 MORT-1에서 관찰된 것(제1 실시예 참조)과 같이 자가-결합과 세포-독성 사이의 관계는, MACH 자가-결합이 또한 세포-독성에도 관여할 수 있다는 것을 제시하였다.
상기 가능성을 시험하기 위하여 MACH를 코딩하는 구조물이 테트라사이클린-제어된 발현 벡터와 함께 준비되었다(자세한 것은 제1 실시예 참조). 이러한 구조물들은 벡터들이 순간적으로 발현되는 HeLa 세포들을 트랜스펙션하는데 사용되었다. MACH 구조물외에도, 다른 대조군 구조물들이 HeLa 세포들의 생존력에 대한 순간적인 발현의 효과를 평가하기 위하여 사용되었으며, 이는 MACH 구조물들의 효과와 비교될 수 있다. 이러한 다른 구조물들은 MORT-1, 사람 FAS-IC 및 루시퍼라제(Luc)를 포함한다. 게다가 HeLa 세포들의 동시-트랜스펙션은 또한 MORT-1 및 MACH 구조물들을 사용함으로써, 이러한 단백질들간의 상호작용이 어떠한 효과를 야기하는지 확인할 수 있다. 트랜스펙션 후 HeLa 세포들이 항온배양되었으며, 발현을 차단하기위한 테트라사이클린(1㎍/㎖)이 있거나 또는 없을 때 트랜스펙션 48시간후에 세포 생존력이 평가되었다.
도6에 결과들을 보여주고 있으며, 동시-트랜스펙션된 세포들(MORT1+MACH)뿐만 아니라, 다른 단백질들을 코딩하는 구조물들로 트랜스펙션된 세포들과 비교하여, MACH로 트랜스펙션된 세포들에 있어서 세포사멸 효과의 리간드-비의존성 촉발을 그래프로 나타낸 것이다. 540㎚에서의 OD 유니트로 각 구조물들에 대한 세포 생존력을 보여 주고 있으며, 빗금친 막대기는 테트라사이클린이 없은 상태에서 트랜스펙션된 세포들을 항온배양한 것을 나타내고, 채워진 막대기는 테트라사이클리이 있는 상태에서 트랜스펙션된 세포들을 항온배양한 것을 나타낸다.
도6에 나타난 결과로부터, MACH는 HeLa 세포들에서 극적인 세포독성 효과를 유도한다는 것이 명백하다. 즉, HeLa 세포들에서 MACH cDNA의 유도된 과다발현은 극적인 세포독성 효과를 초래한다. 이러한 세포독성 효과는 MACH의 자가-걸합 능력과 관련이 있는 것처럼 보인다.
<(ⅲ) 노던 분석>
잘 알려진 공정을 사용하여(제1 실시예 참조), 몇 개의 세포들의 노던 분석이 MACH cDNA를 프로브로하여 수행되어졌다. 상기 분석의 결과들을 통해, 많은 수의 세포주들에 있어서 특히, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Juskat 및 A673 세포주들에 있어서, 크기가 대략 3.2kb인 2개의 하이브라드화된 전사체들이 존재한다는 것을 보여주고 있다.
상기 관점에 있어서, MACH 단백질, 특히 MACHβ1 단백질(MACH의 ORF-B)은 세포들에 대한 MORT-1 관련된 효과들을 직접적으로 조절 또는 매개하도록 사용될 수 있고, MORT-1에 의해 조절 또는 매개되는 경우 FAS-R 리간드 효과를 간접적으로 조절 또는 매개하도록 사용될 수 있다. MACH가 MORT-1의 업스트림 영역에 특이성있게 결합하고 MORT-1와 상동성을 공유한다는 사실은, MACH 또는 MACH ORF-B가 상기 MORT-1의 특이성 영역을 조절하는데 사용되고 따라서 MORT-1의 특이성 있는 활성이 상기 업스트림 영역에 의해 결정될 수 있는 방법을 제공한다. 나아가, MACH 또는 MACH ORF-B는, MACH가 자가-결합하고 그로인해 스스로 세포독성을 유도할 수 있는 능력 때문에 MORT-1 자체와 유사한 방식으로(상기 참조) 세포내 효과들의 조절인자 또는 매개자로써 사용될 수 있다.
나아가, MACH 단백질 및 이를 코딩하는 DNA 서열들의 분석들이 본원 하기에서 설명하는 바와같이 수행되었다. 나아가, MACH의 ORF-B은 많은 수의 MACH 이소폼들중 오직 하나만을 나타낸다. 따라서, MACH 단백질 및 이를 코딩하는 DNA 서열들은 다시 명명되어졌으며 다음부터 명백하게 될 것이다.
(a) MORT-1에 결합하는 단백질들에 대한 이중 하이브리드 스크린은 MORT-1과 서열 모티프를 공유하는 신규한 단백질을 보여준다.
상기 언급한 바와같이, MORT-1에 의한 세포 사멸의 유도에 참가하는 단백질들을 동정하기 위하여, 이중 하이브리드 기법이 MORT-1에 결합하는 단백질들에 대하여 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 사용될 수 있다. MORT-1 cDNA를 미끼로 사용한 사람 B세포 라이브러리의 이중-하이브리드 스크린[Durfee et al., 1993]을 통해, MORT-1자신의 cDNA를 수득할 수 있으며 이는 상기 단백질의 자가-결합할 수 있는 능력을 반영하고, MORT-1이 효과적으로 결합하는 TRADD의 클론들도 수득할 수 있다(제2 실시예 참조). 또한 상기 스크린은 신규한 서열의 cDNA 클론들을 수득하였는데, 그 생산물은 MORT-1에 특이적으로 결합한다. 단백질은 초기에는 MACH로 불리었으나 다중 이소폼들이 있다고 알려진 후(하기 참조)에는 MACHβ1으로 재명명되었으며, 이중 하이브리드 시험에 있어서 제자신에 결합 할 수 있는 능력을 보여주였으나 FAS-R에는 결합할 수 없었다.
도5에는 트랜스펙션된 효모 세포들안에서 MORT-1과 MACH의 상호작용의 결과들을 보여주고 있다. 간단히 말하자면, MORT-1 및 MACHβ1 및 그들의 결실 구조물들뿐만아니라, MACHα1, 촉매성 시스테인 Cys360이 Ser으로 치환된 MACHα1 돌연변이체(MACHα1 (C360S)) 및 사람 FAS-R의 세포내 도메인(Fas-IC)은, 트랜스펙션된 SFY526 효모안에서 Gal4 DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인 구조물들(pGBT9 및 pGAD-GH)의 형식으로 발현되었다. 그들의 상호작용은 Boldin et al.(1995b)에 기재된 것과 같이 β-갈락토시다제 발현 필터 분석에 의해 검정되었다. 강한 색깔의 발현에 필요한 시간 간격들에서 결과들이 나타났다. ND는 분석이 행하여지지 않은 것을 표시한다. 검사된 어떠한 삽입체들도, 사람 p55 TNF 수용체, p75 TNF 및 CD40의 세포내 도메인들, 및 라민, 사이클린 D 및 '비어있는' Gal4벡터들을 포함하여, 시험된 많은 음성 대조군들과 상호작용하지 않았다. HF7c 효모 리포터 계통을 사용하여, MORT-1에 결합하는 단백질에 대한 Gal4 AD-꼬리표 달린 사람 B세포 라이브러리[Durfee et al., 1993]의 이중 하이브리드 스크린을 통해, MACHβ1이 클론되었다. 그렇지 않으면 지적되었을 것을 제외하고, 제시된 연구결과들을 위한 모든 실험적인 공정들은 상기에 기재한 바와 같다[Boldin et al., 1995도 참조]. 결실 분석을 통해 MACHβ1이 MORT-1의 N-말단 부분에 결합하고 이는 세포 사멸 유도에 관여한다는 것이 보여졌다[Chinnaiyan et al. 1995]. MACHβ1은 또한 트랜스펙션된 효모에서 자가-결합하였다. 그러나 그것은 몇 개의 제어 단백질들에는 결합하지 않았으며, MORT-1과는 달리 FAS-R에는 결합할 수 없었다(도5). 포유류 세포들에 있어서 MACHβ1 분자들의 발현을 통해 동시-발현되는 MORT-1 분자들에 결합하는 34kDa의 단백질을 얻었다. 그것은 또한 생체외로 GST-MORT-1 융합 단백질에 결합할 수 있다.
MACHβ1 및 MORT-1에 있는 아미노산 서열들을 비교해 보면, 상기 두 단백질들에 공유하는 서열 모티프("Mort 모듈" 로 명명됨)가 나타나며, 이는 FAS-R에 결합하는 MORT-1의 사멸 모티프(death motif)와는 구별된다. 상기 모티프는 MORT-1에는 1번 나타나고 MACHβ1에는 2번 나타난다. 또한 같은 모티프가 PEA-15(알려지지 않은 기능을 갖는 성상신경교세포 인단백질)에서도 발견되었다. 예비적인 데이터는 MORT 모티프가 MORT-1에 대한 MACHβ1(및 다른 MACH 이소폼들)의 결합에 관여한다고 제시하고 있다.
도 7A는 MACHβ1의 추론된 아미노산 서열(서열번호 5)을 나타내고 있다. 두 개의 MORT 모듈들이 상자로 그려져 있으며, 사용된 두 개의 MACHβ1 결실 돌연변이체들의 C- 말단들은 별표로 표시되어 있다. 도7B는 MACHβ1(도7B에는 MACH로 표시되어 있음), MORT-1 및 FEA-15 유전자 (수납번호 X86809)에 있는 모듈들의 서열 상동성을 보여주고 있다. 동일 및 유사성있는 잔기들은 각각 상자로 그려졌고 그림자 영역으로 표시되었다.
도8은 사멸 도메인 및 MORT 모듈들 및 Fas/APO1, MACHβ1 및 MACHα1에 있는 CED3/ICE 상동성 영역을 도식화한 표현물이다.
상기 'MORT 모듈' 을 포함하는 MORT-1안의 영역이 상기 단백질에 의한 세포 사멸 유도에 참가하다고 밝혀졌다(상기 제1 실시예 참조). 또한 충분하지는 않지만 MORT-1의 자가결합에도 기여한다고 보여지고 있다. 도5에 나타난 바와같이, 트랜스펙션된 효모들에서 MACHβ1의 결실 구조물들의 결합 성질들의 분석을 통해, MACHβ1의 자가-결합뿐만아니라 MORT-1에 대한 결합에 비슷한 MORT 모듈들이 관여한다는 것을 보여주었다: MORT 모듈의 아래(다운스트림)에 있는 영역이 없는 결실 구조물은 서로 결합할 수 없었으나, 전길이 MORT-1 및 전길이 MACHβ1에 결합하는 능력은 유지하였다. 결실된 MORT 모듈 서열의 부분을 더 절단하면 단백질들의 결합 능력이 소실되었다. 이러한 상호작용들에 대한 MORT 모듈들의 관여를 더 분석하기 위하여 FLAG 옥타펩티드와 융합된 MACHβ1의 결실 돌연변이체(FLAG-MACHβ1)가 HeLa 세포들에서 발현되었으며, 박테리아-생산된 글루타티온-S-트란스퍼라제-MORT-1 융합 단백질(GST-MORT-1)와 생체외 결합하는지에 대하여 검정되었다. 도9A-C에 나타난 바와같이, 효모 이중-하이브리드 시험에서 관찰되는 결합과 유사하게, 상기 생체외 결합도 MACHβ1 모듈들안에 있는 영역의 상호작용에 의해 좌우된다고 밝혀졌다. 도9A 및 9B는 MACHβ1 및 그의 결실 돌연변이체들의 MORT-1과의 생체외 상호작용에 대한 결과들(오토라디오그램)을 보여주고 있다. 간단히 말하자면, 35[S] 대사적으로 표지된 MACHβ1, N-말단이 FLAG 옥타펩티드에 융합된 MACHβ1(FLAG-MACHβ1), FLAG-MACHβ1의 C-말단 절단 돌연변이체들 및 대조군으로써 루시퍼라제가, 트랜스펙션된 HeLa세포들에서 생산되었다. 테트라사이클린-제어된 발현벡터를 사용하여, 테트라사이클린-제어된 트란스-활성화인자(transactivator)를 발현하는 HeLa 세포 클론(HtTA-1)에서 발현시켰다.
도9A는 항-FLAG 항체를 사용하여 세포 용해물들로부터 면역침강반응을 함으로써 단백질들의 발현 및 그들의 분자 크기들의 검정을 보여주고 있다. 사용된 항체들은 다음과 같다: GST-MACHβ1 및 GST-MORT1 융합 단백질들에 대하여 토끼 항-MACHβ1 및 항-MORT1 항혈청이 만들어졌다. FLAG 옥타펩티드(M2) 및 FAS/APO1(CH11, Yonehara et al., 1989)에 대한 마우스 모노클로날 항체들은 Eastman Kodak 및 Oncor(Gaithersburg, MD)에서 각각 구입되었다. 마우스 모노클로날 항-HA 에피토프 항체(12CA5, Field et al., 1988) 및 항-TNF 항체는 당업계에 잘 알려진 일상적인 방법에 따라 우리 실험실에서 생산되었다. 도 9B는 글루타티온-아가로스 비드들에 흡착된 GST-MORT-1(또는 대조군으로 GST 또는 Fas-APO1의 세포내 도메인에 융합된-GST)에 대한 단백질들의 친화 결합을 보여주고 있다. 도9C는 다양한 항체들을 사용한 다양한 MORT-1 및 MACH 융합 구조물들의 면연침강반응의 결과들을 보여주고 있다.
(b) MACH는 다중 이소폼들로 나타난다.
MACHβ1 cDNA를 프로브로 사용한 노던 분석은, 몇 개의 세포주들에서 크기가 대략 3kb인 중간 정도 양의 전사체(들)을 보여주었다. 간단히 말하자면, 몇 개의 세포주들로부터 전체 RNA(14㎍/래인) 또는 폴리 A+RNA(2㎍)의 노던 블럿 분석이 MACHβ1 cDNA를 프로브로 사용하여 수행되었다. 검사된 세포주들 T47D, CEM, Raji, Daudi, HeLa, Alexander, Jurkat 및 A673은 모두 사람으로부터 기원된 것이고, 각각 유방의 도관암, 급성 림프모세포 T세포 백혈병, 버키트 림프종, 표피암, 사람 간암, 급성 T세포 백혈병 및 횡문근육종으로부터 유래되었다. 노던 블럿들의 하이브리드화된 밴드가 다소 퍼진 형태로 나타난 것은, 이러한 전사체들이 2.85 및 3.5kb사이의 범위안에서 불균질의 크기를 가지고 있음을 제시하였다. 전사체들의 양 및 크기 모두는 다른 사람 조직들중에서 다양하였고, MORT1의 발현[Chinnaiyan et al., 1995] 또는 FAS/APO1의 발현[Watanabe et al., 1992]과는 관련이 없었다. cDNA 프로브들은 무작위-프라임 장비(radom-prime kit)로 방사선표지되었고[Boehringer Mannheim], 제조자의 지침들에 따라 사람 다중성 조직 블럿들(human multiple tissue blots)의 분석[Clontech]에 적용되었다. 예를들면 고환 및 골결근육에 있어서 비록 이러한 조직들은 상당량의 MORT1를 발현하지만, MACH 전사체들은 거의 검출되지 않았다. 반대로, MORT1 발현이 매우 작은, 휴식하는 말초 혈액 단핵 백혈구에서는 높은 수준으로 MACH를 발현한다고 밝혀졌다. 백혈구들이 렉틴 활성화는 MORT-1의 유도와 함께 MACH 전사체들의 크기패턴에 있어서 현저한 변화를 초래한다.
상기 크기 불균질성의 성질을 조사하기 위하여, MACHβ1 cDNA 프로브와 하이브리드하는 전사체들에 대하여 cDNA 라이브러리를 스크린하였다. MACHα1 및 MACHα2는 사람 흉선의 mRNA로부터 유래된 샤프론 BS cDNA 라이브러리에서 클론되었다. 무작위-프라임 장비[Boehringer Mannheim]를 사용하여 표지된 MACHβ1 cDNA 프로브를 사용하여 스트린젼트 조건하에서 라이브러리를 스크린하였다. 다른 MACH 이소폼들은, Raji(MACHα1, α2, α3, β3, β4 및 β5) 및 Daudi(MACHα2, β2, β3, β4 및 β5) 사람 림프모세포 세포들로부터 전체 RNA를 얻어 RT-PCR에 의해 클론되었다. 역전사효소 반응이, 제조자의 지침들에 따라 사용되어진, 올리고-dT 아댑터 프라이머(5 '-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC(T)17-3':서열번호 26) 및 수퍼스크립트 Ⅱ 역전사효소(SuperScript Ⅱ reverse transcriptase: GIBCO-BRL)와 함께 수행되었다. 첫 회의 PCR이, 확장된 긴 주형 PCR 시스템(Expand Long Template PCR system)[Boehringer Mannheim]과함께, 다음과 같은 센스 및 안티센스 프라이머들을 사용하여 수행되었다: 각각 5'-AAGTGAGCAGATCAGAATTGAG-3'[MACHβ1 cDNA(서열번호 4)의 뉴클레오티드 530-551에 해당함] 및 ' 5-GACTCGAGTCTAGAGTCGAC-3'(서열번호 27). 두 번째 회는 벤트 폴리머라제(Vent polymerase:NEB)와 함께 다음과 같은 센스 및 안티센스 한벌의 프라이머들을 사용하여 수행되었다: 각각 5 ' -GAGGATCCCCAAATGCAAACTGGATGATGAC-3'(서열번호 28) 및 5' -GCCACCAGCTAAAAACATTCTCAA-3' [서열번호 4의 뉴클레오티드 962-939에 해당]. MACHβ3 및 MACHβ4가 개시 코돈들을 가지고 있다는 것을 확인하기 위하여, Raji 세포들의 RNA로부터의 이러한 이소폼들의 5 '서열이 하나 더 클론되었다. RT-PCR 반응은, 상기 언급한 바와 같이 올리고-dT 아댑터 프라이머를 사용하여 수행되고, 다음과 같은 센스 및 안티센스 올리고뉴크레오티드를 사용하여 2회의 PCR(벤트 폴리머라제(NEB)와 함께)을 하였다: 5' -TTGGATCCAGATGGACTTCAGCAGAAATCTT-3'(서열번호 29) 및 MACHβ1에 있는 5'-ATTCTCAAACCCTGCATCCAAGTG-3'(서열번호 4의 뉴클레오티드 946-923에 해당). 나중 뉴클레오티드는 β-이소폼들에 특이적이다. 상기 방법에서 수득된 클론들 중에서, '블록 2' ( 'block 2' )의 아미노산들을 코딩하는 뉴클레오티드들[이들의 존재는 하기 논의하는 바와같이 MACHβ3 및 MACHβ4를 MACHβ1 및 MACHβ2로부터 구별되게한다]을 포함한다고 밝혀진 것들이 완전히 서열화되었다. 클론된 모든 이소폼들에 있는 뉴클레오티드 서열들은 다이디옥시-사슬 종결 방법(dideoxy-chain termination method)에 의해 양쪽 방향에서 결정되었다. MACHβ3 및 MACHβ2의 오직 부분적인 cDNA 클론들만이 얻어졌다. 이러한 스크리닝은 MACH의 다중 이소폼들의 존재를 보여주었다. 이러한 이소폼들 중 8개의 아미노산 서열들이 자세히 연구되었다. 결과들이 도10에 도식적으로 설명되어있고, 3개의 이소폼들의 아미노산 서열들이 알려진 동족체들와 비교되어 도11에 예시되어있다.
도10은 다양한 MACH 이소폼들의 도식화된 표현을 보여주고 있다. 코딩 영역들은 상자로 표시된 범위들로 표시되어 있다. 코딩 영역들안에 있는 다양한 도메인들은 다음과 같이 다른 표시들에 의해 표현되어있다: MORT 모듈들(▒); 이소폼들에서 다른 조합들로 나타나는 세 개의 아미노산 서열 블록들. ICE의 촉매 활성에 연루되어있는 CED3/ICE 상동성 영역에 있는 잔기들의 위치들이 X-선 결정구조에 기초하여 보여지고 있다. 촉매작용의 시스테인 잔기는 또한 별(★)로 표시되어 있다. 다른 이소폼들의 서열들에는 없는 MACHα1 뉴클레오티드 서열의 부분들이 다른 이소폼들의 도해들에 V-모양의 연결선들로 표시되어 있다. 아마도 구별된 엑손들(exons)에 해당하는 이러한 cDNA영역들의 길이들은 MACHα1의 도해의 아래에 표시되어 있다. MACHα1에서 '블록 2' 를 코딩하는 65개의 뉴클레오티드들의 결여는 MACHβ1 및 MACHβ2에 있어서 '블록 3' 을 코딩하는 뉴클레오티드들의 비정지 해독틀의 변형을 야기한다. 그러므로, 그러한 이소폼들에서 이러한 뉴클레오티드들은 그들의 독특한 C-말단 영역을 구성하는 다른 아미노산들을 코딩한다. 이에반하여, MACHβ3 및 MACHβ4에서는 블록3의 해독틀은 유지되나, 3 ' 비-코딩 영역의 부분이 더 다운스트림의 뉴클레오티드들의 해독틀 변형을 야기시킨다. 이러한 변형 때문에 상기 비-코딩 다운스트림 영역의 대부분의 5' 부분은 10개의 아미노산을 코딩하고 이러한 두 개의 이소폼들의 독특한 C-말단 영역을 이룬다(빗금쳐진 것). 도에 표시된 바와같인 MACHα3 및 MACHβ2의 오직 부분적인 cDNA 클론들만이 수득되었다.
이소폼들은, 사람 B세포 cDNA 라이브러리(MACHβ1)로부터, 사람 흉선 cDNA 라이브러리(MACHα1 및 α2)로부터, 그리고 사람 림프모세포성 세포들인 Raji(MACHα1, α2, α3, β3, β4 및 β5) 및 Daudi(MACHα2, β2, β3, β4, 및 β5)의 mRAN로부터 클론되었다. Raji 및 Daudi의 mRNA로부터 클론닝은, 3 '비-코딩 영역에 해당하고 MACHβ1에 있는 두 번째 MORT 모듈안에 있는 서열에 해당하는 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, RT-PCR에 의해 수행되었다. 그러므로 상기 방식에서 분리된 클론들의 개시코돈은 두 번째 MORT 모듈안에 위치한다. MACH이소폼들의 cDNA 서열 및 아미노산 서열들이 아래 표4와 같이 서열목록에 나타나있으며 동정되었다.
다른 이솜폼들에 있는 서열들은 다음과 같이 서로에게 관련되어 있다: (a) 모든 MACH 이소폼들은 MORT모듈들을 공유하나, 이러한 모듈들의 카르복시 말단(3'다운스트림)뿐만아니라 그들의 비-코딩 영역들은 다양하지 않다. (b) 그들의 C 말단 서열들에 기초하여 이소폼들은 2개의 서브그룹으로 분류된다: 서브그룹 β로 정의되는 4개의 이소폼들은 해독틀의 변형으로인해 다른 C-말단을 가진다. 두 개의 MACHβ1 및 β2는, 이중-하이브리드 스크린에서 처음에 클론된 이소폼들에서 발견된 C-말단을 공유하고, 두 개의 MACHβ3 및 β4는 다른 C-말단을 공유한다; 서브그룹 α로 정의된 세 개의 이소폼들은, CED3/ICE 패밀리의 프로테아제들을 매우 닮은, 훨씬 더 긴 C-말단 영역을 갖는다(하기 참조); (c) MORT 모듈 영역 및 서브그룹들을 결정하는 C-말단 영역사이에 펼쳐져 있는 영역들은 이소폼들에서 서로 다양하다. 그러나 세밀한 검사를 통해, 이러한 중간 영역들은, 동일한 세 개의 아미노산 서열 블록들(블록 1, 2, 및 3)의 다른 조합들로 구성되어있다는 것을 보여주었다. 다른 클론들중에서 아미노산 서열의 변화들은 2종류의 뉴클레오티드 서열들의 변화들을 반영하는데, 대부분은 얼터너티브 스플라이싱에 의해 일어나는 것처럼 보인다: (a) Lys184를 코딩하는 뉴클레오티드들의 아래에, 45개의 뉴클레오티드들(nts) 및 65nts 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 양쪽 모두의 삽입 또는 결여; (b) MACHβ1에 있는 3' 비-코딩 부분을 구성하는 영역안에 부가적인 삽입체의 존재. 이러한 변화들은 해독틀 및 단백질의 길이 모두에 영향을 준다.
MACH 이소폼들의 부분은 CED3/ICE 동족체를 포함한다. 데이터 은행 서치를 통해, 블록 3 및 그것의 다운스트림에 있는 서열을 포함한 MACHα 이소폼들의 C 말단 영역은 CED3/ICE 패밀리 프로테아제와 매우 닮았다는 것을 보여주고 있다. 도11은 MACH 및 상기 패밀리의 잘 알려진 다양한 사람 일원들 및 Caenorhabditis elegans ced3 단백질에 있는 상기 영역의 서열 비교를 보여주고 있다. CED3[Ellis and Horvitz, 1986; Yuan et al., 1993], 및 CED3/ICE 프로테아제 패밀리의 알려진 사람 프로테아제들: CPP32[Fernandes-Alnemri et al., 1994](아포파인(apopain)[Nicholson et al., 1995] 및 야마(Yama)[Tewari et al., 1995b]로도 명명됨) Mch2α[Fernandes-Alnemri et al., 1995], Ich-1[Wang et al., 1994; 마우스 Nedd2 단백질의 사람 동족체, Kumar et al., 1994], ICErelⅡ[Munday et al., 1995](TX 및 Ich2[Faucheu et al.,1995; Kamens et al., 1995]로도 명명됨), ICErelⅢ[Munday et al., 1995], 및 ICE[Thornberry et al., 1992; Cerretti et al., 1992]. 도 11은 MACH의 이소폼들 및 CED3/ICE 프로테아제 패밀리로 알려진 일원들의 동시선형적인 아미노산 서열 정렬을 체계적으로 나타낸 것이다. MACHα1, MACHβ1 및 MACHβ3뿐만아니라 Caenorhabditis elegans 프로테아제 CED3 및 CED3/ICE 프로테아제 패밀리의 알려진 사람 프로테아제의 아미노산 서열들을 보여주고 있다. MACH의 상기 C-말단 영역은 CPP32(41% 동일성과 62% 상동성을 가짐) 및 CED3(34% 동일성과 56% 상동성을 가짐)과 매우 닮았다. 그것은 ICE(28% 동일성과 50% 상동성) 및 그와 밀접하게 관련된 동족체들인 ICErelⅡ(TX 및 Ich2로도 명명됨)과 ICErelⅢ와는 상당히 작은 유사성을 보여준다. MACHα이소폼들의, 블록 3안에 있는 Tyr226으로부터 시작하여 C말단까지의 전체 영역에 걸쳐서 유사성이 관찰된다.
유사성중 2가지 점이 특히 주목할 만하다:
(a) CED3/ICE 패밀리의 알려진 모든 프로테아제들은 P1 위치에 있는 Asp 및 P1 '위치의 작은 소수성 아미노산 잔기에 의해 정의되는 부위들에서 단백질들을 절단한다. 그러나 그들의 특이성은 위치 P2-P4에 있는 잔기들의 성질을 포함하여 기질의 다른 구조적 특징들에 따라 다르다. 따라서, 촉매반응에 관여하고(ICE에서 His237, Gly238 및 Cys285해당함) P1 Asp의 카르복실레이트 측쇄에 대한 결합 포켓에 관여하는(Arg179, Gln283, Arg341 및 아마도 Ser347) 활성 부위 잔기들은 이러한 프로테아제들에 보존되어있다. 도11에서 보여주는 바와같이, 이러한 잔기들은(잔기들의 그림자에 의해서 그리고 서열들의 아래에 채워진 그리고 비어있는 원들로 표시되어 있음) 또한 MACHα1에 보존되어 있다. 그러나 하나의 예외가 있다-ICE의 Ser347에 해당하는 부위에서 Ser의 Thr로의 보존적 변화. MACHα 이소폼들 및 단백분해 패밀리의 다른 일원들 사이의 약간의 서열 차이는, (어쩌면 중요할 지도 모르는데) ICE의 Arg286에 해당하는 잔기의 Arg에서 Gln로의 치환이다. 이러한 잔기는 추정되는 촉매작용의 시스테인 잔기에 인접해 있는데, 다른 모든 CED3/ICE 패밀리 일원들에서 완전히 보존되어 있다. 또한 기질에 가까이 위치한 부위들에 있는 일부의 잔기들 P2-P4 잔개들은(도 11에 있는 서열들 아래에 세모로 표시되어 있음) MACHα이소폼들에 있어서 다른 CED3/ICE 패밀리 일원들에서 발견된 것들과 다르다.
(b) CED3/ICE 패밀리의 프로테아제들은 자가절단의 부위들을 갖고 있다. 게다가, 몇 개의 프로테아제들은 자가-공정되고, 최대 촉매 활성을 나타내기위해서는 상기 공정에 좌우된다고 알려져 있다. 그들의 완전한 생물활성 형태는, 크기가 다른 두 개의 비-공유결합으로-연결된 절단 생성물들(도11에서 화살표들로 표시되어 있는 것과 같이, ICE에서는 p20 및 p17; CPP32에서는 p17 및 p12)로 구성되어있다. 패밀리의 다른 일원들에 있는 가능성 있는 자가절단 부위들의 존재는, 그들이 비슷하게 공정되며 그리고 비슷하게 최대한의 활성을 나타내기 위해서는 이러한 공정에 의해 좌우된다는 것을 제시한다. 상기 가능성 있는 자가절단 부위들은 MACHα1안에 있으며 거의 CPP32에서와 같은 동일한 위치에 있다(도11에 있는 그림자진 상자들을 참조). CPP32의 p17 서브유니트의 N-말단에 해당하는 부위는 두 번째 보존된 아미노산 블록에 위치하며, CED3/ICE-상동성 영역의 N-말단의 업스트림에 있는 단지 몇 개의 아미노산들이다(하기 Asp216). CPP32의 두 개의 서브유니트들 사이에 있는 절단위치에 해당하는 부위는, 절단된다고 알려져 있는 CED3/ICE 패밀리의 다른 모든 일원들에서와 같게, 촉매반응의 시스테인 잔기의 다운스트림에 있는 몇 개의 아미노산들(하기 Asp374)에 위치한다. 이러한 보존을 통해, MACHα1안에 있는 CED3/ICE 상동성 영역이 단백분해 공정을 받는다는 것이 제시된다. 이러한 절단에 의한 2개의 예상되는 생산물들의 크기는, 공정된 CPP32 분자의 두 개의 서브유니트들의 크기와 매우 비슷하다.
(c) MACH안에 있는 CED3/ICE 상동성 영역은 단백질 분해 활성을 갖고 있다.
MACHα안에 있는 CED3/ICE 상동성 영역이 단백질 분해 활성을 갖고있는지 알아내기 위하여, 출원인들은 박테리아에 있는 단백질의 상기 영역의 업스트림에 있는 가능성있는 절단 부위(Asp216과 Ser217사이)로부터 C 말단까지 확장된 영역을, GST 융합 단백질로써 발현시켰다. 이전 다른 CED3/ICE 동족체들에 의해 절단된다고 보여진 것처럼, 박테리아 용해물들은 형광발색 펩티드 기질들을 절단하는 능력에 대하여 검사되어졌다. 두 개의 펩티드 기질들이 사용되었다: 첫 번째, 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-메틸-쿠마릴-7-아미드) (AC-DEVD-AMC)는, FAS-R 자극후 즉시[Tewari et al., 1995b] 그리고 다른 아폽토시스 과정들에서[Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993; Lazebnik et al., 1994] 세포들안에서 절단된다고 밝혀진 핵단백질인 폴리(ADP-라이보스)폴리머라제(PARP)에 있는 서열에 해당한다. 이 형광발색 기질은 CPP32에 의해 효과적으로 절단된다. 두 번째 형광발생 기질, 아세틸-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC(Ac-YVAD-AMC)는, IL-1β 전구체에 있는 ICE에 대한 기질 부위에 해당한다. 이 형광발색 기질은 ICE에 의해 절단된다. 도12A-F 및 도13A-B에서 보여주는 바와같이, MACHα1안에 있는 CED3/ICE 상동성 영역을 발현하는 박테리아의 용해물들은 PARP 서열-유도된 형광발색 기질을 효과적으로 절단하였다. 그러나 IL-1β-전구체에 있는 ICE 절단부위[Thornberry et al., 1992]인 Ac-YVAD-AMC 즉 IL-1β-전구체 서열-유도된 형광발색 기질(대조군)에 대하여는 단백질 분해 활성이 측정되지 않았다. 단백질 분해 활성은 요오도아세테이트산(5mM)에 의해 차단되었는데 이는 그것이 티올 프로테아제에 의해 매개된다는 것을 확인시켜준다. 촉매반응의 시스테인 잔기 Cys360이 Ser으로 치환된 GST-융합된 MACH CED3/ICE-상동성 영역을 함유하는 용해물들에서는 어떠한 절단도 관찰되지 않았다. GST-융합 단백질과 같이, 전길이 MACHα1 단백질을 발현한 박테리아의 용해물들은 Ac-DEVD-AMC를 절단하지 않았다. 아마도 박테리아 효소들이 전길이 분자를 공정할 수 없기 때문인 것같다. CED3/ICE 상동성 영역의 두 개의 가능성있는 절단 생산물들 중 어느 하나를 함유하는 용해물들에서도 어떠한 절단도 일어나지 않았다.
도12A-F 및 13A는 MACHα1에 있는 CED3/ICE 상동성 영역[단백질의 Ser217부터 C-말단까지]의 GST-융합 단백질을 발현하는 E. coli의 추출물들에 의한, PARP-서열-유래된 형광발색 기질인 Ac-DEVD-AMC(50μM)의 절단 반응속도론이다. 이는 전체-길이 MACHα1의 GST-융합 생산물들 또는 CED3/ICE 상동성 영역의 두 개의 가능성있는 단백분해 생산물들[Ser217부터 Asp3373까지 및 Asp479부터 단백질의 C-말단까지] 중 어느하나를 발현하는 박테리아의 추출물들에서는 절단이 결여된 것과 비교되어 있다.
또한, GST와 융합된 MACHα1 CED3/ICE 상동성 영역을 발현하는 E. coli의 추출물들과 함께 180분동안 기질이 항온배양된, Ac-DEVD-AMD의 절단의 기질-농도 의존성을 보여주고 있다(도13B). 요오드아세트산(5mM)존재하에서 어떠한 절단도 관찰되지 않았다. 추출물은 Ac-YVAD-AMC, 즉 IL-1β 전구체에 있는 ICE 절단 부위에 해당하는 형광발색 기질에 활성을 갖지 않았다.
간단해 말하자면, GST-융합 단백질들은 pGEX3 발현 벡터을 사용하여 XL1-블루 박테리아에서 생산되었다. 박테리아는, 25mM HEPES(pH 7.5), 0.1% 3-[3-콜아미도프로필-다이메틸아미노]-1-프로판설포내이트, 5mM EDTA 및 2mM DDT를 함유하는 완충용액안에서 초음파처리에 의해 용해되고(lysed), 10분동안 16,000Xg에서 원심분리되었다. SDS-PAGE분석을 통해, 용해물들안에 다양한 융합 단백질들이 비슷한 수준으로 존재한다는 것이 확인되었다(나타나있지는 않음). 50㎕ 분취량들의 추출물들(전체 단백질 4㎎/㎖)이, 500㎕ 전체 반응부피 안에서 지시된 농도들의 형광발색 기질들과함께 지시된 기간들동안 상온에서 항온배양되었다. AMC 분비가 380㎚의 여기파장 및 460㎚의 방출파장에서 분광형광계에 의해 측정되었다. AMC의 농도는 표준 커브에 의해 결정되었다. 형광발색 기질 펩티드들 두 개 모두는 펩티트 연구소 Inc.에서 얻었다[Osaka, Japan]. 다른 CED3/ICE 프로테아제는, 오직 단백분해 공정후에만 완전한 할성을 보여주었고, 상기 공정은 자가-절단, 또는 다른 프로테아제들에 의한 절단 중 어느하나를 통해 일어났다[Kumar, 1995; Henkart, 1996 검토]. CED3/ICE 상동성 영역을 발현하는 박테리아의 용해물들에서 관찰되는 활성과 상반되게, GST-MACHα1 분자들을 발현하는 박테리아의 용해물들은 효소활성을 갖지않는다는 출원인들의 관찰결과는 공정이 또한 MACHα 활성에 필요하다는 것을 제시한다. MACHα 공정이 어떤 방식으로 일어나는지, 그리고 어떻게 상기 공정이 FAS-R 또는 p55-R 촉발에의해 일어나는지는 알려져 있지 않다. MORT-1은 세포안에서 다른 몇 개의 단백질들과 함께 활성화된 FAS-R에 결합한다고 보여졌다[Kischkel et al., 1995]. 이러한 단백질들은 MACHα1 및 다른 MACH 이소폼들을 포함하는 것 같다. MACHα와 관련되어 있는 MORT-1의 FAS-R에 대한 결합은 몇 개의 MACH 분자들을 불러모으거나, 그들에 있어서 입체배좌의 변화들을 유도하고, 이러한 변화들은 MACHα의 자가분해 공정을 촉발하거나 다른 프로테아제들에 의해 MACHα가 절단되도록 하는 것같다. p55-R의 자극은, 유사하나, 몇 개의 TRADD 분자들을 불러모으거나 또는 그들에 있어서 입체배좌 변화를 유도시키고 차례로 MORT-1 및 그의 연결된 MACH 분자의 응집의 입체배좌 또는 상태에 있어서 변화를 유도하는 덜 직접적인 방식으로 MACHα의 자가-공정을 촉발할 수 있다.
MACHα의 기질특이성은 다소 '사멸 경향'( 'death oriented' )이 있는 것같다. 비록 MACHα1는, 사멸 기질 PARP에 있는 절단 부위(Ac-DEVD-AMC)에 해당하는 기질 펩티드를 절단할 수 있으나, MACHα는 ICE에 의한 IL-1β 전구체의 공정 부위(Ac-YVAD-AMC)에 해당하는 펩티드에 대하여는 어떠한 단백질 분해 활성도 보여주지 않았다. MACHα에 의해 절단되는 기질들의 역할을 하는 세포성 단백질들을 동정하는 것은, 상기 프로테아제에 의한 사멸 유도에서의 더 다운스트림에 있는 사건들을 설명할 것이다. MACHα절단에 대한 기질들은 CPP32 및 ICE 같은, CED3/ICE 패밀리의 다른 일원일 것같다. 이러한 프로테아제들 중 몇 개는 정말로 FAS-R 또는 TNF 수용체-촉발 후에 공정된다[Miura et al., 1995; Schlegel et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996]. 아마도 CED3/ICE 패밀리에 속하지 않는 프로테아제들도 또한 MACHα에 의해 직접적으로 또는 다른 CED3/ICE 프로테아제들의 활동을 통해 활성화된다. 세포 사멸 과정에 있는 다중 프로테아제들의 참여는, 다양한 프로테아제들의 억제인자들의 알려진 능력과 일치한다. 이러한 억제인자들은, 세린 프로테아제의 억제인자 및 ICE의 절단의 억제인자들뿐만아니라 FAS-R 및 TNF 수용체-유도성 독성으로부터 세포들을 방어하기위한 안티센스 ICE cDNA을 포함한다[Weitzen and Granger, 1980; Ruggiero et al., 1987; Enari et al., 1995; Los et al., 1995].
포스포리파제들, 스핑고마이엘리나제들 및 단백질 키나제들을 포함한, 다양한 다른 효소들은, TNF 수용체들 및 FAS-R에 의한 세포 사멸 유도에 참여할 것이다[Eischen et al., 1994; Vandenabeele et al., 1995; Cifone et al., 1995 및 거기에 있는 참조문헌들을 참조하라]. 이러한 효소들중 몇 개는 MACHα에 의해 개시되는 단백분해 절단에 의해 활성화될 수 있다. 그러나 이러한 다른 사멸-관련된 활성들의 적어도 일부는 MACHα자극과 무관하게 구별되는 신호전달 경로들에 의해 자극될 가능성이 있는 것처럼 보인다. p55-R 및 Fas/APO1와 공유하는 그리고 그들중 오직 하나만에 의해 유도되는, 사멸 유도에서 하나이상의 신호전달 캐스캐이드의 관여는, 두 개의 수용체들에 의해 유도되는 세포 사멸 과정들의 공유하는 특징 및 구별되는 특징 모두와 일치한다[Grell et al., 1994; Schulze-Osthoff et al., 1994; Wong and Goeddel, 1994; Clement and Stamenkovic, 1994].
(d) MACHα1는 MORT1뿐만아니라 MACHβ1에도 결합한다.
MACHα1가 MORT1에 결합할 수 있는지 밝혀내기 위하여 마찬가지로 MACHβ1에도 결합하는지 밝혀내기 위하여, 형질전환된 효모들안에서 단백질들의 상호작용이 먼저 검사되었다. MACHα1은 효모들에 심각한 세포독성 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 효과는, 활성화 도메인(AD) 벡터(발현수준은 DNA 결합 도메인(DBD) 벡터보다 높다)로 상기 단백질을 발현하는 효모들에서 콜로니들의 수득률이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 다른 한편, 촉매반응의 시스테인 잔기, Cys360이 Ser으로 치환된 MACHβ1(MACHα1(C360S))은 포유류 세포들(하기참조) 또는 효모에도 전혀 세포독성을 나타내지 않았다. MACHβ1과 마찬가지로, MACHα1(C360S)는 트랜스펙션된 효모에서 MORT-1에 결합하였으며, 그자신에게도 결합하였다. 그것은 또한 MACHβ1에도 결합하였다. 또한, MORT-1 또는 MACHβ1과 함께 야생형-타입 MACHα1을 발현하는 효모는 트랜스펙션된 단백질들의 상호작용을 나타냈다. 그러나 lacZ-생산물 색깔의 정도는 효모 콜로니들에서 다양하다; AD 벡터 및 DBD 벡터 양쪽의 형태로 MACHα1로 트랜스펙션된 효모에서는 색깔 생산물이 관찰되지 않았는데, 아마도 야생형-타입 MACHα1의 세포독성 효과때문인 것 같다. 이러한 다양화에도 불구하고, MORT1과 조합하여 또는 MACHβ1와 조합하여 MACHα1를 발현하는 효모들은 형질전환된 단백질들의 상호작용에 대하여 양성을 나타내었다. MACHβ1와 달리 MACHα1는 이중 하이브리드 시험에 있어서 자가-상호작용을 나타내지는 않았다(도5).
MACHα1(C360S) 및 MACHβ1 모두는 사람 배아 신장 293-EBNA 세포들의 용해물로부터 MORT-1과 함께 동시-면역침강되었는데, 이는 그들이 포유류 세포들에서도 또한 MORT-1에 결합한다는 것을 나타내는 것이다. 포유류 세포들안에서도 MACHα1이 MORT-1에 결합할 수 있는지 더 시험하기 위하여, FLAG 옥타펩티드에 융합된 MACHα1 또는 MACHβ1이 HA 에피토프-꼬리를 가진 MORT1 분자들과 함께 발현되었다. FLAG 옥타펩티드에 N-말단이 융합된 35[S]대사적으로 표지된 MACHα1 및 MACHβ1(FLAG-MACHα1), 및 HA 에피토프에 N 말단이 융합된 MORT1[Field et al., 1988]이 HeLa 세포들에서 발현되었다. 대조군으로써 FLAG 옥타펩티드(M2;Eastman Kodak), HA 에피토프(12CA5, Fiolk et al., 1988) 또는 p75-R TNF 수용체(#9, Bigda et al., 1994)에 대한 마우스 모노클로날 항체들을 사용하여, 세포들의 용해물들로부터 단백질들의 면역침강이 수행되었다. 단백질들은 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(12% 아크릴아미드)과 오토레이디오그래피에 의해 분석되었다. MACHα1 및 MACHβ1 모두는 세포들의 용해물로부터 MORT1과 면역침강되는데, 이는 그들이 MORT1에 결합하는 것을 알려준다. MORT1과 MACHα1의 상호작용의 효율성은 MACHβ1보다 낮은 것으로 나타났다.
(e) CED3/ICE 상동성 영역을 함유하는 MACH 분자들은 세포 사멸을 매개할 수 있다:
세포-사멸 유도에 MACH의 관여를 알아내기 위해, 세포 생존력에 대한 다양한 MACH 이소폼들의 과도발현의 효과가 검사되었다. 시험은, 트랜스펙션 표지로써 β-갈락토시다제 발현벡터와 함께 MACH 발현 벡터들을 사람 배아 신장 293-EBNA 세포들 및 유방암 MCF7 세포들안으로 트랜스펙션함으로써 수행되었다.
간단히 말하자면, 293-EBNA 세포들 MCF7 사람 유방암 세포들 및 HeLa HtTA-1 세포들은, 10% 태아 송아지 혈청, 비필수 아미노산들, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 추가된 둘베코의 수정된 이글 최소 필수 배지(Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium)에서 배양되었다. 세포 조직 배양 접시들(6-㎝접시들 안에 있는 5x105 293-EBNA 세포들, 3x105 MCF7 세포들 또는 3x105 HeLa 세포들)은, β-갈락토시다제 발현벡터와 함께 지시된 단백질들의 cDNAs으로, 칼슘 인산염 침전 방법을 사용하여, 순간적으로 트랜스펙션되었다. 도14A-D 및 15에 나타난 실험들에 있어서, 각 접시는 3.5㎍의 지시된 MACH 구조물 및 1.5㎍의 pSV-β-gal로 트랜스펙션되었다. 도 16A-D 및 17-19에 나타난 실험들에 있어서, 각 접시는 2.5㎍의 지시된 MACH 또는 MORT1 구조물(또는 대조군으로 비어있는 벡터) 및 1.5㎍의 pSV-β-gal로 트랜스펙션되었다. 세포들이 트랜스펙션되고 6-10시간후에 세척되었다. 293-EBNA 및 MCF7 세포들은 부가적인 처리없이 18시간 더 항온배양되었다. HeLa 세포들은 트랜스펙션된 후 26시간동안 항온배양되었고, 그리고나서 항-Fas.APO1 항체(CH11, 0.5㎍/㎖) 또는 TNF (100ng/㎖)중 어느 하나의 존재하에서 사이클로헥사미드 (10 ㎍/㎖)와 함께 5시간 항온배양되었다. 항온배양기간들 끝에서 세포 사멸의 정도가, Kumar et al., 1994에 기재된 바와같이, β-갈락토시다제 발현 결정에 의해 검정되었다.
MACHα1 또는 MACHα2의 발현 벡터로 트랜스펙션된 배양세포들은, 세포의 둥글고 물집이 생긴 수축 및 결국 세포들이 접시로부터 분리되는 것으로 나타나는, 광범위한 세포 사멸을 보여주었다(도14B). 트랜스펙션후 20시간까지, β-갈락토시타제 염색법(X-gal)에 의해 동정된, 대부분의 트랜스펙션된 세포들은 아폽토시스에 전형적인 밀집된 모폴로지를 보여주었다(도14B). 반대로, 비어있는 벡터를 발현하는 세포들은 살아남았다.
특히, 도14A-D는 표시된 MACH 이소폼들을 순간적으로 발현하는 사람 태아 신장 293-EBNA 세포들의 모폴로지를 보여주고 있다. 화살표(도14B)는 아폽토시스성 세포들을 지적한다. 트랜스펙션되고 26시간 후에 사진을 찍었다. 도15는, 표시된 구조물들로 혐질감염되고 20시간후의 아폽토시스성 모폴로지를 나타내는 β-갈락토시다제-발현 세포들의 분획을 결정함으로써, 293-EBNA(줄무늬 정사각형들) 및 MCF7(검정 정사각형들) 세포들의 MACH-유도성 사멸의 양을 보여주고 있다. 293-EBNA 세포들로한 세 개의 독립적인 실험들 및 MCF7 세포들로한 두 개의 독립적인 실험들에서 데이터가 나왔다. 그들은 계산된 푸른색 세포들 전체 숫자(각 샘플당 약 500세포들)의 분수로써 아폽토시스성 징후를 보이는 푸른색 세포들의 평균 백분율로써 표현된다.
아폽토시스성 효과들에 대한 MACHα안에 있는 CED3/ICE 상동성 영역의 관여를 검사하기 위하여, 세포들은, CED3/ICE 상동성 영역이 결여되어 있는 MACHβ1 이소폼에 대한 발현 벡터뿐만아니라 상기 영역의 N-말단 부분이 결여된 MACHα3에 대한 발현벡터, 및 MACHα1(C360S)에 대한 발현벡터, 및 CED3/ICE 프로테아제 기능에 중요하다고 생각되는 잔기들의 하나(ICE에 있는 Ser347에 해당)를 결여한, C-말단이 절단된 MACHα1 돌연변이체(MACHα1(1-415))에 대한 발현벡터로 트랜스펙션되었다. 어떠한 사멸(비어있는 발현벡터로 트랜스펙션된 세포들에서 관찰되는 경미한 양이상)도, MACHα3, MACHα1(1-415) 또는 MACHα1(C360S)에 대한 발현 벡터들로 트랜스펙션된 293-EBNA 또는 MCF7 세포들에서 나타나지않았다. 게다가, 이러한 벡터들과 함께 MACHα1로 트랜스펙션된 세포들도 또한 세포 사멸을 거의 나타내지 않았으며, 이는 불완전한 CED3/ICE 영역을 함유하는 MACH 분자들은 야생형-타입 분자들의 활성에 대한 음성 우성적인 효과를 갖는다는 것을 제시하고 있다. CED3/ICE 영역을 전혀 함유하지 않는 MACHβ1는 약간의 경미한 세포 사멸을 나타내었다(도15). MACHβ1의 이러한 효과는 아마도 대부분 내재성 MACHα1 분자들의 활성화로부터 기인되는 것 같은데, 상기 효과는 트랜스펙션된 HeLa 세포들에서 더욱 명백한 이유가 된다. 게다가, HeLa 세포들에서 MACHα3, MACHα1(1-415) 및 MACHα1(C360S)은 또한 약간의 세포독성이 있다(도19).
도8은, FAS/APO1(FAS-R) 및 p55-R에 의한 세포사멸 유도에 참여하는 수용체 및 표적 단백질 상호작용들이 도식적으로 나타내고 있다. MACHα활성은, FAS-APO1 및 p55-R의 세포사멸 효과들에 대한 신호전달 캐스캐이드에 있는 거의 업스트림의 효소 단계를 구성하는 것으로 보인다. MORT-1 및 MACHα1 양쪽에 결합하는 MACHβ1의 능력은, 이러한 이소폼이 효소학적으로 활성있는 이소폼들의 활성을 강화한다는 것을 제시한다. 이러한 이소폼으로 트랜스펙션된 293-EBNA 및 MCF7 배양세포들에서 관찰되는 온화한 세포독성 및 HeLa세포들에서 발휘되는 다소 심각한 세포독성 효과는 아마도 트랜스펙션된 MACHβ1 분자들에 결합하고 내재적으로 발현되는 MACHα분자들의 활성화를 반영하는 것 같다. 아마도, 몇 개의 MACH 이소폼들은 Fas/APO1 및 TNF 수용체들의 다른 비-세포독성 효과들에 관여하는 분자들의 도킹 부위들로써 작용할 수 있다.
(f) MACHα 기능의 차단은 Fas/APO1 및 p55-R에 의한 세포사멸 유도를 방해한다.
Fas/APO1(FAS-R) 및 p55-R 세포독성에 대한 MACHα의 기여를 검정하기 위하여, MACHα3뿐만아니라 비기능적인 MACHα1 돌연변이체인 MACHα1(1-415)와 MACHα(C360S)이 이러한 세포독성을 발휘하도록 유도하는 세포들에서 발현되었다. p55-R-유도성 세포독성은, 상기 수용체의 순간적인 과도-발현에 의해 293-EBNA 세포들에서 촉발되었고[Boldin et al., 1995a], Fas/APO1 세포독성은, p55-R의 세포외 도메인과 Fas/APO1의 막통과 및 세포내 도메인들로 이루어진 키메라 분자들의 과도-발현에 의해 촉발되었다. 어떤 이유로, 상기 키메라는 정상적인 Fas/APO1보다 훨씬 더 큰 세포독성 효과를 갖는다. HeLa 세포들에서 세포독성 활성들은 또한 단백질-합성 차단제인 사이클로헥사미드 존재하에서 그들을 TNF 또는 항-Fas/APO1 항체로 처리함으로써 유도되었다. HeLa 세포들은 상기 수용체의 순간적인 발현에 의해 Fas/APO1에 반응성을 갖게 되었다. 검사되는 모든 시스템들에서, MACHα3 및 비기능적인 MACHα1 돌연변이체들은 Fas/APO1 또는 p55-R 촉발에 의해 유도되는 세포독성에 대한 효과적인 방어를 제공하였다(도16-19). 이러한 방어는 또한 전에 알려진 바와같이[Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996], MACH-결합 영역을 결여한 MORT1 N-말단 결실 돌연변이체(MORT1(92-208))로 트랜스펙션된 세포들에서 관찰되었다. 이러한 방어적인 효과들은, MACHα가 세포사멸에 대한 Fas/APO1- 및 p55-R-유도성 신호전달 캐스캐이드들의 필수적인 구성요소이라는 것을 제시하여 준다.
특히, 도16A-D는, Fas/APO1의 막통과 및 세포내 도메인들(아미노산 153-319)에 융합된 p55-R의 세포외 도메인(아미노산 1-168)으로 이루어진 키메라의 순간적인 발현에 의해(도16A 및 16B) 또는 p55-R의 발현에 의해(도16C 및 16D) 세포사멸이 유도되는 293-EBNA 세포들의 모포로지 및 MACHα1(C360S)로 동시적인 트랜스펙션에 의해 이러한 세포독성 효과들로부터 방어된 세포들의 모포로지(도16B 및 16D)를 보여준다. 트랜스펙션되고 26시간 후에 사진을 찍었다. 도17은, 비어있는 벡터, MACH-결합 영역이 결여된 MORT1 결실 돌연변이(MORT1(92-208)), 또는 비기능성 CED3/ICE 영역을 함유하는 MACHα분자들과 함께, p55-Fas 키메라 또는 p55-R로 트랜스펙션함으로써, 293-EBNA 세포들에서 유도된 사멸의 양을 보여주고 있다.
도18은, 항-Fas/APO1 항체(aFas) 및 사이크로헥사미드(CHI)로 처리됨으로써 유도되는 Fas/APO1을 순간적으로 발현하는 HeLa 세포들의 사멸 및 MORT1DD(92-208), MACHα(C360S) 또는 MACHα3의 동시트랜스펙션에 의한 그것의 방어을 보여주고 있다.
도 19는 TNF 및 사이클로헥사미드(CHI)을 적용함으로써 유도되는 HeLa 세포들의 사멸 및 도18에서와 같은 그의 방어를 보여주고 있다. 데이터는 적어도 두 개의 독립적인 실험들로부터 구했으며, 도14A-F 및 15와 같이 나타난다.
MACH는 다른 조직들에서 현저하게 다른 수준으로 그리고 현저하게 다른 이소타입 패턴들로 발현된다. 이러한 차이들은 아마도 Fas/APO1 리간드 및 TNF에 대한 반응의 조직-특이성 특징들에 기인할 것이다. 다른 CED3/ICE 동족체들[Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995]의 경우와 마찬가지로, 불완전한 CED3/ICE 영역들을 함유하는 MACH 이소폼들(예를들면 MACHα3)은 동시발현되는 MACHα1 또는 MACHα2 분자들의 활성화를 억제한다고 밝혀졌다; 그들은 또한 Fas/APO1 및 p55-R에 의한 사멸 유도를 차단하다고 밝혀졌다. 세포들에서 이러한 억제성 이소폼들의 발현은 Fas/APO1- 및 TNF-매개성 세포독성에 대한 세포성 자가-방어의 메카니즘을 구성할 수 있다. MACH 이소폼들의 광범위한 이질성은 CED3/ICE 패밀리의 다른 프로테아제들중 어느 것에서 관찰되는 것보다 훨씬 초과하며, 활성 MACH 이소폼들의 기능을 특별히 정교하게 조율하도록 한다.
본 발명에 대하여 완전히 기재되었으나, 본 발명의 개념 및 범위로부터 벗어나지 않고 과도한 실험을 수행하지 않으면서 본 발명의 분야에 있는 당업자에 의해 같은 것들이 넓은 범위의 균등한 매개변수들, 농도들 및 조건들안에서 수행될 수 있을 것을 포함한다.
본 발명은 실시예와 관련하여 기재되었으나 본 발명은 더 수정될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 적용은, 일반적인 본 발명의 원칙들에 따른 본 발명의 모든 변화들, 용법들 또는 개조들을 포함하고, 본 발명의 기술분야안에서 알려진 통상적 수단안에서 나오며, 청구범위의 범위에서 설명되어진 중요한 특징을 응용한 본 발명의 이탈도 포함한다.
여기에서 언급된 모든 논문들 또는 발췌들, 공개되거나 해당되는 미국 또는 외국 특허 출원들, 등록된 미국 또는 외국 특허들 또는 다른 어떤 참조들은 데이터, 표들, 그림들 및 언급된 참조들에서 제시된 문자에 의하여 여기에서 참조로서 모두 포함된다.
알려진 방법의 단계들, 통상적인 방법들의 단계들, 알려진 방법들 또는 통상적인 방법들에 대하여 언급하는 것이 어떠한 경우에도, 본 발명의 설명 또는 실시예가 관련된 기술분야에서 공개되었다거나, 암시되었다는 것을 인정하는 것은 아니다.
앞서 설명된 본 발명의 실시예들은 본 발명의 일반적인 본질을 완전히 나타내는 것으로서, 본 발명의 분야의 기술(여기에서 언급된 참조들을 포함하여)을 적용하여, 본 발명의 일반적인 개념에 벗어나지 않고, 과도한 실험을 수행하지 않으면서, 그러한 실시예들을 용이하게 적용시키거나 수정할 수 있다. 따라서, 그러한 적용들과 수정들은, 본 발명에 제시된 가르침에 기초한, 개시된 실시예들의 의미 및 그 균등 범위에 있다. 여기에서 본 발명을 설명하기 위하여 사용되는 어구 또는 용어는 제한적이지 않고, 본 명세서의 그러한 용어 또는 어구는, 본 분야에서의 통상적인 지식과 여기에서 제시된 가르침 및 안내를 고려하여 이해된다.

Claims (26)

  1. MACH 이소폼들인 MACHα1(서열번호 7), MACHα2(서열번호 18), MACHα3(서열번호 20), MACHβ1(서열번호 5), MACHβ2(서열번호 22), MACHβ3(서열번호 8) 및 MACHβ4(서열번호 25)로부터 선택된 하나 이상의 MACH 단백질의 이소폼을 코딩하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    각각 서열번호 7, 서열번호 5 및 서열번호 8의 아미노산 서열들을 갖는 MACHα1, MACHβ1 및 MACHβ3로부터 선택된 MACH 이소폼을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 MACHα1을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  4. 제2항에 있어서,
    서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 MACHβ1을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  5. 제2항에 있어서,
    서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 MACHβ3을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  6. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 숙주를 트랜스펙션시키기 위한 전달 또는 발현 벡터로서, 제1항 내지 제5항 중 임의의 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 진핵 숙주 세포에서 발현될 수 있는 벡터
  8. 제6항에 있어서, 원핵 숙주 세포에서 발현될 수 있는 벡터.
  9. 제6항에 따른 벡터를 함유하는 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포들.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 서열에 의해 코딩되는 MORT-1-결합 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 MORT-1-결합 폴리펩티드는,
    MACHα1, MACHα2, MACHα3, MACHβ1, MACHβ2, MACHβ3, MACHβ4 및 MACHβ5로부터 선택된 적어도 하나의 MACH 이소폼을 포함하는 것임을 특징으로 하는 MORT-1-결합 폴리펩티드.
  12. 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 제9항에 따른 형질전환된 숙주세포를 키우는 단계;
    상기 폴리펩티드를 얻기 위하여 필요한 번역-후 변형들을 수행하는 단계; 및
    상기 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 MORT-1-결합 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
  13. 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드에 특이성이 있는 항체들.
  14. FAS-R 또는 p55-R를 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
    상기 FAS-R의 세포내 도메인에 결합할 수 있는 MORT-1에 결합할 수 있거나 또는 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 TRADD에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있고, 그로인해 상기 FAS-R 또는 p55-R의 활성을 조절/매개할 수 있는, 제10항에 따른 하나 이상의 MORT-1-결합 폴리펩티드로 상기 세포들을 처리하는 단계를 포함하되,
    상기 세포들의 상기 처리는, 상기 하나 이상의 폴리펩티드를 세포내 도입에 적합한 형식으로 상기 세포들내로 도입하거나, 또는 상기 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을, 상기 서열이 상기 세포들내에서 발현될 수 있도록 상기 세포들내로 상기 서열을 도입하도록 하는, 상기 서열을 운반하기에 적당한 벡터의 형태로, 상기 세포들내로 도입하는 것을 특징으로 하는 FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포들의 상기 처리는, 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드 또는 상기 MORT-1 결합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 상기 서열을 운반하기에 적합한 벡터의 형태로 상기 세포들내로 도입하는데,
    상기 벡터는, 상기 서열이 상기 세포들내에서 발현될 수 있도록 상기 세포들내로 상기 서열을 도입하도록 하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 세포들의 상기 처리는 상기 세포들을 재조합 동물 바이러스 벡터로 트랜스펙션시키는 것으로 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) FAS-R- 또는 p55-R-수반 세포의 표면에 있는 특정 세포 표면 수용체에 결합 가능한 바이러스 표면 단백질(리간드)를 코딩하는 제1 서열 및 상기 세포에서 발현되는 경우 상기 FAS-R 또는 p55-R의 활성을 조절/매개할 수 있는, 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제2 서열을 운반하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 제작하는 단계; 및
    (b) (a)의 상기 벡터로 상기 세포들을 감염시키는 단계.
  17. FAS-R 또는 p55-R를 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
    상기 세포들을 제13항에 따른 항체들로 처리하는 단계를 포함하되,
    상기 세포들은, 상기 항체들을 함유하는 적절한 조성물로 처리되는 것을 특징으로 하는 FAS-R 또는 p55-R를 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법.
  18. FAS-R 또는 p55-R을 수반하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
    제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 적어도 부분에 대해 상보적인 서열로 구성되는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 상기 세포들을 처리하는 단계를 포함하되,
    상기 올리고뉴클레오티드는 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드의 발현을 차단할 수 있는 것임을 특징으로 하는 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은,
    FAS-R- 또는 p55-R-수반 세포의 표면에 있는 특정 세포 표면 수용체에 결합 가능한 바이러스 표면 단백질(리간드)를 코딩하는 제1 서열 및
    상기 올리고뉴클레오티드의 서열인 제2 서열을 운반하는 재조합 동물바이러스 벡터를 통해 상기 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 종양 세포들 또는 HIV-감염된 세포들을 처리하는 방법에 있어서,
    (a) 특정 종양 세포 표면 수용체 또는 HIV-감염된 세포 표면 수용체 또는 다른 질환 세포에 의해 수반되는 수용체에 결합할 수 있는 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 서열 및
    상기 종양세포, HIV-감염된 세포 또는 다른 질환 세포에서 발현되는 경우 상기 세포를 죽일 수 있는, 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 코딩하는 서열
    을 운반하는 재조합 동물 바이러스 벡터를 구성하는 단계; 및
    (b) (a)의 상기 벡터로 상기 종양세포, HIV-감염된 세포들 또는 다른 질환 세포들을 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양세포, HIV-감염된 세포 또는 다른 질환 세포를 처리하는 방법.
  21. 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법에 있어서,
    제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 코딩하는 세포성 mRNA 서열과 상호작용할 수 있는 라이보자임 서열을 코딩하는 벡터가, 상기 세포들내에서 상기 라이보자임 서열이 발현되도록 하는 형태로 상기 세포들내로 도입되고,
    상기 라이보자임 서열이 상기 세포들내에 발현되었을 때 상기 세포성 mRNA 서열과 상호작용하고 상기 mRNA 서열을 절단하여 상기 세포들내에서 상기 MORT-1-결합 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 방법.
  22. 세포들에 대한 FAS-R 리간드-또는 TNF-효과를 조절하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로서 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 세포들에 대한 FAS-R 리간드-또는 TNF-효과를 조절하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로서, 세포표면수용체에 결합가능한 단백질을 코딩하고 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 세포들에 대한 FAS-R 리간드 또는 TNF 효과를 조절하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 활성 성분으로서 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 서열로 구성된 안티-센스 올리고뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하되, 상기 올리고뉴클레오티드는 제10항에 따른 MORT-1 결합 폴리펩티드의 발현을 차단할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 아폽토시스성 과정들 또는 계획된 세포 사멸 과정들을 조절하는 방법에 있어서,
    상기 과정들이 발생하는 세포들을 제10항에 따른 하나이상의 MORT-1-결합 폴리펩티드로 처리하는 것을 포함하되,
    상기 MORT-1-결합 폴리펩티드는, FAS-R의 세포내 도메인에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있거나 p55-R의 세포내 도메인에 결합하는 TRADD에 결합하는 MORT-1에 결합할 수 있고, 이로인해 상기 FAS-R 또는 p55 TNF-R의 활성을 조절/매개할 수 있으며,
    상기 세포들의 상기 처리는, 상기 세포들안으로 제10항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 그것의 세포내 도입에 적합한 형태로 도입하거나 상기 세포들 안으로 하나이상의 폴리펩티드를 상기 서열을 운반하는 적합한 벡터의 형식으로 도입하는 것을 포함하되,
    상기 벡터는 상기 세포들에서 상기 서열이 발현되는 방식으로 상기 서열을 상기 세포들 안으로 삽입할 수 있는 것임을 특징으로 하는 아폽토시스성 과정들 또는 계획된 세포 사멸 과정들을 조절하는 방법.
  26. 제10항에 따른 MORT-1-결합 폴리펩티드에 특이성이 있는 항체들의 활성 단편들.
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