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KR100663038B1 - 외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 ｐＭＳＧ1220 - Google Patents

외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 ｐＭＳＧ1220 Download PDF

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KR100663038B1
KR100663038B1 KR1020040057021A KR20040057021A KR100663038B1 KR 100663038 B1 KR100663038 B1 KR 100663038B1 KR 1020040057021 A KR1020040057021 A KR 1020040057021A KR 20040057021 A KR20040057021 A KR 20040057021A KR 100663038 B1 KR100663038 B1 KR 100663038B1
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Abstract

본 발명은 외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 pMSG1220에 관한 것으로, 상기 벡터는 외부유전자를 발현 및 단백질을 분비하는데 매우 유용하며 특별히 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 효과적으로 발현하고 발현 단백질을 효율적으로 분비하는 뛰어난 효과가 있다.
AmpC β-lactamase, 발현, 분비, 발현 벡터, 분비 벡터, 엔테로박터, 감염

Description

외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 ｐＭＳＧ1220{A vector pMSG1220 for expressing and secreting foreign genes}
도 1은 본 발명 벡터를 위한 개열지도를 나타낸다. 여기에서 (A)는 벡터 pMSG1217, (B)는 벡터 pMSG1218, (C)는 벡터 pMSG1219, (D)는 재조합 벡터 pMSG1220을 위한 개열지도를 나타낸다.
도 2는 6개의 임상균주에서 bla AmpC의 PCR 산물들의 밴딩 패턴을 나타낸다.
도 3은 16개의 ampC β-락타메이즈 유전자들의 필로그램(Phylogram)을 나타낸다.
본 발명은 외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 pMSG1220에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔테로박터속(Enterobacter spp.) 유래의 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 발현 및 단백질을 분비하는 벡터 pMSG1220에 관한 것이다.
세균에 의해서 생성되는 β-락타메이즈(β-lactamase)(EC 3.5.2.6)는 세균의 세포벽 합성을 저해하는 항생제(penicillins, cephalosporins, 또는 monobactams) 의 β-락탐 고리(β-lactam ring)를 분해한다. 특히, 임상에서 분리된 장내세균에 속하는 균주에 있어서 β-락타메이즈의 생성은 β-락탐(β-lactam)계 항생제에 내성을 가지게 하는 기작 중 가장 대표적인 형태이다(Sanders et al., Clin. Infect. Dis. 15, 824-839, 1992).
다양한 β-락타메이즈들이 아미노산 상동 관계(amino acid homology)에 의거 A, B, C, D의 네 부류로 분류 되고 있다(Bush et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233, 1995). 다양한 β-락탐계 항생제(cephamycins 및 broad-spectrum cephalosporins)에 내성을 가지게 하는 AmpC β-락타메이즈(AmpC β-lactamase)는 C 그룹의 β-락타메이즈에 속한다.
엔테로박터 속(Enterobacter spp.), 시겔라 속(Shigella spp.), 세라시아 마르세센스 종(Serratia marcescens), 시트로박터 프륜디아 종(Citrobacter freundii), 모르가넬라 모르가니 종(Morganella morganii), 프로비덴시아 속(Providencia spp.), 슈도모나스 아에루기노사 종(Pseudomonas aeruginosa), 에스체리치아 콜리 종(Escherichia coli) 등의 균주가 염색체성 AmpC β-락타메이즈를 생성함이 보고되어 있다(Livermore, D.M., Clin. Microbiol. Rev. 8, 557-584, 1995).
엔테로박터(Enterobacter) 속은 병원에서 획득되는 병원감염균(nosocomial pathogens)으로서 점차로 그 심각성이 증가되고 있다(Sanders et al., Clin. Microbiol. Rev. 10, 220-241, 1997). 엔테로박터에 의한 원내감염의 중요한 원인은 항생제의 오·남용, 장기입원, 중증감염에 의한 신체의 약화, 면역기능의 저하, 치료용 기구의 신체내부 삽입 등임이 밝혀졌다(Bauernfeind et al., Antimicrob. Agents Chemother. 40, 1926-1930, 1996). 엔테로박터 임상 균주에서 AmpC 내성요인(AmpC resistance determinants)의 확산이란 측면에서 AmpC 내성 기작을 규명하는 것은 매우 중요하다.
이에 본 발명에서는 상기와 같은 점을 고려하여 개열지도 1에 나타낸바와 같이 벡터 pMSG1220을 제작하여 상기 벡터를 이용하여 국내 병원에서 분리된 엔테로박터 속(Enterobacter spp.)에서 새로운 AmpC β-락타메이즈의 유전형 및 그 특성을 조사하여 본 발명 벡터가 외래유전자를 발현 및 단백질을 분비시키는데 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 외부유전자 특별히 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 발현 및 단백질을 분비하는 개열지도 1에 개시된 벡터 pMSG1220을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 개열지도 1에 나타낸 바와 같이 벡터 pMSG1220을 제작하여 상기 벡터를 이용하여 국내 병원에서 분리된 엔테로박터속(Enterobacter spp.)에서 새로운 AmpC β-락타메이즈의 유전형 및 그 특성을 조사하여 본 발명 벡터가 외래유전자를 발현 및 단백질을 분비시키는데 유용함을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 외부 유전자를 발현 및 단백질을 분비하는데 매우 유용한 개열지도 1에 개시된 벡터 pMSG1220을 제공한다.
본 발명은 특별히 엔테로박터속(Enterobacter spp.) 유래의 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 발현 및 단백질을 분비하는 개열지도 1에 개시된 벡터 pMSG1220을 제공한다.
본 발명에서는 상기 벡터 pMSG1220을 이용하여 임상균주인 엔테로박터 속(Enterobactor spp.) 균주가 생성하는 염색체성 AmpC β-락타메이즈의 유전자형 및 진화적 측면을 항생제 감수성 시험, pI값 측정, DNA 염기서열 분석, 진화적 유연관계를 밝힘으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 항생제에 대한 최소억제농도 조사는 아목시실린(amoxicillin) 등 11종의 β-락탐계 항생제에 대한 최소억제농도는 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards criteria, 11th informational supplement M100-A11, 2001)의 기준에 따라 한천배지희석법을 이용하여 측정하였다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사용균주의 특성 조사
새로운 AmpC β-락타메이즈를 생성하는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) 균주 5 종류와 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) 균주 1 종류를 대한민국 부산 소재의 고신대 복음병원에서 1998년 6월부터 1999년 5월 사이에 분리하여 사용하였으며, 분리된 균주들은 종래의 방법(Farmer, J.J. III. 1999. Enterobacteriaceae: introduction and identification, p. 442-458. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC, Washington.) 혹은 바이텍 지엔아이 카드(Vitek GNI card)(bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood, MO, USA)를 이용하여 동정하였다. 이들 균주들에 대한 설명은 하기 표 1에 기재하였다. 이. 콜리(E. coli) ATCC 25922는 최소억제농도(minimal inhibitory concentration; MIC) 측정을 위한 참조균주로, 이. 콜리(E. coli) BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Wisconsin, WI, USA)는 발현 숙주(expression host)로 사용하였다.
6 종류의 임상 균주의 특성
균주 (Strain) 종 (Species) 감염타입 β-락탐의 최소억제농도(MICs)(mg/L)
AMX AUG LOT TAX TAZ ATM FEP IMP MER FOX TTN
K9973 E. cloacae UTI >256 128 >256 32 256 256 4 0.25 0.25 256 256
K99230 E. cloacae Pneumonia >256 256 >256 32 128 128 2 0.5 0.125 128 256
K992004.1 E. cloacae Wound infection >256 256 >256 16 256 256 4 0.25 0.125 256 256
K995120.1 E. cloacae Wound infection >256 128 >256 32 128 128 2 1 0.125 256 256
K9911729 E. aerogenes Pneumonia >256 >256 >256 32 64 128 1 0.5 0.25 >256 128
K9914325 E. cloacae UTI >256 128 >256 32 128 128 4 0.5 0.125 128 64
[주] 1. AMX는 아목시실린, AUG는 아목시실린-클라불라닉산, LOT는 세팔로틴, TAX는 세폭탁심(cefotaxime), TAZ는 세프타지딤, ATM은 아즈트레오남, FEP는 세페핌(cefepime), IMP는 이미페넴(imipenem), MER은 메로페넴(meropenem), FOX는 세폭시틴, TTN은 세포테탄을 의미함. 2. UTI는 요도감염, Pneumonia는 폐렴을 통한 감염, Wound infecion은 상처를 통한 감염을 의미함.
6개 임상균주는 세폭시틴(cefoxitin, FOX), 세포테탄(cefotetan, TTN), 세팔로틴(cephalothin, LOT), 아목시실린(amoxicillin, AMX), 아목시실린-클라불라닉산(amoxicillin-clavulanic acid, AUG), 세프타지딤(ceftazidime, TAZ) 및 아즈트레 오남(aztreonam, ATM)에 높은 내성을 보였다(표 1 참조). 염색체성 β-락타메이즈들(chromosomal β-lactamases)을 생성하는 엔테로박터 속(Enterobacter spp.) 균주에서 브로드-스펙트럼 페니실린(broad-spectrum penicillins) 및 브로드-스펙트럼 세팔로스포린스(broad-spectrum cephalosporins)에 대한 내성이 계속적으로 나타나고 있다(Pitout et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42, 596-600, 1998). 항생제 감수성에 대한 양상은 6개 임상균주가 AmpC β-락타메이즈를 생성함을 의미한다.
모든 임상균주에서 염색체성 DNA의 특정위치에 대한 프라이머 쌍(primer pairs)에 의한 PCR 산물은 1165 bp(primer AmpCF1, AmpCR1; 도 1A), 871 bp(primer A1, A2; 도 1B) 및 586 bp (primer A3, A4; 도 1B)이며 모두 다 예상 크기와 같았다. 6개 균주의 내성 표현형을 설명하기 위해 각 균주들의 내성 유전자형을 PCR을 통해 증폭된 프래그먼트(fragment)를 직접 시퀀싱(direct sequencing)하여 분석하였다.
DNA 시퀀싱의 결과를 토대로 볼 때, 6개 임상균주는 새로운 β-락타메이즈 유전자를 갖고 있어서 유전자은행 염기서열 데이터베이스(GenBank nucleotide sequence database)에 모두 등록되었다. 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9992004.1의 경우는 AF411144, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K995120.1의 경우는 AF411145, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K99230의 경우는 AF411146, 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) K9911729의 경우는 AF411147, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9973의 경우는 AF411148, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9914325의 경우는 AF411149이다.
추론된 아미노산 서열을 분석한 결과에 의하면, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9992004.1 및 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K995120.1의 β-락타메이즈는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) MHN1(Bush et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233, 1995)의 염색체 β-락타메이즈(chromosomal β-lactamase)와 동일하였고 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K99230, 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) K9911729, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9973 그리고 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9914325의 β-락타메이즈는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) MHN1(Bush et el., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233, 1995)의 염색체성 β-락타메이즈와 아미노산 서열 상동성이 각각 98.5, 98.5, 98.2, 98.2%로 높게 나타났다. 디그옥시게닌(digoxigenin)으로 표지된 1165-bp PCR 산물에 의한 써던 하이브리디제이션(Southern hybridization) 실험 결과, 6개 임상균주의 염색체 DNA 부위에 각각의 PCR 산물이 결합되었다. 이러한 결과로부터 6개 임상균주가 생성하는 β-락타메이즈는 염색체 AmpC β-락타메이즈임을 알 수 있었다.
실시예 2: PCR 증폭 및 DNA 서열 분석
PCR 수행을 위해 5개 AmpC-타입(bla AmpC) 유전자를 각각 프라이머 계산 프로그램(Primer Calculator program)(Williamstone Enterprises, Waltham, MA, USA)을 사용하여 얼라인먼트(alignment)해서 일치하는 염기서열(consensus sequence)을 확인하여 고안하였다. 고안된 프라이머는 하기 표 3의 처음 6개이다. 즉, bla AmpC 유전자 분리를 위한 프라이머는 AmpCF1, AmpCR1, A1, A2, A3 및 A4이다. DNA 증폭 조건 및 DNA 시퀀싱은 Lee 등의 방법을 따랐다(Lee et al., J. Antimicrob. Chemother. 49, 269-273, 2002, Lee et al., Lett. Appl. Microbiol. 31, 307-312, 2000). DNA 서열분석은 DNASIS for Windows(Hitachi Software Engineering America Ltd., San Bruno, CA, USA)를 이용하였다. 염기서열 및 추론된 아미노산 서열과 유사한 서열의 조사는 NCBI 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 실행하였다. 조셉 펠센스테인(Joseph Felsenstein)(Department of Genetics at the University of Washington)의 필립 패키지(PHYLIP package)에 있는 프로디스트(PRODIST)(Protein Distance Matrix) 및 피치(FITCH)(Fitch-Margoliash and Least-Squares Distance Methods) 프로그램, 16개 ampC 유전자들의 클러스탈 더블유 멀티플 시퀀스 얼라인먼트(CLUSTAL W multiple sequence alignment)(Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680, 1994)를 이용하여 진화적 유연관계(phylogenetic tree)를 조사하였다. 16개 ampC 유전자들은 하기 표 2에 제시되었다.
Wizard genomic DNA purification kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하 여 획득한 genomic DNA를 나일론 멤브레인(nylon membrane)(Hybond-N; Amersham International, Buckinghamshire, England)으로 옮겼으며 프라이머 AmpCF1과 AmpCR1간의 PCR 산물은 디그옥시게닌(digoxigenin)(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)을 이용하여 표지하였다. 하이브리다이제이션은 68℃에서 Roche Applied Science사의 digoxigenin kit에서 권고하는 방법으로 수행하였다.
ampC β-락타메이즈의 PCR 증폭 및 계통발생학적 조사를 위하여 사용된 유전자 염기서열 기탁 번호
β-락타메이즈 출처(기탁번호; Accession number) 비고
EcloQ908R 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) Q908R (X08081) 염색체성
EcloMHN1 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) MHN1 (X08082) 염색체성
EcloCHE 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) CHE (AJ278994) 염색체성
EcloGC1 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) GC1 (D44479) 염색체성
EcloGN747 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) GN747 (AB016611) 염색체성
EcloOUDhy 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) OUDhy (AJ278995) 염색체성
EcloP99 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) P99 (X07274) 염색체성
Eare1 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) (AF211348) 염색체성
EcloK992004.1 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K992004.1 (AF411144) 염색체성
EcloK995120.1 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K995120.1 (AF411145) 염색체성
EcloK99230 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K99230 (AF411146) 염색체성
EcloK9911729 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9911729 (AF411147) 염색체성
EcloK9973 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9973 (AF411148) 염색체성
EcloK9914325 엔테로벡터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9914325 (AF411149) 염색체성
MIR-1 클레브시엘라 퓨모니에(Klebsiella pneumoniae) (M37839) 플라스미드성(Plasmid-encoded)
ACT-1 클레브시엘라 퓨모니에(Klebsiella pneumoniae) MCQ-95 (U58495) 플라스미드성(Plasmid-encoded)
증폭, 벡터 제조 및ampC유전자 클로닝을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드
프라이머 (Primer) 서열(Sequence) 뉴클레오티드 위치 (Nucleotide position) 증폭 크기(size) (bp)
AmpCF1 5'-TCGGAATTCCGGAGGATTACTGATGATGA-3 ' 1 1165
AmpCR1 5'-TTAGTCGACAATGTTTTACTGTAGCGCCTCG-3' 1165
A1 5'-CTATAAGTAAAACCTTCACCGG-3 ' 264 871
A2 5'-TATGCCGCCTCAACGCGTG-3' 1134
A3 5'-TGCGCTTTTATCAAAACTGGCA-3' 468 586
A4 5'-GCCACGTAGCTGCCAAACC-3' 1053
C-NdeIF 5'-GTAGACCATATGCAACAACGACAATCCATCCTGTGG-3' 1329 1179
N-XhoIB 5'-GAATGTCTCGAGCTCTTTCTTTCAACCGGCCAAC-3' 151
Up-26b 5'-CTATCATGCCATACCCGCAAAG-3' 1766 608
Sp-His-SacI 5'-GGCCGCTGAGCTCatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgGATGCTGGCATCCACCAC-3' 1159
EK-AmpC-F 5'-CATAGCGGCGAGCTCCATATCgacgacgacgacaagACGCCAGTGTCAGAAAAAC-3' 1227 1137
AmpC-HindIII 5'-GCTAATGCGAAGCTTTTACTGTAGCGCCTC-3' 2364
ampC 유전자 서열 분석을 수행한 결과 하기와 같았다.
본 발명의 벡터 pMSG1219에 ampC 유전자를 삽입한 pMSG1220을 시퀀싱한 결과, 세파마이신-저항 β-락타메이즈(cephamycin-resistant β-lactamase)를 암호화하는 6개 ampC 유전자(bla EcloK992004.1, bla EcloK995120.1, bla EcloK99230, bla EareK9911729, bla EcloK9973, bla EcloK9914325)는 모두 1165 뉴클레오티드들로 구성되었으며 아미노산이 381개인 단백질을 인코딩하였다.
추론된 아미노산 서열을 분석한 결과, 클래스 C β-락타메이즈(class C β-lactamase)만이 특징적으로 갖고 있는 활성부위 잔기인 SXXK(serine-isoleucine- serine-lysine)(Ghuysen, J.M. Annu. Rev. Microbiol. 45, 37-67, 1991) 서열이 있었다. bla EcloK992004.1, bla EcloK995120.1, bla EcloK99230 그리고 bla EareK9911729는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) MHN1의 염색체성 ampC 유전자(blaEcloMNH1)와 매우 큰 상동성을 나타냈다(각각 99.9, 99.7, 99.6 그리고 99.6% 염기서열 상동성). bla EcloK9973 및 bla EcloK9914325는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) Q908R의 염색체성 ampC 유전자(bla EcloQ908R)와 매우 큰 상동성을 나타냈다(각각 99.7, 99.7% 염기서열 상동성). 이런 높은 상동성은 bla EcloK992004.1, bla EcloK995120.1 , bla EcloK99230 그리고 bla EareK9911729는 bla EcloMNH1로부터, bla EcloK9973 및 bla EcloK9914325는 bla EcloQ908R로부터 유래됨을 시사한다.
6개 ampC 유전자 산물 및 다른 AmpC β-락타메이즈간의 아미노산 서열을 비교한 결과, 6개 AmpC β-락타메이즈는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) MHN1의 AmpC와 가장 큰 상동성(98.1~100%)을 나타냈으며 다음으로 MIR-1(Jacoby et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43, 1759-1760, 1999)(86.6~87.1%), ACT-1(Bradford et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41, 563-569, 1997)(87.4~87.7%), 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes)의 AmpC(Preston et al., Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3158-3162, 2000)(74.8~75.1%)와 유사하였다. 지금까지 보고 된 염색체성 클래스 C β-락타메이즈는 36개이다(Barlow, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1190- 1198, 2002). 염색체성 클래스 C β-락타메이즈(세파마이시네이즈; cephamycinase)를 생성하는 균주의 증가는 세파마이신(cephamycin)에 내성인 균주가 장내세균에 확산될 가능성이 높아짐을 의미한다.
진화적 유연관계(phylogenetic tree)를 분석한 결과, 16개의 클래스 C β-락타메이즈는 3개의 서브클래스(subclass)로 구분되었다(도 3 참고). 즉, 1a (EcloMNH1, EcloK992004.1, EcloK995120.1, EcloK99230 및 EareK9911729), 1b (EcloGC1, EcloP99, EcloCHE, EcloQ908R, EcloK9973 및 EcloK9914325) 그리고 1c (EcloOUDhy, Eare1, EcloGN747, MIR-1 및 ACT-1)이다. 이런 결과는 플라스미드성 MIR-1 및 ACT-1이 염색체에 존재하는 bla EcloGN747과 같은 염색체성 ampC 유전자로부터 유래하였음을 의미하며 이는 다른 보고(Sanders et al., Clin. Microbiol. Rev. 10, 220-241, 1997)에 의해서 확증되었다.
실시예 3: 발현·분비 벡터 제조 및 ampC 유전자의 클로닝
발현·분비 벡터 제조과정은 도 1에 제시되었다. 1998년에 고신대 복음병원에서 분리되었으며 세팔로틴(cephalothin), 세폭시틴(cefoxitin), 세포테탄(cefotetan), 세파만돌레(cefamandole), 세프타지딤(ceftazidime), 아목시실린-클라불라닉산(amoxicillin-clavulanic acid) 및 아즈트레오남(aztreonam)에 내성을 보였던 이 콜리(E. coli) K983802.1이 지니고 있는 플라스미드인 pYMG-2(Lee et al., J. Antimicrob. Chemother. 43, 269-273, 2002)를 PCR 템플레이트(template) 로 이용하였다. 이용된 프라이머는 C-NdeIF 및 N-XhoIB이었다. 두 프라이머는 끝부분에 NdeI(C-NdeIF) 및 XhoI(N-XhoIB)의 인식 서열(recognition sequence, bold-type)을 포함하고 있다(표 3 참조).
모든 제한 효소(restriction enzyme)들은 Roche Applied Science(Mannheim, Germany)의 제품을 사용하였다. C-NdeIF 및 N-XhoIB 프라이머는 structural gene(CMY-11)(Lee et al., J. Antimicrob. Chemother. 49, 269-273, 2002)의 양 끝부분에 존재하며 original gene의 모든 조절 부위는 다음의 클로닝 과정에서 제거되었다.
PCR 증폭은 DNA thermal cycler(mod 2400; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA)을 이용하여 Lee 등의 방법(Lee et al., J. Appl. Microbiol. 95, 744-752, 2003)을 사용하였다. 원하는 1179 bp 크기의 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)을 통해 확인하였다. NdeI/XhoI에 의해 digestion된 PCR 산물은 NdeI/XhoI로 자른 pET-30a(+) 벡터(Novagen, Wisconsin, WI, USA)에 라이게이션(ligation)되었다. 형성된 플라스미드를 pMSG1217로 명명하였다(도 1A).
발현·분비 벡터제조를 위한 PCR 주형(template)은 pMSG1217, 프라이머는 UP-26b(표 3에서 굵게 표시된 SphI 인식 부위를 함유) 및 Sp-HIS-SacI(표 3에서 굵게 표시된 SacI 인식 부위를 함유)를 사용하여 608 bp 크기의 PCR 산물을 얻었다. SphI/SacI에 의해 digestion된 PCR 산물은 SphI/SacI로 자른 pET-30a(+) 벡터에 라이게이션되었다. 형성된 플라스미드(pMSG1219)는 이소프로필-β-D-티오갈락토피 라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) (IPTG, 0.5 mM)로 유도(induction)시켜서 발현이 되며 CMY-11의 신호서열(signal peptide)에 의해서 분비되는 발현·분비 벡터이다(도 1C).
ampC 유전자 클로닝을 위한 PCR 주형은 6개의 임상균주로부터 분리된 염색체성 DNA, 프라이머는 AmpCF1(표 3에서 굵게 표시된 EcoRI 인식 부위를 함유) 및 AmpCR1(표 3에서 굵게 표시된 SacI 인식 부위를 함유)을 사용하여 1165 bp 크기의 PCR 산물을 얻었다. EcoRI/SacI에 의해 digestion된 PCR 산물은 EcoRI/SacI로 자른 pHSG398 벡터(TaKaRa, Otsa, Shiga, Japan)에 라이게이션되었다.
형성된 재조합 플라스미드를 pMSG1218{엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9992004.1의 경우는 pMSG1218-1, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K995120.1의 경우는 pMSG1218-2, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K99230의 경우는 pMSG1218-3, 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) K9911729의 경우는 pMSG1218-4, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9973의 경우는 pMSG1218-5, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9914325의 경우는 pMSG1218-6}로 명명하였다(도 1B).
발현·분비 벡터인 pMSG1219의 성능을 시험하기 위한 PCR 주형은 pMSG1218, 프라이머는 EK-AmpC-F(표 3에서 굵은 소문자로 표시된 enterkinase 인식 부위와 굵은 대문자로 표시된 SacI 인식 부위를 함유) 및 AmpC-HindIII(표 3에서 굵은 대문자로 표시된 HindIII 인식 부위를 함유)를 사용하여 1137 bp 크기의 PCR 산물을 얻었다. SacI/HindIII에 의해 digestion된 PCR 산물은 SacI/HindIII로 자른 pMSG1219 벡터에 라이게이션되었다.
형성된 재조합 플라스미드를 pMSG1220{엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9992004.1의 경우는 pMSG1220-1, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K995120.1의 경우는 pMSG1220-2, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K99230의 경우는 pMSG1220-3, 엔테로박터 아에로지너스(Enterobacter aerogenes) K9911729의 경우는 pMSG1220-4, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9973의 경우는 pMSG1220-5, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) K9914325의 경우는 pMSG1220-6}으로 명명하였다(도 1C).
라이게이션 혼합물(ligation mixture)은 형질전환(transformation)을 통해 이. 콜리(E. coli) BL21 (DE3) pLysS (Novagen) competent cell에 도입시켰다. 형질전환체(transformant)는 암피실린(50 mg/L), 카나마이신(50 mg/L)이 포함되어 있는 루리아-베르타니(Luria-Bertani)(Difco Laboratories) 아가 플레이트(agar plates)에서 선택(selection)되었다. 원하는 pMSG1220은 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Promega)를 이용하여 분리하였으며 bla AmpC 유전자의 삽입 여부는 제한 효소를 이용한 분석을 통해서 확인하였다. 모든 bla AmpC 유전자는 자동서열분석기(automatic sequencer mod. 373A; Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 이용하여 직접 시퀀싱하였다(LEE et al., J. Antimicrob. Chemother. 49, 269-273, 2002).
발현·분비 벡터 및 형질전환체의 특성은 다음과 같았다.
발현·분비 벡터(pMSG1219)에 ampC 유전자가 삽입된 pMSG1220을 이 콜리(E. coli) BL21 (DE3) pLysS 균주에 형질전환시킨 후에 그 유전자가 발현 및 발현 단백질의 분비가 효과적으로 되었으며, 형질전환체(trf K9973 및 trf K9914325; trf K99230 및 trf K9911729; trf K992004.1 및 trf K995120.1)의 아목시실린에 대한 MIC값은 클라불라닉산(clavulanic acid)에 의해서 감소되지 않았다(표 4 참조). 이는 전형적인 클래스 C β-락타메이즈가 갖는 특성이다(Bush et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233, 1995).
6개 형질전환체 중 두개의 형질전환체(trf K9973 및 trf K9914325; trf K99230 및 trf K9911729; trf K992004.1 및 trf K995120.1)는 모든 β-락탐에 대한 MIC 값이 서로 비슷하였다(표 4 참조). trf K992004.1 및 trf K995120.1의 모든 β-락탐에 대한 MIC 값이 가장 높았으며 trf K9973 및 trf K9914325의 모든 β-락탐에 대한 MIC 값이 가장 낮았다(표 4 참조). trf K9973 및 trf K9914325의 세폭시틴과 세포테탄에 대한 MIC값은 trf K992004.1 및 trf K995120.1의 경우보다 8배 내지 16배 높았으며 trf K99230 및 trf K9911729의 세폭시틴 및 세포테탄에 대한 MIC값은 trf K992004.1 및 trf K995120.1의 경우보다 4배 높았다. 이러한 사실은 병원에서 세폭시틴 및 세포테탄을 많이 사용하면서 bla EcloK992004.1 및 bla EcloK995120.1 로부터 bla EcloK99230 및 bla EareK9911729로 진화되었음을 또는 bla EcloK992004.1 및 bla EcloK995120.1로부터 bla EcloK9973 및 bla EcloK9914325로 진화(in vivo evolution) 되었음을 시사한다. 이는 진화적 유연관계(phylogenetic tree, 도 3)에서도 추론되어졌으며 bla SHV-8의 경 우에서 같은 진화적 측면이 보고 되었다(Rasheed et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41, 647-653, 1997). 이런 이유로 내성 유전자의 확산을 방지하기 위해서 세폭시틴 및 세포테탄같은 항생제의 통제된 사용이 필요시 된다.
6개 임상균주의 형질전환체 및 숙주(host, pLysS)의 특성
종(Species) 균주 (Strain) β-락탐의 최소억제농도(MICs)(mg/L)
AMX AUG LOT TAX TAZ ATM FEP IMP MER FOX TTN
trf K9973 E. coli 128 128 >256 8 16 4 0.125 0.25 <0.06 8 4
trf K99230 E. coli 128 128 >256 32 16 8 0.25 0.5 <0.06 16 8
trf K992004.1 E. coli 16 16 32 1 0.5 0.5 0.125 0.25 <0.06 2 1
trf K995120.1 E. coli 16 16 32 1 0.5 0.5 0.125 0.25 <0.06 2 1
trf K9911729 E. coli 128 128 >256 32 32 16 0.25 0.5 <0.06 16 16
trf K9914325 E. coli 64 64 >256 16 16 4 0.25 0.25 <0.06 8 4
pLysS E. coli 1 1 2 <0.06 0.125 <0.06 0.06 0.25 <0.06 <0.06 <0.06
[주] 1. AMX는 아목시실린, AUG는 아목시실린-클라불라닉산, LOT는 세팔로틴, TAX는 세폭탁심(cefotaxime), TAZ는 세프타지딤, ATM은 아즈트레오남, FEP는 세페핌(cefepime), IMP는 이미페넴(imipenem), MER은 메로페넴(meropenem), FOX는 세폭시틴, TTN은 세포테탄을 의미함.
실시예 3: Isoelectric focusing(IEF) 분석
IEF는 Ready Gel Precast IEF Polyacrlyamide Gel(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 Lee 등의 방법(Lee et al., J. Appl. Microbiol. 95, 744-752, 2003)으로 수행되었다. 겔은 0.5 mM 니트로세핀(nitrocefin)(Merck, Whitehouse Station, NJ, USA)으로 active staining하였다. 니트로세핀은 AmpC β-락타메이즈의 기질로 사용되었다.
모든 형질전환체에서 발현 및 분비된 AmpC β-락타메이즈는 네이티브 겔(native gel) 상에서 기질인 니트로세핀(nitocefin)을 분해하였으며 pI값은 모두 8.9이었고 AmpC β-락타메이즈인 MOX-1(Horri et al., Gene 13, 93-98, 1994)의 pI값과 동일하였다. 이러한 사실들은 임상균주에서 발견되는 AmpC β-락타메이즈 유전자(외부 유전자)를 이. 콜리(E. coli) 균주에 발현 및 발현 단백질을 분비시키기 위하여 본 발명의 발현·분비 벡터가 효과적으로 작동됨을 시사한다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명 외부유전자의 발현 및 단백질의 분비를 위한 벡터 pMSG1220은 외부 유전자를 발현 및 분비하는데 매우 유용하며 특별히 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 효과적으로 발현 및 발현 단백질을 효율적으로 분비하므로 생물산업 및 의약품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

  1. 엔테로박터속(Enterobacter spp.) 유래의 AmpC β-락타메이즈(lactamase)를 인코딩하는 유전자를 발현시키고, 상기로부터 발현된 단백질을 분비하는 개열지도 도 1에 개시된 벡터 pMSG1220.
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