KR100768265B1 - 혈액내 순환시간을 향상시키기 위한 헤파린이 수식된리포솜 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤파린과 같은 음전하를 지니고 있는 고분자를 양전하를 띄고 있는 리포솜의 표면에 정전기적 결합에 의하여 결합시킴으로서 친수성 고분자가 결합된 리포솜을 제조하는 것으로, 더욱 상세하게는 혈액 내에서 리포솜의 구조적인 안정성과 체내 순환시간을 증가시키기 위하여 음전하의 헤파린을 리포솜의 표면에 결합 하여 리포솜의 체내순환시간을 증가시키는 한편 항암제의 체내 독성을 감소시키고 종양 조직 내부로 약물을 효과적으로 전달 할 수 있는 효율적인 리포솜의 제조방법에 관한 것이다.

안정성, 순환시간, 리포솜, 헤파린, 친수성 고분자

Description

혈액내 순환시간을 향상시키기 위한 헤파린이 수식된 리포솜 및 이의 제조방법{Heparin coated liposomes to prolong circulation time in bloodstream and preparation method thereof}

도 1은 리포솜의 안정성을 예측하기 위한 결과로서, 혈장내에서 리포솜의 입자크기 변화를 관찰한 그래프이다. (■; 비교예 1, ●; 비교예 2, ▲; 실시예 2).

도 2는 실험용 쥐에 순수한 약물과 리포솜제형을 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주사 후 약물과 리포솜이 체내 분포도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 헤파린과 같은 음전하를 띄고 있는 친수성 고분자를 양이온성 리포솜의 표면에 결합시킨 체내순환 지속형 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 혈액 내에서 혈장단백질의 흡착에 의해 불안정해지는 리포솜의 구조적인 안정성과 리포솜제형이 혈액내를 순환하면서 각 장기내로 이행 시( 간, 비장) 세망내피계에 의한 흡수(uptake)를 감소시켜 체내 순환시간을 향상시키고, 약물을 안전하게 제형화 함으로서 심장에 대한 약물 고유의 독성을 감소시키기 위한 안정화-체내순화지속화 헤파린 결합 리포솜의 제조 및 약동력학적 반감기 증가 및 종양 조직내로의 약물이행 증가를 실현하기 위한 음이온성 고분자가 결합된 리포솜의 제조방법에 관한 것이다.

리포솜은 체내에 존재하는 인지질을 주성분으로서 사용하기 때문에 생체적합성이 우수하고 효율적인 약물의 이동을 수행 할 수 있는 약물 전달체로서 많이 응용되어 왔다 [A.D. Bangham, M. Standish, J. C. Watkis, J. Mol. Biol., 13, 238(1965)]. 또한 독성이 강한 항암약물등의 전달체로서 약물 고유의 독성을 감소시키고 이에 수반되는 심각한 부작용을 미연에 방지할 수 있는 장점을 가지고 있다 [D. Needham, M. W. Dewhirst, Adv. Drug Deliver. Rev., 53, 285(2001)]. 특히 안트라사이클린 계열의 항암약물은 심장에 강한 독성을 나타내며 심장 이외의 지역에서도 정상세포에까지 영향을 미치는 심각한 부작용을 나타내는 특성이 있다. 이러한 약물을 효율적으로 암조직까지 운반하기 위해 리포솜을 이용함으로서 약물의 독성을 감소시키고 체내 순환 시간을 증가시킬 수 있다는 보고가 있다 [D.J.A. Crommelin, L. van Bloois, Int. J. Pharm., 17, 135(1983)]. 그러나 이와 같은 리포솜은 체내 주입 시 혈장 단백질의 흡착과 효소들에 의한 지질의 분해등의 이유로 인하여 리포솜의 구조적인 불안정성이 관찰됨으로서 현재 약물 전달체로써 응용이 많이 부족한 형편이다. 따라서 리포솜의 안정성을 향상시키기 위한 여러 가지 방법들이 도입되고 있는 실정이고, 특히 리포솜의 표면에 음전하를 띄는 고분자 물질을 결합시켜 혈장 단백질과 흡착을 방지하고, 혈액 내에서 리포솜의 안 정성과 잔류 시간을 증가시키기 위한 연구가 진행되고 있다 [H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima, J. Control. Release, 75, 83(2001)].

상기 음이온성 고분자 물질 중에서 헤파린은 주로 술폰기, 카르복시기, 하이드록시기 같은 친수성 구조로 되어있는 수용성 물질이면서, 세포 및 조직과의 상호작용에 대하여 안정성을 갖는 생체 적합성을 나타내고 있다 [M. L. Walfrom, W. H. Mcneely, J. AM. Chem. Soc., 67, 748(1945)]. 또한 안티트롬빈 Ⅲ(antithrombin Ⅲ)와 강하게 결합하여 혈액 속 응고물질인 피브린의 응고(fibrin clot) 형성을 방지하여 항 혈전성 약물로써 이를 이용한 약물 전달체의 연구가 활발히 이루어지고 있다[A. Wirsen, M. Ohrlander, A. C. Albertsson, Biomaterials, 17, 1881(1996), A. Sahli, M. Cansell, J. Tapon-Bretaudiere, D. Letourneur, J. Jozefonvicz, A. M. Fischer, Colloid Surf. B-Biointerfaces, 10, 205(1998), X. H. Wang, D. P. Li, W. J. Wang, Q. L. Feng, F. Z. Cui, Y. X. Song, Int. J. Biol. Macromol., 33, 95(2003)].

최근 체내 안정성을 향상시키기 위한 리포솜 개발 사례 중에서 폴리에틸렌 글리콜을 지질에 결합시킨 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000] (DSPE-mPEG2000)으로 구조적으로 안정한 리포솜을 제조하는 것에 관한 연구결과가 발표되었다. [B. Ceh, M. Winterhalter, P. M. Frederik, J. J. Vallner, D. D. Lasic, Adv. Drug Deliv. Rev., 24, 3356(1997)]. 종래 기술들에 의한 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 2000을 이용한 리포솜의 제조는 제형적인 안정성과 순환시간을 향상시키기에 적합한 방법이었다 [B. Ceh, M. Winterhalter, P. M. Frederik, J. J. Vallner, D. D. Lasic, Adv. Drug Deliv. Rev., 24, 3356(1997)]. 그러나 현 의료 치료시 여전히 리포솜에 의한 약물의 독성에 대한 문제가 제기되는 바, 리포솜의 안정성과 체내 순환시간을 향상시킬 수 있는 방법에 대한 논의가 활발하게 대두되고 있는 실정이다.

따라서 현재 의료적으로 사용하고 있는 리포솜에 비하여 안정성을 월등히 향상시키고 체내 체류 시간 및 독성을 감소시키기 종양 조직 이외의 조직에 대하여 약물의 생체 분포를 낮추기 위한 제형의 개발이 시급한 실정이며, 따라서 혈장 단백질에 대하여 독립적이고 약물의 순환 반감시간을 향상시켜 체내에서 약물의 유효치료 농도를 지속적으로 유지하며, 대상으로 하는 종양 조직으로만 약물이 농축될 수 있도록 하는 제형의 개발이 무엇보다도 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 리포솜이 체내에서 안정성이 향상되며, 지속적으로 순환 되면서 종양 조직에 농축되어 약물의 방출을 유도할 수 있는 리포솜을 개발하기 위하여 연구하였다. 그 결과, 양이온성 리포솜의 표면에 헤파린을 이온 결합시켜 리포솜의 표면이 강한 음전하를 띄게 하여 혈장 단백질과 흡착을 감소시켰고, 결과적으로 안정성과 체내 순환시간이 증가된다는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 혈액 내에서의 안정성과 순환시간을 증가시키기 위하여 리포솜의 지질막 표면에 강한 음이온을 갖는 고분자인 헤파린을 수식하여 혈장 단백 질과 흡착이 적은 안정화-체내순환 지속형 리포솜 및 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 리포솜 표면에, 중량 평균 분자량이 1000 ~ 300,000인 헤파린 또는 그 유도체가 수식된 것을 특징으로 하는 리포솜에 그 특징이 있다.

또한 본 발명은 안트라사이클라인 계열 약물, 알칼로이드 계열 약물, 파클리탁셀 계열 약물 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 어느 하나의 소수성 약물이 상기 리포솜에 봉입된 주사제에 또 다른 특징이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 있어서 헤파린은 다양한 동물조직에서 분리 추출하거나, 재조합 헤파린(recombinant heparin)을 사용하는 것도 가능하다. 현재 이러한 목적으로 사용되는 대부분의 헤파린은 돼지의 장점막으로부터 분리되고, 분리공정은 점막의 가수분해 단계 및 헤파린의 추출 단계를 포함한다. 특히 본 발명의 헤파린분자량이 1000 ~ 300,000 범위이다. 따라서 분자량 1,000 ~ 6,000의 저분자량 헤파린(low molecular weight heparin)이나 분자량 6,000 ~ 100,000의 고분자량 헤파린(high molecular weight heparin)을 모두 사용할 수 있다. 분자량이 상기 범위 미만일 경우에는 헤파린이 리포솜 표면에 결합되지 않는 문제가 있고, 분자량이 상기 범위를 초과할 경우에는 리포솜 구조의 안정성이 떨어지는 문제가 있다. 또한 바람직하게는 중량 평균 분자량이 3,000 ~ 100,000인 헤파린을 사용하는 것이 다. 이하 본 명세서에서 사용하는 "헤파린"은 상기 헤파린, 상기 헤파린의 분절(fragments), 상기 헤파린의 염 또는 상기 헤파린의 유도체를 포함하는 의미이다.

본 발명에서는 헤파린으로 리포솜의 표면을 수식하여 혈액 내 안정성 및 순환시간이 향상된 음이온성을 나타내는 체내순환 지속형 리포솜을 제공한다. 본 명세서에서 사용하는 "표면 수식"은 리포솜 표면에 강한 음이온성 헤파린으로 표면에 이온결합을 통해 코팅된 것을 의미한다. 또한 본 명세서에서 사용하는 "체내순환 지속형" 리포솜은 헤파린이 리포솜 표면에 수식된 리포솜으로 투여 후 수 시간 내에 혈류에서 사라지는 통상의 리포솜과 달리 통상 리포솜을 투여하고, 투여 후 혈류에 60시간 이상 잔류하는 리포솜을 의미한다. 상기 헤파린은 리포솜을 형성하는 지질 100 중량부에 대하여 1 ~ 60 중량부 포함하는 것이고, 바람직하게는 30 ~ 60 중량부 포함하는 것이다. 헤파린이 상기 범위 미만으로 존재하는 경우에는 리포솜표면의 음이온성이 충분하지 않아 혈액 내에서 혈장단백질의 흡착이 우려되고, 안정성 및 순환시간 향상 효과가 크지 않고, 상기 범위를 초과하더라도 리포솜의 표면적이 제한되어 있으므로 더 이상 리포솜의 음이온성 증대 효과가 발생하지 않는다. 또한 상기 리포솜의 평균 입경은 30 ~ 200 nm, 바람직하게는 90 ~ 150 nm인 것이다. 리포솜의 평균 입경이 상기 범위를 초과하는 경우 체내 순환시 장기 즉 간이나 비장에서 세망내피계에 의하여 흡수(uptake)가 발생하며, 리포솜이 상기 범위 미만이 경우에는 목표 부위에 전달하는 약물의 양(drug payload)이 불충분하다.

상기 리포솜을 형성하는 지질로서 본 발명의 리포솜을 구성하는 지질도 특별히 한정되지 않고, 공지된 지질일 수 있다. 상기 지질로는, 예를 들어 인지질, 당지질, 지방산, 디알킬디메틸암모늄(dialkyl dimethylammnonium), 폴리글리세롤알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등, 알킬글리코시드, 알킬메틸글루카미드, 알킬수크로스에스테르, 디알킬폴리옥시에틸렌에테르, 디알킬폴리글리세롤에테르 등, 폴리옥시에틸렌-폴리락트산 등의 양친매성 블록공중합체 등, 장쇄 알킬아민류 또는 장쇄 지방산 하이드라자이드류 등을 들 수 있다.

상기 인지질로는, 예를 들어 포스파티딜콜린(대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 보바인 포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린 등), 포스파티딜에탄올아민(디라우로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 또는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일포스파티딜에탄올아민 등), 포스파티딜세린(디라우로일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린 또는 디스테아로일포스파티딜세린 등), 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤(디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 또는 디스테아로일포스파티딜글리세롤 등), 포스파티딜이노시톨 (디라우로일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜이노시톨 또는 디스테아로일포스파티딜이노시톨 등), 리조포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 난황 레시틴, 대두 레시틴 또는 수소첨가 인지질 등의 천연 또는 합성 인지질 등을 들 수 있다.

상기 당지질로는, 예를 들어 글리세로 당지질, 스핑고 당지질 등을 들 수 있다. 상기 글리세로 당지질로는, 디갈락토실디글리세리드류(디갈락토실디라우로일글리세리드, 디갈락토실디미리스토일글리세리드, 디갈락토실디팔미토일글리세리드 또는 디갈락토실디스테아로일글리세리드 등) 또는 갈락토실디글리세리드류(갈락토실디라우로일글리세리드, 갈락토실디미리스토일글리세리드, 갈락토실디팔미토일글리세리드 또는 갈락토실디스테아로일글리세리드 등) 등을 들 수 있다. 상기 스핑고 당지질로는, 예를 들어 갈락토실셀레브로시드, 락토실셀레브로시드 또는 간글로시드 등을 들 수 있다.

상기 스테롤류로는, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤 또는 라노스테롤 등을 들 수 있고, 리포솜 형성 지질 중에서 20 ~ 45 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 스테롤의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 안정성이 저하되며 약물의 봉입에 문제가 있다.

또한 상기 디알킬디메틸암모늄으로는, 예를 들어 디옥타데실디메틸암모늄(브로마이드 솔트), 디알킬디메틸암모늄프로판, 디알킬트리메틸암모늄프로판 등을 들 수 있다.

상기 리포솜 형성 지질은 단독 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.

또한 헤파린과 결합되는 리포솜의 전하가 반드시 한정될 필요는 없으나, 상기 헤파린과 리포솜 사이의 이온결합력이 증대될 수 있는 양이온성 리포솜이 바람직하다. 이를 위해 리포솜 형성 지질 중에 양이온성 지질로서 디알킬디메틸암 모늄, 디오레오일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일디알킬트리메틸암모늄프로판 또는 디오레오일디알킬디메틸암모늄프로판 등을 10 ~ 30 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 양이온성 지질이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 침전이 생기는 것과 같은 안정성 문제가 발생한다.

또한 본 발명의 바람직한 양태 중의 하나로 리포솜의 형성과 안정성에 효과적인 포스파티딜콜린, 콜레스테롤과 양이온성을 가지고 있는 디메틸디옥타데실암모늄(브로마이드 솔트)로 구성된 리포솜 조성물을 사용하는 것이다.

본 발명의 헤파린을 수식하기 전의 리포솜의 제조방법은 공지된 다양한 기술에 의해서 제조될 수 있다. 본 발명의 헤파린을 수식하기 전의 리포솜을 제조하는 바람직한 방법 중 하나는 아래에 설명하는 역상증발법이나 이에 한정하는 것은 아니다.

먼저 리포솜을 형성할 수 있는 지질 성분을 혼합한다. 상기 리포솜 형성지질에는 앞서 설명한 바와 같이 양이온성 지질을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 혼합된 지질 성분에, 클로로포름과 같이 지질의 용해가 가능한 용매에 용해시킨 후, 증발응축기를 이용하여 클로로포름을 증류시켜 제거하고 얇은 지질막을 형성한다. 이후에 농도차이에 의한 약물 로딩 역할을 수행할 수 있는 암모늄 설페이트(Ammonium Sulfate) 등의 용액을 첨가하여 지질막을 수화시켜 리포솜을 형성한다. 상기 리포솜을 감압 압출을 통해 평균 입경을 30 ~ 200 nm인 리포솜을 제조한다.

다음으로 리포솜에 약물을 봉입한다. 본 명세서에서 "봉입된 (entrapping)"은 화합물이 리포솜 지질 이중막 사이의 또는 이중막 그 자체 내에서의 수성 공간에서, 리포솜의 중심 수성 구획에 봉착되는 것을 의미한다. 본 발명의 체내순환 지속형 리포솜은 소수성 주사용 항암 약물로 일반적으로 사용되는 안트라사이클라인계열 약물(독소루비신, 에피루비신, 하이루비신, 다우노루비신, 에소루비신, 이다루비신 등), 알칼로이드계열 약물, 파크리탁셀계열 약물 및 약리학적으로 허용되는 그들의 염 및 산 등이 봉입에 유리하나 특별히 이에 한정하는 것은 아니다. 독소루비신과 같은 안트라사이클라인계열의 약물들은 리포솜 내에서 암모늄설페이트와 만나 침전을 형성하여 약물이 봉입되는 특징을 가지고 있다. 상기 약물의 리포솜 내 봉입 효율은 80 ∼ 100 % 범위를 갖는다.

상기 약물이 봉입된 리포솜, 바람직하게는 약물이 봉입된 양이온성 리포솜과 본 발명의 헤파린을 리포솜 형성 지질 100 중량부에 대하여 1 ~ 60 중량부 혼합하여, 4 ℃에서 24 시간 동안 교반시킨다. 4 ℃에서 교반시키는 이유는 리포솜의 안정성을 최대로 하고 헤파린을 결합시키기 위함이다. 상기 리포솜과 결합되지 않은 헤파린은 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 제거한다.

상기 리포솜은 단독으로 또는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 주사제로서, 예를 들면 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 주사 등으로 사용된다. 본 발명의 체내순환 지속형 리포솜을 이용해 제조한 주사제는 순수 약물의 30 % 미만을 사용하더라도, 순수 약물과 동등하거나 뛰어난 약리 활성을 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발 명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 : 양이온성 리포솜의 제조

리포솜을 형성하는 지질 성분으로 L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL), 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)를 70: 30: 20 의 몰비율로 혼합하였다. 이후에 클로로포름을 사용하여 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄를 용해시킨 후, 증발응축기를 이용하여 용매를 증류에 의해 제거하여 얇은 지질 막을 형성시켰다. 다음으로 250 mM 암모늄 설페이트 용액을 50 ㎖ 첨가하여 상기 형성된 지질 막을 수화시켜 리포솜을 제조하였다. 상기 수화과정이 끝난 후 가압 압출기를 사용하여 리포솜의 크기를 100 nm 내외로 형성하였고, 잔류 지질, 암모늄 설페이트는 막 투과법을 이용하여 제거하였다.

제조예 2 : 헤파린이 결합된 생체순환 지속형 리포솜의 제조

상기 제조예 1에서 만들어진 리포솜의 표면에 헤파린(HEP) 5 mg/㎖ H₂O을 혼합하여 4 ℃에서 24 시간 교반한다. 사용된 헤파린은 분자량이 3000 이하인 특성을 가지고 있고, 헤파린의 혼합량은 총 리포솜 형성 지질의 양을 100 중량부로 봤을 때, 30 중량부를 혼합하여 교반하였다. 이 후 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 리포솜 표면에 코팅되지 않은 헤파린을 제거하였다.

비교예 1

상기 제조예 1과 동일하게 실시하되, 리포솜 지질 성분으로 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)를 사용하지 않고, L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL)을 70:30 몰비율로 사용하여 리포솜을 제조하였다.

비교예 2

상기 제조예 1과 동일하게 실시하되, 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)대신에 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG)을 사용하여 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG)이 3 : 1 : 1 의 질량비율로 리포솜을 제조하였다.

실험예 1

제조예 1 및 2와 비교예 1 및 2의 입자 크기와 표면 전하를 입도 분석기(ELS-8000, Otus-ka, Japan)를 이용하여 측정하였다(L. Zhu, R. A. Seburg, E. W. Tsai, J. Pharm. Biomed. Anal., 8(2005)). 모든 제조예 및 비교예에서 90 ~ 120 nm 범위 내의 입자크기를 나타내었다. 또한 제조예 1은 양이온성을 나타내었고, 제조예 1의 리포솜에 헤파린을 수식한 제조예 2의 체내순환 지속형 리포솜은 비교예 1 및 2에 비하여 강한 음이온성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.

구 분	성분	입자크기 (㎚)	Z-포텐셜 (mV)
비교예 1	HSPC:CHOL	98.8	-3.88
비교예 2	HSPC:CHOL:DSPE-mPEG	96.3	0.13
제조예 1	HSPC:CHOL:DDAB	91.2	14.02
제조예 2	HSPC:CHOL:DDAB + HEP	101.2	-42.12

실험예 2

리포솜 표면에 코팅된 헤파린의 양을 측정하기 위해 상기 제조예 2에서 제조한 체내순환 지속형 리포솜 용액 1 ㎖에, 톨루이딘 블루 용액 2 ㎖을 첨가하여 톨루이딘 블루 용액과 흡착한 헤파린의 양을 자외선 분광 광도계(파장 673 nm)를 이용하여 측정하였다. 리포솜 표면에 흡착된 헤파린의 양은 2.8 mg/㎖이고, 이에 따른 흡착효율은 92 %를 나타내었다.

실험예 3

혈액내에서 리포솜 입자 안정성을 측정하기 위하여, 소 혈청 용액과 상기 제조예 2 및 비교예 1 및 2에서 제조된 리포솜을 1 : 1 부피비로 혼합하여 37 ℃로 유지시킨 후, 시간 경과에 따른 리포솜 입자의 크기 변화를 측정하여 그 결과를 다음 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 비교예 1에 비하여 제조예 2의 본 발명에 따른 헤파린이 코팅된 리포솜은 소 혈청 내에서의 입자 크기 변화를 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나 비교예 2의 PEG가 결합된 리포솜의 경우 제조예 2의 헤파린이 결합된 리포솜과 큰 차이를 나타내지는 않았다. 따라서 PEG와 헤파린 모두 혈액내에서 혈장단백질의 흡착을 방지한다고 볼 수 있다. 그러나 이것은 in vitro의 실험일 뿐이며, 비교예 2의 PEG가 결합된 리포솜 보다 제조예 2의 헤파린이 결합된 리포솜이 혈장 단백질의 흡착을 감소시켰으므로 이러한 in vivo 실험 결과는 다음 실험예 4에 나타내었다.

제조예 3 : 리포솜 주사제의 제조

상기 제조예 2에서 제조한 리포솜과 슈크로스(10 % w/v)에 독소루비신을 2 mg/㎖로 용해시킨 독소루비신 혼합액을 1 : 1 부피비로 혼합하여 60 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 상기 혼합액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 독소루비신은 막 투석법을 이용하여 제거하여 헤파린 코팅 리포솜 주사제(HSPC:CHOL:DDAB + HEP)를 제조하였다.

또한 비교예 1의 리포솜을 사용한 주사제(HSPC:CHOL) 및 비교예 2의 리포솜을 사용한 주사제(HSPC:CHOL:DSPE-mPEG)를 상기 방법과 동일하게 독소루비신 혼합액을 이용하여 제조하였다.

실험예 4: 약동력학적 실험

리포솜의 체내 순환시간을 관찰하기 위하여 C57BL/6 실험용 쥐에 순수한 약물과 리포솜용액을 꼬리 정맥을 통하여 투여하고 시간별로 혈액을 채취함으로써 리포솜내부에 봉입된 약물의 농도를 측정하였고, 측정되어진 약물의 농도로서 약동력학적 결과를 산출하였다. 약동력학적으로 산출된 결과를 통하여 약물의 체내 순환시간을 확인하였다. 리포솜내부의 약물의 농도는 시간별로 채취한 혈액을 식염수로 희석하여 원심분리 한 후 상층액을 60 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액과 50 mM N-2-하이드록시에틸파이퍼라진-N'-2-에탄설포닉산(HEPES) 용액으로 희석하여 약물의 홉광강도를 측정하였다. 상기 형광강도의 측정은 자외선 분광광도계를 이용하여 측정하였으며 약물의 파장 490 nm에서 측정하였다. 상기 실험에서 산출되어진 약동력학적 결과를 표 2에 나타내었다.

	순수 독소루비신	비교예 1의 리포솜을 사용한 주사제 (HSPC:CHOL)	비교예 2의 리포솜을 사용한 주사제 (HSPC:CHOL:DSPE-mPEG)	제조예 2의 리포솜을 사용한 주사제 (HSPC:CHOL:DDAB + HEP)
AUC (㎍·h/㎖)	12.00	25.59	201.24	319.59
t 1/2 (h)	1.68	2.37	12.80	19.80
CL (㎖/h)	17.40	4.62	0.60	0.38
MRT (h)	1.95	4.82	17.78	28.42

상기 표 2의 AUC(area under the curve)는 체류농도에 대한 면적, t _{1 /2}은 반감기, CL은 불안정성(clearance), MRT(mean residence time)는 약물 체류 시간을 나타낸다.

상기 표 2 에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 2의 헤파린 결합 리포솜을 사용한 주사제(HSPC:CHOL:DDAB + HEP)는 반감기가 19.80 시간으로 나타났고, 약물의 체류시간(MRT, mean residence time)은 28.42 시간, 체류농도에 대한 면적은 (AUC, area under the curve) 319 ㎍·h/㎖, 그리고 CL (clearance)는 0.38 ㎖/h 로 나타났다. 그러나 비교예 2의 PEG 결합리포솜을 사용한 주사제는 반감기가 12.80 시간, 비교예 1의 리포솜을 사용한 주사제는 반감기가 2.37 시간, 순수 독소루비신은 반감기가 1.68 시간으로 나타났다. 반감기가 증가한다는 사실은 체내에서 약물의 유효농도가 계속 유지될 수 있는 50 % 이상의 약물이 체류하는 시간을 시사하며, 본 결과로서 헤파린이 결합된 리포솜이 여타의 비교예에 비하여 체류시간이 월등함을 확인할 수 있었다. 또한 약물의 체류시간이 비교예 2의 PEG 결합리포솜을 사용한 주사제는 17.78 시간, 비교예 1의 리포솜을 사용한 주사제는 4.82 시간, 순수 독소루비신은 1.95 시간으로서 체류 시간이 제조예 2의 헤파린 결합 리포솜을 사용한 주사제에 비하여 작다는 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로서 제조예 2의 헤파린 결합 리포솜을 사용한 주사제가 체내에서 리포솜의 불안정성이 가장 적었고(표 1의 CL결과 참조), 약물 체류시간과 반감기, 체류농도에 대한 면적은 가장 우수한바, 이러한 결과는 리포솜의 표면에 헤파린을 결합함으로서 리포솜의 안정성과 체내 순환시간을 기존의 PEG 리포솜에 비하여 증가시킬 수 있다는 사실을 시사한다.

실험예 4: 약물의 생체분포도

상기 제조예 3과 동일하게 제조한 제조예 2의 헤파린이 결합된 리포솜을 사용한 주사제(Heparin-coated liposomes), 비교예 1의 리포솜(Conventional liposomes), 비교예 2의 리포솜(PEG-liposomes)을 사용한 주사제, 그리고 순수한 독소루비신을 6 mg drug/kg of mouse body weight로서 실험용 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주사 한 후, 실험용 쥐에 대한 약물의 생체분포도를 관찰 하였다.

리포솜의 생체분포도를 관찰하기 위하여 B16F10 피부암 세포주 (melanoma)가 이식된 C57BL/6 실험용 쥐에 순수한 약물과 리포솜용액을 꼬리 정맥을 통하여 투여하고 시간별로 실험용 쥐의 종양, 심장, 간, 비장을 채취하여 약물의 분포를 확인하였다 (도 2). 약물의 농도의 측정방법은 실험예 4를 따랐다.

상기 도 2와 같이, 제조예 2의 헤파린이 결합된 리포솜이 비교예 2의 PEG가 결합된 리포솜에 비하여 종양조직에 많이 농축되어 있는 것을 확인 할 수 있었다 (도 2A). 본 결과로부터 제조예 2의 헤파린 결합 리포솜이 종양조직으로 많이 농축되는 것을 확인하였으며, 이는 비교예 2의 PEG 리포솜보다 순환시간이 증가함과 동시에 리포솜의 안정성이 증가되어 종양 조직으로 이동 될 수 있는 "증진된 투과 및 유지효과"(EPR effect)에 기인하였을 것이라 예측되며, 본 실험결과 종양의 치료효과역시 상승 적일 것이라고 판단된다. 한편 심장의 경우 (도 2B), 순수한 독소루비신이 많이 검출되고 이는 순수한 약물 고유의 심장 독성 때문이다. 따라서 순수한 독소루비신만을 주사하였을 경우 심각한 독성이 예상되기 때문에 약물운반체를 이용하여 효과적으로 약물을 운반하는 것이 바람직하며, 이때 PEG나 헤파린 등의 고분자를 이용하여 리포솜의 제조함으로서 약물의 독성을 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 간 및 비장의 경우 (도 2C 및 2D), 고분자가 결합되지 않은 비교예 1의 리포솜의 경우, 간과 비장에서 세망내피계에 의해 많이 포획된 것을 확인 할 수 있었으며 따라서 리포솜을 효과적이고 오랜 시간 순환시키기 위해서는 고분자의 결합이 바람직한 방법이라는 것을 확인하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 헤파린이 표면에 수식된 생체순환지속형 리포솜은 종래의 리포솜에 비해 체내 순환 지속력이 향상되어 이를 이용하여 약물 전달체를 체내에 투여하는 경우 약물을 함유한 리포솜이 혈액 내에 오랫동안 순환할 수 있는 체류율 연장의 효과가 나타나고, 약물을 체내 목표 부위에 전달하는 효율이 향상되어 이에 따른 부작용도 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

Claims (6)

1. 리포솜 표면에, 중량 평균 분자량이 1000 ~ 300,000인 헤파린 또는 그 유도체가 이온결합을 통해 수식된 것을 특징으로 하는 리포솜.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 헤파린이 상기 리포솜을 형성하는 지질 100 중량부에 대하여 1 ~ 60 중량부 포함되는 것을 특징으로 하는 리포솜.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 리포솜은 평균 입경이 30 ~ 200 ㎚ 범위인 것을 특징으로 하는 리포솜.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 리포솜을 형성하는 지질 중에 양이온성 지질을 10 ~ 30 몰% 포함하고,

   상기 상기 양이온성 지질은 디알킬디메틸암모늄, 디오레오일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일디알킬트리메틸암모늄프로판 및 디오레오일디알킬디메틸암모늄프로판 중에서 선택되는 어느 하나 또는 2 종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포솜.
5. 삭제
6. 독소루비신, 에피루비신, 하이루비신, 다우노루비신, 에소루비신, 이다루비신 중에서 선택되는 어느 하나의 안트라사이클라인 계열 소수성 약물이 리포솜에 봉입된 주사제에 있어서,

   상기 리포솜은 청구항 1 내지 청구항 4 중에서 선택되는 어느 하나의 리포솜인 것을 특징으로 하는 주사제.

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