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KR101019916B1 - 상처 치료용 생물학적 활성 물질로서 사용될 수 있는각질세포 - Google Patents

상처 치료용 생물학적 활성 물질로서 사용될 수 있는각질세포 Download PDF

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KR101019916B1
KR101019916B1 KR1020047005677A KR20047005677A KR101019916B1 KR 101019916 B1 KR101019916 B1 KR 101019916B1 KR 1020047005677 A KR1020047005677 A KR 1020047005677A KR 20047005677 A KR20047005677 A KR 20047005677A KR 101019916 B1 KR101019916 B1 KR 101019916B1
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Abstract

본 발명은 시험관내에서 배양될 수 있는 신규한 각질세포 및 급성 및 만성 상처의 치료에 사용될 수 있는 제품의 제조를 위한 이의 유리한 용도에 관한 것이다.
Figure R1020047005677
각질세포, 상처, KC-BI-1, DSM ACC 2514, 운반체 물질

Description

상처 치료용 생물학적 활성 물질로서 사용될 수 있는 각질세포{Keratinocytes which may be used as biologically active substances for the treatment of wounds}
본 발명은 시험관내에서 배양될 수 있는 새로운 각질세포 및 급성 및 만성 상처를 치료하는데 사용될 수 있는 제품을 제조하기 위한 이의 유리한 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 의학 분야, 구체적으로 조직 공학에 의한 상처 치유 분야에서 완성되었다.
동종이형(allogenic) 각질세포는 상처, 특히 궤양 및/또는 화상의 치료에서 꽤 오랜 동안 성공적으로 사용되어 왔다[참조 문헌: Maier, 1993; Schonfeld et al., 1993]. 장기간에 걸친 종래의 방법에 의한 치료에 대해 내성을 지니는 것으로 입증된 상처가 종종 동종이형 각질세포를 사용하여 성공적으로 치료되었다[참조 문헌: Phillips and Gilchrest, 1993; Beele et al., 1991; Leigh et al., 1991; Lindgren et al, 1998]. 무엇 보다도, 동종이형 각질세포를 사용하는 경우, 피부 치환, 즉 이식된 표피의 재생에 주로 관심이 집중되었다. 그러나, 이러한 치료의 성공이 주로 신체 자체의 재-상피형성(re-epithelialisation)의 자극에 의한 것이지, 상처에서의 동종이형 세포 이식물의 "성장"에 의한 것이 아니라는 것이 곧 분명해졌다. 최근에, 수많은 연구들에 의하면, 이식된 각질세포가 단지 특정 기간 동안에만 상처에 잔존하다가 임상적으로 알려지지 않은 방법으로 체내에서 제거된다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: Kawai et al., 1993]. 따라서, 신체 자체의 상처 치유의 자극은 동종이형 각질세포에 의한 다수의 상이한 성장 인자, 사이토킨, 세포외기질(ECM), 소형 분자 및 프로테아제의 공간상 및 시간상의 최적 방출에 의해 주로 초래된다[참조 문헌: Lang et al., 1996; Marcusson et al., 1992]. 방출된 인자들의 복잡성 및 수는 예를 들면 분리된 성장 인자를 사용하는 통상의 단일 요법 이상의 치료학적 이점을 확인해준다. 그러나, 재-상피형성의 주요 효과와는 별개로, 각질세포를 이용한 치료는 또한 육아조직에서 육안 및 현미경으로 검출가능한 변화를 일으킨다[참조 문헌: Lang et al., 1996]. 환자에게 유익한 것으로 종종 기술되는 각질세포의 또 다른 효과는 이식후 현저한 무통각증이다[참조 문헌: Schonfeld et al., 1993].
상처 치유에 있어서, 활발히 분할하는 각질세포가 상처 치유를 촉진하는 복잡한 분비 양상을 갖는 것으로 여겨지기 때문에, 미분화된, 활발히 분할하는 각질세포를 사용하는 것이 유리하다. 줄기 세포를 제외하고는, 미분화된 각질세포는 단지 수회의 세포 분할 후 천연 분화과정 동안에 생체내에서 이들의 증식 잠재능을 상실한다(이는 지금까지 각질세포의 시험관내 배양에서 관찰되었던 과정이다)[참조 문헌: Barrandon and Green, 1987]. 결과적으로, 특히 상처 치유에 적합한, 활발 히 분할하는 각질세포는 지금까지 시험관내에서만 배양되었으며, 이로 인해 의학적 목적으로 사용하는 것이 곤란하고 비용이 많이 들었다.
동종이형 각질세포는, 다층의, 효소에 의해 분리된 세포 응집체로 이루어진 소위 "각질세포 시트"의 형태로 직접, 또는 "생물학적 활성 상처 치유 드레싱"이란 명칭하에 생체적합성 운반체와 함께 치료학적으로 사용된다. 후자는, 세포들이 사용 전 배양 접시의 기판으로 부터 이들을 분리하는 효소 예비처리를 요구하지 않는다는 이점이 있다. 더구나, 생체적합성 막을 각질세포를 배양하기 위한 운반체로서 사용하는 경우[참조 문헌: EP 0　462　462, US 5,658,331; US 5,693,332; EP　0518　920], 세포들이 더 이상 자가-함유 세포 응집체를 형성하지 않아도 되기 때문에, 조기에 생물학적 활성 상처 치유 드레싱을 제조할 수 있다. 이미 성장한 서브컨플루언스(subconfluence)를 갖는 운반체는 상처 치료에 사용될 수 있다. 보다 수월하게 이용될 수 있는 것과는 별개로, 서브컨플루언스성 세포 응집체를 사용하는 경우 상응하게 배양된 각질세포가 덜 급격하게 분화되는 추가적 이점이 있으므로, 상처 치료에 이롭다.
각질세포는, 어떠한 유해한 효과도 없이, 직접적으로 또는 생체적합성 운반체 물질과 함께 -30 내지 -196℃, 바람직하게는 -70℃ 내지 -90℃의 온도에서 상처 치유를 위해 냉동보존될 수 있다[참조 문헌: De Luca et al., 1992; Teepe et al., 1993]. 이로써, 생물학적 활성 상처 치유 드레싱의 공급이 어느 정도 유지될 수 있기 때문에, 이들의 치료학적 유용성이 개선된다.
발명의 과제
종래의 기술로 부터 공지된 각질세포 및 이들로 부터 제조된 생물학적 활성 상처 치유 드레싱은, 본 발명이 극복하고자 하는 특정 결점을 가진다. 지금까지 공지된 일차 기원의 각질세포의 명백한 단점은, 상기 세포가 이의 높은 분할 속도를 상실하지 않고, 따라서 생물학적 활성 상처 치유 드레싱의 제조를 위한 적합성을 상실하지 않으면서 시험관내 세포 배양 과정에서 세포의 몇 세대 동안만 그자체를 복제할 수 있을 뿐이라는 것이다. 종래의 기술에 따르면, 당업자는 세포의 수를 시험관내 배양에서 약 103 내지 104의 계수로 증가시킬 수 있을 뿐이다[참조 문헌: Tanczos et al., 1999].
상기로 인한 또 다른 단점은, 시험관내에서 상기 각질세포의 제한된 배양가능성으로 인해 복잡하고 빈번한 재-분리를 필수적으로 수행해야 한다는 것이다; 이는 다시 말하면 수득된 복제된 세포 물질이 균일하지 않으므로 이로 부터 제조된 상처 치유 드레싱이 모든 가능성 면에서 질적으로 상이하거나, 적어도 상이할 수 있다는 것을 의미한다.
또 다른 단점은, 다양한 제공자로 부터의 각질세포의 재분리로 인해 상처 치유 응집체의 수여자가 감염될 위험이 증가한다는 것이다. 예를 들면, HIV 또는 간염의 위험이 증가될 수 있다.
본 발명은, 불멸화되지 않고 시험관내 세포 배양 방법에 의해 150회 이상 복제될 수 있는 높은 증식 가능성을 가진 각질세포에 관한 것이다. 이는 약 1044의 세포 증식 계수를 초래한다. 상응하는 각질세포는 여전히 상처 치료에 유리한 특성을 보유한다.
본 발명에 따른 각질세포는 주로 제공자로 부터 분리된 각질세포이고, 시험관내에서 배양될 수 있는데, 이때 분리 및 초기 배양은 예를 들면 문헌[참조: Rheinwald and Green in 1975]에 기술된 방법에 따라 당업자에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 포피의 표피 부분으로 부터 분리된 각질세포에 관한 것이다. 사람 기원의 각질세포, 특히 부다페스트 조약에 따른 특허 절차를 위한 독일 브라운슈바이그 소재의 국제기탁기관[DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) GmbH]에 2001년 6월 27일자로 수탁번호 DSM ACC2514하에 기탁된 배양물 KC-BI-1의 각질세포가 바람직하다. 또한, 본 발명은 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC2514)로 부터 유래된 각질세포를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 본래의 배양물 KC-BI-1을 2차계대(subpassaging) 및/또는 2차클로닝(subcloning)에 의해 생성되고/되거나 될 수 있는 모든 세포 및 배양물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 각질세포의 배양은 각질세포 KC-BI-1에 관한 예(실시예 1)로써 기술된다. 실시예 1에 구체화된 복합 배지의 사용 및 영양공급 세포(feeder cell)의 사용, 바람직하게는 치사량이 방사선조사된 쥐의 3T3 섬유아세포의 사용이 상기 배양에 유리하다. 태아 송아지 혈청의 양은 2 내지 10% 이어야 한다. 영양공급 세포의 제조는 당업자에게 공지되었으며, 예를 들면 실시예 2에 기술된 과정에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 각질세포를 80%의 최대 컨플루언스에서 2차배양(subcultivation)하는 것이 특히 유리하다. 각질세포는 35 내지 38℃, 바람직하게는 37℃, 90% 초과, 바람직하게는 95%의 상대습도, 및 5 내지 9%의 CO2 포화도에서 배양할 수 있다.
실시예 1에 기술된 과정을 사용하는 경우, 포피의 표피 부분으로 부터 유래된 각질세포, 특히 사람 각질세포의 집단을 배가시키는 시간은 1 내지 2일이다(도 1). 당해 세포를 수회 계대(passage)에 걸쳐 실질적으로 일정한 복제 속도로 배양할 수 있다(도 2). 그러나, 본 발명은 각질세포 KC-BI-1에만 제한되지 않으며, 차라리 당업자는 적당한 조건하에서 청구범위 제1항 내지 제8항에 따른 임의의 각질세포를 이용하여 본 발명을 수행할 수 있다.
본 발명과 관련하여 "불멸화되지 않는"이란 표현은, 일차적으로 분리된 각질세포 및 배양된 각질세포가 자발적으로 형질전환되지 않고/않거나 당해 연구분야에서 공지된 분자생물학적, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 형질전환되지 않는다는 것을 의미한다. 후자는 세포를 예컨대 바이러스 인자 또는 서열, 화학적 돌연변이유발 물질을 사용하거나, 방사선조사에 의하거나, 또는 상이한 과정을 병용하여 처리하지 않는 것을 의미한다.
또한 "불멸화되지 않은" 각질세포는, 형질전환된 종양 세포주(Harle-Bachor and Boukamp, 1993)와 비교하여 또는 불멸화된 세포주, 바람직하게는 세포주 HeLa와 비교하여, 당해 각질세포가 텔로머라제(telomerase) 활성을 갖지 않거나 또는 텔로머라제 활성이 실질적으로 감소된 것을 의미한다(참조 도 3). 이는 또한 불멸화된 각질세포주 HaCat와 비교하여도 특히 틀림없다.
또한, "불멸화되지 않은"이란 표현은, 불멸화된 각질세포가 할 수 있는 것처럼, 상기 각질세포가 태아 송아지 혈청의 부재 및/또는 영양공급 세포의 부재 및/또는 표피 성장 인자, EGF의 부재하에서 복제될 수 없는 것을 의미한다[참조 문헌: Schoop et al., 1999].
또한, "불멸화되지 않은"이란 표현은 상기 각질세포가 세포 복제가 증가됨에 따라 이의 특징적 표현형을 변화시키지 않는 것을 의미한다(참조 도 4).
또한, "불멸화되지 않은"이란 표현은 상기 각질세포가 누드 마우스, 바람직하게는 BALB/c 상에 이식된 후 정상적 분화 양상을 나타내는 것을 의미한다. 본원에서 "정상적 분화 잠재능"이란 상기 각질세포가 자가 각질세포와 동일한 방법으로 말단-분화된 각질세포로 발달하고 기저위(suprabasal) 표피층 및 각질을 형성할 수 있는 능력을 의미한다.
또한, 본 발명은 불멸화되지 않고 시험관내 세포 배양 방법에 의해 200회 이상 복제될 수 있는 각질세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 불멸화되지 않고 시험관내 세포 배양 방법에 의해 250회 이상 복제될 수 있는 각질세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 불멸화되지 않고 시험관내 세포 배양 방법에 의해 300회 이 상 복제될 수 있는 각질세포에 관한 것이다.
본 발명은 유리하게도 상기 각질세포가 단지 1명의 제공자 또는 단지 몇명의 제공자로 부터 복제될 수 있도록 한다. 1회의 제공으로 부터 출발하여, 예를 들면 150회 세포 복제 후 1044개 세포, 250회 세포 복제 후 1077개 세포, 및 300회 세포 복제 후 1090개 세포가 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 최초로, 일정하고 확인가능한 성질의 생물학적 활성 상처 치유 응집체의 제조를 위한 다량의 표준화된 세포 물질을 제조할 수 있게되었다. 표준화된 세포 물질의 상응하는 양이 예를 들면 냉동보존된 세포 은행으로 부터 출발하여 복제될 수 있고, 이는 또한 본 발명에 따른 특성을 갖는 각질세포로 부터 생성된다.
생물학적 활성 상처 치유 드레싱을 제조하기 위한 출발 물질로서 표준화된 세포 물질을 사용함으로써, 각질세포의 분리가 몇몇 제공자, 바람직하게는 1명의 제공자로 제한되기 때문에, 수여자에게 가능한 감염 위험성이 또한 감소된다.
따라서, 본 발명은, 현재 지금까지 공지된 각질세포의 제한된 계대로만 이루어진 심각한 단점을 극복한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 각질세포로 피복된 운반체로 이루어진 제품에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위한 "피복된"이란 운반체의 표면이 본 발명에 따른 각질세포로 부분적으로 또는 전적으로 콜로니화된 것을 의미한다. 운반체를 상처 치유에 사용하기 전에 보다 짧은 배양 시간이 요구되기 때문에, 부분적으로 콜로니화된 운반체가 특히 적합하다.
본 발명의 목적을 위해 적합한 운반체는 약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 생체적합성 운반체이다, 예를 들면 문헌[WO 91/13638]에 기술된 바와 같은 소수성 생체적합성 운반체 물질이 사용될 수 있다. 그러나, 주로 친수성을 갖는 운반체 물질을 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 에스테르화된 하이알루론산의 중합체로 이루어진 운반체 물질의 용도를 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, 한정된 기하학적 배열의 천공된 중합체 박막으로 이루어진 에스테르화된 하이알루론산의 중합체가 사용된다. 당해 중합체 박막은 예를 들어 10 내지 500㎛의 두께를 가지며, 10 내지 1000㎛로 측정되는 세공으로 천공되고, 당해 세공은 한정되고 일정한 크기를 가지며, 50 내지 1000㎛의 일정한 간격으로 서로 분리된 정연한 열을 형성한다. 이러한 종류의 박막은 문헌[EP 0 462 426]에 기술되어 있다. 천공된 운반체 물질이 특히 적합한데, 이들이 생물학적 활성 상처 드레싱이 임의의 특정 방향으로 상처에 놓여질 것을 요구하지 않기 때문이다. 실시예 3은 예로서 본 발명에 따른 각질세포에 의해 콜로니화된 한정된 기하학적 배열의 에스테르화 하이알루론산의 천공된 운반체 매트릭스의 제조를 기술한다. 운반체 매트릭스는 제조원[Messrs Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Abano Terme, Italy]에서 제조되어 "Laserskin"이란 제품명으로 독일에서 판매되는 제품이다.
각질세포와 함께 생물학적 활성 상처 드레싱을 제조하기 위한 이러한 운반체 물질의 특히 바람직한 적합성이 동물 모델[참조: Lam et al., 1999] 및 사람[Harris et al., 1999]에서 이미 증명되었다. 상피 세포의 개선된 이동성 및 분화와는 별개로, 하이알루론산 에스테르로 이루어진 매트릭스는 혈관생성 및 콜라겐 생성에 대해 양성 효과를 가진다. 그러나, 현재 매트릭스로서 하이알루론산 에스테르와 함께 사용되는 상처 드레싱은 자가 각질세포 및/또는 각질 세포 및 섬유아세포로 부터 수득된 복합 구조의 피부 등가물로 피복된다. 따라서, 이들은 상기한 종래 기술의 단점을 겪는다. 이들 단점은 본 발명에 따른 유리한 동종이형 각질세포의 사용에 의해 특히 극복될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양은, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리뎁시펩티드, 폴리에테르에스테르, 폴리아미노산 또는 폴리포스파젠, 특히 폴리(L-락티드), 폴리(D,L-락티드), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌-카보네이트) 또는 폴리(디옥사논)으로 이루어진 재흡수가능한 중합체와 함께 본 발명에 따른 각질세포를 포함하는 제품에 관한 것이다. 이들 중합체는 천공되거나 천공되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 각질세포를 -20℃ 내지 -196℃의 온도, 바람직하게는 -180℃ 이하의 온도에서 각질세포를 냉동보존하는 방법에 관한 것이다. 상기 각질세포는 당업자에게 익숙한 표준 방법에 의해 동결될 수 있다. 특히 DMSO가 동해방지제(cryoprotectant)로서 사용될 수 있다. 또한, 기타 동해방지제, 예를 들면 글리세롤, 하이드록시에틸 전분 또는 상기 두개의 배합물, 및 이들과 DMSO와의 배합물을 사용할 수 있다. 적절한 방법이 문헌[WO 96/24018, US 5,891,617 또는 US 5,298,417]에 기술되어있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 각질세포를 이의 상응하는 운반체와 함께 -20℃ 내지 -196℃의 온도, 바람직하게는 -60℃ 내지 -80℃의 온도에서 냉동보존하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 각질세포로 피복된 운반체의 냉동보존에 관한 것이다. 냉동보존의 이점은 다량으로 수득된 생성물을 저장할 수 있으므로, 임상 사용 전에 무작위로 샘플링하여 특질의 균일성에 대해 조사할 수 있다는 것이다. 최종적으로, 저장을 통해 상처 치유 응집체가 의학 목적으로 단기간에 이용가능함이 확실시된다.
본 발명에 따른 적합한 동해방지제는, 예를 들면 7 내지 13% (w/w) 농도의 하이드록시에틸 전분이다. 그러나, DMSO 또는 글리세롤 뿐만 아니라 각종 동해방지제, 특히 하이드록시에틸 전분, DMSO 및/또는 글리세롤의 배합물을 사용할 수도 있다. 또한, 트레할로스를 동해방지제로서 사용할 수도 있다.
2 내지 5분 이내에 37℃로 부터 -5 내지 -10℃, 바람직하게는 -6 내지 -8℃로 온도를 급격히 감소시킨 후, 운반체 및 본 발명에 따른 각질세포를 포함하는 제품을 적당한 온도에서 15 내지 30분, 바람직하게는 23 내지 26분 동안 평형화시킨다. 이어서, 당해 제품을 1℃/분 미만, 바람직하게는 0.2 내지 0.6℃/분, 가장 바람직하게는 0.4℃/분의 동결 속도로 예를 들어 -60 내지 -80℃의 온도로 냉각시킨다.
실시예 4는, 예로서 KC-BI-1로 피복된 하이알루론산 에스테르의 운반체 매트릭스의 냉동보존을 기술한다. 그러나, 다른 냉동보존 방법, 예를 들면 문헌[WO 95/707611, WO 96/24018, EP 0?296?475]에 기술된 방법을 사용할 수 있다; 상기 리 스트는 포괄적인 것으로 간주되어서는 아니되며, 단지 생체적합성 운반체 및 각질세포로 이루어진 제품을 냉동보존하는 방법이 당업계의 현재 수준의 일부임을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 본 발명에 따른 각질세포 및/또는 본원에 기술된 상기 각질세포 및 운반체의 제품의 의학적 용도, 특히 이의 상처 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 태양은, 화상 및/또는 궤양의 치료에 있어서 본 발명에 따른 각질세포 및/또는 상기 각질세포 및 운반체의 제품의 용도에 관한 것이다. 치료될 수 있는 화상은 바람직하게는 2도 화상이며, 치료될 수 있는 궤양은 바람직하게는 하퇴궤양(Ulcus cruris), 바람직하게는 하퇴정맥궤양(Ulcus cruris venosum) 또는 당뇨병성 궤양 유형의 치료하기 곤란한 하퇴의 만성 궤양, 및 욕창성 궤양이다.
당해 의학적 용도는, 상처 치유에 유익한 효과를 갖는 것으로 당업계에 공지된 통상의 치료제와, 상기 각질세포 및/또는 본 발명에 따른 각질세포 및 운반체로 이루어진 제품의 복합 및/또는 보충 용도를 포함한다. 이는 상처 치유에 유익한 효과와 하나 이상의 기타 물질(들)의 복합 및/또는 보충 용도를 의미한다. 하이드로콜로이드 드레싱을 사용한 하퇴정맥궤양의 보충 및/또는 복합 치료 및/또는 항미생물성 물질의 추가적 사용, 예를 들어 항생물질의 투여가 언급될 수 있다.
또한, 본 발명은, 상처 치료, 특히 화상 및/또는 궤양, 예를 들면 2도 화상, 하퇴(정맥)궤양, 당뇨병성 궤양 또는 욕창성 궤양의 치료를 위한 본 발명에 따른 각질세포 및/또는 생체적합성 운반체 및 상기 각질세포의 제품에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 각질세포 및/또는 각질 세포 및 운반체를 포함하는 본 발명에 따른 제품을 치료하고자 하는 상처에 위치시킴을 특징으로 하는, 상기 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 각질세포 및 제품은 냉동보존하지 않고 바로 사용하거나 냉동보존 후 사용할 수 있다. 상처를 치료하는 상응하는 방법은 실시예 5에 기술되어 있다.
도 1: 배양 시간의 함수로서의 각질세포 KC-BI-1의 세포 복제. 이는 94일의 배양 기간에 걸친 각질세포 KC-BI-1의 세포 복제 회수(CPD = 누적 집단 배가)를 보여준다. 94일의 관찰 기간 이내에 세포들은 약 75배 배가된다. 이는 세포 복제당 1.25일 또는 10일당 12.5의 평균 배가 시간에 해당한다.
도 2: 10개월의 기간에 걸친 각질세포 KC-BI-1의 배가. 이는 1 내지 67회의 세포 계대 함수로서 집단 배가(PD)로서 주어진, 10개월에 걸친 각질세포 KC-BI-1의 세포 복제를 보여준다.
도 3: 상대적 텔로머라제 활성의 측정. 이는 세포주 HeLa의 활성과 비교된, 1, 12, 18, 40 및 57회 계대 후의 각질세포 KC-BI-1의 상대적 텔로머라제 활성을 보여준다. 당해 도면은 불멸화된 세포주 HeLa와 비교하여, 각질세포 KC-BI-1의 텔로머라제 활성이 거의 존재하지 않거나 단지 약하게 존재함을 보여준다.
도 4: 5 및 60회 계대 후 각질세포 KC-BI-1의 형태학. 광학 현미경하에서 관측했을때, 각질세포 KC-BI-1는 5회 세포 계대 (배양 시간 25일)과 60회 세포 계 대 (배양 시간 300일)간에서 어떠한 형태학적 차이도 나타내지 않는다.
실시예 1: 예로서 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC2514)을 이용하는 본 발명에 따른 각질세포를 배양하는 방법
1. 재료
각질세포 KC-BI-1; 방사선조사된 3T3-쥐 섬유아세포 (영양공급 세포, 제조에 대해서는 실시예 2 참조); 세포 배양 배지 K/1 (조성은 하기 참조); EDTA (0.02%); 트립신/EDTA (0.05%/0.01%); 세포 배양 플라스크 (T-플라스크): 25　cm2, 80　cm2, 175　cm2.
2. 세포의 해동
2.1 영양공급 세포의 해동
당해 세포를 신속히 해동시키고 5 내지 10ml의 예비가열된 K/1 배지에 두었다. 영양공급 세포의 상응하는 양을 적당한 세포 배양 플라스크로 옮기고, K1/배지로 덮었다:
25cm2 T-플라스크 0.5x106 개의 세포 배지의 최종 용적: 5 내지 6ml
80cm2 T-플라스크 1.5x106 개의 세포 배지의 최종 용적: 20ml
175cm2 T-플라스크 3.5x106 개의 세포 배지의 최종 용적: 50ml
영양공급 세포는 즉시 또는 24시간 이내에 사용될 수 있다.
2.2 각질세포의 해동
당해 세포를 신속히 해동시키고 5 내지 10ml의 예비가열된 K/1 배지에 두었다. 상응하는 양의 세포를 이미 영양공급 세포를 함유하는 세포 배양 플라스크속에 첨가하고, 신선한 배지로 덮었다:
25cm2 T-플라스크 0.15x106 개의 세포; 배지의 최종 용적: 6 내지 10ml
80cm2 T-플라스크 0.4x106 개의 세포; 배지의 최종 용적: 20ml
175cm2 T-플라스크 1x106 개의 세포; 배지의 최종 용적: 50ml
3.0 배양
당해 세포를 35 내지 39℃, 바람직하게는 37℃에서 항온처리한다. 상대습도는 90% 초과, 바람직하게는 95%이고, CO2 농도는 5 내지 9%이다. 각질세포를 80%의 최대 컨플루언스에서 2차배양한다.
이를 위하여, 세포 배양 상청액을 폐기한다. 영양공급 세포를 0.02% EDTA(2 내지 10ml)로 3회 세척하고, 5 내지 10분간 37℃에서 항온처리한 다음, 가볍게 두드려서(또는 흔들어서) 배양 플라스크로 부터 분리시킨다. 이어서, 각질세포를 트립신/EDTA (0.05%/0.01%, 1 내지 6ml)으로 5 내지 10분간 37℃에서 처리하고, 가볍게 두드려서 조심스럽게 분리시킨다. 필요한 경우, 잔존 세포를 세포 스패툴라(spatula)를 사용하여 조심스럽게 긁어낸다. K/1 배지를 첨가하여 트립신/EDTA 용액을 중화시키고, 조심스럽게 위 아래로 피펫팅하여 당해 세포를 분리한다. 당해 세포를 상기 2.2 항목에서 특정된 세포 수로 시딩한다. 당해 세포 배양 배지 K/1을 3일째에 교체하고, 이후 2일 마다 교체한다.
4.0 K/1 배지의 제조
모든 성분 및 원액(stock solution)을 하나씩 표 1에 주어진 순서로 합한다. 당해 혼합물을 WFI(주사용 수)를 사용하여 최대 1리터로 만든다. 이어서, NaOH 또는 HCl를 사용하여 pH를 7.0 내지 7.2로 조정한다. 삼투몰농도는 320 내지 400?mOsm/kg 이어야 한다. 최종적으로, 배지 K/1를 멸균-여과시킨다.
4.1 원액의 제조
트리요오도티로닌
트리요오도티로닌 13.6mg을 1ml의 0.1 NaOH중에 용해시키고, 99ml의 PBS를 이에 첨가한다. 완성된 용액을 PBS로 1:100으로 희석시킨다. 이 용액 1ml가 배지 리터 당 요구된다.
EGF
1mg의 EGF를 100ml의 WFI중에 용해시킨다. 이 용액 1ml가 배지 리터당 요구된다.
rh-인슐린 (pH <4.0에서만 가용성)
5g의 rh-인슐린을 0.9L의 WFI에 첨가하고, 6M HCl를 사용하여 pH를 2.5로 조정한다. rh-인슐린을 용해시킨 후, 1M NaOH를 사용하여 pH를 8.0로 조정한다. 당해 혼합물을 WFI를 사용하여 최대 1리터로 만든다. 이 용액 1ml가 배지 리터당 요구된다.
4.2 배지의 조성
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그러나, 당해 세포는 또한 신선한 생검 재료, 예를 들면 포피의 표피 부분으 로 부터 배양될 수 있다. 미분화된, 증식성 각질세포의 1차 분리를 문헌[참조: Rheinwald and Green in 1975]에 기술된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
사용된 영양공급 세포는 예를 들면 실시예 2에 기술된 세포일 수 있다. 기타 치사 섬유아세포, 바람직하게는 기타 쥐 섬유아세포, 가장 바람직하게는 세포주 3T3의 자손을 사용하는 것을 생각할 수 있다.
실시예 2: 각질세포를 배양하기 위한 방사선조사된 3T3 영양공급 세포의 제조
1. 재료
국제기탁기관[American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA]으로 부터 수득될 수 있는 쥐 3T3 섬유아세포(예: ATCC CCL 92, 3T3-스위스 알비노(Swiss albino), 접촉-억제된 섬유아세포), DMEM+10% 태아 송아지 혈청 (FCS); PBS; 0.2% 트립신 용액; 0.04% EDTA 용액; 세포 배양 플라스크 (T-플라스크): 25cm2, 80cm2, 175cm2.
2. 세포의 해동
당해 세포를 신속히 해동시키고, 5 내지 10ml의 예비가열된 배지에 가한다. DMSO-함유 배지를 원심분리 후 제거한다. 당해 세포를 5 내지 10ml의 배지중에 현탁시킨다. 세포 수를 측정한 후, 세포를 103 내지 104개의 세포/cm2의 밀도로 적당한 세포 배양 플라스크속에 시딩한다. 이들을 35 내지 39℃, 바람직하게는 37℃에 서 항온처리한다. 상대습도는 90% 초과, 바람직하게는 95%이고, CO2 농도는 5 내지 9%이다.
3. 세포 배양
당해 세포의 성장을 매일 검사한다. 세포 밀도는 70 내지 80%의 최대 컨플루언스를 초과해서는 안된다. 2차배양은, 필요에 따라, 2 내지 4일마다 수행한다. 이를 위하여, 배지를 폐기하고, 당해 세포를 EDTA와 트립신의 1:2 혼합물의 적당한 양(0.5 내지 5 ml)으로 세척한다. 이어서, 분리된 세포를 3.5 내지 20ml의 배지중에 넣는다. 당해 세포를 103 내지 104 개의 세포/cm2의 밀도로 재-시딩한다.
4. 영양공급 세포의 방사선조사
영양공급 세포에 약 60 Gy (137Cs 공급원 중 6000 rad)의 선량을 조사한다.
조사된 세포와 조사되지 않은 세포 모두를 표준 방법을 사용하여 액체 질소속에 냉동보존하여 장기간 동안 저장할 수 있다.
실시예 3: 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC2514)로 부터의 각질세포를 사용하여 운반체 매트릭스, 이 경우에는 레이저스킨(Laserskin)을 피복하는 방법
본 발명에 따른 생물학적 활성 상처 치유 드레싱의 제조에 대해 이하에서 예로서 기술된다. 본원에서 기술된 상처 치유 드레싱은 본 발명에 따른 각질세포 KC-BI-1 및 레이저스킨, 즉 하이알루론산 에스테르의 생체재흡수가능 운반체 매트릭스로 이루어진다.
그러나, 본 발명은 본원에 기술된 배합물로 제한되지 않는다. 차라리, 청구범위 제1항 내지 제8항에서 인용된 신규한 특성을 갖는 모든 각질세포가 피복에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 생체적합성 운반체 매트릭스라면, 기타 적합한 운반체 매트릭스도 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[WO 91/13638]에 기술된 소수성 생체적합성 운반체 물질이 사용될 수 있다. 반면, 주로 친수성 특성을 가진 운반체 물질이 사용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양은, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리뎁시펩티드, 폴리에테르에스테르, 폴리아미노산 또는 폴리포스파젠, 특히 폴리(L-락티드), 폴리(D,L-락티드), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌-카보네이트) 또는 폴리(디옥사논)으로 이루어진 재흡수가능한 중합체와 함께 본 발명에 따른 각질세포를 사용함을 포함한다.
1. 재료
K/1 배지 (참조 실시예 1); PBS, 0.04% EDTA (PBS를 사용하여 0.02%로 희석 ); 트립신/EDTA (0.05%/0.01%); 멸균 Roux 디쉬 (T 25 cm2, T 80 cm2, T 175 cm2,), 144x21 페트리 디쉬 (145cm2 표면적)내의 레이저스킨 (Messrs. Fidia Advanced Biopolymers srl, Abano Terme, Italy) ; 3T3 영양공급 세포; 본 발명에 따른 각질세포 (예: KC-BI-1).
2. 생물학적 활성 상처 치유 드레싱의 배양
2.1. 재료
방사선조사된 영양공급 세포, 예를 들면 실시예 2에서 언급된 쥐 3T3 섬유아세포; 원액으로 부터의 본 발명에 따른 각질세포; 페트리 디쉬내의 8.5cm x 8.5cm 크기의 레이저스킨 (완성 제품); K/2 배지.
2.2. 3T3 영양공급 세포의 시딩
실시예 2에 따라 제조된 영양공급 세포를, 약 15,000 내지 25,000개 세포/cm2 (대략적으로 3x106개 세포/페트리 디쉬)의 시딩 밀도로 레이저스킨 상에 둔다. 이어서, 당해 페트리 디쉬를 90% 초과의 상대 습도 및 5 내지 11%의 CO2하에 35 내지 37℃에서, 바람직하게는 7 내지 9% CO2하에 37℃에서 항온처리한다. 각질세포를, 동일한 날 또는 가장 최근의 다음날(24 시간 후)에 영양공급 세포 층 상에 시딩한다.
2.3. 각질세포의 시딩 및 배양
생물학적 활성 상처 치유 드레싱을 본 발명에 따른 각질세포를 이용하여 제조한다. 각질세포의 2차배양은 예를 들어 아래와 같이 수행할 수 있다.
서브컨플루언스 배양물을 0.02% EDTA 로 1회 세척한다 (80cm2 Roux 디쉬: 8　mL; 175cm2 Roux 디쉬: 10ml). 이어서, 영양공급 세포를 0.02% EDTA와 함께 5 내지 10분간 37℃에서 항온처리하고(80cm2 Roux 디쉬: 8 mL; 175 cm2 Roux 디쉬: 10ml), 조심스럽게 진탕하여 분리시킨다.
각질세포를 실시예 1에서와 같이 트립신/EDTA 혼합물 (0.05%/0.01%) (80cm2 Roux 디쉬: 2 내지 3 mL; 175cm2 Roux 디쉬: 5 내지 6?ml)로 용해시킨 다음, 세포 배양 배지 (80cm2 Roux 디쉬: 7 내지 8 mL; 175cm2 Roux 디쉬: 14 내지 15?ml)속에 넣고, 조심스럽게 위 아래로 피펫팅하여 분리한다.
본 발명에 따른 각질세포를, 영양공급 세포가 제공된 레이저스킨(Laserskin) 박막에 약 15,000 내지 25,000개 세포/cm2(대략적으로 3x106 개의 세포/페트리 디쉬에 상응함)의 시딩 밀도로 적용한다. 이어서, 당해 세포를 30 내지 100% 컨플루언스, 바람직하게는 80 내지 100% 컨플루언스 까지, 35 내지 39℃, 바람직하게는 37℃에서 항온처리한다. 상대 습도는 90% 초과, 바람직하게는 95%이고, CO2 농도는 5 내지 9%이다.
실시예 4: 본 발명에 따른 생물학적 활성 상처 치유 드레싱을 냉동보존하는 방법
각질세포가 30 내지 100%, 바람직하게는 80 내지 100%의 컨플루언스로 운반체 매트릭스상에 콜로니화한 후, 본 발명에 따른 제품을 적당한 용기, 예를 들면 열-봉합가능한 PP 백속에서, 통제된 조건하에 동결시킬 수 있다. 이를 위하여, 배양 배지를 조심스럽게 제거하고, 2 내지 6℃에서 20ml의 K/2 동결 배지로 대체한다. 이어서, 당해 제품을 멸균 조건하에 패키징하고, 아래의 절차에 따라 동결시킨다:
2 내지 5분간 온도를 -5 내지 -10℃, 바람직하게는 -6 내지 -8℃로 급격히 낮춘 후, 당해 제품을 상응하는 온도에서 15 내지 30분간, 바람직하게는 23 내지 25분간 평형화시킨다. 이어서, 당해 제품을 1℃/분 미만, 바람직하게는 0.2 내지 0.6℃/분, 가장 바람직하게는 0.4℃/분의 동결 속도로 예를 들어 -60 내지 -80℃의 온도로 냉각시킨다.
K/2 동결 배지:
7 내지 13% (w/w)의 하이드록시에틸 전분과 혼합된 K/1 성장 배지 (참조 실시예 1).
실시예 5: 상처, 예를 들면 정맥성 하퇴 궤양을 보호하기 위하여 본 발명에 따른 각질세포로 콜로니화된 운반체 매트릭스의 사용 예
1. 새로이 제조된 상처 치유 드레싱의 수송
각질세포를 레이저스킨 상에서 30 내지 100%, 바람직하게는 80 내지 100% 컨 플루언스로 성장시킨 후, 당해 배양물을 적당한 양, 바람직하게는 30?ml의 K/3 수송 배지로 1회 이상 세척한다. 생물학적 활성 상처 치유 드레싱을 적당한 양, 바람직하게는 20ml의 K/3 수송 배지로 수송한다. 페트리 디쉬의 헤드룸을 5 내지 10% CO2의 혼합 공기로 잠시 채우로, 접착 테이프(예: Parafilm)으로 봉합하고, 즉시 수송 박스로 진료소에 운반한다.
K/3 수송 배지:
태아 송아지 혈청(FCS)이 존재하지 않는 성장 배지 K/1(참조 실시예 1). 그러나, 포스페이트-보레이트(예: PBS)를 기본으로 하거나, HEPES (N-2-하이드록시에틸피페라진-N'2-에탄설폰산) 또는 MES([2-N-모르폴리노]에탄설폰산)을 기본으로 하는 간단한 생리학적 염수 용액을 또한 사용할 수 있다.
2. 냉동보존된 상처 치유 드레싱의 수송
냉동보존된 상처 치유 드레싱을 전형적으로 드라이 아이스상에서 공급할 수 있다. 그러나, 상처 치유 드레싱이 -60℃ 이하의 온도에서 수송된다면, 다른 수송 형이 사용될 수 있다. 냉동보존된 상처 치유 드레싱을 신속히 해동시킨다. 이어서, 동결 배지를 제거하고, 당해 드레싱을 K/3 수송 배지 (상기 참조) 또는 또 다른 적합한 생리학적 용액, 예를 들면 링거액으로 1회 이상 세척한다.
3. 치료학적 용도
이후, 당해 드레싱을 상처 위에 놓는다. 비-천공된 운반체 매트릭스를 사용하는 경우, 상처 치유 드레싱은 상처쪽을 향하는 세포와 정확하게 위치되어야 한다. 각질세포가 운반체(예: 레이저스킨)의 양쪽면을 콜로니화시킬 수 있도록 해주는 천공된 운반체를 사용한다는 것은, 본 발명에 따른 상처 치유 드레싱을 임의의 특정 방향으로 치료하고자 하는 상처 위에 놓을 필요가 없다는 것을 의미한다. 치료의 성공여부에 따라, 당해 치료를 수회 반복할 수 있다.
실시예 6: 각질세포 KC-BI-1 (DSM ACC2514)의 유전자 특징
KC-BI-1 세포를 상기한 본 발명에 따른 방법을 사용하여 수회 계대에 걸쳐 2차배양하였다. 이어서, 4회, 13회 및 121회 계대로 부터의 세포를 유전자 분석하여, 15개의 상이한 유전자좌 (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX 및 vWA)을 조사하였다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분석을 수행하였다. 이를 위하여, 부계를 판정하기 위한 시험 [PoewerPlexR16 System; 제조원: Messrs Promega (Mannheim, Germany)]을 제조자의 지침에 따라 사용하여 상응하는 대립형질유전자를 증폭시켰다. 당해 대립형질유전자를 단편 길이를 측정하여 확인하였다 (길이 표준 ILS 600는 상기 키트의 일부이다). 집단내의 대립형질유전자 빈도에 관한 데이터는 상응하는 표에서 찾아볼 수 있다.
분석을 통해, 분석된 모든 세포 계대에 있어서 모든 유전자좌에서 모든 대립형질유전자가 일치함이 밝혀졌다. 따라서, 당해 데이터를 통해, KC-BI-1 세포를 유전학적으로 분류할 수 있다. 99.999% 초과의 분류 확률이 대립형질유전자 빈도로 부터 측정되었다.
Figure 112004015721059-pct00002
문헌:
Figure 112004015721059-pct00003
Figure 112004015721059-pct00004

Claims (40)

  1. 불멸화되지 않으며 시험관내 세포 배양 방법에 의해 150회 이상 복제될 수 있는, 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC 2514)의 각질세포 또는 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC 2514)로부터 유래된 각질세포로서,
    ⓐ 태아 송아지 혈청, ⓑ 영양공급 세포(feeder cell), ⓒ 표피 성장 인자(EGF) 각각의 부재하에 복제될 수 없거나, 이들 ⓐ , ⓑ , ⓒ의 둘 또는 셋의 부재하에 복제될 수 없으며;
    Hela 세포주의 텔로머라제 활성이 100%일 때, 상기 각질세포의 텔로머라제 활성이 1.96%이하 이고;
    상기 배양물 KC-BI-1 (DSM ACC 2514)로부터 유래된 각질세포는 최초의 배양물 KC-BI-1을 2차계대(subpassaging), 2차클로닝(subcloning), 또는 이들 둘 모두를 수행함으로써 생성되거나 생성될 수 있는 세포 및 배양물임을 특징으로 하는 각질세포.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 시험관내 세포 배양 방법에 의해 200배 이상 복제될 수 있는 것을 특징으로 하는 각질세포.
  7. 제1항에 있어서, 시험관내 세포 배양 방법에 의해 250배 이상 복제될 수 있는 것을 특징으로 하는 각질세포.
  8. 제1항에 있어서, 시험관내 세포 배양 방법에 의해 300배 이상 복제될 수 있는 것을 특징으로 하는 각질세포.
  9. 제1항에 따른 각질세포로 피복되어, a) 각질세포로 부분적으로 콜로니화되거나 또는 b) 각질세포로 완전히 콜로니화된 운반체로 이루어진 제품.
  10. 제9항에 있어서, 운반체가 약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 생체적합성 운반체인 것을 특징으로 하는 제품.
  11. 제10항에 있어서, 운반체 물질이 소수성 또는 친수성 생물분해성 막인 것을 특징으로 하는 제품.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 운반체가 에스테르화된 하이알루론산의 중합체인 것을 특징으로 하는 제품.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 운반체 물질이 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리뎁시펩티드, 폴리에테르에스테르, 폴리아미노산 또는 폴리포스파젠이고,
    b) 상기 중합체는 천공되거나, 또는
    c) 천공되지 않는 것을 특징으로 하는 제품.
  14. 제1항에 따른 각질세포를 -20℃ 내지 -196℃의 온도에서 냉동보존하여, 당해 각질세포를 냉동보존하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, -20℃ 내지 -196℃의 온도에서 냉동보존하는 각질세포의 냉동보존 방법에 의해 처리된 각질세포.
  16. 제1항에 있어서, 의학용으로 사용하기 위한 각질세포.
  17. 제1항에 있어서, 상처 치료용 각질세포.
  18. 제17항에 있어서, 상처가 화상 및/또는 궤양인 각질세포.
  19. 제17항에 있어서, 상처가 2도 화상인 각질세포.
  20. 제17항에 있어서, 상처가 하퇴궤양(Ulcus cruris) 유형의 치료하기 곤란한 만성의 하퇴 궤양인 각질세포.
  21. 제17항에 있어서, 상처가 당뇨병에 의해 발병된 궤양인 각질세포.
  22. 제17항에 있어서, 상처가 욕창성 궤양인 각질세포.
  23. 제17항에 있어서, 상처 치유에 유익한 효과를 주는 하나 이상의 기타 물질에 대한 보충물로서 또는 이와 복합하여 사용하기 위한 각질세포.
  24. 제23항에 있어서, 기타 물질이 하이드로콜로이드 드레싱인 각질세포.
  25. 제23항에 있어서, 기타 물질이 (a) 항생물질을 포함하는 항미생물성 물질인 각질세포.
  26. 제12항에 있어서, 에스테르화된 하이알루론산의 중합체가 한정된 기하학적 배열의 천공된 중합체 박막이고, 이때 당해 중합체 박막은 10 내지 500㎛의 두께를 가지며, 10 내지 1000㎛로 측정되는 세공으로 천공되고, 당해 세공은 한정된 일정한 크기를 가지며, 50 내지 1000㎛의 일정한 간격으로 서로 분리된 정연한 열을 형성하는 것을 특징으로 하는 제품.
  27. 제14항에 있어서, 각질세포를 -60℃ 내지 -80℃의 온도에서 냉동보존하는 방법.
  28. 제9항 내지 제11항중의 어느 한 항에 따른 제품을 -20℃ 내지 -196℃의 온도에서 냉동보존하여, 당해 제품을 냉동보존하는 방법.
  29. 제9항 내지 제11항중의 어느 한 항에 있어서, -20℃ 내지 -196℃의 온도에서 냉동보존하는 제품의 냉동보존 방법에 의해 처리된, 각질세포와 운반체를 포함하는 제품.
  30. 제10항에 있어서, 의학용으로 사용하기 위한 제품.
  31. 제10항에 있어서, 상처 치료용 제품.
  32. 제31항에 있어서, 상처가 화상 및/또는 궤양인 제품.
  33. 제31항에 있어서, 상처가 2도 화상인 제품.
  34. 제31항에 있어서, 상처가 하퇴궤양(Ulcus cruris) 유형의 치료하기 곤란한 만성의 하퇴 궤양인 제품.
  35. 제31항에 있어서, 상처가 당뇨병에 의해 발병된 궤양인 제품.
  36. 제31항에 있어서, 상처가 욕창성 궤양인 제품.
  37. 제31항에 있어서, 상처 치유에 유익한 효과를 주는 하나 이상의 기타 물질에 대한 보충물로서 또는 이와 복합하여 사용하기 위한 제품.
  38. 제37항에 있어서, 기타 물질이 하이드로콜로이드 드레싱인 제품.
  39. 제37항에 있어서, 기타 물질이 (a) 항생물질을 포함하는 항미생물성 물질인 제품.
  40. 제13항에 있어서, 운반체 물질이 폴리(L-락티드), 폴리(D,L-락티드), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌-카보네이트) 또는 폴리(디옥사논)인 것을 특징으로 하는 제품.
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