KR100872694B1

KR100872694B1 - 코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법

Info

Publication number: KR100872694B1
Application number: KR1020060117795A
Authority: KR
Inventors: 김성보; 이영미; 박승원; 김정훈; 송상훈; 이강표; 김혜원; 최혜진
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2026-11-27
Also published as: AU2007326238B2; EP2087108B1; NZ576797A; DK2087108T3; JP2010510774A; WO2008066260A1; US20080124770A1; CN101631856A; US20090246828A1; CN101631856B; EP2087108A4; AU2007326238A1; ES2438982T3; EP2087108A1; KR20080047844A; US8802393B2; JP5274476B2

Abstract

본 발명은 호열성 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068 DSM 5068)로부터 유래된 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 GRAS 균주인 코리네박테리움 속 균주로부터 식품안전형으로 발현된 호열성 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법을 제공한다.

써모토가 네아폴리타나 DSM 5068, 타가토스, 아라비노스 이성화효소, 활성형, 코리네박테리움

Description

코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스 이성화효소 및 그를 이용한 타가토스의 제조방법{ARABINOSE ISOMERASE EXPRESSED FROM CORYNEBACTERIUM GENUS AND TAGATOSE MANUFACTURING METHOD BY USING IT}

도 1은 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 균주로부터 유래한 호열성 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pCJ-1-TNAI 및 pCJ-7-TNAI의 제조과정을 나타내는 도면이다.

도 2는 재조합 코리네박테리움 균주의 배양 시간별 생육 결과이다. 최적화 배지에서 30℃, 24시간 배양한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3은 재조합 코리네박테리움 균주로부터 발현된 아라비노스 이성화효소의 순수 분리 정제 단계별 조효소액에 포함되어 있는 전체 단백질 패턴의 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석 결과를 나타내는 도면이다. 각 단백질 밴드는 다음과 같다.

M : 넓은 범위의 단백질 표준 마커(Bio-Rad, U.S.A)

1 : 조효소액

2 : 열처리된 효소 상등액

3. 음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography ; HiTrap Q column, GE Healthcare, U.S.A.) 후의 효소 절편

4. 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; Superdex 200 pg column, GE Healthcare, U.S.A.). 후의 정제된 효소 절편

도 4는 아라비노스 이성화효소를 활성형으로 발현하여 내부에 포함하고 있는 재조합 코리네박테리움 및 재조합 대장균을 각각 0, 10, 20, 30, 40%의 갈락토스 기질을 포함하고 있는 PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼에서 2시간동안 고온 (70℃)에서 교반 반응시킨 후, 그 버퍼에 용출된 효소의 양을 나타낸 도면이다.

본 발명은 코리네박테리움 속 균주로부터 발현된 아라비노스 이성화효소와 그를 이용한 타가토스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068 DSM 5068)로부터 유래된 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 GRAS 균주인 코리네박테리움 속 균주로부터 식품안전형으로 발현된 호열성 아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법을 제공한다.

최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 각종 성인병을 유발시킬 수도 있는 설탕을 대체하기 위하여 비교적 부작용이 없는 대체 감미료로서 개발된 타가토스는 갈락토스의 이성질체이며, 프룩토스와 유사한 물리·화학적 성질을 갖고 있다고 알 려진 물질이다. 최근 타가토스는 저칼로리 천연 당으로 미국 FDA에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 감미료로서 사용을 허가 받았다.

GRAS(Generally Recognized As Safe)는 일반적으로 안전하다고 여겨지는 물질로서 경험과 훈련을 거친 전문가들이 과학적 절차를 통해 물질의 의도된 사용조건 하에서 안전성을 평가하였을 때 안전하다고 판단하는 물질을 말한다. GRAS 제도는 미국만이 가지고 있는 독특한 제도로서 안전성이 높은(일정한 사용조건 하에서) 식품 및 식품화학물질에 적용되지만 그 인식이 미국 내 뿐만 아니라, 국제적으로도 인식되고 있기 때문에 앞으로 추이가 주목되는 제도이다.

타가토스를 생산하는 방법으로는 주로 갈락토스에 촉매를 이용하여 이성화 방법에 의해 생산하는 화학적 방법과, 이성화효소를 이용하여 효소적인 방법으로 전환시키는 생물학적 방법이 있다. 화학적 생산 방법은 경제성이나 수율 측면에서 우수하나, 고온고압의 화학공정을 가지며 공정 자체가 복잡하고 산업 폐기물을 발생시키는 문제점을 가지고 있으므로 환경친화적인 생물학적 생산 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.

이러한 생물학적 생산 방법으로는 알도스(aldose) 또는 알도스 유도체를 케토스(ketose) 또는 케토스의 유도체로 효소적인 방법에 의해 전환시키는 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 갈락토스에서 타가토스로의 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)를 이용한 이성화 반응은 열역학적으로 높은 반응 온도에서 비례적으로 높은 전환율을 가지는 반응이다. 따라서 이성화효소를 이용한 타가 토스의 생물학적 전환법은 고온에서 안정한 효소의 개발과 이를 이용한 타가토스의 생산법이 산업화의 핵심 기술이라고 할 수 있다. 이에 고온균 유래의 아라비노스 이성화효소의 탐색을 통하여 일차적으로 산업화가 가능한 고온 적합성 이성화효소의 개발 및 이를 이용한 이성화 공정의 개발이 각 연구팀들에 의하여 진행되어 왔다.

국내에서는 동양제과에서 아라비노스 이성화효소를 이용한 효소 이성화법을 개발하였다. 동양제과는 대장균 유래 아라비노스 이성화효소 유전자를 대장균에서 재조합 기술을 이용하여 대량 발현하였으며, 이 재조합 이성화효소는 30℃에서 24시간 반응시켰을 때, 갈락토스로부터 타가토스의 전환율이 25%로 열안정성 및 전환수율이 낮았다(대한민국 특허출원 제 99-16118호). 오덕근 교수팀(세종대학교)은 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래의 아라비노스 이성화효소를 대장균에서 재조합 기술을 이용하여 대량 발현하였으며, 이를 고정화하여 갈락토스의 타가토스로의 고온 이성화 공정을 제안하였다. 본 연구팀은 써모토가 네아폴리타나로부터 기존에 보고되지 않은 아라비노스 이성화효소 유전자를 클로닝하여 대장균에서 대량 발현하였고, 이를 이용한 초고온 조건에서의 타가토스의 생산기술을 개발하였다(대한민국 특허 등록번호 10-0443865).

현재까지의 고온균 유래의 아라비노스 이성화효소를 이용한 타가토스의 생산기술은 재조합 대장균에서 대량 발현된 재조합 효소 혹은 이를 포함한 숙주를 이용한 갈락토스에서 타가토스로의 이성화 반응공정 개발에만 머물러 있다. 그러나 이러한 재조합 대장균을 이용한 타가토스의 생물공학적 생산은 식품안전성 측면에 서 실질적으로 식품 소재로서의 타가토스 생산에 부적합하며, 이에 GRAS 균주면서 산업적으로 대량 생산이 가능한 숙주에서 발현된 아라비노스 이성화효소 및 이를 포함한 숙주를 이용한 대량 생산이 필수적이다.

코리네형 세균은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네형 세균은 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이며, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 다양한 공정 조건에서 높은 안전성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 GRAS 균주인 코리네박테리움 속 균주에서 초고온균인 써모토가 네아폴리타나 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소를 활성형으로 발현하였으며, 식품안전형으로 발현된 상기 재조합 효소를 이용하여 고농도 갈락토스에서 타가토스로의 이성화 반응 기술을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상기 재조합 효소를 코리네박테리움 속 균주에서 대량 발현함으로써, 고온 및 고농도의 갈락토스 기질 조건에서도 세포 내에 아라비노스 이성화효소를 안정적으로 포함하는 GRAS 균주를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 기존의 대장균에서만 효소를 발현하여 적용하였던 종래의 기술을 벗어나, 써모토가 유래의 아라비노스 이성화효소를 GRAS 균주인 코리네형 균주에서 활성형으로 발현하고, 발현된 재조합 효소 혹은 이를 포함한 숙주를 이용하여 갈락토스로부터 실질적으로 식품소재로 이용 가능한 타가토스를 생산하는 방법을 제공한다.

이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 고도 호열성 미생물, 특히 80℃ 이상의 고온 조건 혹은 혐기 조건에서 최적 생육 환경을 가지기에 산업적으로 직접적인 균체 배양을 통하여 효소를 수득하기 불가능한 미생물 유래의 아라비노스 이성화효소 유전자를 식품안전형 숙주 내에 삽입시켜 재조합 효소를 생산하고, 이를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 아라비노스 이성화 효소는 70 내지 90℃ 범위에서 최적 반응 온도를 가지는 써모토가(Thermotoga sp.), 써모스(Thermus sp.) 또는 썰포로버스(Sulforobus sp.) 속 균주로부터 유래된 것이 바람직하다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소의 유전자는, 바람직하게는 초고온균으로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 초고온균인 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068(Thermotoga neapolitana DSM 5068 DSM 5068)로부터 유래된 것으로 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 아라비노스 이성화효소 유전자는 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(directed evolution) 및 부위 특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서 임의에 따라 선택되어지는 GRAS 숙주에 일정한 정도 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지고 있고, 상기 숙주에서도 활성형으로 발현되는 재조합 효소 및 이를 포함하는 숙주 세포는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명에 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으나, 당업계에 알려진 임의의 벡터가 될 수 있다.

본 발명의 벡터는 호열성 아라비노스 이성화효소를 활성형으로 발현하기 위하여 코리네박테리움에서 활성을 갖는 프로모터를 사용하였다. 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터 서열은 대장균이나 고초균 등과 같은 다른 산업 미생물과는 달리 일반적인 구조가 알려지지 않았다. 따라서 산업적으로 많이 이용되는 코리네박테리움으로부터 유래되고, 대장균에서 발현가능한 강력한 프로모터가 개발되었다. tac 프로모터는 종래 가장 강력한 프로모터 활성을 갖는 것 중의 하나로 널리 알려져 있었다. tac 프로모터 란 대장균의 트립토판 오페론 프로모터의 -35영역으로부터 얻어진 서열과 대장균의 유당 오페론 프로모터의 -10영역으로부터 얻어진 서열을 융합하여 얻어진 프로모터를 의미한다. 본 발명에 사용된 CJ-1 내지 CJ-7로 구성된 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아 세포에서 tac 프로모터 보다 효율적으로 유전자를 발현시킨다는 것이 확인 되었다(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0068505).

본 발명에서 사용된 코리네형 프로모터는 코리네박테리움 속 미생물 뿐만 아니라 에세리키아 속 박테리아 및 대장균 세포에서도 프로모터 활성을 갖는다. 특히 본 연구에서 사용된 프로모터는 에세리키아 속 박테리아 세포에서도 tac 프로모터에 비하여 2배 이상 더 강력한 프로모터 활성을 갖는다.

본 발명의 식품안전형 숙주는 GRAS(Generally recognized as safe)형 균주로서 코리네박테리움을 포함하며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 10302(Corynebacterium glutamicum KCTC 10302)가 이용된다.

본 발명은 상기 벡터로 코리네박테리움을 형질전환하여 제조된 재조합 균주를 배양하여, 이로부터 식품안전형으로 발현된 아라비노스 이성화효소를 제공한다. 숙주 세포의 배양은 선택되어지는 숙주 세포에 따라 종래 알려진 임의의 배양 배지 및 배양 조건을 사용하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 아라비노스 이성화 효소 및 상기 효소를 세포 내부에 포함하고 있는 숙주 세포를 균체 고정화하고 이를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

본 발명의 실시예에서는 고도호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068 (Thermotoga neapolitana DSM 5068) 유래의 호열성 아라비노스 이성화효소 (arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자를 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pCJ-1 및 pCJ-7(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0068505)에 각각 삽입하여 최종적으로 숙주인 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032 (Corynebacterium glutamicum KCTC 13032)에서 상기 단백질을 과량 발현하였다. 수득된 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미컴 CJ-1-TNAI(KCCM10786P) 및 CJ-7-TNAI(KCCM10787P)를 배양하여 배양 단계에 따라 세포 추출물을 준비하고, 타가토스 생산 활성을 측정하여 각 배양 시기별 생산되는 활성형 재조합 단백질의 양을 측정하였다. 이렇게 최적 발현된 배양 결과물은 세포 파쇄, 열처리, 이온교환수지 및 겔 크로마토그래피 등을 통하여 순수분리 정제하고 최종적으로 아미노기 말단 아미노산 염기서열을 통하여 확인한 후 단백질 활성 측정을 통하여 타가토스 생산 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 1 : 아라비노스 이성화효소의 클로닝

써모토가 네아폴리타나 DSM 5068을 혐기 조건에서 배양한 후, 이 균체를 8,000xg 에서 10분간 원심분리하여 수득하였다. 상기 수득된 균체로부터 세포 배양 DNA 미디 키트(Cell culture DNA Midi Kit; Qiagen, U.S.A.)를 사용하여 지노믹 DNA를 순수 분리하여 사용하였다. 상기 지노믹 DNA로부터 각각 EcoRV와 PstI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 5'-CCCGA TATCATGATCGATCTCAAACAGTATGAG-3'(서열번호 1)과 5'-TGCACTGCAGTCATCT TTTTAAAAGTCCCC-3'(서열번호 2)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합연쇄반응(polymerase Chaim Reaction; PCR)을 수행하였 다. 써모토가 네아폴리타나 유래의 아라비노스 이성화효소 유전자를 포함하는 1,509bp 크기의 DNA를 증폭하였다. 상기 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 아라비노스 이성화효소를 대량 발현하기 위하여, 보유하고 있는 코리네박테리움 속 유래의 벡터 중 단백질 과발현 성능이 우수한 2개의 벡터를 우선 선별하여 본 실험에 사용하였다. 상기 선별된 벡터는 대장균 DH5alpha에 형질전환하여 2004년 11월 6일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였던 유전자원(수탁번호 KCCM-10611 및 KCCM-10617)을 사용하였다(표 1).

프로모터명	벡터	수탁번호	유래 단백질
pCJ1	pECCG117	KCCM-10611	열충격단백질 hsp60
pCJ7	pECCG117	KCCM-10617	망간 수퍼옥사이드 디스뮤타제

제한효소 EcoRV와 PstI로 절단한 셔틀벡터 pCJ-1 및 pCJ-7에 제한효소 EcoRV와 PstI으로 절단된 상기 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 재조합 발현 벡터 pCJ-1-TNAI 및 pCJ-7-TNAI를 제작하였다(도 1 참조). 재조합 발현 벡터 pCJ-1-TNAI 및 pCJ-7-TNAI로 코리네박테리움 글루타미컴 KCTC 13032를 각각 형질 전환시켜 재조합 균주를 제조한 후 이를 각각 '코리네박테리움 글루타미컴 CJ-1-TNAI' 및 '코리네박테리움 글루타미컴 CJ-7-TNAI'로 명명하였으며, 그를 2006년 10월 18일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10786P 및 KCCM10787P로 기탁하였다.

실시예 2 : 코리네박테리움에서 아라비노스 이성화효소의 발현

상기 실시예 1에서 제조된 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미컴 CJ-1-TNAI 및 CJ-7-TNAI(각 수탁번호 KCCM10786P 및 KCCM10787P)를 각각 10μg/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L)에 초기 농도 O.D.600 = 0.1 로 접종하고, 30℃에서 24시간 배양하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 발현을 유도하였다. 발현된 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 배양액을 8000xg 에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 50mM Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼 용액에 재 현탁하고, 이를 초음파 처리로 세포를 파쇄 처리하여 상등액을 조효소액으로 사용하여 갈락토스 이성화 반응을 실시하였다. 갈락토스 이성화 반응은 40mM의 갈락토스를 기질로서 포함한 100μl의 효소액과 1 ml의 반응 버퍼 용액(50mM Tris-HCl, pH 7.0)을 혼합하여 사용하였다. 이때 반응액 내에 최종 농도 5mM의 염화망간(MnCl₂)과 최종 농도 1mM의 염화코발트(CoCl₂)를 각각 첨가하여 사용하였다. 상기 제조된 조효소 반응액은 65℃에서 20분간 반응하였으며, 상기 조효소의 활성 측정은 시스테인-카바졸-황산법(cystein-carbazol-sulfuric acid; Dische, Z., and E. Borenfreund., A New Spectrophotometric Method for the Detection and Determination of Keto Sugars and Trioses, J. Biol. Chem., 192:583-587, 1951)으로 측정하였다. 조효소 반응액 내의 단백질 정량은 브래포드 검정법(Braford assay kit, Biorad, U.S.A)을 사용하였으며, 그 결과 이성화효소 활성 2.050(mg-tagatose/mg-protein·h)으로 갈락토스 이성화반응 산물인 타가토스가 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 재조합 균주의 대량 발현을 위한 배양 조건 최적화

상기 실시예 2에서 얻어진 재조합 균주를 각각 10μg/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L) 초기 농도 O.D. 600 = 0.6으로 접종하고, 이를 두가지 종류의 코리네형 세균 기본 배지로 알려져 있는 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, Soytone 5g/L) 및 변이 배지(Bacto-peptone 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 2.5g/L, Beef extract 5g/L)에서 생육을 비교하였다. 각각 25, 30, 37℃에서 배양 온도별 및 pH별 생육 비교, 기본 탄소원인 포도당과 설탕의 각각 농도별 첨가 생육 비교, 정치 및 호기 조건에서의 생육 비교 실험을 수행하였다. 이렇게 선정된 다양한 조건에서의 생육 결과 및 효소 발현량을 시간별로 측정하여 재조합 아라비노스 이성화효소의 최적 발현 조건을 선정하였다(표2 및 3).

	변이 배지	MB 배지
	호기	호기	정치	25℃	30℃	37℃
OD₆₀₀	10.1	9.4	5.56	8.88	10.1	4.44
pH	7.5	7.6	7.8	7.4	7.5	7.5
활성 (mU/ml)	60.907	56.09	34.2	58.783	60.907	29.054

	0%	수크로오스				글루코오스
	0%	2.5%	5%	7.5%	10%	2.5%	5%	7.5%	10%
OD₆₀₀	10.1	13.6	12.72	14.86	12.94	14.7	14.32	10.96	4.36
pH	7.5	4.5	4.7	4.7	4.7	4.5	4.5	4.7	4.7
활성 (mU/ml)	60.907	85.088	82.160	79.104	73.708	67.935	58.896	58.649	42.441

이 때 발현된 아라비노스 이성화효소의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 2에서 언급한 방법으로 효소를 처리한 후 정량한 결과, 갈락토스 이성화 반응 산물인 타가토스는 MB 배지에 수크로스 2.5%를 첨가하고 호기 조건에서 30℃ 배양하였을 경우, 기본 배양 조건에서 얻어진 60.9mU/ml에 비하여 1.4배 높은 85.1mU/ml의 효소 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 상기 최적화 배지에서의 균체 생육 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 4 : 재조합 아라비노스 이성화효소의 순수 분리 정제 및 N-말단 아미노산 서열 분석을 통한 활성형 단백질 발현 확인

상기 실시예 3에서 얻어진 최적의 배양 조건에서 2L 배양을 실시하였으며, 이렇게 하여 수득된 배양액을 8000xg 에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후 50mM Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼 용액에 재 현탁하여 단백질 정제에 사용하였다. 상기 세포 현탁액은 고압 세포 파쇄기 T-시리즈 4.0kW(T-series 4.0kW; Constant systems, UK)을 이용하여 세포 파쇄한 후 80℃에서 20분간 열처리를 하였으며, 10,000xg 에서 10분간 원심분리를 하여 발현된 내열성 아라비노스 이성화효소를 우선 분리하였다. 이렇게 하여 분리된 재조합 효소액은 이온교환수지 및 겔 크로마토그래피(anion-exchange chromatography; Hiprep Q 16/10, Amersham Bioscience, U.S.A.), 한외여과(ultrafiltration; Centriprep 30, Amicon, Germany), 크기별 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography; Superdex 200pg, Amersham Bioscience, U.S.A.)를 이용하여 순수 분리 정제하였다(표 4). 이때 각 정제 단계별 효소액의 단백질 조성은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분석하였다(도 3).

정제 단계	총단백질량 (mg)	총활성 (AU)	정제도 (%)	수율 (%)
조효소 용액	665	410.4	1.0	100
열처리	480	364.3	1.2	89
이온교환 크로마토그래피	63.5	201.5	5.1	49
겔 크로마토그래피	28.1	136.3	7.7	33

상기 과정을 통하여 순수 분리된 재조합 단백질은 최종적으로 N-말단 아미노산 염기 서열 분석을 통하여 최종적으로 확인하였다. 겔 크로마토그래피(Gel chromatography)를 통하여 최종적으로 순수 정제된 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과, 약 55kDa의 분자량을 가짐을 확인할 수 있었으며, 이는 실제로 알려진 써모토가 네아폴리타나 속 유래의 아라비노스 이성화효소의 분자량과 일치함을 알 수 있었다. 이렇게 얻어진 단백질 밴드를 PVDF 멤브레인에 전이하여 한국기초과학지원연구원에 분석 의뢰를 한 결과, 순수 분리 정제된 재조합 단백질의 아미노 말단의 아미노산 서열 10개의 분석 결과가 'Met-Ile-Asp-Leu-Lys-Gln-Tyr-Glu-Phe-Trp'과 같은 N-말단 단백질 서열을 가짐을 확인할 수 있었으며, 이는 본 연구에서 사용된 써모토가 네아폴리타나 유래의 아라비노스 이성화효소의 알려진 단백질 아미노산 서열과 일치함을 확인할 수 있었다(서열번호 3).

실시예 5 : 재조합 효소 발현 균주의 고온 및 고농도 반응 안전성 확인

코리네형 세균은 다양한 공정 조건에서 높은 안전성을 가지는 균주이며 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으므로, 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다. 이러한 균주 특성을 이용하여 고농도 기질에서의 반응 안정성을 효과적으로 증가시키기 위하여, 본 연구팀은 코리네박테리움을 숙주로 하여 초고온성 아라비노스 이성화효소를 발현시켰다.

상기 실시예 3에서 얻어진 배양 조건을 통하여 얻어진 재조합 코리네박테리움 균주 및 LB 배지(5g/L Yeast extract, 10g/L Bacto-trypton, 10g/L Sodium chloride)에서 배양 후 얻어진 재조합 대장균 균주의 배양액을 각각 8000xg에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후 이를 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼 용액에 재현탁하여 실험에 사용하였다. 각각의 균주의 고농도 기질에서의 균주 안정성을 비교하기 위하여 각각 0, 10, 20, 30, 40%의 갈락토스 기질을 용액내에 추가적으로 포함하였으며, 이를 70℃의 고온 반응 조건에서 0, 1, 2 시간 동안 교반 반응하여 그 결과물을 실험에 사용하였다. 각각의 반응 결과물은 그 세포내 단백질의 용출량 비교를 위하여 13,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 분리하고 각각 BCA법(bicinchonic acid. protein assay method)을 이용하여 용출된 단백질 정량을 수행하였다. 재조합 대장균 균체와 재조합 코리네박테리움 균체에서의 각각 기질 농도별 단백질 용출량을 계산한 결과, 대조군인 대장균에 비하여 비교군인 코리네박테리움에서의 단백질 용출량이 현저하게 적은 것을 알 수 있었다. 재조합 대장균에서의 반응 결과 갈락토스 기질 농도가 현저하게 늘어남과 달리, 코리네박테리움에서의 단백질 용출량은 대조군에 비하여 최대 당 농도인 40% 갈락토스 조건에서도 약 20%만 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

이는 대장균과 비교하였을 경우, 실질적으로 고농도의 기질 조건에서 균체 내의 단백질 용출 정도가 비약적으로 감소되는 결과였다. 이렇게 발현된 효소를 내부에 포함하고 있는 코리네형 숙주는 기존 발명에서 적용하였던 대장균 숙주의 경우와 비교하였을 때, 고농도의 당 농도에서 세포내 단백질의 용출이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다.

고온 및 고농도 반응의 결과, 코리네박테리움 숙주는 대장균 숙주에 비하여 균주 안정성이 현저히 높은 것을 알 수 있었다. 이는 균체 고정화 반응기에서의 반응 안전성을 증가시키고 결과적으로 고정화 균체 반응기의 반감 주기를 비례적으로 증가시키는 결과를 도출할 수 있다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 고도 호열성 미생물인 써모토가 속 유래의 아라비노스 이성화효소가 코리네형 균주에서 안정적으로 발현됨을 확인하였으며, 이렇게 발현된 활성형 효소를 내부에 포함하고 있는 코리네형 세균을 이용하여 효율적으로 고정화 연속 반응을 수행하였다. 미생물 효소를 이용한 생물공학적 식품소재의 생산은 제조 공정 중에 사용된 첨가물의 식품 안전성이 필수이며, 본 발명으로 완성된 기술을 통하여 써모토가 속 유래의 아라비노스 이성화효소를 식품안전형으로 발현하여 연속 반응 공정에 적용할 수 있으므로, 실질적인 산업화의 가능성이 있다.

<110> CJ Corporation <120> Arabinose isomerase expressed from corynebacterium genus and tagatose manufacturing method by using it <130> PA06-0312 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 cccgatatca tgatcgatct caaacagtat gag 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 tgcactgcag tcatcttttt aaaagtcccc 30 <210> 3 <211> 496 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Ile Asp Leu Lys Gln Tyr Glu Phe Trp Phe Leu Val Gly Ser Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Tyr Gly Leu Glu Thr Leu Lys Lys Val Glu Gln Gln Ala Ser 20 25 30 Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Asn Asp Pro Ile Phe Pro Ser Lys Ile 35 40 45 Val Leu Lys Pro Val Leu Lys Asn Ser Ala Glu Ile Arg Glu Ile Phe 50 55 60 Glu Lys Ala Asn Ala Glu Pro Lys Cys Ala Gly Val Ile Val Trp Met 65 70 75 80 His Thr Phe Ser Pro Ser Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Lys Lys Pro Leu Leu His Leu His Thr Gln Tyr Asn Arg Glu Ile Pro 100 105 110 Trp Asp Thr Ile Asp Met Asp Tyr Met Asn Leu Asn Gln Ser Ala His 115 120 125 Gly Asp Arg Glu His Gly Phe Ile His Ala Arg Met Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Lys Val Val Val Gly His Trp Glu Asp Arg Glu Val Arg Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Lys Trp Met Arg Val Ala Cys Ala Ile Gln Asp Gly Arg Thr Gly 165 170 175 Gln Ile Val Arg Phe Gly Asp Asn Met Arg Glu Val Ala Ser Thr Glu 180 185 190 Asp Asp Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Leu Gly Trp Ser Ile Asn Thr 195 200 205 Trp Gly Val Gly Glu Leu Ala Glu Gly Val Lys Ala Val Pro Glu Asn 210 215 220 Glu Val Glu Glu Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Glu Arg Tyr Ile Met Pro 225 230 235 240 Glu Asp Glu Tyr Ser Leu Lys Ala Ile Arg Glu Gln Ala Lys Met Glu 245 250 255 Ile Ala Leu Arg Glu Phe Leu Lys Glu Lys Asn Ala Ile Ala Phe Thr 260 265 270 Thr Thr Phe Glu Asp Leu His Asp Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu Ala 275 280 285 Val Gln Arg Leu Met Glu Glu Gly Tyr Gly Phe Gly Ala Glu Gly Asp 290 295 300 Trp Lys Ala Ala Gly Leu Val Arg Ala Leu Lys Val Met Gly Ala Gly 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gly Thr Ser Phe Met Glu Asp Tyr Thr Tyr His Leu Thr 325 330 335 Pro Gly Asn Glu Leu Val Leu Gly Ala His Met Leu Glu Val Cys Pro 340 345 350 Thr Ile Ala Lys Glu Lys Pro Arg Ile Glu Val His Pro Leu Ser Ile 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Asp Gly Gln Glu Gly 370 375 380 Pro Ala Val Asn Ala Ser Ile Val Asp Met Gly Asn Arg Phe Arg Leu 385 390 395 400 Val Val Asn Arg Val Leu Ser Val Pro Ile Glu Arg Lys Met Pro Lys 405 410 415 Leu Pro Thr Ala Arg Val Leu Trp Lys Pro Leu Pro Asp Phe Lys Arg 420 425 430 Ala Thr Thr Ala Trp Ile Leu Ala Gly Gly Ser His His Thr Ala Phe 435 440 445 Ser Thr Ala Val Asp Val Glu Tyr Leu Ile Asp Trp Ala Glu Ala Leu 450 455 460 Glu Ile Glu Tyr Leu Val Ile Asp Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asn Phe 465 470 475 480 Lys Lys Glu Leu Arg Trp Asn Glu Leu Tyr Trp Gly Leu Leu Lys Arg 485 490 495

Claims

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셔틀벡터 pCJ-1(KCCM 10611P) 또는 pCJ-7(KCCM 10617P)에 써모토가 네아폴리타나 DSM 5068로부터 유래된 서열번호 3으로 표시되는 아라비노스 이성화효소를 코딩하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및

상기 재조합 벡터로 형질전환시킨 코리네박테리움 속 균주로부터 아라비노스 이성화효소를 생산하는 단계;

를 포함하는 아라비노스 이성화효소의 생산 방법.
제6항에 있어서,

상기 균주가 코리네박테리움 글루타미컴 CJ-1-TANI(KCCM 10786P)인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,

상기 균주가 코리네박테리움 글루타미컴 CJ-7-TANI(KCCM 10787P)인 것을 특징으로 하는 방법.