KR100999424B1 - High Sensitivity Micro Cantilever-based Biomaterial Detection System - Google Patents
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Abstract
마이크로 캔틸레버를 이용하고 면역 반응을 기반으로 하는 단백질 검출에 있어서 마이크로 캔틸레버의 감도가 획기적으로 향상된 극미량 생체물질 검출 시스템을 개시한다. 이는 단일클론 항체를 비롯한 특이적 결합 물질(Specific binding agent)을 이용한 샌드위치 면역 검사법을 마이크로 캔틸레버에 적용함으로써 캔틸레버의 출력 신호 변화가 증폭되어 검출 감도가 획기적으로 향상될 수 있는 시스템이다. 이 시스템을 통해 극미량의 질병 특이 항원을 검출할 수 있고, 질병 특히 암과 관련된 극미량의 단백질 분석을 용이하게 수행할 수 있다.A micro trace biomaterial detection system using a micro cantilever and dramatically improving the sensitivity of a micro cantilever in protein detection based on immune responses. This is a system in which a sandwich immunoassay method using a specific binding agent including a monoclonal antibody is applied to a micro cantilever to amplify a change in the output signal of the cantilever, thereby significantly improving detection sensitivity. This system allows detection of trace levels of disease-specific antigens and facilitates analysis of trace amounts of proteins associated with disease, particularly cancer.
마이크로 캔틸레버, 샌드위치 면역 검사법, 단일클론 항체, 특이적 결합 Micro-cantilever, sandwich immunoassay, monoclonal antibody, specific binding
Description
본 발명은 고감도의 마이크로 캔틸레버 기반 생체물질 검출 시스템에 관한 것이다. The present invention relates to a high sensitivity micro cantilever based biomaterial detection system.
마이크로 캔틸레버는 MEMS(micro electromechanical systems), NEMS(nano electromechanical systems)의 발전과 함께 구조적, 재료적 발전을 이루었을 뿐만 아니라 나노·생명공학의 대두로 인하여 응용 분야를 비약적으로 확장시킬 수 있었다. 바이오 센서로서의 마이크로 캔틸레버는 고감도(high sensitivity), 고선택성(high selectivity) 및 비표지 검출(labeling-free detection)을 특징으로 하고 있으며, DNA, 질병 표지 단백질(marker protein), 및 저분자 생체물질을 포함한 병원성 물질(pathogen)을 분석의 대상으로 하고 있다.Micro cantilever has not only achieved structural and material advancement with the development of micro electromechanical systems (MEMS) and nano electromechanical systems (NEMS), but also has greatly expanded the field of application due to the rise of nano and biotechnology. Micro-cantilevers as biosensors feature high sensitivity, high selectivity and labeling-free detection and include DNA, disease marker proteins, and small molecule biomaterials. Pathogens are targeted for analysis.
마이크로 캔틸레버 센서는 그 응용에 있어서 미세천칭(microbalance) 원리 및 표면 스트레스(surface stress) 원리로 크게 나뉜다. 전자는 캔틸레버의 질량 및 스프링 상수 변화에 의해 발현되는 공진주파수의 변화를 측정하는 동적 모드(dynamic mode)이고, 후자는 마이크로 캔틸레버 위에서의 특이 반응에 의한 표면 스트레스 변화에 의해 발생하는 변위를 측정하는 정적 모드(static mode)이다. Microcantilever sensors are largely divided into microbalance principle and surface stress principle in their application. The former is a dynamic mode that measures the change in resonant frequency caused by the change in mass and spring constant of the cantilever, and the latter is a static mode that measures the displacement caused by surface stress change due to the specific reaction on the microcantilever. Static mode.
바이오센서로서의 마이크로 캔틸레버의 경우, 미량의 생체물질이 특이 결합하면서 이웃하는 물질 간에 서로 작용하는 힘과 특이 결합에 의하여 발생하는 구조변화에 의하여 캔틸레버 센서의 표면 스트레스가 발생하고 이로 인하여 마이크로 캔틸레버 센서의 휨 현상이나 공진주파수의 변화가 발생한다.In the case of a microcantilever as a biosensor, surface stress of the cantilever sensor is generated due to structural change caused by a force and a specific bond between neighboring materials, while a small amount of biomaterial is specifically bound, resulting in the bending of the microcantilever sensor. Phenomena or changes in resonant frequency occur.
바이오센서에 있어서 민감도는 선택성 및 신속성과 더불어 중요한 요소중의 하나이다. 바이오센서는 크게 생체물질을 받아들이는 수용체 요소(receptor element)와 이를 전기적 신호로 변환시켜주는 변환기 요소(transducer element)로 구성되어 있으며 광학적 또는 기계적 변화를 매개로 하여 생체물질의 인식을 전기 신호로 변환된다. 바이오센서의 신호를 증폭하고 감도를 향상시키기 위해, 전기적, 광학적 측면에서 변환기 요소의 개선과 화학적, 생물학적 측면에서 수용체 요소의 개선이 동시에 이루어져 왔다.For biosensors, sensitivity is one of the important factors along with selectivity and speed. The biosensor is composed of a receptor element that accepts a biomaterial and a transducer element that converts it into an electrical signal, and converts the recognition of the biomaterial into an electrical signal through an optical or mechanical change. do. In order to amplify the signal of the biosensor and to improve the sensitivity, the improvement of the transducer element in the electrical and optical aspects and the receptor element in the chemical and biological aspects have been simultaneously made.
이에, 본 발명자들은 면역 반응을 이용하는 마이크로 캔틸레버 기반 단백질 검출에 있어서, 단일클론 항체를 비롯한 특이적 결합 물질(Specific binding agent)을 이용한 샌드위치 면역 검사법을 마이크로 캔틸레버에 적용하면 캔틸레버의 출력 신호 변화가 증폭되어 검출 감도가 획기적으로 향상될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 따라서 본 발명은 극미량의 생체물질, 특히 질병 표지 단백질을 검출할 수 있는 마이크로 캔틸레버 기반 고감도 생체물질 검출 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.Therefore, in the present invention, the microcantilever-based protein detection using an immune response, when the sandwich immunoassay method using a specific binding agent including monoclonal antibody to the microcantilever, the change in the output signal of the cantilever is amplified. It has been found that detection sensitivity can be significantly improved. Accordingly, an object of the present invention is to provide a micro cantilever-based high sensitivity biomaterial detection system capable of detecting trace amounts of biomaterials, particularly disease marker proteins.
본 발명은 마이크로 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템으로서, 마이크로 캔틸레버 센서; 상기 센서 표면에 형성된, 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프(epitope)와 결합하는 단일클론 일차 항체(monoclonal antibody)층; 상기 단일클론 일차 항체층 위에 형성된 검출 대상 단백질층; 및 상기 검출 대상 단백질층 위에 형성된, 상기 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 특이적 결합 물질(Specific binding agent)층을 포함하고, 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)이 결합하는 에피토프는 상기 단일클론 일차 항체가 결합하는 에피토프와 상이한, 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템을 제공한다.The present invention provides a protein detection system based on a micro cantilever sensor, comprising: a micro cantilever sensor; A monoclonal primary antibody layer that binds to one epitope on the protein to be detected, formed on the sensor surface; A target protein layer formed on the monoclonal primary antibody layer; And a specific binding agent layer formed on the protein layer to be detected and binding to one epitope on the protein to be detected, wherein the epitope to which the specific binding agent binds is A microcantilever sensor-based biomaterial detection system is provided that differs from the epitope to which the monoclonal primary antibody binds.
본 발명에 따른 생체물질 검출 시스템을 사용하면, 질병 특히 암과 관련된 극미량의 표지 단백질을 수 펨토 몰농도 수준으로 용이하게 검출할 수 있다. Using the biomaterial detection system according to the present invention, it is possible to easily detect trace amounts of labeled proteins associated with diseases, particularly cancer, at a few femto molarity levels.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서를 기반으로 하는 단백질 검출 시스템은, 마이크로 캔틸레버 센서; 상기 센서 표면에 형성된 검출 대상 단백질의 단일클론 일차 항체(monoclonal antibody)층; 상기 단일클론 일차 항체층 위에 형성된 검출 대상 단백질층; 및 상기 단백질층 위에 형성된 상기 단백질의 특이적 결합 물질(Specific binding agent)층을 포함한다. 상기 단일클론 일차 항체는 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하고, 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)도 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합한다. 상기 특이적 결합 물질(Specific binding agent)이 결합하는 에피토프(epitope)는 상기 단일클론 일차 항체가 결합하는 에피토프와 상이하다. Protein detection systems based on the micro cantilever sensor described herein include a micro cantilever sensor; A monoclonal primary antibody layer of the protein of interest formed on the sensor surface; A target protein layer formed on the monoclonal primary antibody layer; And a specific binding agent layer of the protein formed on the protein layer. The monoclonal primary antibody binds to one epitope on the protein to be detected, and the specific binding agent also binds to one epitope on the protein to be detected. The epitope to which the specific binding agent binds is different from the epitope to which the monoclonal primary antibody binds.
특이적 결합 물질(Specific binding agent)이란, 정해진 표적에만 특이적으로 결합하는 물질로서, 특정 항원의 특정 위치(에피토프)에만 결합하는 단일클론 항체, 리간드 또는 앱타머(aptamer) 등이 있다. 앱타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 또는 펩티드 분자를 의미한다.A specific binding agent is a substance that specifically binds only to a predetermined target, and includes a monoclonal antibody, a ligand, or an aptamer that binds only to a specific position (epitope) of a specific antigen. Aptamers refer to oligonucleic acid or peptide molecules that bind to specific target molecules.
본 명세서에 기재된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 단백질 검출 시스템에 있어서, 결합하는 에피토프가 상이한 특이적 결합 물질들이 캔틸레버 표면에 각각 동일한 양으로 결합 반응되더라도, 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질들이 각각 검출 대상 단 백질 항원을 인식하는 위치(에피토프)에 따라, 특이적 결합 물질과 캔틸레버 표면 사이에서 발생하는 힘에 변화가 발생하여 공진주파수의 변화에 영향을 미친다. 특히, 검출 대상 단백질이 극미량일 경우에도, 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질이 검출 대상 단백질 항원을 인식하는 위치(에피토프)에 따라, 특이적 결합 물질과 캔틸레버 표면 사이에 힘이 발생함으로써 공진주파수가 변화하므로, 감도를 획기적으로 향상시킬 수 있다.In microcantilever sensor-based protein detection systems using specific binding agents, including monoclonal secondary antibodies described herein, monoclonal secondary, even if the binding epitopes are bound to the cantilever surface by the same amount of specific binding substances, respectively Depending on the position (epitope) where specific binding substances, including antibodies, respectively recognize the protein antigen to be detected, a change occurs in the force generated between the specific binding substance and the surface of the cantilever, thereby affecting the change of the resonance frequency. In particular, even when the amount of the protein to be detected is extremely small, resonance occurs due to the force generated between the specific binding material and the surface of the cantilever according to the position (epitope) where the specific binding material including the monoclonal secondary antibody recognizes the protein antigen to be detected. Since the frequency changes, the sensitivity can be significantly improved.
본 명세서에 기재된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용하는 마이크로 캔틸레버 센서 기반 단백질 검출 시스템에서, 가장 높은 감도의 검출 결과를 낼 수 있는 특이적 결합 물질을 구별하기 위하여, 검출 대상 단백질에 알려진 모든 에피토프들에 대응하는 각각의 특이적 결합 물질들을 이용하여 예비실험할 수 있다. In a microcantilever sensor-based protein detection system using specific binding agents, including monoclonal secondary antibodies described herein, to distinguish specific binding agents that can produce the highest sensitivity detection results, Preliminary experiments can be made using the respective specific binding agents corresponding to epitopes.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템은 상기 마이크로 캔틸레버 센서와 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층(self assembled monolayer, SAM)을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템에서 상기 마이크로 캔틸레버 센서는 PZT 층을 포함할 수 있고, 상기 마이크로 캔틸레버 센서의 하측면에 금박층을 포함할 수 있으며, 상기 마이크로 캔틸레버 센서의 금박층과 단일클론 일차 항체층 사이에 자기조립단분자층을 더 포함할 수 있다.The microcantilever sensor-based biomaterial detection system described herein may further include a self assembled monolayer (SAM) between the microcantilever sensor and the monoclonal primary antibody layer. In addition, in the micro cantilever sensor-based biomaterial detection system described herein, the micro cantilever sensor may include a PZT layer, and may include a gold foil layer on a lower side of the micro cantilever sensor, and a gold foil of the micro cantilever sensor. A self-assembled monolayer may be further included between the layer and the monoclonal primary antibody layer.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템은 상기 단일클론 일차 항체층 위에 비특이적 흡착 억제용 생체 고분자를 결합시킬 수 있고, 본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템에서 상기 검출 대상 단백질층 위에 결합되는 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질은 형광물질로 표지될 수 있다.The microcantilever sensor-based biomaterial detection system described herein may bind a non-specific adsorption-inhibiting biopolymer on the monoclonal primary antibody layer, and the protein layer to be detected in the microcantilever sensor-based biomaterial detection system described herein. Specific binding agents, including monoclonal secondary antibodies bound to the stomach, can be labeled with a fluorescent material.
샌드위치 면역 검사법이란 면역 반응 후 추가적으로 형광 염료, 효소 또는 나노 입자와 결합하고 있는 특이적 결합 물질(specific binding agent)을 반응시킴으로써 신호를 발생시키는 방법이다. The sandwich immunoassay is a method for generating a signal by reacting a specific binding agent that is additionally bound to fluorescent dyes, enzymes or nanoparticles after an immune reaction.
본 발명의 일 실시예는 마이크로 캔틸레버 바이오센서의 신호를 증폭하여 민감도를 높이기 위해서 (1) PZT 기반의 공진형 마이크로 캔틸레버 센서를 준비하는 단계; (2) 상기 마이크로 캔틸레버 센서 하측면에 금박을 입히고, 그 금박면에 캘릭스크라운(calixcrown) 자기조립단분자층(self assembled monolayer)을 형성하는 단계; (3) 상기 단분자층위에 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 단일클론 일차 항체를 고정하고, 비특이적 흡착을 억제하기 위하여 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 코팅하는 단계; (4) 상기 단일클론 일차 항체층 위에 검출 대상 단백질을 가하여 결합시키는 단계; 및 (5) 상기 검출 대상 단백질층 위에 검출 대상 단백질 상의 하나의 에피토프와 결합하는 단일클론 이차 항체를 가하여 결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 극미량의 단백질을 정량 분석한다. 본 발명의 일실시예에 따라 전립선 특이 항원(PSA)의 단일클론 항체 및 전립선 특이 항원이 반응된 마이크로 캔틸레버의 개략적인 모습이 도 1에 나타나 있다. One embodiment of the present invention to amplify a signal of the micro-cantilever biosensor to increase the sensitivity (1) preparing a PZT-based resonant micro-cantilever sensor; (2) coating a gold foil on the lower surface of the micro cantilever sensor and forming a self-assembled monolayer on the gold foil surface; (3) immobilizing a monoclonal primary antibody that binds to one epitope on the protein to be detected on the monolayer and coating bovine serum albumin (BSA) to inhibit nonspecific adsorption; (4) adding and detecting a protein to be detected on the monoclonal primary antibody layer; And (5) adding and binding a monoclonal secondary antibody that binds to one epitope on the protein to be detected on the protein layer to be detected. According to one embodiment of the present invention, a schematic view of a monoclonal antibody of a prostate-specific antigen (PSA) and a micro-cantilever to which a prostate-specific antigen is reacted is shown in FIG. 1.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 PZT 기반의 공진형 마이크로 캔틸레버는 캔틸레버의 공진 주파수를 분석하는 동적 모드(dynamic mode)를 이용한다. 상기 공 진 주파수 분석은, 검출 대상 단백질이, 마이크로 캔틸레버의 하측면에 고정화된 단일클론 일차 항체와 결합하고, 검출 대상 단백질 상에 단일클론 이차 항체가 결합하면서, 단일클론 이차 항체와 캔틸레버 표면 사이에 힘이 발생하여 캔틸레버의 고유진동수를 변화시킬 때 임피던스의 위상 각도 변화를 분석함으로써 수행된다.The PZT-based resonant microcantilever according to an embodiment of the present invention uses a dynamic mode for analyzing the resonant frequency of the cantilever. The resonance frequency analysis is performed between the monoclonal secondary antibody and the cantilever surface while the protein to be detected binds to the monoclonal primary antibody immobilized on the underside of the microcantilever and the monoclonal secondary antibody binds to the protein to be detected. This is done by analyzing the change in the phase angle of the impedance when a force is generated to change the natural frequency of the cantilever.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 자기조립단분자층은 항체를 고정화하기 위한 것으로서 티올(thiol)기가 달린 캘릭스크라운(calixcrown) 화합물을 코팅하였다. 캘릭스크라운의 에테르 링 구조는 아민기(amine)와 같은 양전하를 띠는 기능기를 포획할 수 있으므로 단일클론 항체 표면의 아민기를 포획하여 항체를 안정적으로 고정할 수 있다. 캘릭스크라운 외에 11-머캡토언데카노산(11-mercaptoundecanoic acid) 또는 티옥트산(thioctic acid)을 사용할 수 있다. BSA는 검출 대상 단백질과 섞여있는 환경 물질 및 검출 대상 단백질 자체의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 사용되었다. BSA 외에 카세인 단백질을 사용할 수 있다.The self-assembled monolayer according to one embodiment of the present invention was coated with a Calixcrown compound with a thiol group to immobilize the antibody. Since the ether ring structure of Calixcrown can capture a positively charged functional group such as an amine group, the antibody can be stably fixed by capturing an amine group on the surface of a monoclonal antibody. In addition to Calixcrown, 11-mercaptoundecanoic acid or thioctic acid can be used. BSA was used to prevent nonspecific adsorption of environmental substances mixed with the protein of detection and the protein of detection itself. In addition to BSA, casein proteins can be used.
본 발명의 일실시예에서는 검출 대상 단백질로서 전립선 특이 항원(PSA)을 포획하였다. 전립선 특이 항원은 일반적으로 전립선암의 표지 단백질로서 현재까지 암 표지자중에 가장 많은 연구가 이루어진 단백질이다. 일반적으로 정상 남성인 경우 4 ng/mL 이하의 전립선 특이 항원을 가지고 있으며, 10 ng/mL 이상에서는 전립선암으로 진단한다. 전립선 특이 항원은 전립선 제거 수술 후에도 재발현 되어 암재발로 이어질 수 있으며, 이는 극미량 분석에 의한 조기 발견을 통해 해결될 수 있다. 한편, 간암의 표지 단백질인 AFP, 대장암 등의 표지 단백질인 CEA, 유방암의 표지 단백질인 HER2, 심혈관 질환의 표지 단백질인 CRP, 뇌졸중의 표지 단백질인 MMP-9, 심근경색의 표지 단백질인 미오글로빈, CK-MB 또는 트로포닌 I, 또는 췌장암의 표지 단백질인 CA 19-9, CA 125, RCAS1, TSGF, CA 242, MIC-1, CECAM1 또는 오스테오폰틴(osteopontin)을 항원으로 사용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, prostate specific antigen (PSA) was captured as a protein to be detected. Prostate-specific antigens are generally the marker proteins of prostate cancer and are the most studied of cancer markers to date. Normally, normal males have prostate specific antigens of 4 ng / mL or less, and prostate cancer is diagnosed above 10 ng / mL. Prostate-specific antigens can be re-expressed after prostatectomy, leading to cancer recurrence, which can be resolved through early detection by trace analysis. On the other hand, AFP, liver label marker protein, such as colorectal cancer, CEA, breast cancer marker protein HER2, cardiovascular disease marker protein CRP, stroke marker protein MMP-9, myocardial infarction marker protein myoglobin, CK-MB or troponin I, or CA 19-9, CA 125, RCAS1, TSGF, CA 242, MIC-1, CECAM1 or osteopontin, which are marker proteins of pancreatic cancer, can be used as antigen.
본 명세서에 기재된 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템의 일실시예에서, 형광 염료가 결합된 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용할 수 있다. 형광 염료를 결합시키는 이유는 형광 분석을 통해 단일클론 이차 항체를 비롯한 특이적 결합 물질을 이용한 결합 반응이 순조롭게 이루어짐을 확인하고, 증폭된 신호와 상호 비교하기 위함이다. In one embodiment of the microcantilever sensor-based biomaterial detection system described herein, specific binding materials can be used, including monoclonal secondary antibodies to which fluorescent dyes are bound. The reason for binding the fluorescent dye is to confirm that the binding reaction using a specific binding material including a monoclonal secondary antibody is smooth through fluorescence analysis, and to compare with the amplified signal.
본 명세서에 기재된 특이적 결합 물질을 이용한 마이크로 캔틸레버 센서 기반 생체 물질 검출 시스템을 통하여 전립선 특이 항원을 검출한 결과, 수 펨토몰 수준으로 생체 물질을 검출할 수 있는 다클론 이차 항체를 이용한 경우에 비해서 공진 주파수가 증폭 정도가 최대 2배 정도 증가하여 검출 감도가 더욱 향상되었음을 알 수 있었다. Prostate-specific antigens were detected through a microcantilever sensor-based biomaterial detection system using the specific binding material described herein, and thus resonated as compared with a polyclonal secondary antibody capable of detecting biomaterials at several femtomol levels. It was found that the detection sensitivity was further improved by increasing the frequency up to 2 times.
이하, 본 발명을 하기 실시예 등 구체예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 구체예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by specific examples such as the following examples. However, the following specific examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
[실시예] 단일클론항체를 이용한 샌드위치 면역 검사EXAMPLES Sandwich Immunoassay Using Monoclonal Antibodies
1-1. 전립선 특이항원 단일클론 항체의 고정1-1. Immobilization of Prostate Specific Antigen Monoclonal Antibodies
마이크로 캔틸레버 하단의 금박면에 자기조립단분자층(SAM)을 형성하기 위해, 금박면을 증착한 즉시 3mM 캘릭스크라운/클로로포름(chloroform) 용액에 상온에서 2시간동안 정치시켰다. 반응 종료 후 클로로포름과 에탄올, 증류수를 차례로 이용하여 마이크로 캔틸레버를 세척하였다. 전립선 특이항원의 PS1 에피토프와 결합하는 단일클론 일차 항체를 고정시키기 위해 캘릭스크라운 SAM이 형성된 마이크로 캔틸레버를 10μg/mL 전립선 특이항원의 PS1 에피토프 결합 단일클론 항체/인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS) 수용액에 1시간동안 상온에서 정치시켰다. 반응 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분동안 마이크로 캔틸레버를 세척하였다. 그리고 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 마이크로 캔틸레버를 1% BSA 수용액에 1시간동안 정치한 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 이 상태의 마이크로 캔틸레버에 대하여 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 초기 공진주파수(F0)을 측정하였다. In order to form a self-assembled monolayer (SAM) on the gold foil surface of the bottom of the micro cantilever, the gold foil surface was immediately placed in a 3mM Calliscrown / chloroform solution for 2 hours at room temperature. After completion of the reaction, the microcantilever was washed with chloroform, ethanol and distilled water in that order. To fix a monoclonal primary antibody that binds to the PS1 epitope of the prostate specific antigen, a microcantilever with a Calixcrown SAM-formed PS1 epitope binding monoclonal antibody / phosphate buffered saline (PBS) of 10 μg / mL prostate specific antigen The solution was left to stand at room temperature for 1 hour. After the reaction, the microcantilever was washed with PBST (1% Tween20 / PBS) for 15 minutes and PBS for 10 minutes. In order to prevent nonspecific adsorption, the microcantilever was allowed to stand in 1% BSA aqueous solution for 1 hour, and then washed with PBST (1% Tween20 / PBS) for 15 minutes, PBS for 10 minutes, and distilled water for 5 minutes. The initial resonance frequency (F 0 ) was measured for the microcantilever in this state using a microcantilever measurement system equipped with a constant temperature and humidity device.
1-2. 전립선 특이항원의 1차 면역반응1-2. Primary Immune Response of Prostate Specific Antigen
마이크로 캔틸레버에 고정화된 전립선 특이항원의 단일클론 항체에 전립선 특이항원을 면역 반응 시켰다. 100μg/mL 농도의 전립선 특이항원 수용액 1mL에 PS1 에피토프 결합 단일클론 항체가 고정된 마이크로 캔틸레버를 1시간 동안 상온에서 정치시켰다. 음성 대조군으로서, CRP(C-Reactive Protein) 항원을 PS1 에피토 프 결합 단일클론 항체가 고정된 마이크로 캔틸레버에 반응시켰다. 면역 반응 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 그리고 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 공진주파수(F1)를 측정하였다. Prostate specific antigens were immunized with monoclonal antibodies of prostate specific antigens immobilized on the microcantilever. A microcantilever immobilized with a PS1 epitope binding monoclonal antibody in 1 mL of 100 μg / mL aqueous solution of prostate specific antigen was allowed to stand at room temperature for 1 hour. As a negative control, the C-Reactive Protein (CRP) antigen was reacted with a micro cantilever immobilized with PS1 epitope binding monoclonal antibody. After the immune reaction, washed 15 minutes with PBST (1% Tween 20 / PBS), 10 minutes with PBS, 5 minutes with distilled water. And the resonant frequency (F 1 ) was measured using a micro-cantilever measuring system equipped with a thermo-hygrostat.
1-3. 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 2차 면역 반응1-3. Sandwich Secondary Immune Responses Using Monoclonal Secondary Antibodies
마이크로 캔틸레버를 이용한 면역 검출 반응의 신호를 증폭하기 위해 2차적으로 단일클론 항체를 반응시켰다. 형광염료가 결합되고, 전립선 특이항원의 에피토프 중 PS1, PS6, 5A6, 2H9 에피토프에 결합하는 10μg/mL 농도의 전립선 특이항원의 단일클론항체 수용액 각각의 1mL에 1차 면역 반응을 거친 상기 마이크로 캔틸레버를 1시간 동안 상온에서 정치시켰다. 반응 종료 후 PBST(1% 트윈20/PBS)로 15분, PBS로 10분, 증류수로 5분동안 세척하였다. 그리고 항온습 장치가 갖춰진 마이크로 캔틸레버 측정시스템을 이용하여 공진주파수(F2)를 측정하였다. Monoclonal antibodies were reacted secondary to amplify the signal of an immune detection response using a micro cantilever. The microcantilever was combined with a fluorescent dye and subjected to a primary immune response to 1 mL of a monoclonal antibody solution of 10 μg / mL concentration of a prostate specific antigen that binds to the PS1, PS6, 5A6, and 2H9 epitopes among the epitopes of the prostate specific antigen. It was left to stand at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction was washed with PBST (1% Tween 20 / PBS) for 15 minutes, PBS for 10 minutes, distilled water for 5 minutes. And the resonant frequency (F 2 ) was measured using a micro-cantilever measuring system equipped with a thermo-hygrostat.
비교를 위하여, 대조군으로서, 형광염료가 결합된 전립선 특이항원의 다클론항체를 이차 항체로 사용하였다. For comparison, as a control, a polyclonal antibody of a prostate specific antigen to which a fluorescent dye is bound was used as a secondary antibody.
이차 항체가 전립선 특이 항원에 결합된 후, 이차 항체의 형광 분석을 통해 이차 면역 반응을 확인하였다. 그 결과는 마이크로 캔틸레버의 형광 사진인 도 2에 나타나 있다. 도 2에 따르면, PS6, 5A6, 2H9 에피토프에 결합하는 전립선 특이항원의 단일클론항체 각각이 해당 에피토프에 결합한 정도는 유사하였다. PS1 에피토프 에 결합하는 전립선 특이항원의 단일클론항체의 경우, PS1 에피토프는 이미 단일클론 일차 항체에 의하여 결합되었으므로, 단일클론 이차 항체의 형광이 관찰되지 않았다. 비특이적 항원인 CRP 항원은 전혀 결합이 일어나지 않았음을 확인하였다. After the secondary antibody was bound to the prostate specific antigen, the secondary immune response was confirmed by fluorescence analysis of the secondary antibody. The results are shown in Figure 2, which is a fluorescence picture of the micro cantilever. According to Figure 2, the degree of binding of each of the monoclonal antibodies of the prostate specific antigen to PS6, 5A6, 2H9 epitopes to the corresponding epitope was similar. In the case of monoclonal antibodies of prostate specific antigens that bind to PS1 epitopes, the fluorescence of monoclonal secondary antibodies was not observed since the PS1 epitopes were already bound by monoclonal primary antibodies. The nonspecific antigen CRP antigen was confirmed that no binding occurred.
이차 항체가 전립선 특이 항원에 결합된 후, 공진 주파수의 증폭 정도를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타나 있다.After the secondary antibody was bound to the prostate specific antigen, the degree of amplification of the resonance frequency was measured. The results are shown in FIG.
단일클론 일차 항체와 결합하는 에피토프가 다른 단일클론 이차 항체의 경우, 다클론 이차 항체를 이용한 경우와 비교하여 공진 주파수가 증폭 정도가 최대 2배 정도 증가하여 검출 감도가 향상되었음을 알 수 있었다. 특히, 단일클론 이차 항체들이 결합하는 에피토프에 따라, 공진주파수 증폭 정도에 차이가 있었다. In the case of monoclonal secondary antibodies having different epitopes binding to the monoclonal primary antibody, the resonance frequency was increased by up to 2 times as compared with the polyclonal secondary antibody, indicating that the detection sensitivity was improved. In particular, according to the epitope to which the monoclonal secondary antibodies bind, there was a difference in the degree of resonance frequency amplification.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 단일클론 이차 항체(monoclonal antibody)를 이용하여 샌드위치 면역 검사를 수행할 때의 마이크로 캔틸레버의 개략도이다. 1 is a schematic diagram of a micro-cantilever when performing a sandwich immunoassay using a monoclonal secondary antibody (monoclonal antibody) according to an embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 마이크로 캔틸레버에서 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 면역 검사를 적용한 후 단일클론 이차 항체가 결합하는 에피토프에 따른 마이크로 캔틸레버 표면의 형광 이미지이다.Figure 2 is a microcantilever surface according to the epitope to which the monoclonal secondary antibody binds after applying a sandwich immunoassay using a monoclonal secondary antibody of prostate specific antigen (PSA) in the microcantilever according to an embodiment of the present invention Is a fluorescence image.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 마이크로 캔틸레버에서 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA)의 단일클론 이차 항체를 이용한 샌드위치 면역 검사를 적용한 후 단일클론 이차 항체가 결합하는 에피토프에 따른 마이크로 캔틸레버 공진 주파수의 변화를 보여주는 그래프이다.3 is a microcantilever resonance according to an epitope to which a monoclonal secondary antibody binds after applying a sandwich immunoassay using a monoclonal secondary antibody of prostate specific antigen (PSA) in a microcantilever according to an embodiment of the present invention. This graph shows the change in frequency.
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