KR100777227B1

KR100777227B1 - 고호열성 ｄｎａ 중합효소 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100777227B1
Application number: KR1020050094644A
Authority: KR
Inventors: 이정현; 권석태; 강성균; 김상진; 현정호; 권개경; 김윤재; 이현숙; 배승섭; 남기훈; 임재규; 전정호; 양성현
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2005-10-08
Filing date: 2005-10-08
Publication date: 2007-11-28
Anticipated expiration: 2025-10-08
Also published as: WO2007043769A1; US20090148896A1; US8257953B2; KR20070039418A

Abstract

본 발명은 고호열성 DNA 중합효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, Thermococcus sp. 균주로부터 분리되어진 신규의 고호열성 DNA 중합효소 및 이의 기능적 동등물, 이들의 아미노산 서열을 가진 단백질 및 고호열성 DNA 중합효소 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따른 DNA 중합효소는 고호열성이며, 기존의 상업적 DNA 중합효소와 비교하였을 때, 높은 신장 능력 및 높은 충실도를 가지는 DNA 중합효소이다. 따라서, 정확한 PCR이 요구되는 정밀분석, 정밀진단. 동정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

DNA 중합효소, 충실도, 고호열성

Description

고호열성 ＤＮＡ 중합효소 및 이의 제조방법{Hyperthermophilic DNA Polymerase and Methods of Preparation Thereof}

도 1은 Thermococcus sp. NA1 (TNA1), T. kodakarensis KOD1(TkKOD1, gi:52696275), Pyrococcus furiosus(Pfu, gi:18892147), 및 Pyrococcus sp. GB-D(PGBD, gi:436495)로부터의 패밀리 B 타입 DNA 중합효소의 아미노산 서열 비교한 것을 보인다. 대시는 갭(gap)을 나타내고, 오른쪽의 숫자는 원래 서열안에 있는 마지막 잔기의 번호를 나타낸다. 4개의 효소 사이에 같은 잔기는 * 로 나타내었고 보존적 치환을 가진 잔기 및 반-보존적으로 치환된 것은 : 으로 나타내었다. Pol I에서 Pol IV까지, 패밀리 B DNA 중합효소에서 보전되어진 영역; Exo I에서 Exo III까지 3'->5' 엑소뉴클리아제 도메인의 보존된 모티프; 및 DNA-결합 모티프가 표시되었다.

도 2는 TNA1-pol의 SDS-PAGE 분석결과이다. M, 표준시료; 1, 조 추출액; 2, 열처리후 3, His-태그된 친화성 크로마토그라피. 분자량 표준물(레인 M)은 포스포릴라아제 b (103 kDa), 소 혈청 알부민 (77 kDa), 오발부민 (50 kDa), 카보닉 안하이드라아제 (34.3 kDa), 콩 트립신 억제제 (28.8 kDA), 및 리소자임 (20.7 kDa)이다.

도 3은 TNA1-pol의 DNA 중합효소 활성에 대한 pH의 영향을 보인다. 활성도 분석은 다음의 완충용액(각각 50mM)에서 표준적인 방법으로 행하여졌다: MES, pH 6.0-7.0; 트리스-HCl, pH 7.0-9.0; 글리신, pH 9.0-10.0.

도 4는 TNA1-pol의 DNA 중합효소 활성에 대한 온도 및 열안정성에 대한 효과를 보인다. (A) DNA 중합효소 활성도에 대한 온도 효과. (B) TNA1_pol의 열안정성. 재조합 TNA1_pol은 95℃ (▲) 및 100℃ (●)에서 전-항온반응되었고, 잔존하는 활성도가 75℃에서 측정되었다.

도 5는 TNA1-pol의 DNA 중합효소 활성에 대한 마그네슘 이온 (A), 암모니움 이온 (B) 및 칼륨 이온 (C)에 대한 효과를 보인다. 활성도 분석은 MgCl₂, (NH₄)₂SO₄, 및 KCl의 존재하에서 수행되었다.

도 6은 재조합 TNA_pol의 엑소뉴클리아제 활성을 측정한 것이다. 3'-> 5' 엑소뉴클라아제 활성는 dNTP가 부존재 (○), 존재 (●)에서 분석되었다. 5'-3' 엑소뉴클리아제 활성은 dNTP의 부존재 (△) 또는 존재 (▲)에서 분석되었다.

도 7. (A)는 여러 가지 DNA 중합효소로 PCR 증폭한 것을 보인다. 레인 M, DNA 분자 사이즈 마커; 레인 1, 네가티브 대조군; 레인 2, Ex Taq DNA 중합효소(다카라); 레인 3, Pfu Turbo DNA 중합효소(스트라타진); 레인 4, KOD DNA 중합효소(노바겐); 레인 5, TNA1-pol. (B) 긴 사슬의 DNA 분절을 재조합 TNA1-pol을 이용하한 증폭을 보인다. 레인 M, DNA 분자 사이즈 마커; 레인 1, 2kb의 PCR 증폭; 레인 2, 4kb의 PCR 증폭; 레인 3, 8kb의 분자량 증폭. TNA1-pol을 이용한 PCR 반응은 20mM 트리스-HCl (pH 8.5), 30mM (NH₄)₂SO₄, 및 1mM MgCl₂에서 수행하였고, 다른 상업적인 중합효소의 PCR은 제조자가 추천하는 표준 프로토콜에 따랐다.

도 8은 본 발명에 따른 재조합 DNA 중합효소 TNA1-pol을 가지고 있는 pETNAPm 재조합플라스미드의 개열지도를 보인다.

게놈의 연구의 최근의 진보는 막대한 양의 서열 정보를 생산했다. 종래의 유전자 공학 및 게놈의 연구 기술의 일반적인 조합과 함께, 몇몇의 고호열성 미생물의 게놈 서열은 생물 공학 분야에서 열에 강한 효소 때문에 관심을 받고 있으며, 많은 매우 열안정적 효소가 생물 공학의 목적으로 개발되고 있다.

열안정적 DNA 중합효소를 사용하는 PCR는, 단백질 및 유전자 연구에서 중요한 기여를 하고 있으며, 현재 넓은 생물학의 응용 분야에서 사용이 된다. 50개 이상의 DNA 중합효소 유전자가 호열성 생물 및 고세균을 포함한 여러 가지 생물체로부터 클론 되었다. 최근, 일반적으로 사용되는 Taq 중합효소 보다 프로프리딩(proof reading) 활성도에 기초하여 PCR에서 높은 충실도(fidelity)를 가지기 때문에, 고호열성 고세균(Pyrococcus와 Thermococcus)로부터의 B 패밀리 DNA 중합효소가 넓게 사용되었다. 그렇지만, 높은 충실도의 효소는 낮은 DNA 신장 능력(elongation ability) 때문에 개선이 요구되고 있다. 본 발명자들은, PACMANUS 필드의 심해 열수 분출구 지역으로부터 새로운 고호열성 균주를 분리했다. 이것은 16S rDNA 서열 분석결과 Thermococcus의 하나로 밝혀졌다. 이로부터 열안정적인 효소를 찾기 위하여 전체 게놈(genome) 서열 분석이 수행되고 있다. 게놈 정보의 분석으로 상기 균주가 B 타입의 DNA 중합효소를 가지고 있음을 보였다. 본 발명자는 상기 균주로부터 DNA 중합효소에 상응하는 유전자을 클론하였고, 대장균에서 발현시키는데 성공하였다. 또한 재조합 DNA 중합 효소를 분리하여 효소적 특성에 대하여 조사하였다.

이에 본 발명자는 고호열성 고세균 Thermococcus sp. NA1으로부터 DNA 중합효소를 분리 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 충실도가 높고, 높은 신장능력을 가지고, 고호열성인 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.

본 발명은 충실도가 높고, 높은 신장능력을 가지고, 고호열성인 DNA 중합효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 DNA 중합효소 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.

본 발명은 DNA 중합효소를 암호화하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

제 1 양태로, 본 발명은 고온에서 안정한 DNA 중합효소를 암호화하는 핵산서열 및 상기 서열에 등가의 핵산서열을 제공한다. 상기 핵산서열들은 보다 구체적으로는 서열번호 1이다.

본 명세서에서 사용된 "DNA 중합효소"는 상보적인 주형 DNA 가닥과 프라이머를 이용하여 뉴클레오타이드를 자라는 3'-하이드록시 그룹에 연속적으로 첨가함으로써 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트로부터 5' -> 3'방향으로 DNA을 합성하는 효소이다. 주형 가닥이 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 첨가되어지는 뉴클레오타이드의 순서를 결정한다.

"등가의 핵산서열"에는 상기 DNA 중합효소 서열의 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.

"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 DNA 중합효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

제 2 양태로, 본 발명은 DNA 중합효소를 제공한다. 보다 상세하게는 서열번호 2로 표시되는 DNA 중합효소 및 이의 기능적 동등물을 제공한다.

본 발명의 "기능적 동등물"에는 서열번호 2의 DNA 중합효소 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 DNA 중합효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명은, 제 3 양태로는 상기 DNA 중합효소 코딩하는 분리된 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제 4 양태로는, 상기 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다.

적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.

본 발명의 제 5 양태로는 상기 형질전환 세포, 또는 상기 Thermococcus sp.를 이용하여 DNA 중합효소를 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

[실시예 1] TNA1_pol 유전자의 클로닝 및 일차적 서열 분석

Thermococcus sp. NA1은 이스트 마뉴스 바신(East Manus Basin)에 있는 파크마누스 지역(3° 14' S, 151° 42' E)에 있는 지역의 심해 열수 분출구로부터 분리되었다. YPS 배지[참고문헌 10 참조]가 DNA 조작을 위해서 Thermococcus sp. NA1를 배양하기 위하여 사용되었고, Thermococcus sp. NA1의 배양 및 균주 유지는 표준적인 방법에 의하여 행하여졌다[참고 문헌 11 참조]. Thermococcus sp. NA1 시드(seed) 배양을 준비하기 위하여, 25ml 혈청 병에 있는 YPS 배지에 파타겔 플레이트(phytagel plate) 위에 형성된 단일 콜로니을 접종하였고, 20시간 동안 90℃에서 배양하였다. 시드 배양은 혐기적 단지(jar)에서 YPS 배지 700ml을 접종하는데 사용되었고, 20시간동안 90℃에서 배양되었다.

성숙한(mature) TNA1-pol 유전자의 제조

E. coli DH5α가 플라스미드 증식 및 핵산 서열분석을 위해 사용되었다. E. coli BL21-Codonplus(DE3)-RIL 세포(스트라타진, 라졸라, 캘리포니아) 및 플라스미드 pET-24a(+)(노바겐, 메이디슨, 위스콘신)이 유전자 발현을 위해 사용되었다. E. coli 균주는 37℃에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지 안에서 배양되었고, 카나마이신이 최종농도 50㎍/ml이 되도록 배지에 첨가되었다.

DNA 조작은 샘브록 및 러셀[참고문헌 11 참조]에 의해 기술된 것처럼 표준적인 방법으로 행하여졌다. Thermococcus sp.의 게놈 DNA는 표준적인 방법으로 분리되었다[참고문헌 11 참조]. 제한효소 및 다른 변형시키는 효소는 프로메가(메이디슨, 위스콘신)으로부터 구매하였다. E. coli 세포로부터 플라스미드 DNA의 적은 양의 제조는 플라스미드 미니 키트(퀴아겐, 힐덴, 독일)을 이용하여 행하여졌다. DNA 서열분석은 빅다이 터미네이터 키트(PE Applied Biosystems, 포스터 시, 캘리포니아)를 이용하여 자동 서열분석기(AB3100)로 행하여졌다.

게놈 서열 분석에 의하여, 1,308 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(3,927 bp; 서열번호 3)이 발견되었고, B 패밀리 타입 DNA 중합효소와 매우 높은 유사성을 보였다. 유추되어진 아미노산 서열(서열번호 4)로부터 얻어진 단백질의 분자량은 151.9kDa 이었고, 이것은 평균적인 열안정적 DNA 중합효소에 대하여 예측되어지는 사이즈보다 훨씬 컸다. 서열 분석은 상기 DNA 중합효소 유전자가 추정의 3'-5' 엑소뉴클리아제 도메인, α-유사 DNA 중합효소 도메인, 및 진핵생물 및 고세균의 α-유사 DNA 중합효소 사이에 보존된 중간지역(Pol III)에 위치한 1605 bp(535 아미노산)의 하나의 인프레임된 介在서열(intervening sequence) 을 포함하고 있는 것을 보였다(도 1, 참고문헌 16 참조). 유추된 인테인(intein)의 아미노산 서열은 또한 다른 고세균 중합효소의 인테인에 매우 유사함을 보였고, pol_1 인테인 1(Thermococcus sp. strain GE8로 부터의 DNA 중합효소 기원, 537 아미노산, AJ25033, )에 81.0%의 상동성, IVS-B(KOD DNA 중합효소 기원, 537 아미노산, D29671)에 69.0% 상동성 및 인테인(Deep vent DNA 중합효소 기원, 537 아미노산, U00707)에 67.0%의 상동성을 보였다.

인테인의 스플라이싱 사이트는 인테인의 N-말단에서의 Cys 또는 Ser 및 C-말단 스플라이스 연결부에서 His-Asn-Cys/Thr가 잘 보존되어 있어서 서열분석에 의하여 예측될 수 있었다[참고문헌 17-18 참조]. 따라서, 인테인을 포함하지 않는 성숙한 형태의 중합효소 유전자(TNA1_pol)이 예상되어질 수 있고, 이것은 773 아미노산 잔기(서열번호 2)로 구성된 단백질을 암호화 하는2,322 bp(서열번호 1) 일 것이다. TNA1_pol의 추정되어진 서열은 다른 DNA 중합효소의 것들과 비교되었다(도 1). 페어와이즈 어라인먼트에서, 유추되어진 성숙한 TNA1_pol 아미노산 서열은 KOD DNA 중합효소(gi:52696275)와 91.0% 상동성, 딥 벤트 DNA 중합효소(gi:436495)와 82.0% 상동성, 및 pfu DNA 중합효소(gi:18892147)과 79.0% 상동성을 보였다. PCR 증폭에 있어서 TNA1_pol의 성능을 보기 위하여, TNA1_pol DNA를 상기 언급한 바와같이 중합효소 전장길이로부터 인테인을 제거하여서 제조되었다.

인테인(intein)을 포함하지 않는 DNA 중합효소의 성숙한 형태는 다음과 같이 제조되었다. 오버랩핑 서열을 포함하도록 디자인된 프라이머를 이용하여, TNA1-pol의 N-말단 부분(센스 [5′-CGACCCGGCATATGATCCTCG ACGTCGATTACATCACAG-3'](서열번호 5) 및 안티센스 [5′- GCCGTAGTACCCGTAATAGCTGT TCGCTAAGATTTTTATTGCCCGCTG-3′](서열번호 6) 및 C-말단 부분(센스 [5′-CAGCGGGCAATAAAAATCTTAGCGAACAGCTATTACGGGTACTACGGC-3′](서열번호 7) 및 안티센스 [5′-CTCCACATCTCGAGTTTCTTCGGCTTCAACCAAGCCCC-3′](서열번호 8)을 각각 증폭하였다. 그리고나서, NdeI 및 XhoI 사이트에 의해 플랭크(flank)된 성숙한 TNA1_pol 유전자의 전장 길이가 두개의 프라이머(센스 [5′-CGACCCGGCATATGATCCTCGACGTCGATTAC ATCACAG-3′](서열번호 9) 및 안티센스 [5′-CTCCACATCTCGAGTTTCTTCGGCTTCAACCAAG CCCC-3′](서열번호 10) 및 주형으로서 상기 N-말단 및 C-말단 부분 증폭된 PCR 분절의 혼합물을 이용하여 증폭되었다. 증폭되어진 서열은 NdeI 및 XhoI로 다이제스트되었고, NdeI/XhoI 다이제스트된 pET-24a(+)에 연결되었다. 연결물(ligate)는 E. coli DH5α에 형질전환되었다. 정확한 구조체를 가진 후보자들이 제한 효소 다이제스쳔에 의해 선택되었고, 클론의 DNA 서열을 분석하여 성숙된 DNA 중합효소를 가지고 있음이 확인되었다.

[실시예 2] TNA1-pol의 발현 및 분리

매우 강하고, 엄격한 T7/lac 프로모터를 가진 pET 시스템이, E. coli에서 외래의 단백질의 클로닝 및 발현을 위해 개발되어진 가장 강력한 시스템 중의 하나이고[참고문헌 19 참조], TNA1-po1 유전자가 재조합 TNA1-pol의 과다발현 및 His-태그 분리를 촉진하기 위해서 증폭되어 pET-24a(+)의 NdeI 및 XhoI 사이트로 도입되었다. 결과의 발현 플라스미드는 pETNAPm으로 지정되었다. 재조합 TNA1_pol은 pETNAPm을 가지고 있는 E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL의 세포질에서 용해성 형태로 발현이 되었다

상기 얻어진 발현 플라스미드, pETNAPm, 은 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL로 형질전환되었다. TNA1_pol 유전자의 과량발현은 이소프로필-β-_D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 중간 기학급수적 성장기에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 항온 배양함으로써 유도되었다. 세포는 원심분리(4℃에서 20분간 6,000 x g)를 통하여 얻어졌고, 0.1M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50mM 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)에서 재현탁시켰다. 세포는 초음파에 의해서 분쇄되어지고, 원심분리(4℃에서 30분간 20,000 x g)에 의해서 분리되었고, 조효소 샘플은 20분간 80℃에서 열처리되었다. 얻어진 상등액은 TALON^TM 금속 친화성 레진(BD Bioscience Clontech, 파우로 알토, 캘리포니아)의 컬럼에 처리되고, 0.1 M KCl 및 10% 글리세롤을 포함하는 50mM 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)안의 10mM 이미다졸(시그마, 세이트 루이스, 미주리)로 세척되었고, TNA1_pol는 완충용액내의 300mM 이미다졸으로 용출되었다. 모아진 분획은 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1 mM DTT, 1mM EDTA, 및 10% 글리세롤을 포함하는 저장 완충용액으로 투석되어졌다.

단백질 농도는 브래드포드[참고문헌 13 참조]의 비색분석 방법에 의해 결정되었다. 단백질의 정제도는 표준 방법으로 수행되어진 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석에 의해서 조사되었다[참고문헌 14 참조].

도 2에 보인바와 같이, 20분 동안 80℃에서의 열처리는 몇몇의 E. coli 단백질을 효과적으로 제거할 수 있었다. 그러나, 어떤 E. coli 단백질들은 열처리 후에 안정된 형태로 남아 있었다. 열처리 풀(pool)의 용해성 상등액은 TALON^TM금속 친화성 레진의 컬럼위에서 크로마토그래피 되었고, 표 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이 정제되었다. 정제되어진 단백질의 비활성(specific activity)는 231.33 단위 mg^-1로 결정되었고, 정제 수율은 대략 26.155%이었다. SDS-PAGE는 분자량 80kDa으로 주요한 단백질 밴드를 보였다. 정제되어진 단백질은 반복적인 얼림과 녹임 순환에서 용해성으로 남아있었다.

[표 1] E. coli에서 TNA1_pol의 분리

[실시예 3] TNA-pol의 성질

DNA 중합효소 활성도 분석

분리되어진 효소의 DNA 중합효소 활성도는 약간의 변형으로 최 및 권에 의해 기술되어진 것처럼 측정되었다[참고문헌 15 참조]. 상기 효소는 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-머캅토에탄올, 100μM의 각각의 dATP, dCTP 및 dGTP, 0.25 μCi의 [methyl-³H]티미딘 5'-트리포스페이트, 및 625 ng의 소 gbdtjs DNA(프로메가)로 구성되어진 반응 혼합액(25 ㎕)안에서 10분간 75℃에서 항온반응되었다. 반응은 얼음 위에서 중지되었고, 일부량은 DE81 여과 종이 디스크(23 mm, 와트만, 영국)위에 점으로 찍었다. 상기 디스크는 히트블락 위에서 건조되고, 0.5 M 소디움 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에서 10분 및 70% 에탄올에서 5분 세척되고, 건조 되었다. 건조된 여과 종이 디스크의 포함된 방사선 활성도가 베크만 LS6500 스킨틸레이션 카운터(미국)을 이용하여 세어졌다. TNA1_pol의 1 단위는 1분동안, 75℃에서, 1 pmole의 [³H]TTP를 산-불수용성 생성물로 포함시키는 중합효소의 양으로 정의되었다.

엑소뉴클리아제 활성도 분석

3' 말단-레이블된 DNA 기질을 준비하기 위하여, Not I에 의해 선형화된 pBluescript SK-DNA가 [α-³²P]dCTP의 존재하에서 클레노우(Klenow) 분절물에 의해 채워졌다. 5'-말단 레이블된 DNA 기질을 준비하기 위하여, 2kb PCR 생성물이 [γ-³²P]ATP의 존재하에 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제에 의해 인산화되었다. 레이블 후에, 각각의 DNA 기질은 에탄올 침전에 의해 정제되었다. 엑소뉴클리아제 활성도 분석을 위해, 각각의 DNA 기질은, dNTPs의 존재 또는 부존재에서 10분동안 75℃에서 20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-머캅토에탄올, 20 mM (NH₄)₂SO₄ 및 0.01% BSA 로 구성된 반응물 혼합액(25㎕)에서 효소와 함께 항온반응되었다. 반응은 얼음위에서 중지되었고, 운반체로서 BSA의 존재하에서 5% 트리클로로아세트산 1ml을 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후에, 상등액은 회수되었고 이의 방사능 활성도는 베크만 LS6500 스킨틸레이션 카운터(미국)을 이용하여 세어졌다.

TNA1-pol의 pH 의존성은 pH 6.0-10.0의 범위에서 조사되었다. 최적의 활성도는 pH 7.5에서 나타났다(도 3). 온도에 대한 중합효소의 의존성은 40-90℃의 범위에서 결정되었고, TNA1_pol의 최적의 활성도는 소의 흉선 DNA 주형을 이용한 분석에서 75℃로 나타났다(도 4A). TNA1_pol이 아래와 같이 95℃에서 열에 안정하였기 때문에, 최적 온도는 소 흉선 DNA 주형이 75℃이상에서 변성되는 것에 영향을 받았다. TNA1_pol의 열안정성은 95℃ 및 100℃에서 전-항온반응 후에 중합효소의 활성을 측정함으로써 시험되었다. 100℃에서 효소의 반감기(t_1/2)가 3.5 시간이었고, 95℃에서의 반감기는 12.5시간이었다(도 4B).

TNA1_pol의 활성도에 대한 MgCl₂(NH₄)₂SO₄ 및 KCl 농도의 효과가 조사되었다(도 5). TNA1_pol은 MgCl₂의 존재에 의해 의존적이었고, 6mM MgCl₂의 농도에서 최고의 활성도를 보여서, 다른 DNA 중합효소에 대한 양이온의 효과와 일관성이 있었다[참고문헌 15 참조]. DNA-의존성 DNA 중합효소를 포함한 대부분의 DNA 결합 효소는 Mg²⁺가 있는 것을 선호하는 경향이 있다. 중합효소의 활성에 대한 Mg²⁺ 이온의 최적 농도가 PCR 증폭에 대한 최적 농도와 다를 수 있는 점에 주목할 필요가 있고, TNA1_pol의 실질적인 PCR 증폭은 Mg²⁺이 많이 낮은 농도에서 행하여졌다. 최적의 (NH₄)SO₄ 농도는 20mM으로 결정되었으나, KCl는 TNA1_pol의 활성도에 많은 영향을 주지 않았다(도 5B 및 C).

[실시예 4] TNA1_pol의 엑소뉴클리아제 활성도

TNA1_pol의 서열분석은 추정되는 3'->5' 엑소뉴클리아제 도메인(ExoI, ExoII, 및 ExoIII)의 존재를 보이고, TNA1_pol이 연결되어진 3'->5' 엑소뉴클리아제를 가질 것이라는 것을 의미한다. 이 점을 밝히기 위해서, TNA1_pol의 3'->5' 및 5'->3' 엑소뉴클리아제의 활성도가 3' 및 5' 말단의 DNA 기질로부터 ³²P의 방출을 측정함으써 정량화되었다. 결과적으로, TNA1_pol 3 말단-레이블된 DNA로부터 1시간내에 68%의 ³²P를 방출하였으나, 5 말단-레이블된 DNA로부터 방출된 ³²P의 양은 매우 낮았고, dNTP로 증가되지 않았다(도 6). 이것은 TNA1_pol이 세 개의 모티프(ExoI, ExoII, 및 ExoIII)의 도메인 구조에의해 지지되어지는 3'->5' 엑소뉴클리아제 활성을 가졌음을 보인다. 그러나 5'->3' 엑소뉴클리아제 활성은 가지지 않았다. 대부분의 고세균 B 패밀리 DNA 중합효소는 연결되어진 3'->5' 엑소뉴클리아제 활성을 가진 것으로 알려졌다[참고문헌 16].

Thermococcales에 속하는 고세균의 밀접하게 관련된 고호열성(hyperthermophilic) 종의 비교 게놈 분석은 밀접하게 관련된 세균사이에서 관찰되는 유연성(plasticity)과 비교될 정도로 높은 게놈 유연성을 보였다[참고문헌 20-21]. 더구나, 단백질 프로파일의 비교는 많은 양의 차별적인 획득 및 손실이 일어났음을 보이고, 이와같은 종들에서 다형성은 이들 자유롭게 사는 개체가 다른 환경 제약에 적응하는 것과 아마 관련되어 있을 것이다. 그럼에서 불구하고, 고호열성 고세균의 종들안에서 보전되어진 오쏘로고스(orthologous) 유전자 집합은 높은 3'->5' 프로프리딩(proofreading) 엑소뉴클리아제 활성을 가진 DNA 중합효소는 강한 진화적 압력에 대하여 고호열성 세균들의 생존에 중요한 핵심 유전자에 심각한 돌연변이를 최소화하기 위해서 필요했던 것을 나타낸다.

[실시예 5] TNA1_pol을 이용한 PCR

열안정성 DNA 중합효소의 주된 사용은 DNA 분절의 시험관내 증폭이다. 시험관내 증폭에 대한 재조합 TNA1_pol의 성능을 조사하기 위하여, 효소는 상기 효소는 PCR 반응에 적용해 보았다.

재조합 TNA1_Pol을 이용한 PCR 증폭이 시도되었고 상업적인 Ex Taq(다카라), pfu Turbo (스트라타진) 및 KOD (노바진) DNA 중합효소의 PCR 증폭과 비교하였다. 2.5 U의 여러 가지 DNA 중합효소가, 주형으로 Thermococcus sp. NA1로부터의 50ng의 게놈 DNA, 10pmole의 각각의 프라이머, 200μM의 dNTP 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 50㎕의 반응 혼합액에 첨가되었다. Thermococcus sp. NA1의 게놈 DNA로부터 2kb를 증폭하기 위한 프라이머[센스 5'-ACTAAATTGGTGATACCGTTATGAG-3'(서열번호 11), 및 안티센스 5'-GGAACATAAAATGTAAGGGACTTC-3' (서열번호 12)]가 디자인되었다. 제조자에 의해 공급되는 PCR 완충용액이 상업적 중합효소의 PCR 증폭에 사용되었고, 재조합 TNA1_Pol의 PCR 증폭을 위하여 20 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 30 mM (NH₄)₂SO₄, 60 mM KCl, 및 1 mM MgCl₂로 구성된 완충용액이 이용되었다. 95℃에서 단일의 변성 단계 후에, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 온도 프로파일로 30 사이클하고, 72℃에서 최종의 7분 연장이 뒤따랐다. PCR 생산물은 0.8% 아가로즈 겔 전기영도에서 분석되었다. 긴사슬의 DNA 증폭에서 재조합 TNA1_pol의 성능을 시험하기 위하여, PCR 반응이 주형으로서 50ng의 Thermococcus sp. NA1로부터의 게놈 DNA, 200μM dNTP 및 PCR 반응 완충용액를 포함하는 50㎕ 반응 혼합액에서 행해졌다. 프라이머가 2kb, 4kb(센스 5'-ACTAAATTGGTGATA CCGTTATGAG-3'(서열번호 13), 및 안티센스 5'-GTCTCTGATGCTCATGATGTAGTTC-3'(서열번호 14)] 및 8kb[센스 5'-ACTAAATTGGTGATACCGTTATGAG-3'(서열번호 15), 및 안티센스 5'- GAGGAGCT CTTTAGAATTCTCAAGC-3'(서열번호 16)]의 Thermococcus sp. NA1 (DQ223723)으로부터의 DNA 절편을 증폭하기 위해서 디자인되었다.

도 7A에서 보이듯이, TNA1_pol은 2kb 목적 유전자를 성공적으로 증폭하였고, PCR 증폭의 수율은 제조자에 의해 공급되어지는 자신의 PCR 완충용액에서 수행되어진 Ex Taq, Pfu, 및 KOD 중합효소 것과 비교할 만한 것이어서, TNA1_pol이 최적화되면 산업적으로 매우 가치가 있을 것임을 보인다(도 7A). 흥미롭게도, PCR 증폭에 대한 실제의 pH는 TNA1_Pol의 중합효소 활성에 대한 최적의 pH와는 다른 것으로 보였다. DNA 분절의 시험관내 증폭은 높은 충실도(fidelity) DNA 중합효소의 경우에 엑소뉴클리아제 활성과 중합효소 활성사이의 밸러스에 의존하는 것으로 생각된다. Pfu DNA 중합효소(pH 8.8), KOD DNA 중합효소 (pH 8.8) 및 벤트 DNA 중합효소 (pH 8.8) 같은 PCR에 일반적으로 사용되는 다른 상업적인 고-충실도(high-fidelity) DNA 중합효소는 또한 알칼리 pH 값에서 반응을 수행하는 것이 추천된다. 고-충실도 DNA 중합효소는 그들의 강한 엑소뉴클리아제 활성도 때문에 긴 DNA 분절의 증폭에는 적당하지 않다고 보고되었다[참고문헌 9]. 재조합 TNA1_pol이 긴 DNA 분절을 증폭할 수 있는지를 테스트하기 위해서, 재조합 TNA1_pol이 Thermococcus sp. NA1의 게놈 DNA를 이용하여 긴 DNA 분절을 증폭하도록 PCR 반응에 적용하였다. 도 7B에서 보이듯이, TNA1_pol은 DNA 분절을 8kb까지 증폭할 수 있었다. 그러나 8kb DNA 증폭의 수율은 4kb 또는 2kb 의 것보다 낮았다. 이것은 TNA1_pol의 야생형 단백질은 PCR 반응을 최적화하거나 긴 DNA 증폭을 위하여 돌연변이의 도입이 필요하다는 것을 의미한다.

일반적으로, 고호열성 고세균으로부터의 패밀리 B 타입 DNA 중합효소는 3'->5' 엑소뉴클리아제 활성을 가지고, 이들 DNA 중합효소가 높은 충실도로 DNA 분절 증폭할 가능성이 있다. 그러나 대부분의 3'->5' 엑소뉴클리아제 활성도를 가진 패밀리 B 타입의 DNA 중합효소는 세균의 엑소뉴클리아제 활성이 없는 A 타입 DNA 중합효소보다 DNA 신장 능력이 떨어졌다. 연결되어진 3'-5' 엑소뉴클리아제 활성을 가진 DNA 중합효소의 단점은 완충용액의 최적화에 의해서, 3'->5' 엑소뉴클리아제의 활성을 떨어뜨리는 돌연변이에 의해서,엑소뉴클리아제 활성이 없는 DNA 중합효소와 매우 프로프리딩하는 DNA 중합효소의 혼합물의 사용에 의해서 극복되어질 수 있다[참고문헌 22]. 더불어서, 생물 시료안의 여러 가지 성분들의 PCR-억제 효과가 성질에서 약간 차이가 나는 중합효소들 중에서, 적당한 열안정성의 DNA 중합효소의 사용으로 어느 정도까지는 제거될 수 있는 것이 알려졌다. KOD DNA 중합효소는 높은 수행력 및 높은 신장 속도로 단점을 극복하는데 성공적이었다. 본 발명자의 실험결과는 TNA1-pol은 높은 충실도를 유지할 뿐만 아니라 KOD DNA 중합효소에 비교할 만한 신장율을 가지고 있다는 것을 보인다.

본 발명에 따른 DNA 중합효소는 고호열성이며, 기존의 상업적 DNA 중합효소와 비교하였을 때, 높은 신장능력 및 높은 충실도를 모두 가지는 신규한 DNA 중합효소이다. 따라서, 정확한 PCR이 요구되는 정밀분석, 정밀진단, 동정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

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제 10 항에 있어서, 상기 재조합벡터가 도 8에 기재된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 10 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
제 12 항에 따른 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포로부터 DNA 중합효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 고호열성 DNA 중합효소 생산방법.