KR100599824B1 - 콩 유래 신규 스트레스 저항성 단백질, 이를 코딩하는유전자 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콩에서 유래된 저온 및/또는 염 저항성 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 유전자로 형질감염된 저온 및/또는 염 저항성 식물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 스트레스(저온 및 염) 저항성 유전자는 연구용뿐만 아니라 산업적으로 스트레스 저항성 형질전환 식물체를 제조하는데 유용하다.

콩, 저온, 염, 저항성, 스트레스, 형질전환 식물체

Description

콩 유래 신규 스트레스 저항성 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 그 용도{A Novel Stress Resistance Protein Originated from Soybean, a Gene Enconding the Same, and Use Thereof}

도 1은 저온 및 각종 스트레스를 처리한 콩으로부터 분리된 전체 RNA의 Northern blot 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 저온 저항성 유전자를 함유하는 재조합 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 저온 저항성 유전자를 함유하는 재조합 전이벡터의 지도이다.

도 4는 형질전환된 대장균에서 발현된 저온 저항성 단백질의 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 형질전환된 대장균에서 발현된 재조합 저온 저항성 단백질을 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제한 사진이다.

도 6은 초 저온에서 저온 저항성 유전자를 포함하고 있는 대장균(SLTI66)과 포함하고 있지 않는 대장균(vector)의 생존율을 비교분석한 결과이다.

도 7은 저항성 유전자를 포함하고 있는 대장균(SLTI66)과 포함하고 있지 않 는 대장균(vector)의 생존율을 염의 농도에 따른 OD값으로 비교분석한 결과이다.

본 발명은 콩에서 유래된 저온 및/또는 염 저항성 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 유전자로 형질감염된 저온 및/또는 염 저항성 식물에 관한 것이다.

콩은 전세계적으로 볼 때, 다양한 기후환경에서 재배되고 있으며. 그러한 기후환경조건 중에서도 기온에 대한 영향을 가장 많이 받는 것으로 알려져 있다. 그 중에서도 저온에 의한 것으로 알려져 있다. 그래서 진화상으로 볼 때 식물은 그 환경적인 요인을 극복하기 위하여 그에 따르는 생존전략으로 그 환경에 적응하는 물질을 만들어 내면서 그에 따른 내성을 증가시켜 왔다. 주요 연구에 따르면 식물체에 있어서 저온의 영향은 원형질과 세포막 사이의 결빙에 의해 수분 포텐셜의 불균형으로 인한 세포내의 수분이 세포 밖으로 빠져나옴으로써 수분 결핍현상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 이로 인하여 세포 결빙에 따른 조직의 기계적 파괴와 수분의 불균형으로 인한 세포의 대사작용에 영향을 줌으로서 식물체의 생장저해와 조직이 죽어가는 결과를 초래한다.

그러나 저온에 대한 저항성을 가지고 있는 식물체는 세포의 결빙으로 인한 기계적 파괴를 줄이고, 세포내 수분 포텐셜을 유지하는 능력을 높임으로서 세포내 수분결핍을 막아 정상적인 대사작용을 이어가는 것으로 알려져 있다. 이러한 저항성을 띠는 단백질을 만들어 내는 DNA가 많이 알려져 있으며, 그 종류 또한 다양하게 알려져 있다. 그러한 예로서 저온이나 수분부족에 의한 스트레스로 인한 유도되는 DNA로 KIN (cold inducible), LTI (low-temperature induced), COR (cold regulated), ERD(early responsive to dehydration) 및 RD (responsive to dehydration)가 알려져 있다. 또한 목화에서 발견된 후 여러가지 식물체 종에서 발견된 lea (late embryogenesis abundant) 단백질은 친수성 아미노산으로 이루어져 있으며, 스트레스 초반에 다량으로 유도되는 것으로 알려져 있다. 그리고 수분부족에 의해서도 다량 유도되어 세포막 부위에서 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 콩에서 저온 스트레스 저항성 단백질에 대한 보고는 거의 없다.

이에, 본 발명자들은 콩의 스트레스(저온, 염)에 의하여 유도된 단편의 cDNA 유전자 라이브러리로부터 RACE PCR 기법을 통하여 스트레스 저항성 신규 유전자를 분리하고 상기 유전자를 재조합 대장균에서 발현시킨 다음, 분리정제된 재조합 단백질이 대장균에서 저온과 염에 내성을 나타내는 것을 검정함으로써 저온 및 염 스트레스에서 저항성을 띠는 유전자임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 콩 유래 저온 스트레스 저항성 유전자 및 그 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저온 저항성 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자로 형질감염된 스트레스 저항성 식물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 저온 및/또는 염 저항성 단백질 및 이를 코딩하는 유전자(Gmslti66)를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 유전자는 저온 및/또는 염 저항성 단백질을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pET-SLTI66인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 저온 및/또는 염 저항성 단백질의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명은, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 저온 저항성 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; (d) 배양물로부터 실질적으로 순수한 저온 저항성 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저온 및/또는 염 저항성 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무 관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야 만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 단백질 및 이를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자로 형질감염된 저온 및/또는 염 저항성 식물을 제공한다. 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그 로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 이용가능한 형질감염 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명에 의하여 밝혀진 유전자는 lea DNA의 특징을 가지는 것으로서 저온과 염 스트레스에 의해서 다량으로 유도되는 DNA로, 지금까지 알려진 것과 달리, 식물체에서 저온이나 다른 스트레스에 강한 저항성을 나타내는 것을 재조합 대장균에서 밝혔으며, 실질적으로 다른 식물체에 적용하여 스트레스 저항성 식물체를 제 조하는데 산업적으로 유용하다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 콩 유래 스트레스 저항성 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열분석

생육상에서 3주 이상 키운 콩에 스트레스와 스트레스를 가하지 않은 잎에서 poly(A+) mRNA를 추출한 다음, PCR-Select cDNA Subtraction(Clontech 사)을 이용하여 스트레스(저온, 염)에 의해서만 발현되는 단편의 cDNA를 확보하였다. 확보된 cDNA를 subcloning 벡터인 pCR2.1 (Invitrogen 사)에 클로닝한 다음, plasmid purification kit (NucleoGen 사 구입)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 염기서열 분석은 마크로젠에 의뢰하여 수행하였다. 염기서열 분석결과를 토대로 RACE PCR를 통하여 전체 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 스트레스 저항성 유전자의 cDNA는 전체 270bp의 염기서열(서열번호 1)로 구성되어 있었고, 이를 연역한 결과, 의해 90개의 아미노산(서열번호 2)으로 구성되어 있었다. NCBI, GenBank, EMBL 및 SwissProt databases에서 제공된 DNASIS 및 BLAST 프로그램을 통해 비교·조사한 결과, 상기 염기서열 및 아미노산 서열은 저온 저항성에 관한 새로운 유전자(Gmslti66)로 판명되었다.

실시예 2: 저온 저항성 유전자의 발현

생육상에서 3주 이상 재배한 콩에 각종 스트레스와 호르몬 그리고 3일, 7일째되는 seedling을 떡잎과 줄기를 분리하여 전체 RNA를 HOT 페놀법을 이용하여 분리하였다. 분리한 전체 RNA를 1.0% 포름알데히드 겔 (formaldehyde gel)에 전기영동한 후, 겔을 20×SSC 용액 (3M NaCl, 0.3M sodium citrate)으로 나일론 막 (Schleicher & Schuell 사)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P]dCTP로 표식된 저온 저항성 유전자(270bp cDNA)를 탐침으로 하여 Northern blot 분석을 수행하였다.

그 결과, 잎에서 각종 스트레스 중 저온 (5℃) 24시간(LT 24hr), 염 6시간(NaCl 6hr), 한발 24시간(Dr 24hr) 및 호르몬 처리에 있어서는 ABA 6시간(ABA 6hr)에서 전사체를 확인할 수 있었고, 조직 특이적으로는 seedling의 떡잎에서만 전사체를 확인할 수 있었다 (도 1). 이 결과로부터 본 발명에 따른 저온 저항성 유전자는 일부 스트레스와 호르몬(ABA) 그리고 조직 특이적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 재조합 대장균에서 스트레스 저항성 단백질의 발현

대장균에서도 저온이나 염의 농도에 따라 저항성을 띠는 지를 알아보기 위하여 상기 실시예 1에서 분리된 저온 저항성 유전자를 대장균 발현 벡터중 pET42a (Novagen 사)에 삽입하였다. 상기 유전자 cDNA와 발현벡터 pET42a를 각각 제한효소 EcoRⅠ과 HindⅢ로 처리한 다음, 라이게이션하여 재조합 전이벡터 pET-SLTI66를 제작하였다 (도 2 및 도 3). 상기 재조합 전이벡터는 T7 프로모터와 IPTG 조절하에 재조합 융합 단백질 발현의 발현이 유도되는 특성을 가지고 있다.

콩의 저온 저항성 유전자를 대장균에서 발현하기 위하여, 상기 재조합 전이벡터 pET-SLTI66 5㎍를 대장균 BL21 50㎍에 온도충격(42℃)으로 삽입하여 형질전환된 대장균을 제작하였다. 상기 형질전환된 대장균을 가나마이신 50㎍/ml이 들어있는 LB (Luria-Bertani) 액체 배지에 1시간 배양한 다음, LB-Kana 고체배지에 도말하여 37℃에 16시간 이상 배양하였다. 배양결과로 확보된 균을 LB-Kana 50ml 액체배지에서 OD 0.6 (1.0 × 10⁶ cell)까지 배양한 후, 0.5mM IPTG를 첨가하고 28℃에서 3시간 동안 배양하였다.

배양 후 3000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 50mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액을 1.7ml 넣고 세포 파쇄기를 이용하여 세포를 파괴한 후 5000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 분리하여 다시 12,000rpm에서 10분동안 원심분리 후 수용성 단백질과 비 수용성 단백질을 분리하여 12% SDS-단백질 전기영동 (Laemmli, Nature, 227:680, 1970)을 수행하여 재조합 융합 저온 저항성 단백질 발현을 분석하였다 (도 4 및 도 5). 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 약 43kDa 재조합 융합 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. 레인 4내지 6은 각각 전체 단백질, 수용성 단백질, 비 수용성 단백질을 나타낸다.

실시예 4: 저온 저항성 유전자를 함유하는 재조합 대장균에서 저온 저항성과 염의 내성 측정

상기 실시예 3에서 발현된 재조합 융합 단백질이 대장균에서 저온 및 염의 저항성을 띠는 지를 대조구와 비교 분석하였다. 스트레스 저항성 단백질이 다량 발현된 대장균과 벡터만 발현시킨 대조구를 각각 초저온과 염(NaCl) 농도별로 스트레스를 가하고 배양하였다.

초저온은 액체 질소를 이용하여 급냉시켰으며, 실온(25℃)에서 완전히 녹였다. 이러한 방법을 이용하여 세번의 급냉과 녹임을 반복한 다음 각각 고체 배지에 일정 비율로 배양하였다. 스트레스 저항성 유전자가 다량 발현된 대장균의 경우, 대조구보다 40-50%의 높은 생존율을 보였다 (도 6).

또한, 염의 내성에 대한 실험은 액체 배지에 염(NaCl)의 농도를 3%, 5%로 하여 0-10시간까지 배양하여 각 시간별로 OD값을 체크하였다. 그 결과, 3% 이상의 염이 존재할 경우, 대조구에 비해 현격히 높은 생존율을 나타냈다 (도 7).

이 결과로부터 콩으로부터 분리된 새로운 스트레스 저항성 유전자는 기능적으로 저온 및 염에 저항성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 저온 및 염 저항성 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 유전자로 형질감염된 저온 및 염 저항성 식물을 제 공하는 효과가 있다. 또한 본 발명에 따른 스트레스 저항성 유전자는 연구용뿐만 아니라 산업적으로 스트레스 저항성 식물체를 제조하는데 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 저온 및/또는 염 저항성 단백질.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 유전자는 저온 및/또는 염 저항성 단백질을 코딩하는 것임을 특징으로 하는 유전자.
5. 제2항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
6. 제5항에 있어서, pET-SLTI66인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
7. 제5항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물.
8. 제7항에 있어서, 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
9. 제7항의 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 저온 및/또는 염 저항성 단백질의 제조방법.
10. 제9항에 있어서, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 저온 저항성 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계; (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계; 및 (d) 배양 물로부터 실질적으로 순수한 저온 저항성 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저온 및/또는 염 저항성 단백질의 제조방법.
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