KR100505152B1 - 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용한 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신경 줄기세포(neural stem cell) 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 에리트로포이에틴을 발현시키는 단계 및 상기 신경 줄기세포 배양액에서 이를 회수하는 단계를 포함하는 에리트로포이에틴의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 아스코르브산을 이용하여 신경 줄기세포에서 생산한 천연형 에리트로포이에틴은 빈혈의 치료와 조혈모세포의 분화에 이용될 수 있다.

Description

아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법{Method for production of erythropoietin using ascorbic acid}

본 발명은 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용한 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신경 줄기세포(neural stem cell) 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 에리트로포이에틴을 발현시키는 단계 및 상기 신경 줄기세포 배양액에서 이를 회수하는 단계를 포함하는 에리트로포이에틴의 생산방법에 관한 것이다.

인간 에리트로포이에틴(erythropoietin; EPO)은 적혈구계의 세포에 특이적인 조혈호르몬으로서, 골수 중의 적아구(erythroblast)계 전구세포의 분화와 증식을 조절하여 적혈구의 생성을 자극하는 순환 당단백 호르몬이다(Carnot et al., Compt. Rend., 1906, 143:384). 인간의 EPO는 165개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 N-결합 당쇄와 1개의 O-결합 당쇄를 포함하고 있고, 전체 당쇄는 이 당단백호르몬 분자량의 40에 해당한다.

인간 EPO는 1906년에 적혈구 조혈(erythropoiesis)을 조절할 수 있는 체액성 인자의 존재 가능성이 보고되면서 처음으로 알려지기 시작하였고, 1957년에 에리트로포이에틴으로 명명된 적혈구 생성을 촉진하는 호르몬이 신장에서 생성된다는 것이 밝혀졌다(Jacobson et al., Nature, 1957, 179:633).

인간 EPO는 재생불량성 빈혈환자의 뇨로부터 대량 분리·정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake et al., J. Biol. Chem., 1977, 252(15):5558), 분자생물학과 당생물학에서 연구가 본격화되기 시작하여, N-말단 30개의 아미노산 서열이 처음으로 보고되었고(Yanagawa et al., J. Biol. Chem., 1984, 295(5):2707), 2년 후에는 인간 뇨 유래 EPO로부터 전체 아미노산 서열을 결정되어 보고되었다(Lai et al., J. Biol. Chem., 1986, 261:3116).

인간 EPO는 적혈구 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서(Goldwasser et al., Ann. NY Acad.Sci., 1968, 149:49) 주로 태아 간이나 성인 신장에서 생산되며, 혈액내 인간 EPO 양은 저산소 혈중 상태에서 증가하여 그 결과로 성숙한 산소전달 적혈구 세포의 생산을 조절한다. 인간은 정상적인 조직의 기능을 위해 적정한 수준의 적혈구 수를 유지하고 있으므로 적혈구 수가 감소하면 조직의 기능 장애가 일어나 빈혈을 일으키게 된다.

인간 EPO는 신부전증의 치료 동안 또는 이로부터 기인한 호르몬의 결핍 또는 생산 감소가 원인인 만성빈혈의 치료에 놀라운 잠재능을 나타냈다(Winearles et al., Lancet, 1986, 22:1175). 특히 말기 신부전증 환자들은 생존을 위해 신장이식이나 정기적인 신장투석이 요구되는데, 만성 신부전증 환자가 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인은 EPO 생성의 결핍임이 이미 입증되었다(Eschbach et al., N. Engl. J. Med., 1989, 321:158). 따라서 인간 EPO는 빈혈, 특히 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용되고 있으며, 이러한 치료제로서 인간 EPO를 대량으로 제조하기 위해서 유전자 재조합 기술과 세포배양 기술을 이용하는 방법은 매우 유용한 수단이 된다.

천연형 인간 EPO는 산성(acid), 단일형(monomer)의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000달톤이다(Wang et al., Endocrinology, 1985, 116:2286). 인간 EPO에서 전체 분자량의 약 40인 당쇄부분은 인간 EPO의 생체내(in vivo) 활성에 필수적인 역할을 하므로, 인간 EPO의 당함량이 감소되면 인간 EPO분자의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 인간 EPO의 생체내 생물학적 활성이 소실된다(Goto et al, Biotechnology, 1988, 6:67). 인간 EPO는 아미노산 Asn24, Asn38 및 Asn83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 갖는 당단백호르몬으로, 인간 EPO에서 당쇄구조의 중요성에 대한 인식은 점차 증가되고 있는데, 유전자 재조합 기술을 이용하여 이질적인 다양한 숙주세포로부터 인간 EPO를 제조하는 경우에는 많은 문제점에 직면하게 된다.

대부분의 경우에 치료제로 사용되는 당단백질에서 당은 당단백질들이 고유의 효능을 나타내는데 필수 불가결한 역할을 하며, 특히 인간 EPO의 경우에 있어서는 당의 역할이 절대적이다. 즉, 당이 없는 경우에는 인간 EPO 활성이 전혀 나타나지 않을 뿐만 아니라 당의 조성이나 말단의 시알산 함량 등에 따라 EPO의 활성과 생체 내에서의 반감기가 좌우된다.

유전자 재조합 기술을 이용한 당단백 호르몬의 발현 및 제조에 있어서, 일반적으로는 숙주세포로 대장균, 효모, 곤충세포 또는 동물세포 등이 사용될 수 있으나, 이들은 각기 자체의 당화능이나 당화체계가 다르기 때문에 특히 인간 EPO와 같이 당이 호르몬의 생체내 활성에 절대적으로 중요한 역할을 하는 당단백 호르몬을 제조하기 위해서는 숙주세포를 선택할 때 당화능이나 당화체계를 가장 우선적으로 고려하여야 한다.

숙주세포 중 대장균은 당화능이 전혀 없고, 효모나 곤충세포의 경우에는 당화능은 있으나 주로 고 만노즈형(high mannose type)의 당단백질을 생성하거나 인간 EPO와 같은 복합형(complex type) 당단백질을 생성시키기에는 당화능이 낮기 때문에 인간 EPO 제조를 위한 숙주세포로는 적절치 못하다.

또한 당화능이나 당화체계를 비교적 잘 갖춘 포유동물세포라 할지라도 세포주의 특성에 따라 당화되는 정도나 형태가 다르기 때문에, 인간 EPO와 같이 치료제로 사용되는 당단백질을 제조할 때는 인체 내에서 항원성 등을 유발시키지 않고 안전하며 높은 생체내 활성을 나타낼 수 있는 당구조를 생성할 수 있는 포유동물 세포주를 숙주세포로 선택하여야 한다.

천연 공급원인 사람의 뇨로부터 정제된 천연형 EPO는 만족스러운 치료 효과를 얻기 위해서 상당한 정제 공정을 거쳐야 하며 많은 양을 얻기 어렵다는 단점이 있으므로, 생명공학 기술에 의해 재조합 EPO를 제조하는 연구들이 제한된 범위 내에서 보고되고 있으며 그 몇가지 예는 다음과 같다.

예를 들어, 대한민국 특허 공고 제92-1379호(대웅제약)의 경우, 고농도 EPO를 생산하는 형질전환체를 확립하기 위해서 고안된 재조합 플라스미드 pDW-MO931로 BHK와 COS(African green monkey kidney) 세포를 형질전환시킨 후, 글리신(glycine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 티미딘(thymidine)이 결여된 변형된 이글 BME (Modified Eagle's BME) 배지에서 세포가 단일층으로 포화되게 배양한 후, 무혈청 배지로 갈아준 다음 7일 동안 배양하여 재조합 EPO를 분리하였다.

다른 예로서 대한민국 특허 공고 제89-1011호 및 제93-5917호(미국 제네틱스 인스티튜트사)의 경우, 재조합 플라스미드pdBPV-MMTneo로 BHK 세포와 COS 세포를 형질전환시켰으며, α-MEM 배지에서 배양한 후 배양 상등액에서 재조합 EPO를 분리였다.

또한, 대한민국 특허 제139168호(제일제당)의 경우, 재조합 플라스미드 pSVEP2neo로 COS-1 세포와 BHK 세포를 형질전환시킨 후 HAT 배지 선택과정을 통해 재조합 EPO 발현 세포주를 얻었고, 이러한 세포주를 배양하여 배양 상등액에서 재조합 EPO를 얻었다. 그러나 상기한 EPO 제조 공정을 이용하여 재조합 인간 EPO를 제조할 때에는 충분한 양의 재조합 인간 EPO를 생산할 수 없다는 문제가 있었다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 그래서 줄기세포를 그 분화 유연성(differential plasticity)에 따라 배아발생과정을 토대로 분류한다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 확립한 배아간세포(embryonic stem(ES) cell)는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력(pluripotent)을 지닌 줄기세포(stem cells)로 볼 수 있다. 그 후 태아 발생과정이 진행되어 태아의 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.

약 10여년 전만 해도 중추신경계(Central Nervous System (CNS))에는 다른 대부분의 조직과는 달리 줄기세포가 존재하지 않는다고 여겨졌으며, 이것이 뇌신경조직이 손상을 받았을 때 스스로 복구되지 않는 원인이라 여겨졌었다. 그러나 근자에 들어와서 성인의 뇌조직에도 줄기세포(뇌신경 줄기세포; CNS stem cell)가 존재하며, 그 줄기세포로부터 신경세포의 형성과정(neurogenesis)이 증명되었다. 현재까지 성인의 뇌신경 줄기세포는 측면 뇌실(lateral ventricle)의 SVZ(subventricular zone) 및 해마(hippocampus)에서만 발견되어 매우 제한된 부위에만 그 존재가 입증되었으며(Doetsch F et al, Cell, 1999, 703-716; Gage FH, Science, 2000, 1433-1438), 또한 이 신경 줄기세포로부터의 신경형성과정도 매우 제한적이어서, 이점이 뇌신경조직이 스스로 재건되지 못하는 원인이라고 생각이 바뀌어 가고 있다.

bFGF(Basic fibroblast growth factor;bFGF, FGF2) 또는 EGF(epidermal growth factor)는 신경 줄기세포를 선택적으로 증식을 유도하는 분열촉진제(mitogen)라는 사실이 알려짐으로써 신경줄기세포를 뇌신경조직에서 분리하고 배양하는 것이 가능하여졌다. 분리된 신경 줄기세포를 bFGF(또는 EGF) 존재 하에 증식시킨 후 이 분열촉진제를 제거하면 신경 줄기세포의 세포주기(cell cycle)가 정지되면서 증식을 멈추고 분화가 유도되기 시작하며, 혈청이나 RA(retinoic acid)를 첨가하면 그 분화가 촉진되기도 한다. 다중잠재성(Multipotent)인 신경 줄기세포는 분화 유도시 뇌신경조직을 구성하는 세포인 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 올리고덴트로사이트(oligodentrocyte)로 분화되어지는데 일반적으로 CNTF(cilliary neurotrophic factor)나 LIF(leukemia inhibitory factor)는 다중잠재성인 신경 줄기세포를 성상세포 쪽으로, PDGF(platelet derived growth factor)는 신경세포 쪽으로, 티로이드 호르몬(tyroid hormone) T3는 올리고덴트로사이트 쪽으로의 분화되도록 한다고 알려져 있다(Johe K et al., Genes Dev., 1996, 10:3129-3140). 그러나 신경 줄기세포는 분리한 부위 및 신경 줄기세포 분리에 사용한 동물의 태아일수에 따라 그 특성에 많은 차이를 보이는데, 예를 들어서 흰쥐 태생 12일에서 분리한 신경 줄기세포를 배양하여 분화 유도 시 주로(약 70-80%) 신경세포로의 분화가 일어나는 반면 태생 14일 이후의 흰쥐태아에서 분리한 신경줄기세포는 주로 성상세포 쪽으로 분화가 일어나는 특성의 차이를 보인다. 그 이외에도 세포가 자라는 양상, 각종 사이토카인에 대한 반응에 많은 차이를 보인다.

신경 줄기세포는 태아 발생 과정 중 태아 중추신경계의 각 세부 조직 어디에나 존재하므로 원하는 태아뇌신경조직을 잘라 내어 그 신경 줄기세포를 분리 배양할 수 있고(embryonic CNS neural stem cell), 성인의 경우에는 측면 뇌실의 SVZ(subventricular zone)이나 해마로부터 신경 줄기세포(adult CNS neural stem cell)를 분리하여 배양할 수 있으며 이와 같은 신경 줄기세포 배양을 이용한 연구는 신경 줄기세포로부터 정상적인 뇌신경계 발생 과정 등을 이해하는데 많은 정보를 제공할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 에리트로포이에틴의 고유한 활성을 나타내는 천연형 에리트로포이에틴을 생산하기 위하여 특정 세포로 분화할 수 있는 신경 줄기세포에서 아스코르브산을 이용하여 에리트로포이에틴을 대량 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아스코르브산을 이용하여 신경 줄기세포 배양액에서 천연형의 에리트로포이에틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경 줄기세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 에리트로포이에틴을 발현시키는 단계 및 상기 신경 줄기세포 배양액에서 이를 회수하는 단계를 포함하는 에리트로포이에틴의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 신경 줄기세포는 태생 12일(embryonic day 12, 이하 'E12'라 약칭한다) 또는 태생 13일이 되는 랫트의 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포를 사용하였다.

본 발명에서 신경 줄기세포 배양액에 첨가되는 아스코르브산의 최종농도가 10 uM 이하에서는 그 효과가 없고 1 mM 이상에서는 세포의 생존율을 떨어뜨리는 세포독성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 상기 신경 줄기세포의 배양액에 첨가되는 아스코르브산의 최종 농도는 통상 50 내지 500 uM을 첨가하는 것이 바람직하고, 100 내지 400 uM을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 신경 줄기세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 에리트로포이에틴이 발현되었는지 확인한 결과, 신경 줄기세포의 증식 및 분화 단계에 아스코르브산을 처리하면 분화단계에서 천연형 에리트로포이에틴이 발현되었다(도 1 및 도 2 참조).

상기의 아스코르브산의 첨가에 의해 신경 줄기세포에서 발현된 에리트로포이에틴을 컬럼 크로마토그래피 단계 및 겔 여과 단계를 거쳐 에리트로포이에틴을 회수하였다. 에리트로포이에틴을 분리, 정제하기 위해, 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포를 분화단계까지 배양 후, 상기 배양액에 황산 암모늄 포화 용액을 첨가하여 얻은 침전물을 투석시키고, 이를 모노-Q 컬럼(Phamacia사)을 이용하여 FPLC에서 염 기울기법에 의해 EPO를 1차로 분리하였다. 1차 분리된 EPO의 시료를 보다 더 정제하기 위해 다시 세파크릴-200 컬럼에 주입하고 이를 세척하여 젤 여과법(Gel filtration)을 수행하여 EPO를 정제하였다.

상기 신경 줄기세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 에리트로포이에틴을 발현시키고 이를 정제하여 얻은 천연형 에리트로포이에틴은 빈혈의 치료와 조혈모세포의 분화에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신경 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명자들은 에리트로포이에틴을 생산하기 위하여 우선 랫트로부터 신경줄기세포를 분리하여 배양하였다.

구체적으로, 임신중인 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트(대한 바이오링크(한국)에서 구입)의 배를 가르고, 가위와 포셋을 이용하여 배아(embryo)를 분리하고 미리 준비해 놓은 해부용 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척한 후 HBSS가 담겨있는 플레이트에 넣어 얼음 위에 놓았다. 태생 12일 내지 태생 15일인 태아 중뇌(ventral mesencephalon)를 잘라내었고, 상기 분리해낸 조직을 CMF-HBSS(Ca²⁺/Mg²⁺-free HBSS)에서 파이펫으로 10-20번 정도 파이펫팅 하여 세포들을 물리적으로 떼어내었다. 상기 해리된 세포들은 폴리오르니틴 피브로넥틴(polyornithine fibronectin)으로 미리 코팅된 12 mm 글래스 커버슬립(coverslips, Carolina Biological Supply Company, Burlington)에 1.27X10⁴ - 1.27X10⁵ 세포/㎠으로 3-5분 동안 놓아 세포가 디쉬 또는 커버슬립에 붙도록 기다렸다. 20 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factors)가 포함된 N2 배지를 첨가하였고 CO2 배양기에서 키워 세포가 증식하여 바닥의 60-80% 정도를 세포가 덮을 때까지(60-80% confluence)로 4-6일간 배양하였다. bFGF는 분화 전까지 매일 넣어주고 배지는 이틀에 한번씩 갈아주었다.

N2 배지 500 ㎖의 조성은 F12/DMEM(Gibco) 6 g, D(+) 글루코스(Sigma) 0.775 g, L-글루타민(Sigma) 0.0365 g, NaHCO₃(Sigma) 0.845 g, 인슐린(Sigma) 0.0125 g, 트랜스퍼린(tranferrin, Sigma) 0.05 g, 1 M 프트레신(Putrescine, Sigma) 50 mcl(최종 100 mcM), 0.5 mM 세레나이트(Selenite, Sigma) 30 mcl(최종 30 nM), 0.1 mM 프로제스테론(Sigma) 100 mcl(최종 20 nM)으로 구성되어 있다.

<실시예 2> 신경 줄기세포에서 에리트로포이에틴의 발현

본 발명자들은 아스코르브산을 이용하여 신경줄기세포에서 에리트로포이에틴을 발현시키기 위하여 신경 줄기세포를 증식하고 분화시켰다.

구체적으로 태생 12일 내지 태생 14일 태아 중뇌를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분리하고, 분리된 신경 줄기세포를 bFGF의 존재 하에서 4-6일 동안 증식을 시켰다. 상기 증식시킨 신경 줄기세포에서 bFGF를 제거하고 6일이 지나면 신경 줄기세포는 분화하는데, 태생 12일 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포인 경우에는 6일 동안의 분화 후에 전체 세포의 5-10%만이 TH+ 세포로 분화하였다. 태생 일수가 증가할수록 TH+ 세포로 분화하는 것은 급격히 감소하였고, 태생 13일인 경우에는 bFGF를 제거하고 6일 동안 분화하면 TH+ 세포는 1% 미만의 아주 적은 양이 생성되었고 태생 15일인 경우에는 거의 생성되지 않았다.

본 발명자들은 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리하여 에리트로포이에틴을 발현시키고자, 태생 12일 또는 태생 13일이 되는 태아 중뇌 신경 줄기세포 배양액에 증식 단계 및 분화 단계에 아스코르브산을 처리하여 아스코르브산을 처리하지 않은 신경 줄기세포와 비교 분석하였다.

구체적으로, 태생 12일 또는 태생 13일이 되는 태아 중뇌 신경 줄기세포 배양의 세포 배양액(N2 배지)에 증식 단계 및 분화 단계에서 아스코르브산을 최종농도가 100-400 uM이 되게 첨가하여 분화를 유도하였다.

상기 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포가 에리트로포이에틴을 발현하였는지 확인하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하였다.

<2-1> RT-PCR

본 발명자들은 아스코르브산을 이용하여 에리트로포이에틴을 생산하는지 확인하기 위하여 에리트로포이에틴의 mRNA 발현양상을 확인하였다.

이를 위해서, 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 증식 단계 또는 분화 단계에서 RNA를 추출하여 EPO 마커 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, RT-PCR 분석을 하기 위하여 아스코르브산을 처리한 신경줄기세포와 처리하지 않은 신경줄기세포의 모든 RNA를 추출하기 위하여 트리졸(Trizol; Life Technologies, Gaithersberg, MD)을 사용하여 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하여 모든 RNA를 분리하였다. 상기 분리한 RNA를 주형으로 역전사효소(Superscript kit, Life Technologies)를 이용하여 cDNA를 합성하였고 이를 주형으로 다시 PCR을 수행하였다. PCR은 수퍼믹스(Supermix, Life Technologies)를 사용하여 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하였고, 마커로는 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 EPO 프라이머를 사용하였다.

그 결과, 증식단계에서 추출한 RNA에서는 EPO가 발현되지 않았고, 아스코르브산을 처리하여 분화단계에서 추출한 RNA에서만 EPO mRNA가 발현되었다(도 1)

<2-2> 웨스턴 블럿

본 발명자들은 아스코르브산을 이용하여 신경 줄기세포에서 에리트로포이에틴 단백질이 발현되는 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리하고, 상기 신경 줄기세포가 분화단계에 이르면 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿을 수행하엿다.

분화 단계 후 세포를 획득하여 그 단백질로부터 웨스턴 블럿을 수행하였다. 분화 후 6cm 배양접시에서 세포를 트립신으로 처리하여 획득하고 (2 X 10⁶ 내지 1X 10⁷ 세포 ) 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 용해 완충액(20mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM β-glycerophosphate, 1% triton X-100, 1mM PMSF, 1mMNa3VO4)을 첨가하여 세포를 깨Em리고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상청액을 취하고 그 단백을 정량한다(Bradford 단백 측정법). 한 레인 당 30 ug의 단백 시료를 로딩하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막에 트랜스퍼하였다. 블록킹 용액(5% 탈지유, TBS 버퍼에 0.1% 트윈 20)으로 1차항체를 희석(토끼 항-EPO 항체(R&D사, 1:1000))하고 이를 첨가하여 4'C에서 하룻밤 반응시켰다. PBS로 3번 세척하고 HRP-접합 2차 항체 (NewEngland Biolabs사; 희석비 1:2000)를 상온에서 2시간 반응한 후 ECL 키트(Amershampharmacia biotech사)로 확인한다.

그 결과, 상기 실시예 1의 RT-PCR 결과와 일치하게 아스코르브산에 의해 발현단계에서 EPO 단백질이 현저히 증가되었음을 알 수 있었다(도 2).

<실시예 3> 에리트로포이에틴의 정제

본 발명자들은 아스코르브산을 이용하여 신경 줄기세포에서 발현시킨 에리트로포이에틴을 분리, 정제하였다.

상기 실시예 2에서 발현시킨 에리크로포이에틴을 분리, 정제하기 위해, 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포를 분화단계까지 배양 후, 상기 배양액에 동량의 황산 암모늄 포화 용액을 첨가하여 얻은 침전물을 10 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.6)에 녹이고, 이틀간 동일한 완충액에 투석하였다. 모노-Q 컬럼(Phamacia사)을 이용하여 FPLC에서 염 기울기법에 의해 0.25 M NaCl에 첨가된 완충액을 이용하여 EPO를 1차로 분리하였다. 1차 분리된 EPO의 시료를 보다 더 정제하기 위해 다시 세파크릴-200 컬럼에 주입하고 세척액(50 mM 트리스 완충액에 0.5 M NaCl, 1mM EDTA, 0.2 mM PMSF를 첨가한 것, pH 7.5)으로 세척하여 젤 여과법(Gel filtration)을 수행하여 EPO를 정제하였다.

본 발명의 아스코르브산을 이용하여 신경 줄기세포에서 생산한 천연형 에리트로포이에틴은 빈혈의 치료와 조혈모세포의 분화에 이용될 수 있다.

도 1은 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 증식 단계 후 또는 분화 단계 후에 RNA를 추출하여 세포간의 에레트로포이에틴 mRNA의 발현 차이를 RT-PCR로 확인한 전기영동 사진이고,

도 2는 신경 줄기세포의 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 분화 단계 후에 단백질을 추출하여 에리트로포이에틴 단백질의 발현 차이를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.

<110> LEE, Sang Hun LEE, Yong Sung <120> Method for production of erythropoietin using ascorbic acid <130> 1p-07-04 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO forward primer <400> 1 cgctccccca cgcctcattt g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO backward primer <400> 2 agcggcttgg gtggcgtctg ga 22

Claims (4)

1. 인간을 제외한 포유동물의 신경 줄기세포(neural stem cell) 배양액에 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하여 에리트로포이에틴(erythropoietin)을 발현시키는 단계 및 상기 신경 줄기세포 배양액에서 이를 회수하는 단계를 포함하는 에리트로포이에틴의 생산방법.
2. 제 1항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물의 신경 줄기세포는 태아 중뇌에서 분리 배양한 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물의 신경 줄기세포는 태생 12일(E12) 또는 태생 13일(E13)인 래트 태아 중뇌에서 분리 배양한 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물의 신경 줄기세포의 배양에서 첨가하는 아스코르브산의 최종농도는 100 내지 400 uM인 것을 특징으로 하는 생산방법.