KR100590839B1

KR100590839B1 - 락토바실러스를 함유하는 질 감염 치료용 약학 조성물

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Publication number: KR100590839B1
Application number: KR1019990015469A
Authority: KR
Inventors: 베드. 베셀리 레나타 마리아 안나 카발리에리; 시모네 클라우디오 드
Original assignee: 베드. 베셀리 레나타 마리아 안나 카발리에리; 시모네 클라우디오 드
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2006-06-19
Anticipated expiration: 2019-04-29
Also published as: CA2254548A1; CN1233474A; ES2165139T3; HK1022439A1; DE69802260D1; PT956858E; AU9240098A; EP0956858B1; HUP9802525A3; AR017404A1; HUP9802525A1; JPH11322621A; PL189577B1; US6277370B1; ATE207755T1; CN1263467C; AU745286B2; CA2254548C; USRE39892E1; HU225491B1

Abstract

질 이상증상과 질염을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 락토바실러스(Lactobacillus) 조합물의 용도. 상기 세균 조합물은 락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis)와 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(Lactobacillus salivarius subs. salicinius)종을 함유하며, 가능하게는, 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(Lactobacillus salivarius subs. salicinius), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii) 락토바실러스 카테나포르미(Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 미누투스(Lactobacillus minutus) 및 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri)중에서 선택된 한가지 이상과 조합될 수 있다. 질 이상 증상 및 질염을 치료하는데 적합한 상기 락토바실러스(Lactobacillus)의 조합물을 함유하는 약학적 조성물도 제공된다.

Description

락토바실러스를 함유하는 질 감염 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING LACTOBACILLI FOR TREATMENT OF VAGINAL INFECTIONS}

본 발명은 질 감염 (vinal infections) 치료용 약학적 조성물을 제조하는데 있어서의 특수한 종의 락토바실러스의 용도, 및 이렇게 제조된 약학적 조성물에 관한 것이다.

정상적인 질과 정상적인 자궁 경부는 위장관계의 여러 세균들에 동화될 수 있는 다양한 종류의 세균의 온상이 되고 있다. 이러한 세균들은 종종 여성 생식기의 비-임균 감염 (non-gonococcus infections)과 관련이 있다 (예컨대: 외음부 농양 및 바르톨린선 (Bartholin') [또는 대전정 (greater vestibular)선]의 농양, 자궁내막염, 수란관염, 난소 농양 및 골반 복막염).

비-성병성 염증성 골반 질환의 경과에 있어서, 종종 혐기성 세균과 호기성 세균의 혼합물이 발견되고 있다; 이러한 세균 범위는 부인병학적 수술후, 출산후, 유산후의 감염에 의한 것일 수 있으며 수정을 방지하기 위한 자궁내 장치 (IUD: intrauterine devices)를 사용하는 것과 관련이 있었다.

세균성 질 이상증상 (bacterial vaginosis)은 질 부위에서 락토바실러스(Lactobacillus)가 박테로이드(Bacteroides), 펩토스트렙토코커스(peptostreptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 모빌룬쿠스 지. 바기날리스 (Mobiluncus G. vaginalis) 등을 비롯한 수많은 혐기성 세균에 의해 대체된 때문으로, 즉 세균성 상호작용에 의한 것이다. 이러한 증상은 비록 자극적이지는 않다 해도 분비물에서 불쾌취가 난다는 특징이 있다. 아주 약간의 가려움증이 있을 뿐이고 성교통증과 같은 증상은 매우 드물다. 비록 세균성 질 이상증상의 진단 기준에 긍정적인 응답을 한 여성 중 50%는 무증상이긴 하지만, 세균성 질 이상증상은 질에 이상이 있는 여성들에 있어서 흔히 진단되는 질환이다. 세균성 질 이상증상은 성행위와 연관되어 있으며 성교 파트너의 수가 많을수록 증가한다; 그러나, 이 증상은 성-전염에만 의한 질환으로 여겨지지는 않는다.

비록 세균성 질 이상증상이 심각한 질환은 아니라 해도, 이 증상은 특히 임신 중 생식기에 보다 심각한 감염을 유발시킬 수 있다.

다음의 네가지 증상중 세가지에 해당되면 세균성 질 이상증상이라 진단할 수 있다:

(1) 질벽에 부착성인, 비-염증성의 균질한 질 분비물이 있다;

(2) 질액의 pH가 4.5를 초과한다;

(3) 지표 세포 (indicator cells)가 있다;

(4) 10% 수산화칼륨 첨가 전후에 질 분비물에서 심한 악취가 난다(Whiff' 테스트).

이와 반대로, 질염 (vaginitis)은 비정상적인 질분비물 과다, 국소적인 염증, 및 외음부 가려움증에 의해 특징지어진다. 상기한 증상은 티. 바기날리스(T. vaginalis) 또는 캔디다 [전술한 모든 캔디다 알비칸스(Candida albicans)]에 의한 국소 감염에 기인하는 것이다. 질 이상증상과 유증상 질염은 당뇨병, 부갑상선 부전, 숙주 개체의 변형된 방어능력, 코르티코스테로이드 치료, 광범위한 항생제 치료, 경구용 피임약 복용 및 임신 등과 관련이 있다. 질염의 주요 증상은 캔디다 (Candida)에 의한 가려움증과 분비이다. 때로 성교통증이 일어나기도 한다. 외음부 홍반 및 외음부질내 염증이 수반되기도 한다. 캔디다(Candida)에 의한 질염이라고 진단하기 위해서는 국소적인 증상이 존재하여야 하는데, 이는, 대개의 여성들의 경우 아무런 이상 없이 질 내에 캔디다(Candida)가 서식할 수 있기 때문이다.

최근의 연구결과는 락토바실러스(Lactobacillus)가, 예컨대 질과 같은 역동적인 생태계에서 정상적인 세균 평형을 유지해 주고, 병원성 미생물에 의해 야기되는 생식기 감염을 예방하는데 있어서 중요한 역할을 수행한다는 것을 뒷받침해주고 있다.

유복한 성인 여성의 질에 많은 락토바실러스(Lactobacillus)가 군집해 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. 이들은 에너지원으로서 질 점막으로부터 분비되는 글라이코겐을 이용하여 증식하며 질 점막으로부터의 병원성 물질과 경쟁하여, 질강 (vaginal lumen)이 잡균으로부터 공격받는 것을 방어해준다. 상기한 질환 (예컨대 비특이적 질염, 질 이상증상 및 외음부 가려움증)을 치료하는데는 주로 설폰아미드류, 항생제 및 소독 약물이 사용되어 왔다. 특히, 여러 가지 항생제가 개발된 최근에는, 종종 항생제 제제가 환자에게 투여되어왔다. 이러한 항생제는 질에 존재하는 락토바실러스에게 치명적일 수 있다. 불행하게도, 병원성 세균 [예컨대 스타필로코커스 (Staphylococcus)]은 항생제에 대한 내성을 획득했기 때문에 항생제를 투여하여 이러한 질환을 투여하는 것이 어려운 실정이다.

미국특허 제 5176911호에는 질 감염을 치료하기 위한 부인병학에서 락토바실러스를 이용하는 것이 제안되어 있다.

이 문헌은 다음의 세균을 열거하고 있으며: 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 가쎄리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 카제이 서브. 슈도플란타룸 (Lactobacillus casei subs. pseudoplantarum) 및 락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 세균 농도는 10³ 내지 10¹⁰ CFU/g이 좋고, 특히 바람직하게는 약 10⁶ CFU/g이 좋다고 제안하고 있다.

그러나, 상기 문헌에 예시된 모든 조성물들은 필수 성분으로서 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) 및/또는 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum)을 1 x 10⁶ CFU/g의 농도로 함유하고 있다. 따라서, 실제로 상기 문헌이 개시하고 있는 것은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) 및/또는 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum)이 질 감염을 치료하기 위한 약학적 조성물 제조시 필수 성분이라는 것과 이러한 조성물은 상기 세균 농도가 1 x 10⁶ CFU/g (CFR는 "colony-forming unit", 즉 "집락-형성 단위"의 약자임)일 때 효과적이라는 것이다.

락토바실러스를 함유하는, 질에 사용하기 위한 페싸리 또는 정제 형태로 만들어진 종래 기술의 약학적 조성물은 질 집락화 (vagina colonization)을 재-수립하는데 충분할 정도로 효과적이지 못하다. 뿐만 아니라, 페싸리 제조시 가해지는 물리적 충격으로 인해 중요 비율의 세균들이 사멸하며, 이들의 수는 질강 내에서 확산하여 전파가 개시되면서 추가로 감소된다는 것을 주목하여야 한다.

따라서, 종래기술에 따른 조성물의 결점이 없으면서, 적절한 종류의 락토바실러스 또는 이들의 혼합물, 및 이들을 함유하는 약학적 조성물을 개발하는 것이 필요한 실정이다.

특히, 환자에게 투여시 실제로 이로운 작용을 하는 질용 약학적 조성물이 요구되고 있다.

또한, 약학적 조성물의 구체예는 일정한 수로 락토바실러스를 번식시킬 수 있어야 하고, 질강 내에서 확산하는 동안 상기 락토바실러스가 시간이 경과하여도 변함없이 연속적으로 활동할 수 있게 하여야만 한다.

본 출원인은 다음의 특성이 가능한 한 최고도로 만족된다면, 질 감염을 치료하는데 있어서 매우 효과적인, 락토바실러스를 기제로 한 약학적 조성물을 얻을 수 있음을 발견하였다:

(a) 선택된 락토바실러스 균주는 질 상피에 고도의 친화성을 가져야만 한다, 즉, 질의 상피세포에 강력하게 부착되어, 생리적 조건 및 병원성 조건 모두에서 세균 상호작용을 가능케 하고 (즉 상피 수용체 부위에서 병원성 미생물과 경쟁적으로 활동할 수 있도록), 미생물 및 최적 pH 조건을 회복할 수 있어야 한다;

(b) 선택된 락토바실러스 균주 중 적어도 한가지는 병원성 미생물에 대한 억제 작 용을 수행하는 과산화수소 생산능력이 우수해야 한다;

(c) 선택된 락토바실러스 균주 중 적어도 한가지는 HeLa 세포에 대한 부착 (adhesion)에 있어서 경쟁적인 방식으로 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)를 방해하는 능력이 우수해야 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기한 특성에 가능한 최대한도로 부합함으로써, 예컨대 질염 및 질 이상증상과 같은 질 감염을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있는, 락토바실러스-기제 약학적 조성물을 제공하는데 있다. 이러한 맥락에서 본 출원인은 다른 어떠한 락토바실러스 종보다도 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)와 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스 (Lactobacillus salivarious subs. salicinius) 종이 상기한 세가지 특성 요구에 전체적으로 가장 우수하게 부합된다는 것을 밝혀내었다.

본 발명의 또 다른 목적은 액체 조성물, 크림 또는 연고 조성물 및 특히 페싸리 및 정제 형태의 고체 조성물 형태로 만들어진, 락토바실러스를 함유하는 질내 투여용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시간이 경과함에 따라 분화된 방식으로 락토바실러스를 방출시킬 수 있는 고상 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다음의 상세한 설명을 통해 명확해질 전술한 목적 및 기타의 목적은 본 발명에 의해 달성되며 첫 번째 목적은 예컨대 질염 및 질 이상증상과 같은 질 감염을 치료하는데 있어서 질내 투여를 통해 사용될, 약학적 조성물 제조시 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 및 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius sub. salicinius)의 락토바실러스 조합물의 용도를 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 한가지 목적은 상기 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 락토바실러스 브레비스(L. brevis)와 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius sub. salicinius) 종 세균을, 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius subs. salivarius), 락토바실러스 젠세니이 (Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 카테나포르미 (Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 미누투스 (Lactobacillus minutus) 및 락토바실러스 가쎄리 (Lactobacillus gasseri) 중 한가지 이상의 종과 병용하여 사용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 사용되는 세균 조합이 락토바실러스 브레비스 (L. brevis), 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스 (L. salivarius subs. salicinius) 및 락토바실러스 가쎄리 (L. gasseri)로 구성되거나, 상기 조합을 포함하는 것이 좋다.

특히 바람직한 락토바실러스는 다음과 같은 것들이다:

- 락토바실러스 브레비스(L. brevis) ATCC 4006 및 ATCC 14869

- 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스 (L. salivarius sub. salicinius) ATCC 11742

- 락토바실러스 가쎄리 (L. gasseri) ATCC 9857

ATCC는 미국 매릴랜드 20852, 로크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 American Type Culture Collection을 가리킨다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용된 세균과 조합물에서, 세균 농도가 10⁷ 내지 10¹³ CFU/g, 더욱 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹² CFU/g, 가장 바람직하게는 10⁹ 내지 1¹² CFU/g을 초과하는 것이 좋다. 바람직하게는, 상기 세균 조합물에서 각각의 종이 10⁸ 내지 10¹² CFU/g의 농도로 존재하는 것이 좋다.

세균 배양물은 동결건조된 형태가 바람직하다.

실제 사용을 위해 본 발명의 약학적 조성물은 액체 형태 (위장 세척용 (lavages) 용액), 크림 또는 연고 형태, 또는 페싸리 또는 질정제, 패켓 등과 같은 고체 형태로 조제될 수 있다. 정제 형태로 만들어진 약학적 조성물은 단층 또는 차동 방출시간을 갖는 2층 이상의 층으로 이루어질 수 있다.

특히, 본 발명의 약학적 조성물은 최외곽층 세균의 방출 속도가 가장 안쪽 층의 세균의 방출속도보다 빠르게 만들어진, 통상적인 부형제 및 첨가제와 결합된 상기한 종의 락토바실러스를 포함하는 층을 2개 이상 갖는 정제 형태로 제조될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 두 개의 층으로 이루어진 정제 형태로 조제될 수 있다. 이러한 두 개의 층은 외곽층의 세균은 10 - 25분, 예컨대 약 15 - 20분 경과 후 방출되는 반면, 내층의 세균은 25 - 50분, 예컨대 약 30 - 40분 경과 후 방출되도록 하는 방식으로 만들 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 투여 후 수시간 동안 자공내 pH를 3 내지 5.5 사이에서 안정하게 유지시킬 수 있는 완충제를 함유하기도 한다. 완 충제는 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기 약산, 예컨대 붕산, 락트산, 아스코르브산, 시트르산, 또는 아세트산 중에서 선택된 약산을 각각의 해당 나트륨염 또는 또는 사용된 약산의 콘쥬게이트 염기의 약학적으로 허용되는 또 다른 염과 복합적으로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 4.2 내지 4.5의 사이에서 pH 완충되며, 바람직하게는 완충제로서 락트산과 소듐 락테이트 또는 아스코르브산과 소듐 아스코르베이트로 이루어진 완충제를 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 제제에 포함될 수 있는 기타 성분으로는 국부용 리프레쉬제로서 향료, 멘톨, 유칼립투스 추출물, 메틸 살리실레이트 또는 살리실레이트류, 히드로코르티손 또는 기타 항염성 스테로이드제 (0.01 내지 500 mg/g), 소염약물, 항미생물제 및 보습제 (EDTA, 도데카에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 등), 에스트리올 (0.001 내지 1 mg/g) 및/또는 기타 호르몬 물질 또는 호르몬 작용을 하는 물질, 옥수수 전분 또는 감자 전분, 비타민, 항산화제, 효소 (히알루로니다제), 헤파리노이드, 리코데인 및 기타 국부 마취제, 식물 추출물 (Belladonna), 아연, 칼슘 및 비스무쓰를 들 수 있다. 세척 및 관주용 수성 배합물 제조를 위해서 사용전 적절한 용매에 용해시킬 동결건조된 미생물을 함유하는 용기가 개별적으로 구비된 작은 병을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제로 독성이 전혀 없으며 전신 흡수를 일으키지 않으므로 임신한 환자에게도 투여가 허용될 뿐만 아니라 항진균제 및 항세균제에 알레르기 증상을 갖는 환자에게도 투여될 수 있다.

이제까지의 임상 경험에 따라, 취침 전 정제, 크림 및 페싸리 형태의 본 발명의 조성물을 투여한 다음, 이튿날 아침 세척 (lavage)하는 것이 특히 적절하고 효과적인 것으로 생각된다.

이제까지 본 발명을 일반적인 방식으로 설명하였으나, 다음에 제시된 구체적인 실시예를 참조하면 본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다. 다음의 실시예들은 오직 설명 목적을 위해 제시된 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

HeLa 세포에 대한 락토바실러스의 부착

American Type Culture Colloection (ATCC)로부터의 여러 가지 락토바실러스 균주들의, 자궁경부의 인체 암종으로부터 기원하는 세포주인 HeLa 세포에 부착할 수 있는 능력을 시험하였다. HeLa 세포들을 10% (v/v) 소의 태아혈청 (FBS)이 첨가된 MEM (최소 필수 배지:Minimal Essential Medium)이 함유된 조직배양 보틀 중 단층으로 유지하였다. 부착 반응은 각 웰에 조직 함유 멸균 덮개 슬라이드 (24 x 24 mm)에 대해 다중-웰 배양판을 이용하여 수행하였다. 각 웰 당 1.2 x 10⁵ 세포/mL 농도의 HeLa 세포 현탁액 1 ml를 접종하고 플레이트를 5% CO₂ 분위기 중 37℃에서 24시간 인큐베이션시켰다. 부착 테스트에 앞서, 모든 세균 균주들을 MRS 브로쓰 서브배양액 (Difco사) 중에 배양시켰다. 혐기적 조건 (15% CO₂) 하, 37℃에서 24시간 인큐베이션시킨 후, 세균들을 새로운 브로쓰에서 "강화"시킨 다음 동일한 실험 조건 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 혐기적 환경은 "Anaerogen" (Oxoid사) 특수백을 함유하는 항아리 중에서 세균을 배양함으로써 달성하였다. 부착 테스트를 위해, MEM 중 세균 현탁액의 여러 가지 희석액을 마이크로친공기성 (microaerophilic) 조건 하, 37℃에서 1시간 동안 세포 단층상에 인큐베이션시켰다. PBS에서 수차례 세척하여 부착하지 않은 미생물들을 제거한 후, 세포들을 웰 당 0.4 ml의 May Grumwald를 이용하여 4분간 고정시킨 다음, 광학 현미경으로 검사하기에 앞서, 15분간 anffh 희석된 Giemsa로 세척하였다. 부착 세균을 갖는 세포의 백분율과 세포 당 부착 세균의 수에 기초하여 프로세싱 농도를 선택하였다. 최대 부착은 5 x 10⁹ 세균/ml의 농도에서 이루어졌다.

얻어진 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1의 결과는 시험된 락토바실러스가 HeLa 세포에 부착할 수 있음과, 숙주 세포에 대해 여러 가지 상이한 부착도를 나타냄을 가리킨다. 최고의 부착도는 락토바실러스 브레비스(L. brevis)와 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스 (L. salivarius subs. salicinius)종에서 얻어졌다. 락토바실러스 카제이(L. casei)는 부착도가 낮을 뿐만 아니라 침입성이 있기 때문에 본 발명의 약학적 조성물을 제조하는데 채택하지 않는다.

HeLa 세포에 대한 여러 가지 락토바실러스 균주들의 부착

락토바실러스	세균 부착
락토바실러스	세포 당 부착된 세균의 수	세균이 부착된 세포의 %	침입성 (a)
A)락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) (ATCC 11742)	15	60	-
B) 락토바실러스 브레비스(L. brevis) (ATCC 4006)	35	100	-
C)락토바실러스 브레비스(L. brevis) (ATCC 14869)	35	100	-
D)락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) (ATCC 33197)	10	45	+/-
E)락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) (ATCC 9857)	5	16	-
F)락토바실러스 카제이(L. casei) (ATCC 8530)	8	19	+

정량적인 세균 부착은 세균이 부착된 300개의 무작위적으로 선택된 세포들의 백분율 및 세포 당 세균이 부착된 평균 수로서 표시된다.

(a) + = 침입성; +/- = 약간 침입성; - = 비침입성

실시예 2

락토바실러스의 항-캔디다 효과

여러 가지 종류의 락토바실러스 종이 HeLa 세포에 대한 부착에 있어서, 캔디다 알비칸스(C. albicans) (및 따라서 캔디다 알비칸스 (C. albicans)감염성에 대한)를 경쟁적인 방식으로 방해하는 능력을 시험하였다.

숙주세포에 대한 진균(Mycetes) (캔디다 알비칸스 (C. albicans))의 부착 수준에 미치는 락토바실러스의 영향을 평가하기 위해, 멸균 덮개 슬라이드를 포함하는 24-웰 플레이트 중에 생육시킨 단층 HeLa 세포에, 각각 5 x 10⁹ 세균/ml 및 5 x 10⁸ 진균(Mycetes)/ml의 최종 농도로 PBS 중에 희석된, 락토바실러스와 캔디다 알비칸스 (C. albicans) (이 연구에서 각각 CA2 및 CA3로 칭해지는, 인간의 질로부터 분리된 2가지 임상 샘플)의 혼합물 0.1 ml를 접종하였다. 마이크로친공기성 조건 하, 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 세포들을 May Grunwald 및 Giemsa로 고정된 PBS 중에서 5회 세척하였다. 이어서 슬라이드를 광학 현미경으로 관찰하고 (1000X 배율) HeLa 세포에 부착한 미생물의 수준을 평가하였다. 결과를 표 2에 제시하였다. 표 2의 결과로부터, 시험된 모든 락토바실러스가 HeLa 세포에 대한 캔디다 알비칸스(C. albicans)의 부착을 감소시킬 수 있음과, 최고의 억제활성도는, 캔디다가 부착된 세포의 수를 약 50% 감소시키고 진균(Mycetes)/ 세포의 수를 콘트롤 넘버의 약 절반 수준으로 감소시킨, 락토바실러스 브레비스(L. brevis) ATCC 4006에 의해 얻어짐을 알 수 있다.

락토바실러스에 의한 HeLa 세포에의 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 부착의 경쟁적 배제

미생물	Mycete 부착 세포 %	세균 부착 세포 %	세포 당 Mycetes의 평균 No.	세포 당 세균의 평균 No.
CA2	68		5
CA3	61		7
A)락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) ATCC 11742		54		10
B)락토바실러스 브레비스(L. brevis) ATCC 4006		95		20
C)락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) ATCC 9857		15		6
D)락토바실러스 카제이(L. casei) ATCC 8530		13		8
CA2+A	52	55	3	10
CA3+A	43	54	3	11
CA2+B	44	99	3	20
CA3+B	34	99	2	20
CA2+C	48	15	4	6
CA3+C	57	16	5	5
CA2+D	61	12	5	7
CA3+D	58	12	5	7

경쟁적-배제 시험을 위해, 락토바실러스와 진균(Mycetes)은 각각 5 x 10⁹/웰 및 5 x 10⁹/웰의 최종농도로 이용하였다.

실시예 3

락토바실러스에 의한 과산화수소의 생산

5가지 락토바실러스 종의 H₂O₂ 생산능력을 시험하였다. 테트라메틸벤지딘과 함께 한천-한천 플레이트 상에서 세균을 배양시켰다. 혐기 조건 하, 37℃에서 3일간 단지에서 인큐베이션시킨 후, 한천-한천 플레이트를 공기에 노출시켰다.

이러한 방식으로, 배양액 배지 중에 존재하는 퍼옥시다제가 락토바실러스에 의해 생산된 H₂O₂와 반응한다. H₂O₂-생산 콜로니가 청색으로 착색되는 것으로부터, 후속적으로 테트라메틸벤지딘의 산화가 일어남을 알 수 있다.

표 3에 그 결과를 나타내었다. 표 3으로부터, 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) ATCC 11742와 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) ATCC 3857은 H₂O₂를 생산하였음을 알 수 있다.

락토바실러스 카제이(L. casei) ATCC 8530은 H₂O₂를 생산한 것으로 나타나지 않았다. 테스트된 다른 균주들은 반응이 결여되었다. 이러한 결과는 락토바실러스에 의한 H₂O₂ 생산과 HeLa 세포에 대한 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 부착의 세균에 의한 경쟁적 배제 사이에 아무런 상관관계가 존재하지 않음을 가리키는 것이다.

락토바실러스에 의한 과산화수소의 생산

락토바실러스	H₂O₂의 생산
A) 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) (ATCC 11742)	+
B) 락토바실러스 브레비스(L. brevis) (ATCC 4006)	-
C) 락토바실러스 브레비스(L. brevis)(ATCC 14869)	-
D) 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) (ATCC 3857)	+
E) 락토바실러스 카제이(L. casei) (ATCC 8530)	-

+ = 모든 세균 콜로니가 청색으로 착색됨

+/- = 담청색으로 착색됨

- = 착색된 콜로니 없음

설명 목적을 위해, 다음에 바람직한 본 발명의 약학적 조성물의 몇가지 구체예를 제시하지만, 이들로 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 이들 조성물은 몇가지 미생물 종의 조합으로 구성된 미생물-배양 동결건조 산물을 질내로 투여하기 위한 정 제, 페싸리, 크림 및 액상 조성물을 제조하기 위한 것이다.

질에 투여하기 위한 제제의 구체예

실시예 4

락토바실러스 브레비스(L. brevis) ATCC 4006 및 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) ATCC 11742가 1:1의 비율로 혼합된 동결건조 미생물 배양 생성물 (1 x 10¹⁰ CFU/g)과 담체로 이루어진 쾌속방출형의 약비등성 (slightly effervescent) 정제를 제조하기 위한 단위형 조성물:

동결건조된 미생물 배양 생성물 500 mg

락토스 350 mg

옥수수 전분 200 mg

아디프산 67 mg

중탄산나트륨 67 mg

스테아르산 나트륨 11 mg

스테아르산 3 mg

콜로이드상 실리카 2 mg

상기 조성을 갖는 정제를 제조하기 위해, 과립물 또는 펠렛을 먼저 제조할 필요가 있다. 미리 300 μm 메쉬 체로 걸른 상기 동결건조된 미생물 배양 생성물 500.0 g을, 윤활처리한 펠렛에 첨가하고 15분간 다시 혼합하였다. 이렇게 얻어진 펠렛을 달걀형 성형 펀치가 구비된 회전식 압착기를 이용하여 압착시켜, 평균 중량 120 mg 의 질 투여용 정제를 얻었다.

정제의 붕괴시간은 Farmacopea Ufficiale Italiana에 설명된 장치를 이용하여 측정할 때, 약 15분 이었다.

실시예 5

실시예 4에 설명된 것과 동일한 동결건조된 미생물 배양 생성물과 담체로 이루어진 서방형 정제를 제조하기 위한 단위형 조성물:

동결건조된 미생물 배양 생성물 500 mg

만니톨 560 mg

히드록시프로필 메틸셀룰로스 80 mg

탈크 18 mg

스테아르산 마그네슘 19 mg

콜로이드상 실리카 3 mg

270 μm 메쉬 위에 동결건조된, 스폰지상의 미생물 배양 생성물 매스를 얹어서 측정하고; 측정된 생성물에 279 μm 메쉬 상에서 미리 걸른 만니톨, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 탈크, 스테아르산 마그네슘 및 콜로이드상 실리카를 첨가하였다. 전체 매스를 Turbular T2A형 믹서에서 30분동안 분말화시켰다. 이렇게 얻어진 혼합물을 달걀형 성형 펀치가 구비된 회전식 압착기를 이용하여 압착시켜, 평균 중량 1200 mg의 질 투여용 정제를 얻었다.

얻어진 정제는, Farmacopea Ufficiale Italiana에 설명된 장치를 이용하여 측정하자, 붕괴시간이 약 30분이었다.

실시예 6

실시예 4에 설명된 것과 동일한 동결건조된 미생물 배양 생성물과 담체로 이루어진 2층형 (한 층은 쾌속방출층이고 다른 층은 서방층임) 정제의 제조.

쾌속방출층 제조를 위한 단위형 조성물 (이것은 약비등성 층이다):

동결건조된 미생물 배양 생성물 250 mg

락토스 240 mg

옥수수 전분 41 mg

아디프산 30 mg

중탄산나트륨 30 mg

스테아르산 마그네슘 6 mg

스테아르산 2 mg

콜로이드상 실리카 1 mg

서방층 제조를 위한 단위형 조성물:

동결건조된 미생물 배양 생성물 250 mg

만니톨 280 mg

히드록시프로필 메틸셀룰로스 50 mg

탈크 9 mg

스테아르산 마그네슘 10 mg

콜로이드상 실리카 1 mg

쾌속방출층에 사용될 펠렛은 실시예 4에 설명된 공정에 따라 제조하였고; 서방층에 사용될 혼합물은 실시예 5에 설명된 공정에 따라 제조하였다.

쾌속방출층에 사용될 펠렛과 서방층에 사용될 혼합물을, 굽은 달걀형 펀치가 구비된 적절한 압착기의 2개의 별개의 로딩 호퍼에 로딩시켜 2층짜리 정제 (Manesty Layer Press 형)를 만들었다.

각 층이 600 mg 씩이고 각각 250 mg의 동결건조된 미생물 배양 생성물을 함유하는 평균 중량 1200 mg의 2-층 정제가 얻어지도록 기계를 조작한다. 얻어진 2-층 정제를 Farmacopea Ufficiale Italiana에 설명된 장치를 이용하여 붕괴시험하자, 쾌속방출층의 평균 붕괴시간은 약 15분이고 서방층의 붕괴시간은 30-40분인 것으로 나타났다.

실시예 7

활성성분: 실시예 4에서 제조된 바와 같은 동결건조된 미생물 배양 생성물 1 g.

부형제: 반합성 글리세라이드와 감자 전분 2.5 g.

실시예 8

질 투여용 크림 (10g 튜브)

부형제: 수소첨가된 라놀린(2 g), 바셀린 오일 (2 g), 디메틸 폴리실록산 (3 g), SiO₂ (4 g).

실시예 9

저장기가 달린 작은 병

각각의 작은 병은 다음을 함유한다:

a) 저장기: 실시예 4에서 설명된 바와 같은 동결건조된 미생물 배양 생성물.

b) 작은 병 (10 ml): 글리세롤 3 g 및 총 10 ml가 되도록 하는데 충분한 양의 물.

실시예 10 내지 15

락토바실러스 브레비스(L. brevis) ATCC 14869와 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(L. salivarius subs. salicinius) ATCC 11742 및 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) ATCC 9857이 1 : 1 : 1의 비율로 혼합된 동결건조된 미생물 배양 생성물 (농도 1 x 10¹⁰CFR/g)을 사용한 것을 제외하고, 각각 실시예 4 내지 9와 동일한 방식을 반복하였다.

임상 연구

질 부위에 다음 중 한가지 이상의 증상 및 징후를 나타낸다는 임상적인 특징을 갖는 출산가능한 연령의 여성 18명에 대해 연구를 수행하였다: 가려움, 통증, in situ 통증, 악취가 나는 희끄무레한 분비물, 음부 가려움증, 국부적 홍반.

제외 기준은 다음과 같았다: 폐경기 여성, 당뇨병 환자, 입증된 에스트로겐 과소증 환자, 알코올중독자 및 진행중인 약물중독자, 연구 개시 14인 이전에 항생제를 복용한 자.

모든 환자들에 대해 연구를 위한 모집시, 치료 말기 및 치료 중단 14일 후에 각각 임상 평가와 세균학적 평가를 실시하였다.

임상 데이타는 증상평가 및 객관적 평가에 의해 수행하였고; 세균학적 데이타는 질분비물 얼룩과 배면 질단개 (rear fornix vaginae)로부터 탐폰을 이용하여 채취한 생물학적 시료의 배양 시험에 의해 얻었다. 모든 환자들은 미생물 배양물 ( 1 x 10¹⁰ CFU/g)의 동결건조된 생성물로 이루어진 국소용의 질 정제를 이용하여 치료하였다.

미생물 배양체의 동결건조물은 2종의 동결건조된 세균 즉: 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 및 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스 (L. salivarius subs. salicinius)(1:1의 비율)로 구성하였다.

이어지는 치료 스케쥴은 정제를 더 잘 녹이기 위해 약간 거품이 나는 1200 mg의 서방정 (실시예 4 참조) 1개를 7일 밤 연속하여 취침전 질내에 삽입하는 것으로 이루어지는 7일간의 1 치료 사이클로 이루어진다. 상기 질정제는 국소용 (즉 질내용)이며 동결건조된 세균 균주의 중량과 환자의 체중과의 비율은 결과적으로 중요하지 않다.

치료전

▶ 18명의 환자 중 16명이 연구를 성공적으로 마쳤다 (환자 중 2명은 후속적인 대조군으로서 응하지 않았으므로 제외되었다).

▶ 7명의 환자는 지. 바기날리스(G. vaginalis)에 대해 양성반응을 나타냈으며, 이들 중 2명에게는 캔디다 알비칸스(C. albicans)도 존재하는 것으로 밝혀졌다.

▶ 4명의 환자에서는 캔디다 알비칸스(C. albicans)만이 주목되었다.

▶ 나머지 5명의 환자에서는 주로 그램-양성 구균으로 된 비특이적인 세균총이 존재하였다.

치료 말기

▶ 지. 바기날리스(G. vaginalis)는 6명의 환자들에게서 사라졌으나, 이들 중 2명은 뒤이은 연구 (follow-up)에서 다시 원상복귀된 것으로 나타났다 (성공하였으나 재감염).

▶ 1명의 환자는 치료효과를 보지 못하였다 (실패).

캔디다 알비칸스(C. albicans)에 감염된 4명의 환자들에 있어서:

▶ 2명의 환자는 부분적으로 치료가 성공을 거두었고,

▶ 2명의 환자는 완전히 치료되었다 (성공).

▶ 그램-양성 구균에 의한 비특이적 질염에 걸려있던 5명의 환자에서는, 미생물학적 성공이 돋보였다.

미생물학적 평가 (16명에 대한 평가결과)

성공	11
부분적 성공	2
재감염 있는 성공	2
초감염	0
실패	1
계	16

임상학적 관점에서 볼 때:

▶ 16명 중 9명의 환자는 완전히 회복되었고,

▶ 5명은 증상학적 견지에서 볼 때 증세가 유의적으로 개선된 것으로 나타났으며

▶ 1명은 나중에 다시 재발하기는 하였고

▶ 오직 1명의 환자만이 치료에 실패하였다 (표 5 참조).

임상 평가 (16명에 대한 평가결과)

회복	9
개선	5
실패	1
재발	1

어떠한 환자에서도 부작용은 일어나지 않았으며 모든 환자에게서 약물 관용성은 우수한 것으로 판단되었다 (표 6 참조)

약물 관용성 평가

매우 우수	16
우수	0
충분함	0
부적합	0

실시예 4 내지 15에 따라 얻은 모든 약학적 조성물은 질 이상증상 및 질염을 앓고 있는 환자들을 치료하는데 매우 유용한 것으로 밝혀졌다.

Claims

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락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis) 및 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(Lactobacillus salivarius subs. salicinius)종과의 락토바실러스(Lactobacillus) 조합물을 함유하는, 질 감염을 치료하기 위한 질내 투여용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 락토바실러스(Lactobacillus)의 조합물이 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii) 락토바실러스 카테나포르미(Lactobacillus catenaforme), 락토바실러스 미누투스(Lactobacillus minutus) 및 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri) 중에서 선택된 한가지 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 종을 추가로 포함하는 것이 특징인 조성물.
제7항에 있어서, 상기 락토바실러스(Lactobacillus)의 조합물이 락토바실러스 브레비스(Lactobaccilus brevis), 락토바실러스 살리바리우스 서브스. 살리시니우스(Lactobacillus salivarius subs. salicinius) 및 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri) 종으로 구성된 것이 특징인 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 락토바실러스(Lactobacillus)의 조합물이 10⁷ 내지 10¹³ CFU/g의 농도로 사용되는 것이 특징인 조성물.
제7항에 있어서, 액체형, 크림형, 또는 연고형, 또는 페싸리 또는 질 투여용 정제와 같은 고체형인 것이 특징인 조성물.
제11항에 있어서, 통상적인 부형제 및 첨가제와 결합된, 상술한 락토바실러스(Lactobacillus) 종을 함유하는 2개 층을 포함하는 정제 형태로서, 여기서, 최외곽층 세균의 방출 속도는 가장 안쪽 층의 세균의 방출 속도보다 빠른 것이 특징인 조성물.