KR100674133B1 - 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

서열목록중 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 열안전성의 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.

Description

폴리펩티드{Polypeptides}

본 발명은 폴리펩티드, 더욱 특히, 바이오매스(biomass)의 이로운 사용에 유용한, 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전공학에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는데 유용한 유전자에 관한 것이다.

각각 α-1,4 결합을 통해 비-환원성 말단(non-reducing end)에 결합된 D-글루코오스를 해리시키는 활성을 갖는 두개의 효소, 글루칸 1,4-α-글루코시다아제 및 α-글루코시아다제가 공지되어 있다.

글루칸 1,4-α-글루코시다아제는 또한 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드로라아제 또는 글루코아밀라아제로 명명된다. 이것은 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스 폴리머의 비-환원성 말단에 작용하여 β-D-글루코오스를 해리시키는 효소이다. 하기로부터 유래된 글루칸 1,4-α-글루코시다아제가 현재 공지되어 있다: 아스퍼길러스 속(Aspergillus), 무코르 속(Mucor), 리조푸스 속(Rhizopus), 피리쿠라리아 속(Piricularia), 써모마이세스 속(Thermomyces) 및 트리코더마 속(Trichoderma)과 같은 진균; 엔도마이세스 속(Endomyces) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces)과 같은 효모; 및 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 박테리 아. α-아밀라아제와 같은 이 효소는 전분을 가수분해하는 과정에서 사용되는 중요한 효소이다. 따라서, 상기 효소는 글루코오스, 이성화당(isomerized sugar) 및 올리고사카라이드의 생산, 및 술 및 발효된 알코올의 생산을 포함하는 다양한 분야에서 산업적으로 이용된다.

글루코오스는 통상 하기와 같이 전분으로부터 생산된다. 전분은 쿠킹에 의해 겔화된다. 겔화된 전분은 약 80℃에서 α-아밀라아제를 그에 작용시켜 액화된다. 이어서, 55 내지 60℃에서 1,4-α글루코시아다제를 작용시켜 당화를 수행한다. 겔화된 전분은 고도로 점성이고 열안정성 α-아밀라아제가 실제로 사용되어 왔기 때문에 액화는 고온에서 수행된다. 미생물에 의한 오염을 막기 위하여 당화를 위한 55℃ 이상의 온도를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한, 통상 사용되는 진균으로부터 유래된 효소를 사용하는 경우, 효소의 열안정성 때문에 60℃ 이하의 온도를 선택하여야 한다. 따라서, 그들의 최적의 온도는 서로 상이하기 때문에 액화 및 당화의 단계를 동시에 수행하는 것은 불가능하고, 이는 에너지의 낭비를 초래한다.

α-글루코시다아제(EC 3.2.1.20)은 비-환원성 말단에서 α-글루코시드에 작용하여 α-D-글루코오스를 해리시키는 효소이다. 동물, 식물 및 미생물에 광범위하게 존재한다. α-글루코시다아제는 하기와 같이 기질 특이성에 기초하여 그룹 (1) 내지 (3)으로 분류된다: (1) 헤테로 및 호모 α-글루코시드 화합물에 작용하는 것 : (2) α-1,4-글루코올리고사카라이드에 고도로 특이적이고 고분자량의 글루칸 및 헤테로글루코시드에 상대적으로 약한 활성을 갖는 것; (3) α-1,4-글루코시드 결합에 고도로 특이적이거나 또한 전분 또는 글리코겐에 작용하는 것. 이중, 그룹 (3) 에 속하는 것은 글루코아밀라아제로 명명된다("Oyo Kosogaku", Tsujisaka et al.,(eds), Kodansha (1979) pp.56).

고온 환경에 적응하는 고온성 미생물은 고도로 열안정성 효소를 생산한다. 고온성 원시세균인 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)는 α-아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제 및 β-글루카나아제와 같은 사카라이드-가수분해 효소를 생산한다고 공지되어 있다. 이 효소중 일부에 대한 유전자가 클로닝되었다(The journal of Biological Chemistry, 268:24402-24407(1993); The journal of Biological Chemistry, 272:16335-16342(1997); The journal of Biological Chemistry, 172:3654-3660(1990); The journal of Biological Chemistry, 177:7105-7111(1995); The journal of Biological Chemistry, 181:284-290(1999)). 그러나, 글루칸 1,4-α-글루코시다아제, 또는 고온 안정성 글루칸 1,4-α-글루코시다아제를 생성시키는 고온성 미생물은 공지된 바 없다. 또한, 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)를 포함하는 고온성 미생물에 의해 생산된 공지된 고온성 α-글루코시다아제는 단지 저분자 기질에 작용하고 전분과 같은 고분자 기질은 분해하지 않는다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 산업적으로 유리한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 유전공학에 의해 상기 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 하기와 같이 요약된다. 본 발명의 제 1면은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 열안정성 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 제 2면은 제 1면의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 제 3면은 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 제 2면의 핵산과 혼성화할 수 있는, 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 제 4면은 제 2면 또는 제 3면의 핵산을 포함하는 재조합 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 제 5면은 제 4면의 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체(transformant)에 관한 것이다. 본 발명의 제 6면은 제 5면의 형질전환체를 배양하고 배양액으로부터 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 제 1면의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제 7면은 제 1면의 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 글루코오스를 해리시키는 것을 포함하는, 글루코오스를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제 8면은 제 1면의 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 올리고사카라이드를 생성시키는 것을 포함하는, 올리고사카라이드를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제 9면은 제 1면의 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 사이클로덱스트린을 생성시키는 것을 포함하는, 사이클로덱스트린을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

집중적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 신규한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)의 게놈상에 존재한다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 박테리아로부터 유래된 다양한 α-아밀라아제 및 사이클로말토덱스트린의 것과 고도로 상동적이지만 상기 폴리펩티드는 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 추가로 조사하여 유전공학적 방법에 의해 상기 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 확인하였다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.

도면의 간단한 설명

도 1은 반응 온도 및 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성과의 관계를 설명하는 도이다.

도 2는 반응 pH 및 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성과의 관계를 설명하는 도이다.

도 3은 80℃에서 가열시 본 발명의 폴리펩티드의 잔존 글루코아밀라아제 활성을 설명하는 도이다.

도 4는 95℃에서 가열시 본 발명의 폴리펩티드의 잔존 글루코아밀라아제 활성을 설명하는 도이다.

도 5는 금속 이온 또는 EDTA의 농도 및 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성을 설명하는 도이다.

도 6은 각 조 추출액을 말토펜타오스에 작용시켜 수득된 생성물의 조성물을 설명하는 것이다.

도 7은 각 조 추출액을 가용성 전분에 작용시켜 수득된 생성물의 조성물을 설명하는 것이다.

발명의 상세한 설명

1. 본 발명의 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 열안정성 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 바, 글루코아밀라아제 활성은 연속하여 폴리사카라이드 또는 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스로 구성된 올리고사카라이드중 글루코시드 결합을 비환원성 말단으로부터 가수분해하여 D-글루코오스를 해리시키는 활성을 의미한다. β-D-글루코오스를 해리시키는 효소를 글루칸 1,4-α-글루코시다아제로 명명한다(EC 3.2.1.3). α-D-글루코오스를 해리시키는 효소를 α-글루코시다아제로 명명한다(EC 3.2.1.20). 본 명세서에 사용되는 바, 글루코아밀라아제 활성을 갖는다는 것은 두 개의 활성중 적어도 하나를 나타내는 것을 의미한다.

글루코아밀라아제 활성을 측정하는 방법은 공지된 방법에 의해 구체화된다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 글루코아밀라아제 활성외에도, 가수분해효소 활성(예: α-아밀라아제 활성 또는 β-아밀라아제 활성) 또는 글루코실트랜스퍼라아제 활성(예: 사이클로말토덱스트린 글로코트랜스퍼라아제)와 같은 다른 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 말토오스, 말토트리오스 또는 말토테트라오스 와 같은 올리코사카라이드가 기질로서 사용되는 경우, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 기질로서 올리코사카라이드의 것보다도 더욱 고분자의 생성물 및 글루코오스를 생성시키기 때문에, 상기 폴리펩티드는 글로코트랜스퍼라아제 활성을 갖는다.

본 발명의 폴리펩티드는 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, "열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는다"는 것은 폴리펩티드가 70℃ 이상, 바람직하게 80℃ 이상, 더욱 바람직하게 85℃ 이상, 가장 바람직하게 90℃ 이상의 온도에서 글루코아밀라아제 활성을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 한, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열중 아미노산의 결실, 삽입, 첨가 또는 치환과 같은 돌연변이가 자연 발생의 폴리펩티드에서 생성될 수 있다. 그러한 돌연변이는 상기 단백질을 코딩하는 DNA의 다형성(polymorphism) 또는 돌연변이, 또는 생체내 또는 합성 후 정제하는 동안 단백질의 변형에 의해 발생될 수 있다. 그러나, 그러한 돌연변이가 활성의 유지 또는 단백질의 구조에 중요하지 않은 부위에 위치한다면, 그러한 돌연변이화된 폴리펩티드는 돌연변이화되지 않은 폴리펩티드의 것과 실질적으로는 동일한 생리학 및 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.

그러한 돌연변이가 폴리펩티드의 아미노산 서열내로 인공적으로 삽입된 폴리 펩티드에 적용될 수 있다. 이러한 경우, 더욱 다양한 돌연변이가 발생할 수 있다. 예를 들면, 인간 인터루킨-2(IL-2)의 아미노산 서열에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 폴리펩티드는 인터루킨-2의 활성을 유지한다고 공지되어 있다(Science, 224:1431(1984)).

또한, 특정 폴리펩티드는 그들의 활성에 필수적이지 않은 펩티드 부위를 갖는다고 공지되어 있다. 그러한 펩티드 부위는 세포외로 분비되는 폴리펩티드중 시그날 펩티드 또는 단백질분해 효소의 전구체중에 발견된 프로시퀸스(prosequence)에 의해 구체화된다. 대부분의 그러한 부위는 전사 후 또는 활성 폴리펩티드로의 전환시에 제거된다. 그러한 단백질은 제거되는 부위를 갖지 않는 폴리펩티드의 것과 상이한 일차 구조를 갖지만, 최종적으로는 동일한 작용을 나타낸다. 본 발명에 따라 분리된 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 이 폴리펩티드는 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는다. 19개의 아미노산 잔기로 구성된 시그날 펩티드성 서열은 코딩 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재한다. 시그날 펩티드가 폴리펩티드로부터 제거된 폴리펩티드, 즉, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 또한 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 언급된 2개의 폴리펩티드를 포함한다.

폴리펩티드가 유전공학에 의해 생성되는 경우, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 활성과 무관한 펩티드 쇄를 폴리펩티드의 카복실 말단 또는 아미노 말단에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 사용되는 숙주에서 고수준으로 발현되는 폴리펩티드의 아미노 말단 부위의 일부를 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 말단에 첨가한, 융합 폴리펩티드(fusion polypeptide)를 발현시켜 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 또다른 경우, 특이 물질과 친화도를 갖는 펩티드를 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 카르복실 말단 또는 아미노기 말단에 첨가하여 발현된 폴리펩티드의 정제를 촉진시킬 수 있다. 첨가된 펩티드가 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 활성에 악영향을 일으키지 않는다면, 첨가된 상태로 존재할 수 있다. 필요한 경우, 적절한 처리, 예를 들면, 단백질분해 효소로 제한적으로 분해하여 조작함으로써 관심의 대상이 되는 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다.

따라서, 본 명세서에 기술된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 한, 본 발명에 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 하기 기재되는 실시예의 돌연변이 폴리펩티드, 예를 들면 206S, P142I, L337V, FS/PI 및 FS/LV를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면, (1) 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물의 배양액으로부터의 정제, 또는 (2) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체의 배양액으로부터의 정제에 의해 제조될 수 있다.

(1) 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물의 배양액으로부터의 정제

본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물은 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입할 수 있는 피로코쿠스 후리오수스 DSM3638(Pyrococcus furiosus DSM3638)에 의해 구체화된다. 미생물의 성장에 적절한 조건하에서 미생물을 배양한다. 바람직하게, 관심의 대상이 되는폴리펩티드의 발현 수준을 증가시키는 배양 조건을 사용한다. 세포 또는 배양액중에서 생성된 관심의 대상이 되는폴리펩티드는 통상 사용되는 단백질 정제 방법에 따라 정제될 수 있다.

통상 사용되는 고온성 세균(hyperthermophile) 배양법을 상기 언급된 균주의 배양을 위해 사용할 수 있다. 균주에 의해 사용될 수 있는 양분을 배양 배지에 첨가한다. 예를 들면, 전분을 탄소원으로서 사용할 수 있고, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출액을 질소원으로서 사용할 수 있다. 마그네슘염, 나트륨염 또는 철염과 같은 금속염을 미량 원소로서 배양 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 예를 들면, 배양 배지의 제조를 위해 인공의 해수를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 고형의 황을 함유하지 않는 투명한 배양 배지가 바람직하다. 그러한 배양 배지를 사용하여, 배지의 혼탁도를 측정하여 세포의 성장을 용이하게 모니터할 수 있다.

배양액은 스탠딩(standing) 배양액 또는 스피너(spinner) 배양액일 수 있다. 예를 들면, [Applied and Enviromental Microbiology, 55:2086-2088(1992)]에 기재된 바와 같은 투석 배양법이 사용될 수 있다. 일반적으로, 배양 온도는 바람직하게 약 95℃이다. 일반적으로, 약 16 시간동안 배양한 후 상당량의 폴리펩티드가 배양액중에 축적된다. 폴리펩티드의 생산성을 최대가 되도록 하기 위해, 사용되는 세포 또는 배양 배지의 조성물에 따라 배양 조건을 결정하는 것이 바람직하다.

첫째, 폴리펩티드를 수득하기 위해 무세포 추출액을 제조한다. 무세포 추출액은 예를 들면, 배양액으로부터 원심 분리, 여과 등에 세포를 수득하고, 이어서 세포를 파쇄(disrupt)하여 제조될 수 있다. 관심의 대상이 되는효소를 추출하는데 고도로 효과적인 세포 파쇄(disruption) 방법은 초음파 처리(sonification), 비드(bead)를 사용한 파쇄, 용균성 효소로의 처리 등으로부터 선택될 수 있다. 폴리펩티드가 배양 상층액내로 분비되는 경우, 배양 상층액내 폴리펩티드는 황산 암모늄 침전(ammonium sulfate salting out), 한외 여과(ultrafiltration) 등에 의해 농축된다. 농축된 폴리펩티드를 무세포 추출액로서 사용한다. 통상 사용되는 단백질 정제법을 사용하여 상기와 같이 수득된 무세포 추출액로부터 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 예를 들면, 황산 암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등이 함께 사용될 수 있다.

(2) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체의 배양액으로부터의 정제

본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체로부터 수득될 수 있다. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 생산된다. SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 생산된다.

형질전환되는 숙주는 특정의 것으로 제한되지 않고 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 효모, 및 곰팡이, 식물, 동물, 식물 배양된 세포 및 동물 배양된 세포를 포함하는 재조합 DNA 분 야에서 통상 사용되는 것에 의해 구체화된다.

예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA가 lac 프로모터로부터 하류에 연결된 플라스미드인 pSJ3231을 포함하는(harboring) 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 사용하여 수득될 수 있다. pSJ3231로 형질전환된 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109 가 디자인되고 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pSJ3231로서 표시되고, 1999년 7월 30일(원기탁일) 부다페트스 조약하에 일본, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1-초메, 1-3에 소재하는 츠우쇼상교쇼코교기쥬츠잉세메이코가쿠코교기쥬츠켄큐죠(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)에 수탁번호 FERM BP-7196하에 기탁하였다.

통상의 배양 조건, 예를 들면, 37℃에 100μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(10g/ℓ의 트립톤, 5g/ℓ의 효모 추출액, 5g/ℓ의 NaCl, pH 7.2)중에서 pSJ3231을 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 로그 성장 단계(logarithmic growth phase)까지 배양하고, 거기에 최종 농도 0.2mM로 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 가하고 추가로 37℃에서 배양하여, 배양된 세포중에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

배양 후 원심분리에 의해 세포를 회수하고, 초음파 처리에 의해 파쇄하고 원심분리에 의해 회수된 상층액을 무세포 추출액로서 사용할 수 있다. 이 무세포 추 출액은 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과법, 소수성 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전법과 같은 공지된 방법을 사용하여 무세포 추출액로부터 정제될 수 있다. 물론, 정제 과정에서 수득된 부분적으로 정제된 생성물 또한 글루코아밀라아제 활성을 나타낸다. pSJ3231을 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109에서 발현된 본 발명의 폴리펩티드는 고도로 열안정성이기 때문에, 배양된 세포 및/또는 무세포 추출액을 예를 들면, 10분동안 80℃에서 가열하여 숙주로부터 유래된 열-변성의 불용성 단백질을 제거하여 폴리펩티드를 정제할 수 있다.

또한, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 하기 실시예에 기재된 바와 같이 pET21amyCΔS를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)를 사용하여 유사한 방법으로 수득할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 사용하여 표준 온도(예: 37℃)에서 발현시키는 경우, 생성된 발현 생성물은 활성, 내열성 등을 유지한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 원 생성 세포(original producer cell)의 성장 온도와 매우 상이한 온도에서 발현될지라도, 그것은 그의 고유의 고차 구조(higher-order structuer)를 유지할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 수득된 본 발명의 폴리펩티드의 효소학적 성질 중 일부를 상기에 기재한다.

(1) 작용:

본 발명의 폴리펩티드는 아밀로오스를 가수분해하여 글루코오스 및 올리고사카라이드를 생성한다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 아밀로오스에 작용하여 사이클로덱스트린을 생성한다.

(2) 최적 온도: 85-90℃에서 최고의 활성을 나타낸다.

(3) 최적 pH : pH 5-6에서 최고의 활성을 나타낸다.

(4) 안정성은 CaCl₂의 존재하에 증가한다.

(5) 활성은 EDTA에 의해 억제된다.

2. 본 발명의 핵산

본 발명의 핵산은 상기 기재된 본 발명의 폴라펩티드를 코딩하는 핵산이다. 특히, 이것은 (1) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; (2) SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산; 및 (3) 엄격한 조건(strigent conditions)하에서 상기 (1) 또는 (2)의 핵산과 혼성화할 수 있는, 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 구체화된다.

본 명세서에서 사용되는 바, 핵산은 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 DNA 또는 RNA를 의미한다. 상기 (2)의 핵산이 RNA 인 경우, 예를 들면, SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열에서 T는 U에 의해 치환된 뉴클레오타이드 서열에 의해 나타내어진다.

예를 들면, 본 발명의 핵산은 하기와 같이 수득될 수 있다.

SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 상기 (2)의 핵산을 하기와 같이 분리시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 상기 기내된 바와 같이 배양된 피로코쿠스 푸리오수스 DSM3638로부터 통상의 방법에 따라 수득된다. 게놈 DNA를 사용하여 DNA 라이브러리를 작제한다. 핵산을 DNA 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 또한, 주형으로서 게놈 DNA를 사용하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜 핵산을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열(예: SEQ ID NO:7의 뉴클레오타이드 서열)에 기초하여 본 발명의 폴리펩티드의 것과 유사한 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 세포로부터 추출된 DNA 또는 주형으로서 상기 DNA를 사용하여 수득된 PCR 생성물로부터 혼성화용 프로브로서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 특히, 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 스크린할 수 있다. 또한, 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR과 같은 유전자 증폭 방법을 사용하여 증폭될 수 있다. 또한, 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 (1) 및 (3)의 핵산을 그러 한 방법에 따라 수득할 수 있다.

관심의 대상이 되는 핵산중 일부만을 포함하는 핵산 단편을 상기 언급한 방법에 따라 수득할 수 있다. 이 경우, 관심의 대상이 되는 전체 핵산을 하기와 같이 수득할 수 있다. 수득된 핵산 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 상기 단편이 관심의 대상이 되는핵산의 일부임을 확인한다. 프로브로서 핵산 단편 또는 그의 일부를 사용하여 혼성화를 수행한다. 또한, 핵산 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.

"엄격한 조건하에서 혼성화"는 것은 예를 들면, 하기 조건과 같이 [T.Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 기재된 조건하에서 혼성화할 수 있는 것을 언급한다. 12 내지 20시간동안 50℃에 0.5% SDS, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜 400(Ficoll 400) 및 0.01% 변성된 연어 정자 핵산을 포함하는 6 x SSC(1xSSC: 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 그 위에 핵산이 고정화된 막을 프로브와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 고정화된 핵산으로부터의 시그날을 바탕(background)과 구별할 수 있을 때까지, SSC의 농도를 0.1 x 이상으로 온도를 50℃ 이하까지 변화시키면서 막을 37℃에 0.5% SDS를 포함하는 2 x SSC중에서 세척한 후, 프로브를 검출한다. 그렇게 수득한 신규한 핵산에 의해 코딩된 단백질의 활성을 상기 기재된 바와 같이 측정하여, 핵산이 관심의 대상이 되는 핵산인지를 확인한다.

올리고사카라이드 프로브가 사용되는 경우, "엄격한 조건"은 본 발명을 제한 하는 것을 아니지만 6 x SSC, 0.5% SDS, 5x Dengardt's 및 0.01% 변성된 연어 정자 핵산을 포함하는 용액중에서 밤새도록 [Tm-25℃]의 온도에서 인큐베이션하는 것을 언급한다.

올리고사카라이드 프로브 또는 프라이머의 Tm은 예를 들면, 하기 식에 따라 결정될 수 있다:

Tm = 81.5-16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41(%G+C)-(600/N)

(상기 식에서, N은 올리고사카라이드 프로브 또는 프라이머의 쇄 길이이고; %G+C는 올리고사카라이드 프로브 또는 프라이머중 구아닌 및 사이토신 잔기의 함량이다).

올리고사카라이드 프로브 또는 프라이머의 쇄 길이가 18 염기보다 짧은 경우, Tm은 예를 들면, A+T(아데닌 및 티아민)의 잔기의 수 곱하기 2(℃) 및 G+C 잔기의 수 곱하기 4(℃)의 합:[(A+T) x 2 + (G+C) x 4]으로 예측될 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 기재된 바와 같이, 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화할 수 있는 핵산이 본 명세서에 기재된 것과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않더라도, 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 한, 본 발명에 포함된다.

유전자중 아미노산을 정의하는 1 내지 6개의 코돈(3개 염기의 조합)이 각 아미노산에 대하여 지정됨이 공지되어 있다. 따라서, 다수의 핵산이 아미노산 서열에 따라 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 핵산은 본래 불안정하다. 뉴클 레오타이드 서열중 돌연변이의 발생은 보통이다. 핵산중에 생성된 돌연변이가 코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수 있다(침묵돌연변이(silent mutation)으로 불려짐). 이 경우, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 핵산이 생성된다고 언급될 수 있다. 따라서, 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 유기체의 계대(passage) 과정에서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산이 생성될 수 있음을 부인할 수 없다. 또한, 다양한 유전공학 기술을 사용하는 경우 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조하기는 어렵지 않다.

예를 들면, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 원(original) 핵산에서 사용되는 코돈이 유전공학에 의해 단백질을 제조하기 위해 사용되는 숙주에서의 사용이 낮은 경우, 단백질의 발현 수준이 낮을 수 있다. 이 경우, 관심의 대상이 되는 단백질의 발현 수준을 향상시킬 목적으로 코딩되는 아미노산을 변경하지 않고 숙주에서 자주 사용되는 것으로 코돈을 인공적으로 전환시킨다(예: JP-B 7-102146). 물론, 상기 기재된 바, 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조할 수 있다. 그들은 또한 자연적으로 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예: SEQ ID NO: 7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산)을 적절한 벡터에 결찰시켜 재조합 DNA를 작제할 수 있다. 재조합 DNA 작제용 벡터는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 및 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA 목적을 위해 적절한 벡터는 선택된다.

또한, 재조합 DNA를 적절한 숙주에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있다. 형질전환체 제조용 숙주는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 박테리아, 효모 및 곰팡이과 같은 미생물 및 포유동물, 식물, 곤충 등으로부터 배양된 세포를 사용할 수 있다. 형질전환체를 배양하여 배양액중에서 본 발명의 폴리펩티드를 제조하여 본 발명의 폴리펩티드를 다량 제조할 수 있다.

3. 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 글루코오스, 올리고사카라이드 또는 사이클로덱스트린 제조 방법.

본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머로부터 D-글루코오스를 해리시킬 수 있다. 본 발명에 따라, α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머중 글루코오스의 중합도를 특정하게 제한하는 것은 아니다. 말토오스, 아밀로오스 및 전분을 포함한다. 본 발명에 따른 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머는 또한 분자내 α-1,4 결합이외의 결합(예: α-1,6 결합) 또는 D-글루코오스외의 사카라이드(예: 푸프럭토오스)를 포함하는 폴리머를 포함한다. 따라서, 가열시 기질의 구조적 변화 및 물리적 성질의 변화를 갖는 상승 효과 때문에, 부분적으로 기질을 효과적으로 분해할 수 있다.

특정 반응 조건은 하기와 같이 구체화된다. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 경우, 80℃에서 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중에 기질과 반응시켜 D-글루코오스를 해리시킬 수 있다. 자연적으로, 기질의 유형(전분, 말토오스 등)에 따라 최적 반응 조건은 달라질 수 있다.

본 발명의 글루코오스를 생성하는 방법에 사용되는 폴리펩티드는 분리 및 정제된 폴리펩티드로 제한되지 않는다. 글루코오스 생성에 악영향을 주지 않는 한 조 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 유리 형태로 기질 용액에 가할 수 있다. 그러나, 폴리펩티드가 적절한 담체상에 고정화된 기질과 반응하면, 반응 종결 후 폴리펩티드는 용이하게 회수된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 α-아밀라아제와 같은 열안정성 효소(들)를 사용하여 고효율로 전분을 D-글루코오스로 분해할 수 있따.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 올리고사카라이드 및 사이클로덱스트린을 생산할 수 있다.

상기 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드에 적절한 조건하에 기질로서 전분, 아밀로오스 또는 적절한 올리고사카라이드를 반응시켜 올리고사카라이드 또는 사이클로덱스트린을 생산할 수 있다. 자연적으로, 반응 조건은 관심의 대상이 되는 생성물의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 올리고사카라이드는 말토오스(G2) 내지 말토옥타오스(G8)의 말토올리고사카라이드에 의해 구체화된다. 따라 적절하게 조정될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린에 의해 구체화된다.

하기 실시예는 추가로 본 발명을 상세히 설명하지만 그의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 방법 중, 플라스미드 DNAs의 제조 및 제한 효소 분해를 포함하는 기본 과정을 [T. Maniatis, et al. (eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual 2nd et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한, 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)를 사용하는 플라스미드의 작제용 숙주로서 사용하였다. 형질전환된 E. coli를 100μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, pH 7.0) 또는 1.5% 농도로 아가를 LB 배지에 가하고 생성된 혼합물을 고형화하여 제조된 LB 플레이트를 사용하여 37℃에서 호기적으로 배양하였다.

실시예 1 : 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 분리

(1) 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 게놈 DNA의 제조

피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus) DSM3638(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입)을 하기와 같이 배양하였다.

1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출액(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분(Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂O, 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H₂O, 0.0001% ZnSO₄, 0.1ppm CuSO₄·5H₂O, 0.1ppm KAI(SO₄)₂, 0.1 ppm H₃BO₃ , 0.1ppm Na₂MoO₄·2H₂O, 0.25 ppm NiCl₂·6H₂O를 포함하는 2ℓ의 배지를 2ℓ배지 바틀에 위치시키고, 20분동안 120℃에서 멸균화하고, 질소 가스로 버블링(bubble)하여 용해된 산소를 제거하였다. 이후, 상기 언급된 균주를 배지내로 접종하여 진탕시키지 않으면서 16시간동안 95℃에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 원심분리에 의해 수득하였다.

이후 수득한 세포를 25% 수크로오스를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)중에 현탁시켰다. 2㎖의 0.2M EDTA 및 0.8㎖의 라이소자임(5mg/㎖)을 현탁액에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20℃에서 인큐베이션하였다. 24㎖의 SET 용액(150mM NaCl, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.0), 4㎖의 5% SDS 및 400㎕의 단백질 분해효소K(10mg/㎖)을 혼합물에 가하였다. 추가로 1시간동안 37℃에서 인큐베이션 시켰다. 혼합물을 페놀-클로로포름으로 추출하여 반응을 종결시켰다. 이후, 에탄올 침전법을 수행하여 게놈 DNA를 수득하였다.

(2) 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편의 제조

피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 aml-F1 및 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 AMY-2N을 합성하였다. 프라이머로서 상기 두개의 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 상기 언급된 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)에 첨부된 프로토콜에 따라 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 0.5분동안 94℃, 1분동안 55 ℃ 및 5분동안 72℃에서 30회 반복. 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 3.5kb의 증폭된 DNA 단편을 겔로부터 추출하고 정제하였다. 약 3.5kb의 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:5로 나타낸다.

(3) 재조합 플라스미드 pSJ3231의 작제

상기 (2)에서 수득한 약 3.5kb의 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 XbaI 및 SphI(두가지 모두 Takara Shuzo로부터 구입)으로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 이후, 관심의 대상이 되는 유전자의 약 2.3kb의 DNA 단편을 추출하고 정제하였다. 한편, 플라스미드 pUC19(Takara Shuzo)를 XbaI 및 SphI로 분해하고, 알카리성 포스포타아제(Takara Shuzo)로 탈인산화하였다. 두개의 DNA 단편을 DNA 리가아제(Takara Shuzo)를 사용하여 결찰시켰다. 결찰 혼합물(ligation mixture)을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109(Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 일부의 형질전환체를 생성된 형질전환체로부터 선별하고, 각 형질전환체에 포함된 플라스미드 DNAs에 삽입된 각각의 DNA 단편의 크기를 측정하였다. 2.3kb DNA 단편을 갖는 플라스미드를 정제하였다. 그렇게 수득한 플라스미드 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 따라서, 상기 언급된 약 3.5kb DNA 단편으로부터 유래되고 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA를 포함하는 DNA 플라스미드 pSJ3231을 수득하였다. pSJ3231을 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pSJ3231로서 표시하였다.

실시예 2 : 폴리펩티드 제조

(1) 폴리펩티드의 발현

실시예 1 (3)에서 제조된 pSJ3231 또는 대조군 벡터로서 pUC19를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 5㎖ LB 배지에 따로따로 접종하고, 밤새도록 37℃에 호기하에서 배양하였다. 상기 배양액을 1% 농도로 5㎖의 동일한 신선한 배지내로 접종하고, 37℃에 호기상태에서 배양하였다. 혼탁도가 OD₆₀₀ = 0.4 내지 0.7에 도달했을 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Takara Shuzo)를 최종 농도 0.2mM로 가하였다. 추가로 세포를 밤새도록 배양하였다. 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 0.5㎖의 50mM 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.5)중에 현탁시키고 10분동안 80℃에서 처리하였다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 Ultrafree-MC(Millipore)를 사용하여 20회까지 농축시키고 하기와 같이 활성을 측정하기 위한 무세포 추출액으로서 사용하였다.

5㎕의 무세포 추출액을 동량의 2x 샘플 완충액(125mM Tris-HCl(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루)과 혼합하였다. 혼합물을 분리용 겔에 0.1% 가용성 전분을 포함하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 적용시키고 통상의 방법에 따라 전기영동시켰다. 전기영동후, 겔을 각각 실온에서 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중 5분동안 3회 세척하고 1.5시간동안 80℃에서 동일한 완충액중 반응시켰다. 반응 후, 겔을 물로 간단히 세척하고 요오드 용액(10mM I₂ 및 1% KI을 수용액)으로 염색하였다.

결과, pUC19를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109으로부 터 제조된 무세포 추출액에 대하여 전분의 분해는 관찰되지 않았다. 한편, pSJ3231을 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109으로부터 무세포 추출액에 대한 겔상에서 전분 분해한 의한 선명한 밴드가 관찰되었다. 0.2mM IPTG를 첨가하여 수득한 샘플에 대한 밴드가 IPTG를 첨가하지 않고 수득된 샘플에 대한 밴드보다 더욱 짙었다.

이 결과는 pSJ3231를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109이 전분을 분해하는 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

(2) 발현된 폴리펩티드의 작용에 의해 전분의 가수분해로부터 생성된 생성물의 확인

시험에 앞서, 하기와 같이 발현되는 폴리펩티드 용액을 제조하였다.

pSJ3231을 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 20㎖ LB 배지에 접종하고, 밤새도록 37℃에서 배양하였다. 상기 배양액을 1ℓ의 동일한 배지내로 접종하고, 혼탁도가 OD₆₀₀ = 0.5에 도달했을 때까지 37℃에서 배양하였다. 최종 농도 0.2mM의 IPTG를 가하였다. 세포를 추가로 밤새도록 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 40㎖의 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중에 현탁시키고 초음파처리하고 10분동안 80℃에서 처리하였다. 이후, 상층액을 원심분리에 의해 수득하였다.

황산암모늄을 60% 포화시까지 상층액에 가하였다. 혼합물을 밤새도록 4℃에서 교반하였다. 원심분리에 의해 회수한 침전물을 1㎖의 아세테이트 완충액중에 용 해시키고 동일한 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석후 수득된 침전물을 200㎕의 완충액에 현탁시켰다. 현탁액을 사용하여 연속된 시험에서 발현된 폴리펩티드 현택액으로서 사용하였다.

발현된 폴리펩티드의 전분을 가수분해하는 활성을 하기와 같이 확인하였다. 특히, 발현된 폴리펩티드 현탁액을 다양한 농도의 기질에 작용시켰다. 이후 생성물을 박층 크로마토그래피상에서 확인하였다.

5%의 농도로 가용성 전분(Nacalai Tesque)을 포함하는 20㎕의 수용액 또는 5%의 농도로 물중 아밀로오스(Nacalai Tesque)을 포함하는 현탁액, 20㎕의 발현된 폴리펩티드 현탁액, 10㎕의 500mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5) 및 50㎕의 물을 함께 혼합하였다. 혼합물을 17시간동안 80℃에서 반응시켰다. 박층 플레이트로서 Silica Gel 60F254(Merk) 및 전개액으로서 에탄올:1-부탄올:물=5:5:3을 사용하여 실리카겔 박층 크로마토그래피시켰다. 전개후 오르시놀-황산 시약[22.8㎖의 황산중에 400mg의 오르시놀(Sigma)을 용해시키고 물을 총 부피 200㎖ 이하로 가하여 제조됨] 또는 질산은암모늄 시약(동일한 부피의 0.1M 질산은 및 5N 수성 암모늄의 혼합물)을 박층 플레이트에 분사하고 고온 플레이트를 가열시켜 스팟을 관찰함으로써 기질로부터 생성물을 확인하였다.

결과, 기질로서 가용성 전분 또는 아밀로오스를 사용하여 발현된 폴리펩티드의 작용에 의해 글루코오스가 생성되었다. 발현된 폴리펩티드 또는 기질만을 사용한 대조군 시험에서는 글루코오스가 관찰되지 않았다.

소듐 보론 하이드라이드를 사용하여 환원되는 기질을 사용하고 반응 시간이 0, 1, 3, 5.5, 또는 23시간이라는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 유사한 방법으로 반응을 수행하였다. 200mg의 전분 또는 아밀로오스를 1㎖의 물중에 현탁시키고 가열에 의해 용해시켰다. 용액을 4.5㎖의 부피로 희석시켰다. 생성된 용액을 얼음상에서 냉각시켰다. 0.5㎖의 얼음 냉각 1.5% 소듐 보론 하이드라이드 수용액을 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 1시간동안 25℃에서 반응시켰다. 0.1㎖의 아세톤을 가하였다. 혼합물을 20분동안 실온에 방치한 후 1N 아세트산을 사용하여 중화시켰다. 생성된 혼합물을 기질 용액으로서 사용하였다.

이 반응 혼합물에 포함된 환원당의 양을 Park & Johnson 법에 따라 측정하였다. 간단히, 적절하게 희석된 10㎕의 반응 혼합물, 40㎕의 물, 50㎕의 카보네이트 시아나이드 용액 및 50㎕의 0.05% 포타슘 페리시아타이드 수용액을 혼합하고 비등수 배쓰에서 15분동안 반응시켰다. 1ℓ의 물중에 5.3g의 탄산나트륨 및 0.65g의 포타슘 시아나이드를 용해시켜 카보네이트 시아나이드 용액을 제조하였다. 75㎕의 반응 혼합물을 125㎕의 철명반(iron alum) 용액과 혼합하였다. 1ℓ의 0.15N 황산중에 1.5g의 철명방 및 1g의 SDS를 용해시켜 철명반 용액을 제조하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15분동안 방치하였다. 이후 690nm에서 흡광도를 측정하였다. 공지된 농도의 글루코오스를 사용하여 작성된 검출선(calibration curve)에 기초하여 환원 말단량을 글루코오스 환산량으로 구했다. 또한, Glucose Test Wako(Wako Pure Chemical Industries)를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하였다.

결과, 환원당 및 글루코오스의 양은 반응 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드가 글루코아밀라아제 활성을 갖는다는 것을 입증하였 다.

실시예 3 : 폴리펩티드의 효소적 성질

(1) 조 추출액의 제조

pSJ3231를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 20㎖ LB 배지에 접종하고, 밤새도록 37℃에 배양하였다. 상기 배양액을 1ℓ의 동일한 배지내로 접종하고, 혼탁도가 OD₆₀₀ = 0.5에 도달했을 때, 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 세포를 추가로 밤새도록 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 75㎖의 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중에 현탁시키고 초음파처리하였다. 초음파처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 10분동안 80℃에서 처리하였다. 생성된 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하여 상층액을 수득하였다. 황산암모늄을 60% 포화시까지 상층액에 가하였다. 혼합물을 5시간동안 4℃에서 교반하였다. 원심분리에 의해 회수한 침전물을 1㎖의 소듐 아세테이트 완충액중에 용해시키고 동일한 완충액에 대하여 투석시켰다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 연속된 시험에서 조 추출액으로서 사용하였다.

(2) 반응 온도에 대한 의존성

말토트리오스(최종 농도 1%), CaCl₂(최종 농도 1mM) 및 소듐 아세테이트 완충액(최종 농도 50mM)을 실시예 3-(1)에서 제조한 10㎕의 조 추출액에 가하고, 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 40, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 100℃에서 1시간동안 반응시켰다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오 스의 양을 측정하여 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성을 측정하였다. 결과로서, 본 발명의 폴리펩티드는 85 내지 90℃에서 최대의 글루코아밀라아제 활성을 나타내었다.

상기 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 반응 온도 및 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성과의 관계를 설명한다. 가로축은 반응 온도(℃) 및 세로축은 글루코아밀라아제 활성(상대치, %)을 나타낸다.

(3) 반응 pH에 대한 의존성

말토트리오스(최종 농도 1%) 및 완충액(소듐 아세테이트, MES-NaOH, 인산나트륨, Tris-HCl 또는 글리신-NaOH; 최종 농도 50mM)을 실시예 3-(1)에서 제조한 10㎕의 조 추출액에 가하고, 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간동안 반응시켰다. 80℃에서 각 완충액의 pH를 조정하였다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하여 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성을 측정하였다. 결과로서, 본 발명의 폴리펩티드는 pH 5 내지 6에서 최대의 글루코아밀라아제 활성을 나타내었다.

상기 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 반응 pH 및 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성과의 관계를 설명한다. 가로축은 pH(℃) 및 세로축은 글루코아밀라아제 활성(상대치, %)을 나타낸다. 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표시(□), 검은 네모 표시(■) 및 흰 세포 표시(△)는 소듐 아세테이트 완충액, MES-NaOH 완충액, 인산나트륨 완충액, Tris-HCl 완충액 및 글리신-NaOH 완충액을 나타낸다.

(4) 열안정성

동량의 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5), 2mM EDTA를 포함하는 동일한 완충액 또는 2mM CaCl₂를 포함하는 동일한 완충액을 실시예 3-(1)에서 제조된 조 추출액에 가하였다. 혼합물을 1, 5 또는 24시간동안 80 또는 95℃에서 가열하였다. 말토트리오스(최종 농도 1%) 및 소듐 아세테이트 완충액(최종 농도 50mM) 및 CaCl₂(최종 농도1mM)를 가열된 30㎕의 가열된 혼합물에 가하고, 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간동안 반응시켰다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하여 열처리하지 않은 조추출액에 대하여 상대적인 잔존 활성을 측정하였다. 결과, EDTA의 부재하에 24시간동안 80℃에서 조추출액을 가열한 경우 거의 어떤 불활성도 관찰되지 않았다. 95℃에서 조추출액을 가열한 경우, 대부분의 활성은 CaCl₂을 첨가하지 않고 1시간동안 가열한 후 상실되었다. 한편, 1mM으로 CaCl₂을 첨가한 경우 5시간동안 가열후 어떤 불활성도 관찰되지 않았고 24시간동안 가열한 후 약간의 잔존 활성이 관찰되었다.

상기 결과를 도 3 및 4에 나타낸다. 도 3 및 4는 각각 80℃ 및 95℃에서 가열시 본 발명의 폴리펩티드의 잔존 글루코아밀라아제 활성을 설명한다. 가로축은 가열처리시간(시간) 및 세로축은 잔존 글루코아밀라아제 활성(%)을 설명한다. 도 3 및 4에서, 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●) 및 흰 네모 표시(□)는 각각 EDTA 또는 CaCl₂을 첨가하지 않은 열처리군, 1mM EDTA를 첨가한 열처리군 및 1mM CaCl₂을 첨가한 열처리군을 나타낸다.

또한, 상기 기재된 바와 유사한 방법으로 10mM CaCl₂의 존재하에 24시간동안 95℃에서 가열한 후 잔존 활성을 측정한 결과, 거의 100%의 활성인 잔존하였다.

(5) pH 안정성

20㎕의 100mM 완충액(소듐 아세테이트,MES-NaOH, 인산나트륨, Tris-HCl 또는 글리신-NaOH)를 실시예 3-(1)에서 제조된 20㎕의 조추출액에 가하였다. 혼합물을 10분동안 80℃에서 가열하였다. 말토트리오스(최종 농도 1%) 및 소듐 아세테이트 완충액(최종 농도 50mM)을 30㎕의 가열된 혼합물에 가하고, 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간동안 반응시켰다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하여 열처리하지 않은 조추출액에 대하여 상대적인 잔존 활성을 측정하였다. 결과, pH 5 내지 9에서 가열한 후 50% 이상의 활성이 잔존하였다.

(6) 금속이온의 효과

말토트리오스(최종 농도 1%), 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5, 최종 농도 50mM) 및 CoCl₂, CaCl₂, CuSO₄, FeCl₃, ZnCl₂, MgCl ₂ 또는 EDTA(최종 농도 0, 0.5, 1, 2 또는 10mM)을 실시예 3-(1)에서 제조된 10㎕의 조추출액에 가하고, 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간동안 반응시켰다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하여 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성을 측정하였다. 결과, 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성은 0.5, 1, 2 또는 10mM 농도의 CoCl₂, CaCl₂, FeCl₃, 또는 MgCl₂ 에 의해 영향을 받지 않았다. 2mM 농도의 CuSO₄ 또는 ZnCl₂ 또는 0.5mM 농도의 EDTA에 의해 활성은 완전히 억제되었다.

상기 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성 및 금속이온 또는 EDTA의 농도 사이의 관계를 설명한다. 가로축은 첨가된 금속이온 또는 EDTA의 농도 및 세로축은 글루코아밀라아제 활성(상대치, %)을 나타낸다. 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표시(□), 검은 네모 표시(■), 흰 세포 표시(△), 검은 세포 표시(▲) 및 별표(*)는 각각, CoCl₂, CaCl₂, CuSO₄, FeCl₃, ZnCl₂, MgCl₂ 및 EDTA의 첨가를 나타낸다.

실시예 4 : 돌연변이 폴리펩티드의 성질

(1) 재조합 플라스미드 pET21amyCΔS의 작제

SEQ ID NO:8의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 PX253-01 및 SEQ ID NO:9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 R4를 합성하였다. 프라이머로서 상기 두개의 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 pSJ3231을 사용하여 PCR을 수행하였다. TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)에 첨부된 프로토콜에 따라 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 0.5분동안 94℃, 0.5분동안 55℃ 및 2분동안 72℃에서 30회 반복. 에탄올 침전법에 의해 반응 혼합물로부터 DNA을 회수하고, NcoI 및 EcoRI(두가지 모두 Takara Shuzo로부터 구입)으로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 1.0kb의 DNA 단편을 추출하고 정제하였다. NcoI 및 EcoRI으로 분해된 pET21d(Novagen)에 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여 pRH03을 수득하였다. 약 1.0kb의 DNA 단편을 pRH03에 삽입하였다. 뉴클레오타이드 서열을 결정한 경우, NcoI 인식부위인 CCATGG 서열에 이어서, SEQ ID NO: 7의 뉴클레오타이드 서열중 2번의 C로부터 1048번의 C까지를 포함하였다.

실시에 1-(2)에서 제조된 약 3.5kb의 증폭된 DNA 단편을 AflII 및 SacI(두가지 모두 Takara Shuzo로부터 구입)으로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 1.8kb의 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다. AflII 및 SacI로 분해된 pRH03에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기 DNA 단편을 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109(Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 플라스미드를 생성된 형질전환체로부터 제조하여 플라스미드 pET21amyCΔS를 수득하였다. pET21amyCΔS의 뉴클레오타이드 서열을 결정한 경우, 플라스미드는 SEQ IN NO:7의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 SEQ IN NO:6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 것으로 나타났다.

(2) 돌연변이 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 작제

하기 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다: SEQ IN NO:10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 F206S-F; SEQ IN NO:11의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 F206S-R; SEQ IN NO:12의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 P142I-F; SEQ IN NO:13의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올 리고뉴클레오타이드 P142I-R; SEQ IN NO:14의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 L337V-F; SEQ IN NO:15의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 L337V-R; SEQ IN NO:16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 F2; SEQ IN NO:17의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 F3; SEQ IN NO:18의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 AN2-R1F2; SEQ IN NO:19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 R5; 및 SEQ IN NO:20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 R6.

주형으로서 pSJ3231및 프라이머로서 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR을 수행하였다. TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)에 첨부된 프로토콜에 따라 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 0.5분동안 94℃, 0.5분동안 55℃ 및 1분동안 72℃에서 30회 반복. PCR 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 표 1에 나타낸 쇄 길이를 각각 갖는 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다.

표 1

반응	FS-F	FS-R	PI-F	PI-R	LV-F	LV-R
프라이머 1	F206 S-F	F206 S-R	P142 I-F	P142 I-R	L337 V-F	L337 V-R
프라이머 2	R5	F2	R6	AN2- R1F2	R4	F3
쇄길이(bp)	약 400	약 260	약 290	약 260	약 300	약 350

상기 기재된 바와 같이 정제된 증폭된 DNA 단편을 하기와 같이 PCRs용으로 사용하였다. 주형으로서 정제된 DNA 단편 및 표 2에 나타낸 프라이머와 함께 PCRs을 수행하였다. 표 2에 나타낸 "주형 1" 및 "주형 2"은 "표 1에서의 반응"과 일치 하고, 표 1에 나타낸 반응으로부터의 DNA 단편을 표 2에 나타낸 반응에서 주형으로서 사용하였음을 나타낸다. TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)에 첨부된 프로토콜에 따라 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 0.5분동안 94℃, 0.5분동안 55℃ 및 1분동안 72℃에서 10회 반복. PCR 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시켰다. 표 2에 나타낸 쇄 길이를 각각 갖는 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다.

표 2

반응	FS	PI	LV
주형 1	FS-F	PI-F	LV-F
주형 2	FS-R	PI-R	LV-R
프라이머 1	F2	AN2-R1F2	F3
프라이머 2	R5	R6	R4
쇄길이(bp)	약 650	약 530	약 640

표 2에서 반응 FS로부터의 DNA 단편을 AflII 및 NdeI(Takara Shuzo)로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 320bp DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다. AflII 및 NdeI로 분해된 pET21amyCΔS에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기 단편을 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여 pET21amyCΔS-F206S를 수득하였다. pET21amyCΔS-F206S DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정한 경우, 플라스미드는 187번의 Phe(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 206번과 일치)이 Ser로 치환된 SEQ IN NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코 딩하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 폴리펩티드를 F206S로 명명하였다.

표 2에서 반응 PI로부터의 DNA 단편을 BalI(Takara Shuzo) 및 AflII로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 280bp DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다. BalI 및 AflII로 분해된 pET21amyCΔS에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기 단편을 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여 pET21amyCΔS-P142I를 수득하였다. pET21amyCΔS-P142I DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정한 경우, 플라스미드는 123번의 Pro(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 142번과 일치)이 Ile로 치환된 SEQ IN NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 폴리펩티드를 P142I로 명명하였다.

표 2에서 반응 LV로부터의 DNA 단편을 NdeI 및 EcoRI로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 170bp DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하였다. NdeI 및 EcoRI로 분해된 pET21amyCΔS에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 상기 단편을 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여 pET21amyCΔS-L337V를 수득하였다. pET21amyCΔS-L337V DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정한 경우, 플라스미드는 318번의 Leu(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 337번과 일치)이 Val로 치환된 SEQ IN NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 폴리펩티드를 L337V로 명명하였다.

(3) 야생형 및 돌연변이 폴리펩티드의 생성

에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)(Novagen)을 pET21amyCΔS, pET21amyCΔS-F206S, pET21amyCΔS-P142I 또는 pET21amyCΔS-L337V로 형질전환시켰다. 각각의 생성된 형질전환체를 100mg/㎖의 앰피실린을 포함하는 20㎖의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 호기하에 밤새도록 배양하였다. 배양 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 0.8㎖의 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)중에 현탁시키고 초음파처리하여 파쇄하고 30분동안 80℃에서 처리하였다. 원심분리에 의해 수득된 상층액을 조추출액으로 사용하였다. 이하, pET21amyCΔS, pET21amyCΔS-F206S, pET21amyCΔS-P142I 및 pET21amyCΔS-L337V로 형질전환된 에쉐리히아 콜라이 (Escherichia coli) BL21(DE3)(Novagen)을 을 조추출액 WT, 조추출액 F206S, 조추출액 P142I 및 조추출액 L337V로 각각 언급한다.

(4) 야생형 및 돌연변이 폴리펩티드를 사용하는 말로올리고사카라이드의 분해

말토트리오스(최종 농도 1%), 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5, 최종 농도 50mM) 및 CaCl₂을 실시예 4-(3)에서 수득한 조추출액중 하나 5㎕에 가하고 총 부피를 50㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간동안 반응시켰다. Glucose Test Wako를 사용하여 반응 혼합물중 글루코오스의 양을 측정하여 조추출액에 포함된 본 발명의 폴리펩티드의 글루코아밀라아제 활성을 측정하였다. 결과, 조추출액 WT에 대한 글루코아밀라아제 활성을 1로 정의한 경우, 조추출액 F206S, 조추출액 P142I 및 조추출액 L337V에 대한 글루코아밀라아제 활성은 2.08, 0.55 및 0.30으로 각각 측정되었다.

말토트리오스를 대신하여 말토펜타오스를 사용하여 유사한 반응을 수행하였다. 결과, 조추출액 WT에 대한 글루코아밀라아제 활성을 1로 정의한 경우, 조추출액 F206S, 조추출액 P142I 및 조추출액 L337V에 대한 글루코아밀라아제 활성은 1.92, 0.53 및 0.37으로 각각 측정되었다.

기질로서 말토펜타오스를 사용하여 상기와 같이 수득된 35㎕의 반응 혼합물에 65㎕의 아세노니트릴을 가하고 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 샘플중에 포함된 올리고사카라이드의 조성을 Palpak Type 5(Takara Shuzo)를 사용하여 표준 상 HPLC에 의해 분석하였다. 65% 아세토니트릴 수용액을 이동상으로 사용하였다. 유속은 1㎖/분이고 칼럼 온도는 40℃이었다. 상이한 굴절 지수 검출기 Shdox RI-71(Showa Denko)를 사용하여 검출하였다. 기질로서 0.1% 농도의 글루코오스(Nacalai Tesque), 말토오스, 말토트리오스, 말토펜타오스 또는 말토헵타오스(Seikagaku Corporation)를 포함하는 각각의 35㎕ 수용액에 65㎕의 아세노니트릴을 가하였다. 혼합물을 원심분리하여 수득한 상층액을 표준으로 사용하였다. 표준에 대한 유지시간은 하기와 같았다: 5.6분(글루코오스), 7.3분(말토오스), 9.7분(말토트리오스), 17.8분(말토펜타오스) 및 30.7분(말토헵타오스). 결과, 각 조추출액을 말토펜타오스에 작용시킨 경우, 1 내지 8범위의 중합화도를 갖는 말토올리고사카라이드가 생성된다고 나타났다. 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은 각 조추출액을 말토펜타오스에 작용시켜 수득된 생성물의 조성을 설명한다. 가로축은 생성물(G1:글루코오스; G2: 말토오스; G3: 말토트리오스; G4: 말토테트라오스; G6: 말토헥사오스; G7: 말토헵타오스; 및 G8: 말토옥타오스) 및 세로축은 반응 혼합물중 생성물의 농도(글루코오스 환산 농도로서; μM)를 나타낸다. 도 6에서, 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표시(□) 및 검은 네모 표시(■)는 각각 조추출액 WT, 조추출액 F206S, 조추출액 P142I 및 조추출액 L337V를 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이 HPLC를 사용하여 측정된 생성된 글루코오스의 양은 Glucose Test Wako를 사용하여 수득된 결과와 일치하지 않는다. 이는 용매에 대한 피크가 글루코오스가 HPLC중에 용출된 위치에서 출현하기 때문에, 글루코오스에 대한 측량이 에러를 포함한다고 여겨진다.

(5) 야생형 및 돌연변이 폴리펩티드를 사용한 전분의 분해

"Hyperthermostable α-amylase gene"으로 표제된 JP-A 7-143880의 실시예 3에 기재된 방법에 따라 고온안전성 α-아밀라아제 표본(preparation)을 제조하였다. 하기 용량의 조추출액 F206S 및 고온안전성 α-아밀라아제 표본을 사용하였다: 40㎕ 및 0㎕(반응 1); 30㎕ 및 10㎕(반응 2); 20㎕ 및 20㎕(반응 3); 10㎕ 및 30㎕(반응 4); 및 0㎕ 및 40㎕(반응 5). 가용성 전분(Nacalai Tesque; 최종 농도 2%), 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5; 최종 농도 50mM) 및 CaCl₂(최종 농도 1mM)을 가하고, 총 부피를 200㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 밤새도록 반응시켰다. 실시예 4-(4)에 기재된 바와 같이 표준 HPLC에 의해 반응 혼합물중 올리고사카라이드를 분석하였다. 고온안전성 α-아밀라아제 표본 또는 조추출액 F206S만을 사용하여 수득된 결과와 비교한 바와 같이, 통상 알코올 발효에 사용되는 효소에 의해 발 효될 수 있는 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스의 농도(글루코오스 환산 농도)의 합은 이들 효소들을 혼합하여 사용한 경우보다 더욱 컸다. 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 각 조추출액을 가용성 전분에 작용시켜 수득된 생성물의 조성을 설명한다. 가로축은 생성물(G5: 말토펜타오스; 다른 것은 도 6에 기재된 바와 같다) 및 세로축은 반응 혼합물중 생성물의 농도(글루코오스 환산 농도로서; μM)를 나타낸다. 도 7에서, 흰 동그라미 표시(○), 흰 세모 표시(△), 흰 네모 표시(□), 검은 세포 표시(▲) 및 검은 동그라미 표시(●)는 각각 반응 1, 반응 2, 반응 3, 반응 4 및 반응 5를 나타낸다.

(6) 본 발명의 폴리펩티드의 사이클로덱스트린 합성 활성

아스파러길러스 니베우스(Aspergillus niveus)로부터의 2유니트의 글루코아밀라아제(Seikagaku Corporation)를 실시예 4-(5)중 반응 1의 50㎕의 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 3시간동안 37℃에서 분석하였다. 반응 혼합물을 실시예 4-(4)에 기재된 바와 같이 표준 상 HPLC에 의해 분석한 경우, α-사이클로덱스트린(CD), β-CD 및 γ-CD(Seikagaku Corporation)에 대하여 관찰된 바와 같이 동일한 유지시간(retention time)을 갖는 피크가 관찰되었다. α-CD, β-CD 및 γ-CD에 대한 유지 시간은 각각 12.3분, 15.2분 및 19.7분이었다. 이 피크에 상응하는 분획을 회수하고 삼중 단계 4중극자 질량분석계 API 300(Perkin-Elmer Sciex)를 사용하여 양이온 모드로 질량 분광분석하였다. 결과, 각 피크로부터의 샘플은 α-CD, β-CD 및 γ-CD의 것과 동일한 질량 스펙트럼을 나타냈다. 따라서, 조추출액 F206S에 포함된 본 발명의 폴리펩티드는 CD를 합성하는 활성을 갖 는다고 나타났다.

(7) 이중-돌연변이 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 작제

pET21amyCΔS-F206S를 PstI(Takara Shuzo) 및 AflII로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 3.1kb의 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하여 DNA 1을 수득하였다. pET21amyCΔS-P142I을 PstI 및 AflII로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 4.6kb의 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하여 DNA 2를 수득하였다. pET21amyCΔS-F206S를 PstI 및 NdeI로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 4.9kb의 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하여 DNA 3을 수득하였다. pET21amyCΔS-L337V를 PstI 및 NdeI로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 2.8kb의 DNA 단편을 추출하고 겔로부터 정제하여 DNA 4를 수득하였다.

T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 1 및 DNA 2를 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) HB101(Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 플라스미드 pET21amyCΔS-F206S/P142I을 형질전환체로부터 수득하였다. pET21amyCΔS-F206S/P142I DNA의 뉴클레오타이드를 결정한 경우, 플르스미드는 187번의 Phe가 Ser에 의해 치환되고 123번의 Pro가 Ile에 의해 치환된 SEQ IN NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 폴리펩티드를 FS/PI로 명명하였다.

T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 3 및 DNA 4를 서로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) HB101(Takara Shuzo)을 형질전환시켰다. 플라스미드 pET21amyCΔS-F206S/L337V를 형질전환체로부터 수득하였 다. pET21amyCΔS-F206S/L337V DNA의 뉴클레오타이드를 결정한 경우, 플라스미드는 187번의 Phe가 Ser에 의해 치환되고 318의 Leu가 Val에 의해 치환된 SEQ IN NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 나타났다. 이 돌연변이 폴리펩티드를 FS/LV로 명명하였다.

(8) 이중 돌연변이 폴리펩티드의 성질

에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)을 pET21amyCΔS-F206S/P142I 또는 pET21amyCΔS-F206S/L337V로 형질전환시켰다. 실시예 4-(3)에 기재된 바와 같이 형질전환체를 사용하여 조추출액 FS/PI 및 조추출액 FX/LV를 수득하였다.

가용성 전분(최종 농도 2%), 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5, 최종 농도 50mM) 및 CaCl₂(최종 농도 1mM)을 20㎕의 조추출액 WT, 조추출액 F206S(둘 다 실시예 4-(3)에서 제조됨), 조추출액 FS/PI 또는 조추출액 FS/LV에 가하고 총 부피를 100㎕ 이하로 하였다. 혼합물을 80℃에서 밤새도록 반응시켰다. 실시예 4-(4)에 기재된 바와 같이 표준 상 HPLC에 의해 반응 혼합물중 올리고사카라이드를 분석하였다. 결과, 조추출액 WT에 대한 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스의 농도(글루코오스 환산 농도)의 합을 1로 정의한 경우, 조추출액 F206S, 조추출액 FS/PI 및 FS/LV에 대한 값은 2.22, 2.22 및 2.79로 각각 측정되었다.

생성된 CDs의 조성과 관련하여, 조추출액 WT를 사용한 경우, γ-CD의 양은 β-CD 양의 약 반이었다. 조추출액 F206S 또는 조추출액 FS/LV를 사용한 경우, γ-CD 및 β-CD 양은 거의 동일하였다. 조추출액 FS/PI를 사용한 경우 γ-CD의 양은 β-CD 양의 약 1.7배였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3

조추출액	생성된 양(μM)
	β-CD	γ-CD
WT1	220	103
F206S	292	294
FS/PI	227	386
FS/LV	379	363

산업상 이용가능성

본 발명은 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 고도로 열안정성이고 효과적으로 전분을 분해할 수 있다. 또한, 바이오매스의 이용을 촉진시키면서, 본 발명의 폴리펩티드를 고온성 세균으로부터의 α-아밀라아제를 함께 사용하여 전분으로부터 글루코오스를 효율적으로 생산할 수 있다.

서열 목록 프리 텍스트

SEQ ID NO:3: 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 am1-F1.

SEQ ID NO:4: 피로코쿠스 후리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 AMY-2N.

SEQ ID NO:8: PCR 프라이머 PX253-01.

SEQ ID NO:9: PCR 프라이머 R4.

SEQ ID NO:10: PCR 프라이머 F206S-F.

SEQ ID NO:11: PCR 프라이머 F206S-R.

SEQ ID NO:12: PCR 프라이머 P142I-F.

SEQ ID NO:13: PCR 프라이머 P142I-R.

SEQ ID NO:14: PCR 프라이머 LV337V-F.

SEQ ID NO:15: PCR 프라이머 LV337V-R.

SEQ ID NO:16: PCR 프라이머 F2.

SEQ ID NO:17: PCR 프라이머 F3.

SEQ ID NO:18: PCR 프라이머 AN2-R1F2.

SEQ ID NO:19: PCR 프라이머 R5.

SEQ ID NO:20: PCR 프라이머 R6.

<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Polypeptide <130> 662046 <150> JP 11-218778 <151> 1999-08-02 <160> 20 <210> 1 <211> 722 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 1 Met Arg Lys Leu Ile Ile Ser Phe Thr Ile Leu Val Leu Tyr Phe 5 10 15 Ser Gln Val Ala Ala Tyr Tyr Val Pro Glu Arg Ser Val Ile Tyr 20 25 30 Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Tyr Asp Arg Asn Pro Thr Asn Asn 35 40 45 Glu Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Lys Lys Asn Tyr Arg Leu Tyr Trp 50 55 60 Gly Gly Asp Ile Glu Gly Ile Ile Glu Arg Leu Asp Tyr Ile Glu 65 70 75 Ser Leu Gly Val Ser Met Ile Trp Leu Ser Pro Leu Asn Asp Asn 80 85 90 Ile Asn Arg Met Ala Gly Gly Ser Ala Pro Tyr His Gly Tyr Trp 95 100 105 Pro Arg Asp Phe Lys Arg Ile Asp Glu His Phe Gly Thr Trp Glu 110 115 120 Asp Phe Arg Arg Leu Val Glu Glu Ala Lys Lys Arg Gly Ile Cys 125 130 135 Ile Ile Val Asp Tyr Val Pro Asn His Ser Asn Pro Ala Thr Asp 140 145 150 Gly Glu Phe Gly Ala Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Val Thr Asn 155 160 165 Tyr Tyr Glu Asp Arg Lys Asn Ala Thr Arg Asn Pro Tyr Thr Ala 170 175 180 Ser Leu Glu Asn Ile Tyr His His Asn Gly Asn Ile Asn Asp Trp 185 190 195 Phe Gly Phe Gln Leu Lys Tyr Ala Asn Leu Phe Gly Leu Ala Asp 200 205 210 Phe Asn Gln Met Asn Asp Phe Val Asp Asn Tyr Leu Lys Glu Gly 215 220 225 Ala Ala Leu Phe Val Lys Asn Gly Ala Cys Gly Phe Arg Ile Asp 230 235 240 Ala Val Lys His Ile Glu Leu Gly Trp Leu Glu Thr Phe Tyr Leu 245 250 255 Tyr Leu Tyr Gln Ile Ser Asp Glu Pro Leu Phe Ile Tyr Gly Glu 260 265 270 Tyr Phe Ala Asn Thr Pro Asp Lys Thr Phe Asp Leu Tyr Glu Phe 275 280 285 Tyr Arg Tyr Ser Asn Val Ser Ser Leu Leu Asn Ile Pro Ile Arg 290 295 300 Glu Ser Ile Ala Arg Thr Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Phe Glu Gln 305 310 315 Leu Ala Lys Met Leu Glu Glu Tyr Tyr Ser Leu Phe Val Tyr Pro 320 325 330 Asn Lys Gln Leu Asn Phe Leu Asp Ser His Asp Leu Val Arg Phe 335 340 345 Leu Asn Met Asn Pro Asn Lys Asp Arg Tyr His Met Ala Leu Gly 350 355 360 Leu Val Met Thr Leu Pro Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Asp 365 370 375 Glu Ser Tyr Leu Val Ser Lys Glu Gly Lys Gly Asp Pro Tyr Asn 380 385 390 Arg Pro Met Met Val Phe Asp Asn Ser Thr Lys Ala Ala Glu Ile 395 400 405 Ile Arg Lys Leu Ser Leu Leu Arg Lys Val Asn Asp Ala Leu Ala 410 415 420 Tyr Ser Asp Phe Arg Thr Val Tyr Val Asp Tyr Asn Thr Trp Ile 425 430 435 Phe Glu Arg Lys Phe Gly Ser His Lys Ile Leu Val Ala Leu Asn 440 445 450 Lys Gly Pro Asp Lys Asn Ile Thr Ile Ser Leu Asn Trp Thr Asp 455 460 465 Gly Thr Tyr Ile Asp Ile Ile Glu Gly Ala Ile Leu Lys Val Lys 470 475 480 Glu Gly Gln Gly Glu Ile Lys Leu Pro Arg Tyr Ser Phe Tyr Val 485 490 495 Phe His Val Glu Glu Glu Gln Lys Thr Pro Leu Ile Gly Ser Ile 500 505 510 Thr Pro Tyr Ile Ala Gln Pro Gly Gln Lys Ile Leu Ile Ala Gly 515 520 525 Ala Gly Leu Asn Gly Asn Ile Lys Val Tyr Ile Gly Gly Arg Arg 530 535 540 Ala Arg Ile Ile Glu Lys Glu Glu Asn Ser Ile Leu Val Glu Val 545 550 555 Pro Glu Ile Lys Thr Met Asn Ala Trp Ile Pro Val Trp Val Val 560 565 570 Val Asn Gly Thr Arg Ser Asn Glu Val Lys Leu Arg Tyr Tyr Ser 575 580 585 Ser Asn Asp Ile Pro Ala Leu Ile Val Leu Gln Gly Asn Tyr Thr 590 595 600 Gly Tyr Leu Trp Val Lys Gly Asn Ile Pro Glu Leu Ser Glu Pro 605 610 615 Arg Pro Leu Leu Lys Ser Pro Thr Gly His Tyr Phe Ala Val Val 620 625 630 Pro Leu Pro Arg Asn Lys Thr Phe Thr Val Gln Leu Tyr Lys Gly 635 640 645 Leu Pro Trp Glu Pro Leu Gln Pro Thr Asn Val Thr Leu Tyr Gly 650 655 660 Ile Gly Asn Lys Thr Val Ile Leu Asn Glu Ala Ala Pro Glu Thr 665 670 675 Pro Val Cys Gly Pro Gly Ile Val Ala Val Phe Ala Leu Leu Pro 680 685 690 Leu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Lys Ser Pro Asn Thr Thr Ile Thr 695 700 705 Pro Tyr Gly Val Pro Ile Val Ala Val Ser Trp Ile Val Arg Trp 710 715 720 Cys Leu <210> 2 <211> 2169 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 2 atgagaaagc tgataataag ttttacaatt cttgtactct atttttccca ggtcgcagcc 60 tattatgttc cagagagaag tgttatatat caaataatgg tggacagatt ttacgataga 120 aacccaacaa ataacgaacc cttctatgat ccagagaaga aaaactacag gctctattgg 180 ggaggagaca ttgaaggcat catagagaga cttgactata tagagagtct aggtgtttca 240 atgatatggc tttcaccatt aaacgacaac ataaacagaa tggcaggtgg aagcgctcct 300 tatcatgggt attggccaag agacttcaaa aggatagacg agcactttgg cacctgggaa 360 gactttagaa ggttagtaga agaagctaag aaaagaggaa tttgcataat agtagactat 420 gtccccaacc attcaaatcc agcaactgat ggggagtttg gagctttgta cgataatgga 480 acattagtga ctaactacta tgaagacaga aaaaatgcca caagaaatcc ctatactgcg 540 agcctggaaa acatctatca ccacaatggc aacataaacg attggtttgg ctttcagctt 600 aagtacgcaa atctttttgg attggcagat ttcaaccaaa tgaatgactt tgtggataat 660 tatcttaaag aaggggcagc tttattcgtg aaaaatggcg cttgtggatt tagaattgat 720 gctgttaagc atatagagct gggatggctt gaaaccttct acctttacct atatcaaatc 780 tcagatgaac cactctttat ctacggagaa tactttgcaa acactcctga caaaacgttt 840 gacctctatg agttctatag gtactcaaat gtatcttccc tcttaaatat cccaattaga 900 gaatcaattg cgagaacttt tgcatatgga ggaagttttg agcagctagc aaagatgtta 960 gaggagtatt acagtttgtt cgtttatccc aacaagcagt tgaacttctt agacagccat 1020 gatttagtta ggttcctgaa catgaaccca aacaaagaca ggtaccacat ggccctcgga 1080 ttagtaatga cactcccagg aattcctgtt atatattatg gagatgaaag ctatttagtg 1140 agtaaggaag ggaagggaga cccctacaac agaccaatga tggtttttga taactctact 1200 aaggctgctg agattataag aaagctttca ttgctaagaa aagtcaacga tgcccttgct 1260 tatagtgatt tcagaaccgt atatgtggac tacaacacat ggatatttga gagaaagttt 1320 ggaagccaca agatattagt tgctctaaac aaagggccag acaaaaacat cacgatttcc 1380 ctaaactgga cagatggaac atacatagac atcatcgaag gagcaattct caaagttaaa 1440 gaaggtcagg gtgagataaa gctacccaga tattcatttt atgtctttca tgtagaggaa 1500 gaacagaaaa cccctctcat aggatctata actccataca tagcccaacc tgggcaaaaa 1560 atccttatag ccggagcagg cctcaatgga aacatcaagg tgtatatagg aggtaggaga 1620 gcaagaatta ttgagaaaga agaaaattcc atccttgtag aggttcccga gattaaaact 1680 atgaatgcgt ggattcctgt ttgggttgtt gttaatggaa ctagaagcaa tgaggttaag 1740 cttaggtact attctagcaa tgatatccca gcactaatag tcctacaagg aaactacact 1800 ggttaccttt gggtcaaggg gaacatacca gaactctcag agccgagacc cctcttgaaa 1860 tctccaacgg gacactactt tgccgtggtt cccctcccca gaaacaaaac ttttacagtt 1920 caactatata agggacttcc ctgggaacct ctccaaccaa caaatgtcac gttgtatgga 1980 attggaaata aaacagtaat attgaatgaa gccgctccag aaactcctgt atgcggccca 2040 ggaattgtcg cagtatttgc acttctccca ttgttaaaaa gaaaaaagaa aaagtcaccc 2100 aacaccacaa taactccata cggagtaccc atagtagccg ttagctggat cgtgaggtgg 2160 tgcctctag 2169 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer am1-F1 for amplifying a gene encoding a polypeptide having a glucoamylase activity from Pyrococcus furiosus. <400> 3 aaagcatgca ctaaaggtga taacatgag 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer AMY-2N for amplifying a gene encoding a polypeptide having a glucoamylase activity from Pyrococcus furiosus. <400> 4 gcaggtcgac ggatcacgtg aacataaag 29 <210> 5 <211> 3519 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 aaagcatgca ctaaaggtga taacatgaga aagctgataa taagttttac aattcttgta 60 ctctattttt cccaggtcgc aagcctatta tgttccagag agaagtgtta tatatcaaat 120 aatggtggac agattttacg atagaaaccc aacaaataac gaacccttct atgatccaga 180 gaagaaaaac tacaggctct attggggagg agacattgaa ggcatcatag agagacttga 240 ctatatagag agtctaggtg tttcaatgat atggctttca ccattaaacg acaacataaa 300 cagaatggca ggtggaagcg ctccttatca tgggtattgg ccaagagact tcaaaaggat 360 agacgagcac tttggcacct gggaagactt tagaaggtta gtagaagaag ctaagaaaag 420 aggaatttgc ataatagtag actatgtccc caaccattca aatccagcaa ctgatgggga 480 gtttggagct ttgtacgata atggaacatt agtgactaac tactatgaag acagaaaaaa 540 tgccacaaga aatccctata ctgcgagcct ggaaaacatc tatcaccaca atggcaacat 600 aaacgattgg tttggctttc agcttaagta cgcaaatctt tttggattgg cagatttcaa 660 ccaaatgaat gactttgtgg ataattatct taaagaaggg gcagctttat tcgtgaaaaa 720 tggcgcttgt ggatttagaa ttgatgctgt taagcatata gagctgggat ggcttgaaac 780 cttctacctt tacctatatc aaatctcaga tgaaccactc tttatctacg gagaatactt 840 tgcaaacact cctgacaaaa cgtttgacct ctatgagttc tataggtact caaatgtatc 900 ttccctctta aatatcccaa ttagagaatc aattgcgaga acttttgcat atggaggaag 960 ttttgagcag ctagcaaaga tgttagagga gtattacagt ttgttcgttt atcccaacaa 1020 gcagttgaac ttcttagaca gccatgattt agttaggttc ctgaacatga acccaaacaa 1080 agacaggtac cacatggccc tcggattagt aatgacactc ccaggaattc ctgttatata 1140 ttatggagat gaaagctatt tagtgagtaa ggaagggaag ggagacccct acaacagacc 1200 aatgatggtt tttgataact ctactaaggc tgctgagatt ataagaaagc tttcattgct 1260 aagaaaagtc aacgatgccc ttgcttatag tgatttcaga accgtatatg tggactacaa 1320 cacatggata tttgagagaa agtttggaag ccacaagata ttagttgctc taaacaaagg 1380 gccagacaaa aacatcacga tttccctaaa ctggacagat ggaacataca tagacatcat 1440 cgaaggagca attctcaaag ttaaagaagg tcagggtgag ataaagctac ccagatattc 1500 attttatgtc tttcatgtag aggaagaaca gaaaacccct ctcataggat ctataactcc 1560 atacatagcc caacctgggc aaaaaatcct tatagccgga gcaggcctca atggaaacat 1620 caaggtgtat ataggaggta ggagagcaag aattattgag aaagaagaaa attccatcct 1680 tgtagaggtt cccgagatta aaactatgaa tgcgtggatt cctgtttggg ttgttgttaa 1740 tggaactaga agcaatgagg ttaagcttag gtactattct agcaatgata tcccagcact 1800 aatagtccta caaggaaact acactggtta cctttgggtc aaggggaaca taccagaact 1860 ctcagagccg agacccctct tgaaatctcc aacgggacac tactttgccg tggttcccct 1920 ccccagaaac aaaactttta cagttcaact atataaggga cttccctggg aacctctcca 1980 accaacaaat gtcacgttgt atggaattgg aaataaaaca gtaatattga atgaagccgc 2040 tccagaaact cctgtatgcg gcccaggaat tgtcgcagta tttgcacttc tcccattgtt 2100 aaaaagaaaa aagaaaaagt cacccaacac cacaataact ccatacggag tacccatagt 2160 agccgttagc tggatcgtga ggtggtgcct ctaggtatac ccatccgcta ctatctactc 2220 ttttatctac ccatcctcct aggtttccag tgtattcatg aatacaagcc cctgcaaact 2280 ttggaacgta tacccaccta ccaacccagt tagggctcaa gttaatgtaa gttataagcc 2340 caggccttct agaatctcca tttctcacaa atatgagctc atcgttgtcg tagtagacaa 2400 ttgttgtgct tcctcctgcc aaatgatcat ggatccaaat gaggttaatt agcttatcct 2460 tgttcagcca ttcctcaaag tccctgtaga atattactgg ctgtccctca tatgtcaata 2520 tgaacgcata tgctggatac ttgttccata ttatatctgt gtcatgattg gcaacgaaag 2580 ttactgcctt aaatggatct ctcgaaacta cagtttgtcc gttttgtagg gcatagacta 2640 atgctggaat gttgttattg tcaaatgctt catccatttt atagtagagc gggaagtcaa 2700 agacctttgc accactctca tatgcccagc ttagtagtgc atctacattt gtgtcccagt 2760 actctccaac tgcccaacct ccccaccaat taagccagtc tctgacaacc caagctccat 2820 agcccttaac atagtcaaat ctccaaccat caaatcctat gcttcttaaa taagcagcat 2880 aactctcatt gctcttccat agccagtact gatcccactc tttgtgatga catatatctg 2940 gaaatcctcc aaaggttcct tcgtcacaac aatgaagctc gtttggatgg aagtccagat 3000 agttagctgt atatttccct gaggcaactt tagaaaagtc tgtccatgtg taatctccaa 3060 cgaaggggtt ccattctagg tcaccaccag ccctgtggtt tataactaca tcggcgatta 3120 cctttattcc ataggcatgg gcagtttgta tcaatctcac tagttcttct tttgatccaa 3180 aacgcgtctc tacagttccc ttctggtagt actcgccgag atcaaagtaa tcatagggat 3240 cgtagcccat tgaatatcct ccactcatcc ccttgcttgg tggaggtagc catattgcag 3300 agattccagc ttcataccat tcaggaatct tcgatcttat atgatcccac caaattcctc 3360 cccctggaac atcccaatag aatgcttgca ttataactcc tccctcttca agctccaagt 3420 attttgctgc acttactgga cttgctagta ctataaaaaa cagtaataga gttaggaggg 3480 gtgttaattt ctttatgttc acgtgatccg tcgacctgc 3519 <210> 6 <211> 703 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 6 Ala Tyr Tyr Val Pro Glu Arg Ser Val Ile Tyr Gln Ile Met Val 5 10 15 Asp Arg Phe Tyr Asp Arg Asn Pro Thr Asn Asn Glu Pro Phe Tyr 20 25 30 Asp Pro Glu Lys Lys Asn Tyr Arg Leu Tyr Trp Gly Gly Asp Ile 35 40 45 Glu Gly Ile Ile Glu Arg Leu Asp Tyr Ile Glu Ser Leu Gly Val 50 55 60 Ser Met Ile Trp Leu Ser Pro Leu Asn Asp Asn Ile Asn Arg Met 65 70 75 Ala Gly Gly Ser Ala Pro Tyr His Gly Tyr Trp Pro Arg Asp Phe 80 85 90 Lys Arg Ile Asp Glu His Phe Gly Thr Trp Glu Asp Phe Arg Arg 95 100 105 Leu Val Glu Glu Ala Lys Lys Arg Gly Ile Cys Ile Ile Val Asp 110 115 120 Tyr Val Pro Asn His Ser Asn Pro Ala Thr Asp Gly Glu Phe Gly 125 130 135 Ala Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Val Thr Asn Tyr Tyr Glu Asp 140 145 150 Arg Lys Asn Ala Thr Arg Asn Pro Tyr Thr Ala Ser Leu Glu Asn 155 160 165 Ile Tyr His His Asn Gly Asn Ile Asn Asp Trp Phe Gly Phe Gln 170 175 180 Leu Lys Tyr Ala Asn Leu Phe Gly Leu Ala Asp Phe Asn Gln Met 185 190 195 Asn Asp Phe Val Asp Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Ala Ala Leu Phe 200 205 210 Val Lys Asn Gly Ala Cys Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 215 220 225 Ile Glu Leu Gly Trp Leu Glu Thr Phe Tyr Leu Tyr Leu Tyr Gln 230 235 240 Ile Ser Asp Glu Pro Leu Phe Ile Tyr Gly Glu Tyr Phe Ala Asn 245 250 255 Thr Pro Asp Lys Thr Phe Asp Leu Tyr Glu Phe Tyr Arg Tyr Ser 260 265 270 Asn Val Ser Ser Leu Leu Asn Ile Pro Ile Arg Glu Ser Ile Ala 275 280 285 Arg Thr Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Phe Glu Gln Leu Ala Lys Met 290 295 300 Leu Glu Glu Tyr Tyr Ser Leu Phe Val Tyr Pro Asn Lys Gln Leu 305 310 315 Asn Phe Leu Asp Ser His Asp Leu Val Arg Phe Leu Asn Met Asn 320 325 330 Pro Asn Lys Asp Arg Tyr His Met Ala Leu Gly Leu Val Met Thr 335 340 345 Leu Pro Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ser Tyr Leu 350 355 360 Val Ser Lys Glu Gly Lys Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Pro Met Met 365 370 375 Val Phe Asp Asn Ser Thr Lys Ala Ala Glu Ile Ile Arg Lys Leu 380 385 390 Ser Leu Leu Arg Lys Val Asn Asp Ala Leu Ala Tyr Ser Asp Phe 395 400 405 Arg Thr Val Tyr Val Asp Tyr Asn Thr Trp Ile Phe Glu Arg Lys 410 415 420 Phe Gly Ser His Lys Ile Leu Val Ala Leu Asn Lys Gly Pro Asp 425 430 435 Lys Asn Ile Thr Ile Ser Leu Asn Trp Thr Asp Gly Thr Tyr Ile 440 445 450 Asp Ile Ile Glu Gly Ala Ile Leu Lys Val Lys Glu Gly Gln Gly 455 460 465 Glu Ile Lys Leu Pro Arg Tyr Ser Phe Tyr Val Phe His Val Glu 470 475 480 Glu Glu Gln Lys Thr Pro Leu Ile Gly Ser Ile Thr Pro Tyr Ile 485 490 495 Ala Gln Pro Gly Gln Lys Ile Leu Ile Ala Gly Ala Gly Leu Asn 500 505 510 Gly Asn Ile Lys Val Tyr Ile Gly Gly Arg Arg Ala Arg Ile Ile 515 520 525 Glu Lys Glu Glu Asn Ser Ile Leu Val Glu Val Pro Glu Ile Lys 530 535 540 Thr Met Asn Ala Trp Ile Pro Val Trp Val Val Val Asn Gly Thr 545 550 555 Arg Ser Asn Glu Val Lys Leu Arg Tyr Tyr Ser Ser Asn Asp Ile 560 565 570 Pro Ala Leu Ile Val Leu Gln Gly Asn Tyr Thr Gly Tyr Leu Trp 575 580 585 Val Lys Gly Asn Ile Pro Glu Leu Ser Glu Pro Arg Pro Leu Leu 590 595 600 Lys Ser Pro Thr Gly His Tyr Phe Ala Val Val Pro Leu Pro Arg 605 610 615 Asn Lys Thr Phe Thr Val Gln Leu Tyr Lys Gly Leu Pro Trp Glu 620 625 630 Pro Leu Gln Pro Thr Asn Val Thr Leu Tyr Gly Ile Gly Asn Lys 635 640 645 Thr Val Ile Leu Asn Glu Ala Ala Pro Glu Thr Pro Val Cys Gly 650 655 660 Pro Gly Ile Val Ala Val Phe Ala Leu Leu Pro Leu Leu Lys Arg 665 670 675 Lys Lys Lys Lys Ser Pro Asn Thr Thr Ile Thr Pro Tyr Gly Val 680 685 690 Pro Ile Val Ala Val Ser Trp Ile Val Arg Trp Cys Leu 685 700 <210> 7 <211> 2112 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 7 gcctattatg ttccagagag aagtgttata tatcaaataa tggtggacag attttacgat 60 agaaacccaa caaataacga acccttctat gatccagaga agaaaaacta caggctctat 120 tggggaggag acattgaagg catcatagag agacttgact atatagagag tctaggtgtt 180 tcaatgatat ggctttcacc attaaacgac aacataaaca gaatggcagg tggaagcgct 240 ccttatcatg ggtattggcc aagagacttc aaaaggatag acgagcactt tggcacctgg 300 gaagacttta gaaggttagt agaagaagct aagaaaagag gaatttgcat aatagtagac 360 tatgtcccca accattcaaa tccagcaact gatggggagt ttggagcttt gtacgataat 420 ggaacattag tgactaacta ctatgaagac agaaaaaatg ccacaagaaa tccctatact 480 gcgagcctgg aaaacatcta tcaccacaat ggcaacataa acgattggtt tggctttcag 540 cttaagtacg caaatctttt tggattggca gatttcaacc aaatgaatga ctttgtggat 600 aattatctta aagaaggggc agctttattc gtgaaaaatg gcgcttgtgg atttagaatt 660 gatgctgtta agcatataga gctgggatgg cttgaaacct tctaccttta cctatatcaa 720 atctcagatg aaccactctt tatctacgga gaatactttg caaacactcc tgacaaaacg 780 tttgacctct atgagttcta taggtactca aatgtatctt ccctcttaaa tatcccaatt 840 agagaatcaa ttgcgagaac ttttgcatat ggaggaagtt ttgagcagct agcaaagatg 900 ttagaggagt attacagttt gttcgtttat cccaacaagc agttgaactt cttagacagc 960 catgatttag ttaggttcct gaacatgaac ccaaacaaag acaggtacca catggccctc 1020 ggattagtaa tgacactccc aggaattcct gttatatatt atggagatga aagctattta 1080 gtgagtaagg aagggaaggg agacccctac aacagaccaa tgatggtttt tgataactct 1140 actaaggctg ctgagattat aagaaagctt tcattgctaa gaaaagtcaa cgatgccctt 1200 gcttatagtg atttcagaac cgtatatgtg gactacaaca catggatatt tgagagaaag 1260 tttggaagcc acaagatatt agttgctcta aacaaagggc cagacaaaaa catcacgatt 1320 tccctaaact ggacagatgg aacatacata gacatcatcg aaggagcaat tctcaaagtt 1380 aaagaaggtc agggtgagat aaagctaccc agatattcat tttatgtctt tcatgtagag 1440 gaagaacaga aaacccctct cataggatct ataactccat acatagccca acctgggcaa 1500 aaaatcctta tagccggagc aggcctcaat ggaaacatca aggtgtatat aggaggtagg 1560 agagcaagaa ttattgagaa agaagaaaat tccatccttg tagaggttcc cgagattaaa 1620 actatgaatg cgtggattcc tgtttgggtt gttgttaatg gaactagaag caatgaggtt 1660 aagcttaggt actattctag caatgatatc ccagcactaa tagtcctaca aggaaactac 1740 actggttacc tttgggtcaa ggggaacata ccagaactct cagagccgag acccctcttg 1800 aaatctccaa cgggacacta ctttgccgtg gttcccctcc ccagaaacaa aacttttaca 1860 gttcaactat ataagggact tccctgggaa cctctccaac caacaaatgt cacgttgtat 1920 ggaattggaa ataaaacagt aatattgaat gaagccgctc cagaaactcc tgtatgcggc 1980 ccaggaattg tcgcagtatt tgcacttctc ccattgttaa aaagaaaaaa gaaaaagtca 2040 cccaacacca caataactcc atacggagta cccatagtag ccgttagctg gatcgtgagg 2100 tggtgcctct ag 2112 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer PX253-01. <400> 8 cgcgccatgg cctattatgt tccagagag 29 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer R4. <400> 9 tatccatgtg ttgtagtcc 19 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 206S-F. <400> 10 acgcaaatct tagtggattg gcagatttca ac 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer F206S-R. <400> 11 gccaatccac taagatttgc gtacttaagc tg 32 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer P142I-F. <400> 12 agactatgtc attaaccatt caaatccagc 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer P142I-R. <400> 13 tgaatggtta atgacatagt ctactattat gc 32 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer L337V-F. <400> 14 tgaacttcgt cgacagccat gatttagtta g 31 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer L337V-R. <400> 15 catggctgtc gacgaagttc aactgcttgt tg 32 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer F2. <400> 16 ctttagaagg ttagtagaa 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer F3. <400> 17 atcttaaaga aggggcagct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primerAN2-R1F2. <400> 18 ggggaggaga cattgaaggc 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer R5. <400> 19 aagttcaact gcttgttggg a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer R6. <400> 20 acaagcgcca tttttcacga 20 1/19

Claims (10)

1. 하기 ⅰ) 내지 ⅳ)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는, 열안정성 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 갖는 폴리펩티드:

   ⅰ) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,

   ⅱ) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드,

   ⅲ) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에서 하기 a) 내지 c)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드;

   a) 187번 위치 Phe의 Ser으로의 치환,

   b) 123번 위치 Pro의 Ile으로의 치환, 및

   c) 318번 위치 Leu의 Val으로의 치환,

   ⅳ) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 하기 a) 내지 c)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드;

   a) 206번 위치 Phe의 Ser으로의 치환,

   b) 142번 위치 Pro의 Ile으로의 치환, 및

   c) 337번 위치 Leu의 Val으로의 치환.
2. 제 1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
3. 제 2항에 있어서, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
4. 삭제
5. 제 2항 또는 제 3항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 DNA.
6. 제 5항에 따른 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체(transformant).
7. 제 6항에 따른 형질전환체를 배양하고 배양액으로부터 열안정성 글루코아밀라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 제 1항에 따른 폴리펩 티드를 제조하는 방법.
8. 제 1항에 따른 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 글루코오스를 해리시키는 것을 포함하는, 글루코오스를 생성시키는 방법.
9. 제 1항에 따른 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 올리고사카라이드를 생성시키는 것을 포함하는, 올리고사카라이드를 생성시키는 방법.
10. 제 1항에 따른 폴리펩티드를 α-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 사이클로덱스트린을 생성시키는 것을 포함하는, 사이클로덱스트린을 생성시키는 방법.

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