KR100550206B1

KR100550206B1 - 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의제조방법

Info

Publication number: KR100550206B1
Application number: KR1020020014556A
Authority: KR
Inventors: 이해신; 박태관
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2002-03-18
Filing date: 2002-03-18
Publication date: 2006-02-08
Anticipated expiration: 2022-03-18
Also published as: KR20030075374A

Abstract

본 발명은 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 상피세포성장인자 (EGF)에 특정 부위에 선택적으로 단일 분자로 접합시킨 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의 제조방법기술에 관한 것이다.

본 발명은 상피세포성장인자(EGF)의 N-말단기에 선택적으로 생체적합성이 우수한 폴리에틸렌글리콜을 단일 분자로 접합시켜 생리 활성도는 비접합 상피세포성장인자와 비교하여 전혀 감소되지 않는 동시에, 생체내에서 지속성과 안정성이 증가 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의 제조방법{mono-PEGylated epidermal growth factor and the preparation method of thereof}

도 1은 본 발명의 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조과정을 나타낸 개념도이다.

도 2(a)는 분자량이 2000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체 젤거름 크로마토그램이다.

도 2(b)는 분자량이 5000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체 젤거름 크로마토그램이다.

도 2(c)는 분자량이 3400인 n-하이드록시 석신이미드-폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체 투석전후의 양상 변화를 나타낸 크로마토그램이다.

도 3은 분자량이 2000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체 및 분자량이 5000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체 질량을 분석한 것이다.

도 4은 시험예 3에 의해 트립신으로 처리하여 폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자 분해조각을 분석한 역상 HPLC 그래프이다.

도 5는 시험예 4의 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체의 세포성장을 측정한 것이다.

도 6은 시험예 5에 의해 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체가 세포 표면에 발현되어 있는 상피세포성장인자 수용체와 결합하였을 경우, 세포내 전달 활성도는 접합되지 상피세포성장인자의 활성도와 차이가 없다는 것을 보여주는 사진이다.

도 7은 분자량이 각각 2000 및 5000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체, 천연 상피세포성장인자를 정맥주사로 쥐에 투여한 뒤 생체내에서의 잔류량을 시간별로 분석한 그래프이다.

도 8은 분자량이 각각 2000 및 5000인 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체, 천연 상피세포성장인자를 분쇄된 쥐 콩팥 조직들과 37℃에서 시간별로 혼합시킨 후 그 잔류량을 면역효소법으로 분석한 것이다.

생체 내 특히 혈액 및 조직 내에는 우리 몸의 성장 및 분화에 영향을 주는 수많은 단백질 및 펩타이드 호르몬 및 성장인자들이 존재한다. 이들은 주로 세포벽에 존재하는 수용체와 특이적으로 결합하여 그 결합으로 인하여 세포의 성장 및 분화에 영향을 주게 된다. 그러나 이러한 호르몬들이 생체 내에 적절한 양으로 존재하지 않을 때는 많은 문제점이 나타나게 된다. 예를 들면 인간 성장 호르몬이 생체내에 적은 양으로 존재할 때 키가 크지 않는 결과가 나오게 된다.

1953년 미국의 코헨(S. Cohen) 박사는 상피세포성장인자라는 아미노산 53개가 하나의 긴 사슬로 이루어져 있는 펩타이드 성장인자를 발견하였다(S. Cohen. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born animal. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1555-1262). 이 성장인자는 우리 몸 안 조직의 외곽에 위치한 세포들의 성장조절 역할 등을 담당하고 있다. 현재 이 상피세포성장인자는 상처치료 및 위벽의 손상시 이를 치료하는 치료제로 쓰이고 있고(대한민국 특허출원 번호 2000-8116), 또한 당뇨병 환자에게 발생하기 쉬운 족부궤양의 치료제로 각광을 받고 있다(P. Kirkegaard, P.S. Olsen, S.S. Poulsen, E. Nexo. Epidermal growth factor inhibits cysteamine-induced duodenal ulcers. (1983) Gastroenterology 85, 1277-1283. S.J. Konturek, T.Radecki, I. Piastrucki. Gastric cytoprotection by epidermal growth factor. (1981a) Gastroenterology 81, 438-443).

그러나 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 펩타이드성 성장 인자들은 그 사멸시간(체내 반감기)이 수 분 정도로 아주 짧다. 따라서 상피세포성장인자를 치료용으로 사용할 시 생체 내 약효 지속성과 안정성이 큰 문제로 대두된다.

이러한 짧은 혈액 및 조직 잔류 시간을 늘려주는 방법의 한가지로, 생체적합성 고분자, 특히 폴리에틸렌글리콜을 단백질 및 펩타이드 약물등에 접합시키는 시도가 있어왔다(F. M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions (2001) Biomaterials 22, 405-417. P. Bailon, W. Berthold. Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical proteins (1998) Pharm. Sci. Tech. Today 1, 352-356).

폴리에틸렌글리콜은 생체내에서 면역반응을 일으키지 않는 미국식품의약안정청(FDA)이 승인한 합성 고분자 중의 하나이다. 이 합성 고분자를 이용하여 단백질 접합체를 제조함으로써, 접합체의 분자량의 증가로 인한 신장에서의 거름(filteration)효과에 의한 단백질의 투과를 억제하고 생체내의 단백질 효소들에 의한 분해를 억제 효과를 통해, 궁극적으로 생체내에서의 반감기 및 안정성을 증가시키게 된다. 이러한 방법으로 약효를 증진시킨 단백질들은 인간성장호르몬, 인터페론, 인슐린, 인터루킨, 칼시토닌등 그 종류가 다양하다.

단백질 약물의 체내 안정성 및 지속성의 향상을 위하여 사용하는 폴리에틸렌글리콜은 단백질 약물과 반응 시 단백질 약물이 가지고 있는 여러개의 결합부위와 반응함으로써 결과적으로 생성되는 산물이 불균일한 접합체 혼합물(a mixture of multi-PEGylated species)이 되는 문제점을 내포한다. 또한 한 분자의 폴리에칠렌글리콜이 결합된 mono-PEGyated 접합체를 제조한다 할지라도, 그 결합 부위에 따라 약물의 생물학적 또는 체내 활성도가 현격히 영향받는다는 점이 그 문제점으로 수반된다.

지금까지 상피세포성장인자에 폴리에틸렌글리콜을 접합시키려는 시도가 있어왔다. 여기에 사용된 폴리에틸렌글리콜은 단백질의 1차아민에 특이적으로 반응하는 물질인 N-하이드록시 숙시이미드(N-hydroxy succinimide) 또는 N-숙신이미딜 프로피오네이트(succinimidyl propionate)가 한쪽 말단에 붙어있는 메톡시 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용하였다.

상피세포성장인자에는 2개의 입실론 1차 아민그룹(Lys28 and Lys48)과 1개의 N-말단기의 1차아민 그룹이 존재하기 때문에, 접합되는 폴리에틸렌글리콜의 수는 상피세포성장인자 한 분자당 여러개가 붙는 것이 일반적인 현상이다. 이럴 경우, 생체내에서 고분자인 폴리에틸렌글리콜이 상피세포성장인자의 수용체에 대한 결합을 입체장애적으로 방해함으로써 활성도를 감소시키는 원인이 되고 있다(T. H. Kim, H. Lee, T. G. Park. PEGylated recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) for sustained release from biodegradable PLGA microspheres. (2001) Biomaterials in press. I. B. Lee, Dong H. Na, C. J. Park, B. H. Lee, S. S. Lee, S. D. Lee, K. C. Lee. Increased stability of PEGylated recombinant human epidermal growth factor. M2232, AAPS annual meeting and exposition, October 2001, Denver, CO.).

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구하던중 폴리에틸렌글리콜 유도체를 상피세포성장인자에 접합시 접합위치에 따른 활성도의 변화를 세포성장 및 성장 억제, 세포내 신호전달 측면에서 상피세포성장인자의 N-말단기에 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 단일 분자로 접합시키는 것이 가장 좋은 효과를 나타냄을 알게되었다.

따라서 본 발명은 상피세포성장인자(EGF)의 N-말단기에 선택적으로 생체적합성이 우수한 폴리에틸렌글리콜중 알데하이드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜 유도체를 단일 분자로 접합시켜 생리 활성도는 천연 상피세포성장인자와 비교하여 전혀 감소되지 않는 동시에, 생체내에서 지속성과 안정성이 증가 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 및 이의 제조방법 제공을 목적으로 한다.

본 발명의 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜 접합체의 제조방법은 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자를 완충용액에 용해하고, 폴리에틸렌글리콜 유도체를 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자가 용해된 완충용액에 첨가하고 환원제 존재하에서 반응시키는 단계와;

반응 후 미반응된 상피세포성장인자, 폴리에틸렌글리콜 및 환원제를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용하는 상피세포성장인자는 공지의 유전자 재조합의 방법으로 생산된 것으로 포유동물에서 추출하는 형태이거나, 유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 원핵생물이나 진핵생물 숙주의 발현으로부터 얻어진 산물을 이용할 수 있다.

상기에서 원핵생물 숙주는 대장균(Escherichia coli)를 포함하여, 진핵생물 숙주는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula Polymorpha), 사카로마이세스. 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하고, 포유동물은 쥐, 개, 사람으로 부터 추출한 상피세포성장인자를 사용할 수 있다.

상피세포성장인자를 용해하는 용매역할을 하는 완충용액은 모폴리노 에탄설폰산, 아세트화 나트륨산, 시트르산, 인산염 완충용액, 아세타미도 이미다이아세트산 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있는며, 이들 완충용액의 pH는 5∼6을 유지하도록 한다.

만일 완충용액의 pH가 5 미만이면 단백질의 안정성에 문제가 있고, pH가 6 초과하면 폴리에틸렌글리콜과 결합하는 부위인 상피세포성장인자의 N-말단 접합의 특이적 성질이 감소하는 문제가 있어 본 발명에서 사용하는 완충용액의 pH는 5∼6, 특히 pH 5.5를 유지하는 것이 좋다.

한편 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자와 결합하는 폴리에틸렌글리콜 유도체는 알데하이드기를 포함하는 알데하이드 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 프로피온산 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 부탄산 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 두 분자가 접합되어 있는 di-폴리에틸렌글리콜 석신이미드, 석신이미딜 석시네이트 폴리에틸렌글리콜, 벤조트리아졸 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 에폭사이드 폴리에틸렌글리콜, 카르보닐 이미다졸 폴리에틸렌글리콜, p-나이트로페닐 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 이소시안산 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 하나를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 여러 단백질과의 접합반응시 낮은 산도를 지닌 완충용액에서 선택적으로 N-말단에 결합성질이 우수한 알데하이드 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 것이 좋다.

한편 본 발명에서 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500∼50000인 것을 사용하는데 보다 바람직하게는 반응의 효율성과 분자량 10000을 초과하는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 확보가 어려운 이유로 분자량이 2000∼10000인 것을 사용하는 것이 좋다.

만일 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량이 500 미만이면 폴리에틸렌 글리콜이 액상 형태가 되어 물리적 성질로 인한 문제가 있고, 50000 초과하면 제조상의 문제가 있어 본 발명에서 사용하는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500∼50000인 것을 사용하는 것이 좋다.

완충용액내에서 폴리에틸렌글리콜 유도체를 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자를 반응시 사용하는 환원제는 시아노수소화브롬나트륨(NaCNBH₃), 시안화 나트륨, 카테콜알레인(Catecholalane:1,3,2-Benzodioxaluminole)중에서 선택된 하나 또는 이들이 균일하게 혼합된 혼합물을 사용할 수 있다.

또한 환원제가 첨가된 완충용액에서 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응은 2시간∼100시간 동안 4℃∼25℃ 실시하는 것이 좋은데 만일 반응시간이 2시간 미만이면 폴리에틸렌글리콜의 접합효율에 문제가 있고, 100시간을 초과하면 산성용액에 오래 노출되는데서 기인하는 단백질의 안정성 문제가 있으며, 반응온도가 4℃ 미만이면 반응속도가 너무 느리다는 문제가 있고, 25℃ 초과하면 상피세포성장인자의 3차구조 유지에 어렵다는 문제가 있어 환원제가 첨가된 완충용액에서 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 반응은 2시간∼100시간 동안 4℃∼25℃ 실시하는 것이 좋다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이들이 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 분자량이 2000인 알데하이드-메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체와 상피세포성장인자와의 접합.

유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 E. Coli 숙주의 발현으로부터 얻어진 상피세포성장인자를 동결건조한 후 동결건조된 상피세포성장인자 10 mg과 분자량이 2000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜 10mg을 2.5 mM 시아노수소화붕소나트륨 (NaCNBH₃)가 포함된 아세테이트 완충용액(50 mM, pH 5.5)에서 25℃에서 10시간 동안 반응시켜 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체를 제조하였다.

폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자는 분자량 10000의 크기를 가진 반투석막 상에서 빠져나가지 못하므로, 반투석막을 이용하여 반응되지 않은 폴리에틸렌글리콜, 상피세포성장인자, NaCNBH₃를 분리한 후 제거하였다.

<실시예 2> 분자량이 5000인 알데하이드-메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체와 상피세포성장인자와의 접합.

유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 E. Coli 숙주의 발현으로부터 얻어진 상피세포성장인자를 동결건조한 후 동결건조된 상피세포성장인자 10 mg과 분자량이 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜 25mg을 2.5 mM 시아노수소화붕소나트륨 (NaCNBH₃)가 포함된 아세테이트 완충용액(50 mM, pH 5.5)에서 25℃에서 10시간 동안 반응시켜 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체를 제조하였다.

<실시예 3> N-하이드록시 석신이미드 폴리에틸렌글리콜와 상피세포성장인자와의 접합.

유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 E. Coli 숙주의 발현으로부터 얻어진 상피세포성장인자를 동결건조한 후 동결건조된 상피세포성장인자 8 mg과 N-하이드록 시 석신이미드 폴리에틸렌글리콜 140 mg를 인산염 완충용액(50 mM, pH 8.0)에서 25℃에서 12시간 동안 반응시켜 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체를 제조하였다.

폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자는 분자량 10000의 크기를 가진 반투석막 상에서 빠져나가지 못하므로, 반투석막을 이용하여 반응되지 않은 폴리에틸렌글리콜, 상피세포성장인자를 분리한 후 제거하였다.

<시험예 1> 젤여과 고속 액체크로마토 그래피 분석 (SEC-HPLC)

실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 각각의 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체를 젤여과 고속 액체크로마토그래피(HPLC, Waters 660E)로 분석하였다.

사용된 컬럼은 수용액상 단백질크기별로 분석할 수 있는 KW-800(Showa Denko, Japan)을 사용하였다. 이동상으로는 50 mM NaCl이 포함된 50 mM 인산염완충용액 (산성도=6)을 분당 1 ml이 흐르는 조건에서 사용하였다. 이동상에서 상피세포성장인자를 확인하기위해 280 nm 자외선으로 검출하였다. 또한 상피세포성장인자가 접합되어 있는 부분만 정제하기 위하여, 크로마토그래피 상에서 앞에 나오는 부분만 따로 정제한 후 진공회전식으로 시료를 농축하였다.

SEC-HPLC의 분석결과를 도 2(a)(b)(c)에 나타내었다.

도 2(a)는 실시예 1의 알데하이드 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체의 젤 거름 크로마토그래피로 분석한 것이고, 도 2(b)는 실시예 2의 알데하이드 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체의 젤 거름 크로마토그래피로 분석한 것 이고, 도 2(c)는 실시예 3의 N-하이드록시 석신이미드 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체의 젤 거름 크로마토그래피로 분석한 것이고다.

도 2(a)(b)에서 알데하이드 폴리에틸렌글리콜 유도체와 상피세포성장인자를 반응시킨 경우 24시간이 지나도 폴리에틸렌글리콜이 한 개가 붙었음을 알 수 있다. 반면에 N-하이드록시 석신이미드-폴리에틸렌글리콜 유도체를 반응시킨 도 2(c)의 경우 접합된 폴리에틸렌글리콜의 수가 한 개, 두 개, 세 개인 것이 분석되었다.

상기의 결과로 미루어 보아 알데하이드 유도체를 사용한 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우 균일한 단일 분자의 폴리에틸렌글리콜이 상피세포성장인자의 N-말단 아민기에 선택적으로 접합되었고, N-하이드록시 석신이미드 폴리에틸렌글리콜을 사용한 결과 상피세포성장인자의 아민잔기 세 곳(라이신28번, 라이신48번, N-말단)과 모두 반응한 것으로 나타났다.

<시험예 2> 비행시간 측정식 레이져 질량분석 (MALDI-TOF)

실시예 1 및 실시예 2에서 폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자의 실제 정확한 질량을 알아내기 위해 이온화된 분자의 비행시간을 측정하여 그 질량을 분석하는 기기인 비행시간 측정식 레이져 질량분석기(MALDI-TOF, Voyager DE-STR Perkin-Elmer PerSeptive Biosystem)를 사용하여 분자량이 2000인 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체(PEG2k-EGF)와 분자량이 5000인 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체(PEG5k-EGF)의 질량을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

시료의 결정은 다음의 방법으로 얻었다. 70% 아세토나이트릴과 30%물이 혼합된 용액에 지지체 (Matrix)를 10 mg/ml의 농도로 녹였다. 시료 1uL와 지지체 용액 1uL을 각각 질량분석용 판에 떨어뜨리고 약 2분정도 용액이 증발하기를 기다렸다. 지지체는 sinapinic acid(Sigma)를 사용하였고, 양이온 검출모드하에 25000V의 전압차를 걸어주어 시료의 질량을 확인하였다.

도 3에서 처럼 상피세포성장인자의 분자량은 약 6100 달톤이나, 약 8100의 질량 전후에서 신호가 검출된는바, 분자량이 200인 폴리에틸렌글리콜이 단일 분자로 접합됨을 알 수 있다. 마찬가지로 분자량이 5000인 폴리에틸렌글리콜의 경우 약 질량 11000 전후에서 신호를 감지할 수 있었다. 질량분석으로도 상피세포성장인자에 단 한 개의 폴리에틸렌글리콜이 붙어 있음을 알 수 있었다.

<시험예 3> 역상 크로마토 그램 (RP-HPLC chromatography)

실시예 1 및 실시예 2에서 폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자에 붙어있는 폴리에틸렌글리콜 위치를 분석하기 위하여 상피세포성장인자를 트립신으로 분해하였다. 5 mg의 상피세포성장인자를 6M 구아니딘 하이드로 클로라이드가 포함된 트리스 완충용액(0.1M pH 8.0)에 녹인 후, 단백질의 황결합을 끊어주는 역할을할 수 있는 다이시오스레이톨 (DTT)용액을 넣어주어 최종적으로 10mM이 되게 하였다.

끊어진 결합의 재생성을 막기 위하여 아세트산 요오드용액을 넣어주어 100 mM을 만들어 주고 상온에서 6시간 동안 반응을 시켰다. 미반응된 시약들을 제거해 주기 위하여 5 mM 트리스 완충용액(pH 8.0)에서 분자량 3500 이하의 물질이 투과할 수 있는 반투석 막을 이용하여 투석을 실시 한 후, 회전식 진공방법으로 용액을 1 mL까지 농축시켰다.

트립신 분해를 하기 위한 완충용액은 50 mM 트리스(pH 8.0), CaCl₂ 1 mM을 사용하여 12시간 동안 반응시키고 상피세포성장인자/트립신의 무게비가 100/1이 되게 넣어 주었다. 반응용액의 50 μL을 취해 C-18 컬럼을 사용하여 역상 크로마토그래피(Waters Spherisorb 4.6 X 250 mm)를 실시하였다.

이동상-1은 0.1% 트리플로로아세트산(tri-fluoroacetic acid, TFA)가 첨가된 증류수, 이동상-2는 0.1% TFA의 아세토나이트릴을 사용하였다. 이동상-2를 처음 10분간 2%로 흐르게 하고, 다음 30분간 이동상-2가 60%까지 1차적으로 증가하도록 프로그램 하였다.

도 4(a)(b)는 이러한 트립신의 분해작용으로 생긴 단편들을 보여주는 크로마토 그램이다. 도 4(a)는 분자량 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우이고, 도 4(b)는 분자량 2000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우이다.

상피세포성장인자는 그 분자안에 트립신이 특이적으로 인식하는 아미노산 잔기가 총 4개가 있다(라이신 28번과 48번, 아르기닌 41번과 45번). 따라서 결과적으로 5개의 피크를 크로마토그램상에서 볼 수 있는데, 폴리에틸렌글리콜이 상기한 바와 같이 상피세포성장인자의 중간에 위치한 라이신 잔기와 접합될 경우 트립신이 특이적으로 인식하지 못하여 4조각의 폴리펩타이드 단편이 형성되게 된다.

도 4에 나타난 바와 같이 5개의 피크가 나타난 것은 폴리에틸렌글리콜에 의한 접합이 N-말단에서 특이적으로 일어났음을 보여주는 증거이다.

<시험예 4> 방사선 동위원소 (³H-thymidine)를 이용한 세포(NRK49F) 성장률 측정

쥐 콩판 세포(입수처 : ATCC, NRK49F)를 5 X 10³의 농도로 24well의 세포배양판에 접종한 후 하루를 세포배양기(5% CO₂ 환경)에서 키웠다. 24시간 후, 무혈청 배지로 교체해 주고 12시간 동안 배양한 후, 분자량이 각각 2000 및 5000인 알데하이드 폴리에칠렌글리콜이 접합되어 있는 상피세포성장인자(PEG2k-EGF, PEG5k-EGF) 와 아무런 처리를 하지 않은 천연 상피세포성장인자(Native EGF)를 0.01부터 100 nM의 농도로 배지에 포함되어 있는 용액을 각각 넣어 주었다. 이렇게 8시간을 키운 후, 방사선 동위원소 (³H thymidine)를 다시 12시간 동안 넣어 주었다.

세포를 터뜨린 후, 20% 트리클로로 아세트산으로 처리하여 침전물을 만든 후, 이를 nitrocellulose종이로 옮겨 방사선 동위원소 카운터(Beckman LS 6500)로 DNA에 포함되어 있는 ³H thymidine의 양을 측정하여 세포의 성장을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서처럼 천연 상피세포성장인자의 경우에는 약 100 pM 부근 에서부터 세포를 성장시키기 시작하였고 약 10 nM 부분부터는 상피세포성장인자의 농도가 세포의 성장에 영향을 주지 않는 것으로 관찰되었다. 알데하이드 폴리에틸렌글리콜이 붙어있는 경우(PEG2k-EGF, PEG5k-EGF)도 거의 같은 정도의 상피세포성장인자의 활성도가 관찰되었다.

이런 결과는 상피세포성장인자에 고분자를 N-말단에 붙이는 경우 활성도의 감소를 거의 보이지 않음을 나타내는 긍정적인 결과라 할 수 있다.

<시험예 5> 특이적 항체를 이용한 상피세포성장인자 수용체 및 신호전달 분자의 인산화 측정

아프리카 녹색 원숭이 콩팥 세포(입수처 : ATCC, COS-7 세포)를 하나의 well당 2.5 X 10⁵개의 수로 접종을 한 후 하루간 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, 혈청을 없앤 배지로 교체하여 준 후, 다시 하루간 배양하였다. 상피세포성장인자 및 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체를 처리해 주기 전 0.1mM Na₃VO₄ 1ml을 10분간 처리해 주었다. 상피세포성장인자 및 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체는 0.5분, 1분, 2분, 5분 처리해 준 후, 4℃로 차갑게 한 인산염 완충용액을 넣어 씻어 주었다. 세포를 깨기위하여 0.5ml Lysis 완충용액을 넣고 30초간 초음파 분쇄시켜 세포를 완전히 파괴하였다.

SDS-PAGE 전기영동을 하기전 각 젤의 라인에 동일한 양의 단백질용액을 넣어주기 위하여, Bradford 단백질 정량을 실시하여 각 시료당 단백질의 농도를 같게 맞추어 주었다. Gel에는 10uL의 단백질을 넣어주었다. 3시간동안 15mV로 전기영동 을 실시한 후 나이트로 셀룰로오스종이로 단백질을 전기적으로 옮긴 다음 특이적 인산-타이로신인식 항체와 인산-ERK인식항체를 1차 항체로 사용하여 2시간 반응, 1차항체를 인식하는 2차항체인 퍼옥시데이스(peroxidase)를 사용하여 2시간 반응하여 씻어준 후, 기질을 넣고 인화하여 밴드를 보았다.

도 6는 상기와 같은 실험의 결과를 나타낸 것이다.

도 6에서 첫 번째줄은 천연 상피세포성장인자(Native EGF), 분자량이 2000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자와의 접합체(PEG2k-EGF), 분자량이 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자의 접합체(PEG5k-EGF)에 의해 상피세포성장인자 수용체의 타이로신 잔기의 인산화를 본 것이다.

접합된 상피세포성장인자와 본래의 상피세포성장인자의 수용체에 대한 인산화의 강도는 농도에 따른 변화된 양상을 보여 주고 있다. 상피세포성장인자에 의한 수용체의 1차 반응 양상인 수용체로의 인산화에는 별 차이가 없다는 것을 보여주고 있다. 하지만 무엇보다 중요한 것은 과연 상피세포성장인자가 그 수용체와 붙어 세포내로 들어가게 되어 수용체로부터 출발한 신호가 그 하부의 신호전달 단백질까지 제대로 가느냐 하는 것이다. 그래서 본 발명에서 선택한 것이 ERK라는 전달물질이다. ERK 또한 상피세포성장인자수용체의 인산화에 의해서 역시 인산화되는 신호전달에 관여하는 단백질이고 특히 이 단백질의 인산화는 상피세포성장인자의 세포내로의 이동(endocytosis)가 일어나야만 일어난다고 알려져 있다.

도 6의 두 번째줄이 이를 보여주고 있다. 인산-ERK 항체로 본 결과 농도에 따라 ERK에도 인산화가 일어난다는 것을 보여주고 있다. 그 대조군 실험으로서, 세 포내에 총 ERK의 양을 보여준 것이 세 번째 줄이다. 두 번째줄과 세 번째줄을 비교해보면 세포 내 ERK양은 변화가 없지만 인산화는 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체 및 상피세포성장인자에서 동일하게 일어나는 것을 나타낸다.

도 6에서 마지막 줄은 western blot시 아크릴 아마이드젤에 로딩한 단백질의 양이 동일하다는 것을 actin에 특이적 항체를 사용하여 보여준 것이다.

상기에서 설명한 것처럼 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체 및 상피세포성장인자는 세포내 신호전달에 별다른 차이를 보여주지 않다는 것이고, 더욱이 그 세포내 이동(endocytosis) 또한 동일하게 접합체에서도 잘 일어난다는 것을 알 수 있었다.

<시험예 6> 쥐 (ICR) 정맥주사를 통한 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체 및 상피세포성장인자의 생물학적 안정성 측정

분자량이 각각 2000 및 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자가 결합한 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체 및 상피세포성장인자(1.2 ㎍0.1ml)를 7주령 된 숫컷 ICR mice 정맥에 주사하고 정해진 시간(5분 ∼ 4시간)에 심장에서 혈액을 체취한 뒤, 해파린(2μl)이 첨가된 튜브로 옮긴 후, 혈장를 얻기위하여 12,000 rpm에서 원심분리를 하여 상층액을 취하였다.

얻어진 혈장을 10² ∼ 10⁵ 사이로 희석하여 면역효소법측정범위(0.6 ∼ 20.7 pM)내에 들어가게 한 후, 혈장에 포함된 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합 체 및 상피세포성장인자의 양을 측정하였다. 각 시간마다 사용된 쥐의 수는 5마리로 하였다.

도 7에 위에서 실시한 시험에 대한 결과를 나타내었다. 폴리에틸렌글리콜이 접합된 상피세포성장인자 접합체가 쥐모델에서 지속성이 우수한 것으로 나타났다. 폴리에틸렌글리콜이 접합되어 있지 않은 경우 그 반감기가 6.71분인 것에 반해, 분자량이 2000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜이 단일 분자로 접합된 경우 15.59분, 그리고 분자량이 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜이 상피세포성장인자에 접합된 경우의 반감기는 24.36분으로 계산되었다. 분자량이 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜 접합되어 있는 상피세포성장인자의 경우, 비접합 상피세포성장인자에 비해 약 4배 정도의 지속성의 증가를 보여주었다. 다른 폴리에틸렌글리콜로 변형된 단백질의 경우 보다 그 생체 내 지속 시간이 많이 증가되지 않은 것은 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 작은 것에 기인한다.

<시험예 7> 쥐 콩팥조직을 이용한 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체의 생물학적 안정성 측정

쥐의 콩팥 1.5g을 얻어 인산염 완충용액으로 씻어준 후, 10배 희석한 인산염 완충용액 존재하에서 매뉴얼타입 세포분쇄기로 콩팥조직을 분쇄한 후 12,000rpm으로 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 취하여 단백질 농도를 브래드포드법으로 정량하였다(5.3 mg/ml).

얻어진 상층액 2ml과 0.5 ㎍20μl의 상피세포성장인자와 분자량이 각각 2000 및 5000인 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자가 결합한 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체 용액과 섞어주어 37℃에서 반응시켜 정해진 시간(10분, 30분, 60분, 120분, 240분, 550분)에 0.1ml씩 취하였다. 남아있는 상피세포성장인자의 양을 면역효소반응법으로 정량하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서처럼 분자량이 각각 2000 및 5000인 알데하이드 폴리에틸렌글리콜과 상피세포성장인자가 결합한 폴리에틸렌글리콜-상피세포성장인자 접합체는 상피세포성장인자 보다 생체조직 내에 포함되어 있는 단백질 분해효소에 대하여 현저히 향상된 저항성을 나타냄을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에서 사용한 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 사용하여 상피세포성장인자의 N-말단기에 폴리에틸렌글리콜을 단일 분자로 접합 시켰을 경우, 그 생물학적 약효성 변화가 없이 생체 내 지속시간이 길어지는 효과와 안정성이 증가하는 효과를 가져올 수 있다. 그 결과 창상 치료효과가 보다 우수한 상피세포성장인자의 고분자 접합체 제조에 본 발명의 효과가 있다고 하겠다.

Claims

알데하이드 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 프로피온산 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 부탄산 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 두 분자가 접합되어 있는 di-폴리에틸렌글리콜 석신이미드, 석신이미딜 석시네이트 폴리에틸렌글리콜, 벤조트리아졸 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 에폭사이드 폴리에틸렌글리콜, 카르보닐 이미다졸 폴리에틸렌글리콜, p-나이트로페닐 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 이소시안산 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 어느 하나의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 상피세포성장인자의 N-말단기에 단일 분자로 선택적으로 공유결합된 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체.
삭제
제 1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500∼50000 임을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체
제1항에 있어서, 상피세포성장인자는 E. Coli, 한세눌라 폴리모르파, 또는 S. 세레비시에 유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 발현되어 얻어진 산물재조합 임을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체.
N-말단기를 가지는 상피세포성장인자를 완충용액에 용해하고, 알데하이드 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 프로피온산 폴리에틸렌글리콜, 석신이미드 부탄산 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 두 분자가 접합되어 있는 di-폴리에틸렌글리콜 석신이미드, 석신이미딜 석시네이트 폴리에틸렌글리콜, 벤조트리아졸 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 에폭사이드 폴리에틸렌글리콜, 카르보닐 이미다졸 폴리에틸렌글리콜, p-나이트로페닐 카르본산 폴리에틸렌글리콜, 이소시안산 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택되는 어느 하나의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 N-말단기를 가지는 상피세포성장인자가 용해된 완충용액에 첨가하고 환원제 존재하에서 반응시키는 단계와;

반응 후 미반응된 상피세포성장인자, 폴리에틸렌글리콜와 환원제를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법.
제5항에 있어서, 상피세포성장인자는 E. Coli, 한세눌라 폴리모르파, 또는 S. 세레비시에 유전자의 DNA 벡터로의 클로닝 이후 발현되어 얻어진 산물재조합 이거나 또는 인간을 제외한 포유동물에서 직접 추출한 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법.
제 5항에 있어서, 완충용액은 모폴리노 에탄설폰산, 아세트화 나트륨산, 시트르산, 인산염 완충용액, 아세타미도 이미다이아세트산 중에서 선택된 어느 하나 임을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법
제 5항에 있어서, 완충용액은 pH가 5∼6 임을 특징으로 하는 상피세포성장인 자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법
삭제
제 5항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 분자량은 500∼50000 임을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법
제 5항에 있어서, 환원제는 시아노수소화브롬나트륨, 시안화 나트륨, 카테콜알레인 중에서 선택된 하나 또는 이들이 균일하게 혼합된 혼합물 임을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜 접합체의 제조방법
제 5항에 있어서, 환원제가 첨가된 완충용액에서 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜 유도체는 2시간∼100시간 동안 4℃∼25℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자와 폴리에틸렌글리콜의 접합체 제조방법