KR100977583B1

KR100977583B1 - 불미나리에서 간세포 보호 및 간손상 예방 효능을 갖는카페익산을 추출하는 방법 및 이를 포함하는 기능성건강지향식품

Info

Publication number: KR100977583B1
Application number: KR1020080034386A
Authority: KR
Inventors: 전우진; 박창수; 이정민; 황권택; 최희정; 유양희
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2010-08-24
Anticipated expiration: 2028-04-14
Also published as: KR20090109007A

Abstract

본 발명은 불미나리(Oenanthe javanica DC)에서 간세포 보호 및 간 손상 예방 효능을 갖는 카페익산을 추출하는 방법 및 이를 포함하는 기능성 건강식품에 관한 것으로, 본 발명에 의한 불미나리로부터 추출 분리한 카페익산은 간세포 보호 및 간 손상 예방 효능을 갖기 때문에 불미나리 추출물 및 그 카페익산을 함유한 분말류, 음료수, 가공 식품류 등과 같은 기능성 건강지향식품에 유용하게 사용될 수 있다.

불미나리, 카페익산, 간세포, 간 손상, 간 보호, 기능성 식품

Description

불미나리에서 간세포 보호 및 간손상 예방 효능을 갖는 카페익산을 추출하는 방법 및 이를 포함하는 기능성 건강지향식품 {Ethanol extracts and caffeic acid from Ocnanthe javanica DC. having hepatoprotective effect, the method for preparing thereof and functional foodstuff comprising the same}

본 발명은 불미나리(Oenanthe javanica DC)에서 카페익산을 추출하는 방법 및 이를 포함하는 기능성 건강식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 불미나리에서 간세포 보호 및 간 손상 예방 효능이 있는 분리한 카페익산을 추출하는 방법 및 이를 포함하는 기능성 건강지향식품에 관한 것이다.

간은 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있으며, 건강에 유익한 영양분뿐만 아니라 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생이 우수한 장기이나, 손상이 지속될 경우 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고, 그 기능이 저하되어 정상 간으로서의 기능을 발휘하기 어려운 상태가 되며, 이와 관련된 질환은 간섬유화, 간경화, 간암 등이 있다. 이러한 만성적 간질환은 질환으로써 발병되기 전에 자각증상이 없는 경우가 대부분으로, 간 손상 정도가 심한 정도가 되어야 자각증상이 나타나고 치료가 이루어지므로 그 치료와 완치가 매우 어렵다. 이에 간에 부담을 주지 않은 안전성을 가지면서, 간 손상 만성화를 미리 예방할 수 있는 간세포 및 간 손상 예방 기능성 소재를 찾고자 하는 노력이 필요하다.

사염화탄소(CCl₄)는 간에 손상을 주는 표본물질로서 마우스와 같은 설치류에 직접 투여하는 방법을 이용하여 주로 간 손상을 유발시켜 연구하는데 널리 이용된다. 사염화탄소(CCl₄)는 사이토크롬 P₄₅₀과 같은 대사효소에 의해 반응하여 자유라디칼인 CCl₃가 생성되면 이는 간의 중성지방과 막인지질의 산화를 유발하며, 이는 산소와 결합하여 지질 과산화물을 형성한다. 또한 이러한 과산화물에 의해 간에 여러 기능들이 파괴되어 간조직의 손상을 유발하게 된다(Chang. J. M. et. al., Drug and chemical toxicology, 6. 443-453, 1983).

불미나리는 미나리속인 다년생 초본으로써 민간에 널리 재배되어 식품으로 주로 이용되고 있으며, 그 잎과 줄기는 한방에서 혈압강하, 해열, 이뇨, 보혈, 지혈, 강장, 주독 및 폐렴의 치료로 이용되는 약용식물의 하나이다(중약대사전, 상해과학기술 출판사, p1332-1333, 1981, 약품식물학각론, 진명출판사, p306, 1980).

미나리 메탄올 추출물은 토끼에서 사염화탄소 투여로 유발된 간기능 손상에 완화효과가 있는 것으로 보고된 바 있었으며(서화중 등, J. Korean Soc. Food Nur., 14, 72-76, 1985), 미나리 부탄올 분획물은 마우스에서 사염화탄소로 유발된 급성 간조직 손상의 예방 효과를 나타낸 바 있다(Lee, S.I. et. al., J. Korean Soc. Food Nur., 22, 392-397, 1993). 또한 같은 미나리과의 파슬리 추출물도 간손상 예방 치료활성이 특허화 된 바 있다(공개특허 2002-0090248호).

벌꿀 프로폴리스 추출물의 활성 성분의 하나인 카페익산은 항균, 항염, 항암의 특성으로써 민간 약재로 사용되어졌고(Banskota et al., Phytotherapy Research, 15, 561-571, 2001: Ozen et al., Journal of Applied Toxicology, 23, 27-35, 2004), 지질과산화 억제 및 항산화 효소의 활성을 자극하는 약물학적으로 안전한 성분으로 보고되었다(Zhao, W.X. et al., World Journal of Gastroenterology 9, 1278-1281, 2003).

지금까지 알려진 간세포 보호 및 간손상 예방 효능을 갖는 기능성 식품 소재는 극히 제한적인 것으로, 최근의 건강지향적인 최근의 추세에 따라, 식품소재로부터 상기 효능을 갖는 활성 물질에 대한 발굴의 필요성이 대두되었다.

또한, 아직까지 불미나리의 간세포 보호 및 간 손상 예방의 기능을 가진 활성 성분이 밝혀진바 없으며, 이 활성성분의 기능을 밝혀 음료류 등 기능성 건강지향 식품소재로 이용된 바도 없고, 또한 공개된 바도 없다.

본 발명의 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 불미나리로부터 간세포보호 및 간 손상 예방 효능을 갖는 카페익산을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 불미나리 유래 카페익산을 포함하는 간 세포 보호 및 간 손상 예방 생리활성을 갖는 기능성 건강지향식품을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간 보호 작용이 우수하며, 안전성이 뛰어난 불미나리(Oenanthe javanica DC) 유래 카페익산을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 추출방법에 의해 불미나리를 추출한 것임을 특징으로 하는 불미나리(Oenanthe javanica DC) 추출물을 제공한다.

본 발명은 불미나리(Oenanthe javanica DC) 유래 카페익산을 포함하는 기능성 건강식품을 제공한다.

본 발명에 의한 불미나리(Oenanthe javanica DC) 유래 카페익산은 간 세포 보호 및 간 손상 예방 효능이 있으므로, 이를 함유하는 분말류, 음료류, 가공 식품류 등과 같은 기능성 건강지향식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명은 간 보호 작용이 우수하며, 안전성이 뛰어난 불미나리(Oenanthe javanica DC)의 카페익산을 추출하여 제공한다.

본 발명은 불미나리(Oenanthe javanica DC)를 에탄올로 1차 환류추출하고, 에틸아세테이트로 2차 추출하여 얻어진 분획물을 분석용 얇은막 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체크로마티그래피를 수행하여 카페익산에 해당하는 구획을 확인하고, 수집용 얇은막 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체크로마토크래피를 수행하여 카페익산을 추출하는 것을 특징으로 한다.

먼저 카페익산을 추출하기 위하여, 건조한 불미나리의 잎과 줄기를 분말화 한 후, 불미나리 분말 중량 대비 10 내지 20배 부피의 80% 에탄올을 첨가하고, 200 내지 300℃에서 2 내지 4시간 교반하여 추출하는 것이 바람직하다. 상기 추출액을 여과지를 이용하여 상등액을 수득하고, 회전증발기를 이용하여 감압농축, 건조하여 분말 형태의 불미나리 1차 추출물을 얻는 것이 바람직하다.

상기 불미나리 1차 추출물에 5%(W/V) 증류수를 첨가하고 1 ~ 2 부피의 핵산을 섞어 핵산에 용출된 핵산 분획물을 제거하고 남은 수층에 1 ~ 2 부피의 클로로포름을 섞어 클로로포름에 용출된 클로로포름 분획물을 제거하고, 남은 수층에 1 ~ 2 부피의 에틸아세테이트를 섞어 에틸아세테이트에 용출된 에틸아세테이트 분획물 을 수층과 분리하여, 0.3㎛ 여과지로 여과한 후 감압농축하여 불미나리 2차 추출물을 얻는 것이 바람직하다.

또한, 상기 불미나리 2차 추출물을 메탄올로 녹여 분석용 얇은 막 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체크로마토그래피를 수행하여 불미나리 유래 카페익산의 확인하는 것이 바람직하다.

상기에서 규명한 불미나리 유래 카페익산을 수집용 역상 고성능 액체크로마토그래피방법을 이용하여 분리된 수집액을 감압하고 증발 건조시켜 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명은 상기 추출방법에 의해 불미나리를 추출한 것임을 특징으로 하는 불미나리 추출물을 제공한다.

본 발명은 불미나리 유래 카페익산이 간세포 보호 및 간 손상 예방 효과를 나타내는지 조사하기 위하여 세포 실험과 동물 실험을 수행하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명의 불미나리 유래 카페익산은 과산화수소에 의해 유도된 간세포 손상을 보호하며, 사염화탄소에 의한 간 손상을 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 불미나리 유래 카페익산을 함유하는 기능성 건강지향식품의 소재로 활용 할 수 있다.

상기 기능성 건강지향식품은 간세포손상 보호 및 간 손상 예방 등의 기능을 가지며, 음료, 환, 과립, 가공 식품류 등을 그 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 카페익산을 함유하는 음료는 정백당, 액사과당, 구연산, 구연산나트륨, 말토덱스트린, 젖산칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 화이트클라우디 및 이산화탄소 중에서 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 것이 바람직하다.

상기 카페익산을 함유하는 음료는 100㎖당 5~100㎎의 카페익산을 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 기능성 건강식품은 불미나리 유래 카페익산을 하루에 10~40㎎/㎏, 바람직하게는 30~40㎎/㎏을 1회 또는 수회로 나누어 먹을 수 있도록 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나 그 실제 함유량은 건강식품의 유형 및 체중 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야하며, 따라서 상기 함유량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 불미나리 유래 카페익산의 제조

불미나리(Oenanthe javanica DC)는 화순 소재 (주) 한우물에서 공급받아 본 발명에 사용하였다. 건조, 분말화한 불미나리 50g에 20배 부피의 에탄올을 첨가하여 250℃에서 3시간 동안 교반 후, 0.3㎛의 필터를 이용하여 여과한 다음, 상등액 을 45℃에서 30분 동안 감압농축하여 10^-4 torr, 72시간의 조건으로 동결건조하여 불미나리 1차 추출물 분말을 얻었다.

상기 불미나리 1차 추출물 10g에 200㎖의 증류수를 첨가하여 1차 추출물 분말을 완전히 풀어준 후, 200㎖의 핵산을 첨가하여 혼합한 후 분획하였다. 분획의 핵산층에 용출된 핵산분획물을 제거하고 같은 방법으로 1회 더 시행하였다. 핵산분획물과 분리된 수층에 200㎖의 클로로포름을 첨가하여 혼합한 후 분획하였다. 분획의 클로로포름에 용출된 클로로포름분획물을 제거하고 같은 방법으로 1회 더 시행하였다. 클로로포름분획물과 분리된 수층에 200㎖의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합한 후 분획하였다. 이때 수층과 분리된 에틸아세테이트분획물을 수집용기에 수집하고 같은 방법으로 1회 더 시행하여 같은 수집용기에 수집한 후 0.3㎛ 여과지로 여과한 후 감압농축 및 질소가스 용매 증발법을 이용하여 불미나리 2차 추출물(에틸아세테이트 분획물)을 수득하였다.

상기 2차 추출물은 다시 메탄올에 녹여 분석용 얇은 막 크로마토그래피(에틸아세테이트:핵산(haxane): 물:개미산=40:20:5:5(v/v/v/v) 또는 역상 고성능액체크로마토그래피(70% 메탄올, 0.1% phosphoric acid)를 이용하여 불미나리의 단일획분을 분리하고 ¹³C/¹H-NMR로 구조분석하여 카페익산으로 규명하였다. 수집용 얇은 막 크로마토그래피 또는 역상 고압액체크로마토그래피를 이용하여 규명된 불미나리 유래 카페익산을 수집하였다.

[실시예 2] 불미나리 유래 카페익산의 간세포 보호 효과 측정

상기 실시예 1에서 수집 제조된 카페익산의 간세포 보호 효과를 확인하기 위하여 HepG 2 세포주에 불미나리 유래 카페익산을 처리하여 배양한 후, 과산화수소를 이용하여 간세포 손상을 유발한 뒤 XTT 방법을 이용하여 카페익산의 간세포 보호 효과를 측정하였다.

HepG 2 세포주를 24 well 배양용기에 80% confluence한 상태로 준비하여 DMEM 배양액으로 37℃ 배양기에서 배양한 후, 24시간 동안 불미나리 유래 카페익산을 10, 20, 30, 40, 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 배양한다. 배양액을 제거한 후, 2mM 과산화수소를 이용하여 간세포의 손상을 유발하고, XTT 세포 생존율 평가 방법(Rochem N.W. et al., J. Immunol. Methods 142 : 257-265, 1991)을 이용하여 살아있는 간세포에서 형성된 포마잔을 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 값을 구하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 불미나리 유래 카페익산은 과산화수소로 유발된 간세포 손상을 20㎍/㎖ 이상부터 보호하는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] 불미나리 유래 카페익산의 사염화탄소에 의한 간손상 예방 측정

불미나리 유래 카페익산의 간 손상 보호 효과를 측정하기 위하여 웅성 흰쥐에 실시예 1에서 제조한 불미나리 유래 카페익산을 경구 투여하고, 사염화탄소에 의해 간 손상을 유도한 후, 혈청 중 GOT(Glutamic Oxalacetic Transaminase)와 GPT(Glutamic Pyruvic Transaminase) 양을 측정하였다. 또한, 각 투여군에 따른 간 조직 박편을 대조군과 비교 평가하였다.

500~600g의 웅성 흰쥐를 1주 동안 실험실 환경에 적응시키고 사료와 물을 충분히 공급하면서 사육하였다. 총 24마리의 웅성 흰쥐를 각 6마리씩 4군으로 나누고 <표 1>과 같이 체중의 1% 부피의 량을 경구투여 하였다. 15일째에 사염화탄소를 20% 농도로 옥수수기름에 녹여, 체중의 1% 부피의 량을 1회 경구 투여하고, 24시간 후 해부하여 혈청과 간 조직을 수득하여 실험 전까지 혈청은 -20℃에서 보관하였다. 각 군의 혈청을 GOT, GPT Kit(아산제약)를 이용하여 평가하고 1군에 비하여 2군이 통계적으로 유의하게 높아졌고, 불미나리 유래 카페익산을 투여한 3군과 4군에서 1군과 유사한 수준을 보임으로써 간 손상으로 인해 높아지는 두 가지 효소 GOT, GPT의 결과를 평가하면 간 손상을 예방하는 효과가 있음을 확인하였다<표 2>.

또한 각 군의 조직박편을 비교한 결과 사염화탄소에 유도된 간 손상이 미리 투여된 카페익산(40㎎/㎏/day)에 의해 예방하는 효과가 있음을 확인하였다(도 3a, 도 3b).

<표 1> 불미나리에서 분리한 카페익산의 간 손상 예방 평가를 위한 실험동물 분류표

Group	1일 ~ 14일	15일
1군 (n=6)	옥수수기름 투여군
2군 (n=6)	옥수수기름 투여군	20% 사염화탄소 투여군
3군 (n=6)	옥수수기름에 카페익산을 10㎎/㎏/day 녹여 투여한 군	20% 사염화탄소 투여군
4군 (n=6)	옥수수기름에 카페익산을 40㎎/㎏/day 녹여 투여한 군	20% 사염화탄소 투여군

<표 2> 불미나리에서 분리한 카페익산의 간손상 예방 효능 도표

Group	GOT(Karmen/mL)	GPT(Karmen/mL)
1군	108.56 ± 16.87^a	32.08 ± 6.01^a
2군	156.14 ± 22.98^b	65.89 ± 8.17
3군	117.49 ± 6.97^a	29.15 ± 3.63^a
4군	113.53 ± 14.40^a	34.53 ± 15.53^a

^{a, b}같은 문자는 95% 신뢰 수준에서 통계적 유의차를 보이지 않은 경우

[실시예 4] 불미나리 유래 카페익산을 함유하는 기능성 음료의 제조

본 발명은 상기 실시예 1에서 제조한 불미나리(Oenanthe javanica DC) 에탄올 추출물 또는 불미나리 유래 카페익산을 함유하는 간세포 보호 및 간 손상 예방 생리활성을 갖는 기능성 음료를 제조하였다.

(1) 정제수 100㎖에 불미나리 에탄올 추출물을 20㎎, 50㎎ 및 100㎎을 각각 혼합하고, 정백당 100mg, 액상과당 10mg, 구연산 1.0mg, 구연산나트륨 0.3mg를 혼합한 후, 3%의 이산화탄소를 첨가하여 불미나리 에탄올 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

(2) 정제수 180㎖에 불미나리 에탄올 추출물을 20㎎, 50㎎ 및 100㎎을 각각 혼합하고, 정백당 5 mg, 말토덱스트린 100 mg, 무수구연산 0.1 mg, 무수구연산나트륨 0.03 mg, 젖산칼슘 0.03 mg, 염화나트륨 0.01 mg, 염화칼륨 0.01 mg, 염화마그네슘 0.001 mg, 화이트클라우디 0.02 mg을 첨가한 불미나리 에탄올추출물을 함유하는 이온음료를 제조하였다.

(3) 정제수 100㎖에 불미나리 에탄올 추출물을 20㎎, 50㎎ 및 100㎎을 각각 혼합하고, 정백당 100 mg, 액상과당 10 mg, 구연산 1.0 mg, 구연산나트륨 0.3 mg를 혼합한 후, 3%의 이산화탄소를 첨가하여 불미나리 유래 카페익산을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

(4) 정제수 180㎖에 불미나리 유래 카페익산을 10㎎ 및 40㎎을 각각 혼합하고, 정백당 5 mg, 말토덱스트린 100 mg, 무수구연산 0.1 mg, 무수구연산나트륨 0.03 mg, 젖산칼슘 0.03 mg, 염화나트륨 0.01 mg, 염화칼륨 0.01 mg, 염화마그네슘 0.001 mg, 화이트클라우디 0.02 mg을 첨가한 불미나리 에탄올추출물을 함유하는 이온음료를 제조하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야에서 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 불미나리 에탄올추출물로부터 분리한 카페익산의 역상 고성능 액체크로마토그래피 그래프를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 의한 불미나리에서 분리한 카페익산의 간세포 보호 효능을 그래프로 나타낸 것이다.

CON : 과산화수소 무처리군,

2 mM HPO : 과산화수소 처리군,

CA 10 ~ CA 50 : 불미나리유래 카페익산 10㎍/㎖, 20㎍/㎖, 30㎍/㎖, 40㎍/㎖, 50㎍/㎖ 처리군,

^* 과산화수소 처리군과 비교하여 95% 신뢰구간에서 통계적 유의차가 있는 경우>

도 3a는 본 발명에 의한 불미나리에서 분리한 카페익산의 투여에 의한 간 손상 예방을 확인하기 위한 조직박편의 사진을 나타낸 것이다.

<실험군>

A: 옥수수기름 투여군(14일간) + 생리식염수

B: 옥수수기름 투여군(14일간) + 생리식염수에 20% 사염화탄소를 제조하여 투여한 군(실험마지막 날)

C: 옥수수기름에 불미나리 유래 카페익산을 40㎎/㎏/day 녹여 투여한 군(14일간) + 생리식염수에 20% 사염화탄소를 제조하여 투여한 군(실험마지막 날)

도 3b는 본 발명에 의한 불미나리에서 분리한 카페익산의 투여에 의한 간손상 예방 조직박편에 대한 평가를 도표로 나타낸 것이다.

<다음에 따라 조직손상의 등급을 결정한다>

1) 정상(-), 가벼움(+), 중증도(++), 심각함(+++)

2) 1 ~ 6 : 각 군이 포함하는 개체의 수>

Claims

불미나리(Oenanthe javanica DC)에 10∼20배 부피의 80％ 에탄올을 첨가하여 200∼300℃에서 2∼4시간 동안 교반하여 불미나리를 에탄올 추출하는 단계;

상기 불미나리 에탄올 추출물을 여과한 후, 그 여과액을 감압농축한 후 동결건조하여 불미나리 1차 추출물을 수득하는 단계;

상기 동결 건조한 불미나리 1차 추출물에 증류수를 첨가하여 불미나리 1차 추출물을 용해시킨 후 헥산(hexane)을 섞어 헥산에 용출된 헥산 분획물을 제거하고 남은 수층에 클로로포름(chloroform)을 섞어 클로로포름에 용출된 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 수층에 에틸아세테이트(ethylacetate)를 섞어 에틸아세테이트에 용출된 에틸아테세테이트 분획물인 불미나리 2차 추출물을 수득하는 단계;

및 상기 불미나리 2차 추출물을 크로마토그래피 하는 단계를 포함하는 간세포 보호 및 간 손상 예방 효능을 갖는 카페익산을 추출하는 방법.
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제1항에 있어서, 크로마토그래피 하는 단계는 불미나리 2차 추출물을 메탄올에 녹여 수집용 얇은 막 크로마토그래피 하는 것을 특징으로 하는 카페익산의 추출방법.
제1항 또는 제4항의 추출방법에 의해 불미나리를 추출한 것임을 특징으로 하는 불미나리(Oenanthe javanica DC) 추출물.
제1항의 추출방법에 의한 간 보호 및 간 손상예방 생리활성을 갖는 불미나리(Oenanthe javanica DC) 유래 카페익산을 함유하는 기능성 건강식품.
제6항에 있어서, 기능성 건강식품은 액상, 분말, 환, 과립 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.