KR101031305B1

KR101031305B1 - 마이크로ｒｎａ-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성증진용 조성물

Info

Publication number: KR101031305B1
Application number: KR1020080071891A
Authority: KR
Inventors: 박종배; 이승훈; 곽희진; 김태훈; 헌 유; 이동희; 박은경; 김혜진
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2011-04-29
Anticipated expiration: 2028-07-23
Also published as: WO2010010980A1; CN101951926A; JP5112516B2; JP2010534249A; US20110021601A1; CA2690828C; EP2187895B1; CN101951926B; CA2690828A1; KR20100010834A; US8883751B2; EP2187895A4; EP2187895A1

Abstract

본 발명은 방사선 민감성을 증진시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로RNA-21 저해제, 특히 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물, 및 이를 이용하여 마이크로RNA-21 발현 정도가 높은 상태의 암세포, 특히 신경교종세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

마이크로RNA-21, 방사선 민감성, 암, 안티센스 핵산분자, 안티올리고뉴클레오티드

Description

마이크로ＲＮＡ-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물{Composition containing microRNA-21 inhibitor for enhancing radiation sensitivity}

암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세에 있어 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.

방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량의 방사선 치료 시 정상조직의 손상 등이 방사선치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다. 따라서,방사선 치료의 효율을 증진시키기 위한 방사선 치료 민감제에 대한 연구가 시도되고 있으나, 현재까지 보고된 방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를 들어 탁솔(Taxol)과 시스플라틴(cisplatin) 등이 보고되어 있다.

또한, 항암제로서의 성질은 지니지 않고 방사선 치료에만 사용되는 방사선 치료효과 증진제로는 티라파자민(tirapazamine)이 있으나 저산소증의 종양세포에만 효과가 있으며, 저산소상태 특유의 종양 내부 압력 때문에 종양 조직 내부로의 약물전달이 미흡하여 임상적 방사선 치료에서 효과가 미약하다고 알려져 있다.

그러나, 상기와 같이 방사선치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들을 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 부작용, 즉, 방사선 치료부위의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있다.

특히, 중추신경계의 암은 성상세포(astrocyte)와 희돌기세포(oligodendrocyte) 같은 신경교(glia)를 포함한 다른 세포 계열로부터 발생한다. 성상세포종(astrocytic tumor, astrocytomas)은 인접한 미세환경과 어떻게 상호작용을 하는가에 따라 미만성 성상세포종(diffuse astrocytoma)와 국소성 성상세포종(localized astrocytoma)으로 나눌 수 있다. 국소성 성상세포종은 주위의 미세환경과 경계가 뚜렷한 증식과 제한적인 침윤 잠재성을 가지는 반면에 종양 등급(tumor grade)과는 상관없이 미만성 성상세포종은 peritumoral margin과 주된 종 양 형성부위로부터 먼 곳에서 세포침윤의 특성을 가지고 있다. 미만성 성상세포종(diffuse astrocytoma)은 astrocytoma(World Health Organization[WHO] grade ), anaplastic astrocytoma (WHO grade ), glioblastoma multiform (GBM, WHO grade ) 세 가지로 분류된다. 세 가지 등급의 미만성 성상세포종은 침윤 특성을 가지고 있으며 특히 GBM(신경교종)은 더 높은 증식률, 괴사와 저산소증, 혈관형성, 뇌의 지지구조에 높은 침윤 및 암 재발율이 높은 특성을 가지고 있고, 다른 조직으로의 전이가 용이하기 때문에 이들의 암 치료능을 높이기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만, 화학치료만으로는 한계가 있으며, 방사선 치료시에도 암세포가 방사선 저항성을 획득하게 되어 제대로 치료되지 않은 문제점이 있었다.

또한, 뇌종양 치료에 있어 수술적 치료 및 항암제 치료와 더불어 방사선 치료는 뇌종양 치료에 있어 중요한 치료법이다. 뇌종양 중 WHO grade 인 GBM 뇌종양 환자는 수술적 치료, 항암제 치료, 방사선 치료 또는 복합적인 치료 (e.g. 방사선 치료와 항암제 치료 또는 수술적 치료와 방사선 치료)에도 불구하고 예후 (암 재발)가 좋지 않으며 평균 생존율이 1년이며 5년 생존율은 5% 미만이다. 뇌종양 치료법 중 방사선 요법은 방사선에 의한 DNA 손상에 대하여 세포는 세포 주기를 지연 (DNA damage checkpoint)시키거나 세포사멸 (apoptosis)을 유도하여 비정상 세포를 제거하는 방법이다. 그러나 방사선 요법의 문제점은 암세포의 내재적인 방사선 저항성과 방사선 치료에 따른 내성증가로 인해서 방사선 저항성 암세포들이 암의 재발을 유발시키며 방사선 저항성 세포는 항암제에도 내성을 가진다.

따라서, 방사선에 대해서 내재적인 방사선 저항성을 가진 암세포의 방사선 민감성을 증진시키면서 부작용은 최소화되어 방사선 요법을 최적화할 수 있는 방사선 민감성 증진제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 마이크로RNA는 최근 다양한 암의 발생에서 발견된 작은 조절 RNA 분자이며 항암치료를 위한 새로운 표적으로 제안되고 있다. microRNA의 표적인 mRNA를 감쇠(degradation)하거나 해독억제(translational repression)을 통해 음성적으로 조절함으로서 microRNA는 종양억제자(tumor suppressors)와 암유전자(oncogene)로 작용할 수 있다. 최근 microRNA 중 하나인 let-7의 방사선 저항성의 상관관계와 더불어 현재의 세포독성 치료를 증진시킬 수 있는 주요한 새로운 tool로 보고된 바 있다. 이에, 본 발명자들은 방사선 민감성 증진제 개발에 있어 유전자 조절 기전 중 전사 후 조절 기전(post-transcriptional regulation mechanism)에 중요한 역할을 하는 마이크로RNA에 중점을 두었다.

마이크로RNA-21은 거의 모든 사람의 GBM 표본에서 높은 수준의 발현을 나타내었으며 다양한 암 표본에서 microRNA-21의 과발현이 보고된바 있다. 이러한 보고는 마이크로RNA-21가 다양한 암의 암유전자(oncogene)로 작용하는 것을 제안하고 있으며, 또한, 마이크로RNA-21은 유방암, 대장암, 또 다른 암 세포주에서 세포사멸(apoptosis), 세포성장(cell proliferation), 세포이동(cell migration) 조절기능이 보고되었다. 그러나, 현재까지 상기 마이크로RNA-21 과발현과 방사선 저항성 의 상관관계를 밝혔거나, 마이크로RNA-21 저해제를 이용하여 방사선 민감성을 증진시키는 것과 관련된 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 마이크로RNA-21의 발현 수준과 세포의 방사선 저항성과의 상관 관계를 밝히고, 이를 통해 마이크로RNA-21의 저해제가 암 치료를 위한 방사선 요법에서 암세포의 방사선 민감성을 효과적으로 증진시킨다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 마이크로RNA-21 발현 정도가 높은 상태의 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "마이크로RNA-21 저해제"는 세포 내에서 마이크로RNA-21의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 마이크로RNA-21에 직접적으로 작용하거나 또는 마이크로RNA-21의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 마이크로RNA-21의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 마이크로RNA-21의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, 마이크로RNA-21의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 뜻한다.

마이크로RNA는 대부분 염색체상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha)등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태(precursor- miRNA, precursor form)로 바뀐 후 엑스포틴(exportin)에 의해서 핵을 빠져 나와 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 정도 길이의 성숙된 형태로 바뀌게 되고 이는 RISC (RNA interference silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다 (Nat Rev Mol Cell Biol 6, 376-385;2005). 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제는 이러한 마이크로RNA-21이 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 마이크로RNA-21의 발현 수준을 감소시키거나, 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 마이크로RNA-21 저해제는 마이크로RNA-21 저해활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다. 바람직하게는 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, 마이크로RNA-21에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이다.

본 발명에서 용어 "상보적인"은 뉴클레오티드 서열과 다른 뉴클레오티드 서열의 각 염기가 매치되는, 즉 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 경우를 의미한다.

본 발명에서 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 마이크로RNA-21 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 마이크로RNA-21의 프로세프 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능 을 저해시킬 수 있게 된다. 마이크로RNA-21 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 마이크로RNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 마이크로RNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전구체 마이크로RNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적이거나, 성숙 마이크로RNA 분자에 상보적일 수 있다. 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제의 타겟인 마이크로RNA21의 염기서열 정보는 미국국립보건원 유전자은행 (NIH GenBank) 및 miRBASE (http://microrna. sanger.ac.uk/) 등에서 유전정보를 얻을 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 마이크로RNA21, miRBASE (http://microrna. sanger.ac.uk/)의 허가번호, hsa-mir-21(전구체 형태로서 MI0000077(hsa-mir-21), 성숙 형태로서 MIMAT0000076(hsa-miR-21, 서열번호 2))이다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 마이크로RNA-21 핵산에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적일 수 있고, 이들 자체적으로 루프를 형성하여 루프를 형성하는 마이크로RNA-21 에도 결합할 수 있다.

또한, 본 발명의 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드 형태인 것이 바람직하며, 이들은 세포에 도입되었을 때, 마이크로RNA-21의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예 를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것 은 아니다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA-21 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4개 또는 5개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 15 내지 40 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된다.

한편, 본 발명의 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 안티센스 핵산 분자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스 쉘(shell))의 친핵성으로 인해 분열 세포 뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도 입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에서 이용할 수 있는 마이크로RNA-21 저해제로서, 마이크로RNA-21에 대한 siRNA, RNA 앱타머 및 리보자임 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 마이크로RNA-21 저해제로 이용할 수 있는 siRNA는 마이크로RNA-21에 특이적으로 작용하여 마이크로RNA-21분자를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 본 발명의 siRNA는 마이크로RNA-21 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 마이크로RNA-21에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 마이크로RNA-21 저해제로 이용할 수 있는 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체형태를 채택하는 능력에 의해 마이크로RNA-21과 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 마이크로RNA-21 저해제로 이용할 수 있는 리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 예를 들면 햄머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 테트라히메나 리보자임이다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어 "방사선 민감성 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암 치료시 병행처리되면 암세포의 방사선 민감성이 증진되어 암세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 낼 수 있게 된다.

본 발명의 마이크로RNA-21 저해제는 세포 내에서 마이크로RNA-21에 작용하여 이들의 발현율을 감소시키는 등, 마이크로RNA-21 기능을 저해함으로써 세포의 방사선 저항성을 낮추어 방사선에 대한 민감성을 증진시킨다. 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 데 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 마이크로RNA-21의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 모든 암세포에 적용이 가능하며, 바람직하게는 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선압, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병 등의 마이크로RNA-21 발현 정도가 높은 상태의 암세포에 적용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 신경교종에 적용가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 조성물은 세포주기 조절을 통해 방사선 민감성을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 마이크로RNA-21 저해제는 세포주기 조절 활성을 가지며, 특히, 이를 통해 방사선에 의한 세포 G2/M기의 어레스트를 증진시킴으로써 방사선 민감성을 증진시킬 수 있다. 진핵세포의 증식은 DNA합성 (Synthesis phase: S기)과 세포의 분열과정 (Mitosis phase: M기)이 주기적으로 반복됨에 따라 일어나며, 세포주기는 Gap1(G1), DNA 합성단계(S), Gap2(G2) 및 분열기(M)로 이루어진다. 세포분열을 끝낸 세포는 다시 G1기로 들어가는데 이 G1기는 세포 내 대사가 가장 활발한 시기로 대부분의 세포는 많은 시간을 G1기로 존재하게 된다. 정상세포는 G1기에서 외부에서 신호가 있으면 S기로 진입하며, G2기를 거쳐 세포분열을 일으켜 증식하고, 외부신호가 없으면 세포주기가 중단되어 G1기에서 오래 정지된 상태인 G0기로 존재한다. 반면, 암세포는 외부신호와는 상관없이 세포주기를 따라 DNA합성과 세포분열을 계속하면서 증식하게 되는데, 이러한 세포주기를 조절하면, 암세포의 증식을 억제할 수 있게 되는 것이다. 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제는 세포주기를 어레스트할 수 있는 조절 활성을 가지므로, 방사선에 의한 세포 어레스트 효과를 현저하게 증진시킬 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명자들은 microRNA-21의 발현과 방사선 저항성의 상관관계를 알아보기 위해서, U251세포를 이용하여 확립한 방사선 내성 세포주 RRC7, GBM cell line 인 U373, U87, 및 LN18에서 microRNA-21의 발현량을 알아보았다. 방사선 내성 세포주 RRC7의 경우 RRC7의 모세포주(parent cell line)인 U251과 비교 시 microRNA-21의 발현양이 1.6배 증가했음을 발견하였으며, GBM의 경우 정상세포인 astrocyte와 비교 시 U373과 U87 세포주는 microRNA-21의 발현양이 각각 4.7배 및 2배 과발현 되어져있는 것을 관찰하였다. 반면 LN-18 세포주의 경우 microRNA-21의 발현양이 0.3배 감소함을 확인하였다(도 1).

또한, 본 발명자들은 microRNA-21이 발현량과 방사선 저항성과의 연관성을 증명하기 위해서 방사선 내성 세포주 RRC7, U373, U87, LN18 세포주에서 집락형성 분석법(clonogenic assay)를 이용하여 방사선 저항성을 측정하였다. 또한 추가적으로 microRNA-21 발현양이 높은 유방암 세포 주, 폐암세포주, 자궁암세포주에서도 방사선 저항성을 측정하였다. 집락형성 분석법을 이용한 방사선 저항성 측정에서, RRC7는 모세포주군보다 방사선 저항성이 증가하였음 확인하였다. 또한 microRNA-21 발현양이 높은 GBM 세포주인 U373과 U87세포는 방사선 저항성이 높았으며 반면 microRNA-21의 발현양이 낮은 뇌종양세포주인 LN18은 방사선에 저항성이 낮았다. 이를 통해 microRNA-21의 과발현이 방사선 저항성에 밀접한 관계가 있음을 확인하였다(도 2).

또한, 본 발명자들은 microRNA-21 과발현을 통해 세포주기를 조절할 수 있는지를 알아보기 위해, U373 세포주의 내재적 microRNA-21의 기능을 anti-microRNA-21(서열번호 1) 이용하여 기능을 억제한 후, 방사선 조사한 결과, anti-microRNA-21(서열번호 1)을 처리한 실험군이 anti-microRNA-negative control을 형질도입한 대조군에 비해 방사선에 의한 세포주기 G2/M 어레스트를 증진시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

또한, 본 발명자들은 microRNA-21 과발현과 방사선 저항성의 상관관계에 착안하여, microRNA-21의 과발현으로 인한 microRNA-21 기능을 억제함으로써 세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는지를 확인하였다. 구체적으로 microRNA-21 발현양이 높은 GBM 세포주인 U373세포에 anti-mir-21를 U373 세포주에 형질도입 한 후 24 시간 뒤 각각 방사선 0, 1, 2, 및 4 Gy를 각 군에 조사하였다. 조사 후 2일마다 새로운 세포배양배지로 대체하였으며, 2주 동안 배양하였다. 그 결과 anti-mir-21 및 방사선을 처치하여 microRNA-21 기능을 억제시킨 실험군은 대조군에 비하여 방사선 민감성을 현저하게 증진시킨다는 것을 확인하였다(도 4).

이러한 실험 결과들을 통해, 마이크로RNA-21 저해체를 세포에 처리하여 세포 내의 마이크로RNA-21 기능을 억제함으로써 세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명의 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 마이크로RNA-21 저해제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 마이크로RNA-21 저해제, 예를 들어 안티센스 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암 세포 내로 도입되면, 마이크로RNA-21의 발현 수준을 낮추거나 활성을 저해함으로써, 방사선 민감성을 증진시키게 된다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 암 치료를 위한 방사선 요법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방사선 요법은 마이크로RNA-21 발현 증가로 인해 방사선 저항성이 증대될 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 마이크로RNA-21의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있으며, 바람직하게는 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선 압, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병 등의 마이크로RNA-21 발현 정도가 높은 상태의 암 치료에 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방사선 요법은 암세포에 본 발명의 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, 여기서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 특별하게는 오늘날 통상 사용하고 있는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미한다. 방사핵종에 의한 종양에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다. 조성물 투여 시기는 바람직하게는, 종양에 방사선을 조사하기 한 달 전까지는, 특히 10일 또는 일주일 전까지는 본 발명의 조성물 투여를 시작하는 것이 좋다. 추가적으로, 종양의 방사선 조사를 분별하고, 최초와 최후의 방사선 조사 기간 사이에 조성물의 투여를 지속하는 것이 유리하다. 투여되는 마이크로RNA-21 저해제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사량의 간헐성은 암의 종류, 그것의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 달라진다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 근접치료, 방사성 핵종 치료, 외부 빛살 방사선요법(external-beam radiation therapy), 온열치료(냉동절제 치료, 고열치료), 방사선 외과, 하전입자 방사선치료(charged-particle radiotherapy), 중성자 방사선 요법 및 광역동치료 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 암세포의 방사선 민감성을 증진시킴으로써 방사선 저항성이 증대되어 있는 다양한 암 치료시 방사선 요법의 효과를 증대시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 방사선 내성 세포 클론( clone ) 확립 및 뇌종양세포와의 마이크로RNA-21 발현량 비교

<1-1> 세포 배양

실험에 이용되는 세포들을 하기와 같은 방법으로 각각 배양하였다.

(1) 뇌종양 세포주로서, U87, U373, LN-18, 및 U251 를 각각 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, 미국), 페니실린 100 Unit/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 포함하는 DMEM 배지(WelGENE, 한국) 및 DMEM 배지 (GIBCO BRL, 미국)를 사용하여 습식조건, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

(2) 유방암세포주로서, MCF7 및 MB-MDA-231을 각각 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, 미국), 페니실린 100 Unit/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 포함하는 DEME 배지(WelGENE, 한국)를 사용하여 습식조건, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배 양하였다.

(3) 폐암세포주로서, A549는 10% fetal bovine serum FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, 미국), 페니실린 100 Unit/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 포함하는 RPMI 1640 배지(WelGENE, 한국)를 사용하여 습식조건, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<1-2> 방사선 내성 세포 클론 확립

방사선 내성 세포 클론을 확립하기 위해서 뇌종양 세포주 중 신경교종 세포인 다형성교아세포종(GBM) U251 세포를 이용하여 이들에게 방사선을 조사하여 생존하는 군집을 선택하여 클론을 분리해냈다. 구체적으로, U251 세포주가 70~80% 군집 도달 시 상온에서 ¹³⁷Cs gamma-ray source로 하는 GammacellElite 기계(dose rate : 3Gy/min)를 이용하여 3일 간격으로 3Gy씩 방사선을 조사하였다. 3일 간격으로 3Gy씩 방사선을 조사하여 생존하는 세포군을 수집 후 올바른 세포 배양접시에 일정 수의 세포를 배양하는 실험을 6개월까지 반복하여 방사선 내성 세포주를 분리하여 RRC7 라고 명명하였다.

<1-3> 뇌종양 세포주 및 방사선 내성 세포 클론( RRC7 )의 마이크로 RNA -21 발현량 비교

마이크로RNA-21의 발현수준이 방사선 내성 및 저항성과 연관성이 있는지를 알아보기 위해서 방사선 내성 세포 clone (RRC7)과 뇌종양세포주에서 microRNA-21의 발현량을 실시간 중합연쇄반응(real-time PCR)법으로 알아보았다.

또한, 뇌종양 세포들이 정상세포에 비해 마이크로RNA-21의 발현수준이 다른지를 확인하기 위해 정상세포인 성상세포(astrocyte) 및 뇌종양 세포 U87, U373 및 LN18의 마이크로RNA-21 발현량을 실시간 중합연쇄반응(real-time PCR)법으로 알아보았다.

구체적으로, 6 웰 플레이트에 세포가 70~80%의 군집을 이루었을 때, 세포배양 배지 제거 후 DBPS로 2번 씻어주었다. 씻어 준 후 세포에 TRI reagent (invitrogen, 미국) 처리하여 전체(total) RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 분리하는 방법은 다음과 같다. TRI reagent 1㎖을 처치한 후 핵단백질 복합체로부터 전체 RNA를 용출하기 위해서 상온에서 5분 동안 방치하였다. 방치 후 TRI reagent 1㎖당 유기용매 클로로포름 0.2㎖을 첨가한 후 15초 동안 손으로 강하게 흔들어준 후 상온에서 3분 동안 방치하였다. 원심 분리기를 이용하여 4℃, 12,000×g 조건으로 15분 동안 원심분리하여 전체 RNA 층을 수확하였다. 수확된 전체 RNA 층에 이소프로판올 0.5㎖을 처치하여 섞은 후 4℃, 12,000×g 조건으로 10분 동안 원심분리하여 총 RNA 펠렛을 얻은 후 75% Et-OH로 씻어 주었다. 75% Et-OH를 제거한 후 상온에서 펠렛을 건조한 후 DEPC-H₂O로 펠렛을 녹였다. 총 RNA의 용출 양(amount)과 질(quality)은 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 용출한 전체 RNA를 ㎕ 당 25ng로 희석하여 실시간 중합연쇄반응 실시하였다. 실시간 중합연 쇄 반응은 mirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion, 미국) 이용하여 성숙 microRNA-21 (mature microRNA-21) 발현량을 측정하였다. 실시간 중합연쇄 반응 조건은 95℃에서 10분 동안 변성한 후 연쇄반응 조건은 95℃에서 15초, 60℃에서 60초이며 40 cycle을 반응시켰다. 실시간 중합연쇄 반응은 ABI 7500 real time PCR 기계를 이용하여 모니터링하였다.

그 결과, microRNA-21 발현수준이 방사선 내성 세포 클론인 RRC7의 경우 모세포주인 U251보다 1.6배 증가해 있음을 확인하였고(도 1a), 뇌종양 세포주의 경우 정상세포인 성상세포(astrocyte)와 비교 시 U87과 U373은 각각 1.5배, 4.5배 과발현해 있음을 확인하였다. 반면 LN18 세포주의 경우 0.3배 감소해 있음을 확인하였다(도 1b).

실시예 2. 마이크로 RNA -21의 발현량에 따른 방사선 저항성 확인

마이크로RNA-21의 발현량에 따른 방사선 저항성과의 연관성을 증명하기 위해서 방사선 내성 세포주 RRC7와 뇌종양 세포주들 U251, U373, U87 및 LN18 세포에서 집락형성 분석법(clonogenic assay)을 이용하여 방사선 저항성을 측정하였다.

또한, 추가적으로 마이크로RNA-21 발현량이 높은 유방암 세포주, 폐암세포주, 자궁암세포주에서도 방사선 저항성을 측정하였다.

구체적인 집락형성 분석(clonogenic assay) 방법은 다음과 같다. 방사선 내성 세포주 RRC7, 뇌종양 세포주로서 U251, U373, U87 및 LN18, 유방암 세포주로서 MCF-7 및 MB-MDA-231, 폐암세포주로서 A549, 자궁암 세포주로서 HeLa 세포를 대수기(log-phase)에서 세포를 수확하여 새로운 세포배양 배지로 부유하였다. 부유 후 60-㎜ 세포배양접시에 각각의 군마다 triplicate로 100개의 세포를 접종하였다. 접종 후 24시간째에 방사선을 조사하였다. U373, U87, LN18 (뇌종양세포주), MCF-7 및 MB-MDA-231(유방암세포주), A549 (폐암세포주), HeLa (자궁암 세포주)의 경우 방사선은 0Gy (대조군), 2Gy, 4Gy 및 8Gy (실험군)로 나누어 조사하였으며 방사선 내성 세포 clone RRC7과 U251은 0Gy (대조군), 3Gy, 6Gy 및 9Gy (실험군)로 나누어 조사하였다. 방사선 조사 후 2일마다 새로운 세포배양배지로 대체하여 2주 동안 배양하였다. 군집(colony) 확인을 위해서 Diff-quik solution (Sysmex, 일본)을 이용하여 세포를 염색하였으며 50개 이상의 세포로 이루어진 콜로니를 카운팅했다.

그 결과, 세포의 내재적 마이크로RNA-21의 발현수준이 높은 경우, 방사선에 저항성도 높은 것을 확인하였다. 방사선에 내성이 있는 세포 클론 RRC7의 경우 U251 뇌종양 세포주보다 집락형성 분석에서 방사선 저항성이 높음을 확인하였다 (도 2a).

또한, 뇌종양 세포주에서 마이크로RNA-21 발현이 높은 세포주인 U373과 U87의 경우 마이크로RNA-21의 발현이 낮은 세포주인 LN-18 세포주에 비해 방사선에 저항성이 높음을 확인하였다(도 2b). 또한 다양한 세포주들 HeLa, A549 및 MCF7 세포들도 마이크로RNA-21의 발현 수준이 높은 뇌종양 세포주인 U373 및 U87과 비슷한 수준으로 방사선에 저항성이 높음을 확인하였다(도 2b).

상기 실험을 통해, microRNA-21 발현량이 방사선 저항성과 밀접한 상관관계가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 마이크로 RNA21 에 대한 안티올리고뉴클레오티드( anti - micro RNA -21)를 이용한 세포주기 G2 /M 구간 어레스트 ( arrest ) 증진효과 확인

뇌종양세포주에서 microRNA-21 발현량이 높은 U373세포에서 microRNA-21의 기능을 억제함으로 인해서 세포주기를 어레스트 하는지를 확인하기 위해서 anti-microRNA-21(서열번호 1)과 방사선를 이용하여 세포주기를 측정하였다.

microRNA-21의 기능을 억제하기 위하여 microRNA-21의 염기서열에 상보적인 염기서열을 가지는 anti-microRNA-21(서열번호 1)과 anti-microRNA-negative control (Dharmacon, 미국) 세포에 형질도입 하였다. 형질도입은 Cell Line Nucleofector kit T solution (Amaxa, 미국)을 사용하여 전기천공(electroporation)을 수행하였다.

구체적인 실험방법은 다음과 같다. 15㎖ conical tube에 분주하여 1,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 이렇게 모여진 세포는 DPBS를 이용하여 두 번 씻어준 후 90×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 100 ㎕의 T solution과 100 nM 농도로 anti-microRNA-21(서열번호 1)를 첨가해 주고 잘 섞은 후 Amaxa electroporator를 사용하여 전기천공을 수행하였다. 전기 충격 후 바로 10%의 FBS가 들어 있는 DMEM 배지 1 ml에 섞어 준 후에 37℃의 10%의 FBS가 들어 있는 DMEM 배지로 2×10⁵ 세포개수가 되도록 희석하여 각 군마다 triplicate로 하여 37℃의 세포배양배지가 첨가되어져 있는 60 mm 세포배양접시에 세포를 접종하였다. 대조군과 실험군은 세포 배양기로 옮겨져 24시간 배양 한 후 다음의 실험에 사용 되었다.

세포주기를 측정하기 위한 구체적인 실험방법은 다음과 같다. 24시간 배양 한 후 방사선량 8Gy를 조사하였다. 8Gy 조사 후 다시 대조군(0Gy)과 실험군은 세포 배양기로 옮겨져 24시간 배양 한 후 다음의 실험에 사용 되었다. 15㎖ conical tube에 분주하여 1,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 이렇게 모여진 세포는 DPBS를 이용하여 두 번 씻어준 후 ice cold DPBS 500㎕로 부유하였다. 부유한 세포를 ice cold 70% Et-OH 4.5㎖에 첨가 후 흔들어서 혼합하였다. 세포를 고정하기 위해서 4℃ 냉장고에서 16시간 동안 방치하였다. 방치 후 4℃, 1,500rpm, 15분 동안 세포를 원침하여 ice cold DPBS 두 번 씻어준 후 PI solution (Propidium Iodide 100㎍/㎖, DNase-free RNase 20㎍/㎖, 0.1% Triton X-100) 1㎖로 부유하여 37℃ 항온기에서 15분 동안 방치하였다. 방치 후에 4℃, 1,500rpm, 15분 동안 세포를 원침하여 ice cold DPBS 1㎖로 부유하였다. 부유하여 FACS tube로 세포를 옮긴 후 FACS Calibur (BD science, 미국)를 이용하여 세포주기 측정하였다.

그 결과, U373 세포주의 내재적 microRNA-21의 기능을 anti-microRNA-21(서열번호 1) 이용하여 기능을 억제한 후, 방사선 조사한 결과, anti-microRNA-21(서열번호 1)을 처리한 실험군이 anti-microRNA-negative control을 형질도입한 대조군에 비해 방사선에 의한 세포주기 G2/M 어레스트를 증진시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 4. 마이크로 RNA -21에 대한 안티올리고뉴클레오티드( anti - micro RNA -21)를 이용한 방사선 민감성 증진효과 확인

뇌종양세포주에서 microRNA-21 발현량이 높은 U373과 U87세포에서 microRNA-21의 기능을 억제함으로 인해서 방사선의 민감성 증진효과를 가지는지를 확인하기 위해서 anti-microRNA-21(서열번호 1)과 방사선를 이용하여 방사선 저항성을 측정하였다.

구체적인 실험방법은 다음과 같다. 15㎖ conical tube에 분주하여 1,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 이렇게 모여진 세포는 DPBS를 이용하여 두 번 씻어준 후 90×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 100 ㎕의 T solution과 100 nM 농도로 anti-microRNA-21(서열번호 1)를 첨가해 주고 잘 섞은 후 Amaxa electroporator를 사용하여 전기천공을 수행하였다. 전기 충격 후 바로 10%의 FBS가 들어 있는 DMEM 배지 1 ml에 섞어 준 후에 37℃의 10%의 FBS가 들어 있는 DMEM 배지로 1×10³ 세포개수가 되도록 희석하여 각군마다 triplicate로 하여 37℃의 세포배양배지가 첨가되어져 있는 60 mm 세포배양접시에 세포를 접종하였다. 대조군과 실험군은 세포 배양기로 옮겨져 24시간 배양 한 후 다음의 실험에 사용 되었다.

U373 및 U87에 anti-microRNA-21(서열번호 1)과 anti-microRNA-negative control을 형질도입 후, 방사선은 0Gy, 1Gy, 2Gy 및 4Gy로 나누어 조사방사선 조사 후 2일마다 새로운 세포배양배지로 대체하여 2주 동안 배양하였다. 군집(colony) 확인을 위해서 Diff-quik solution (Sysmex, 일본)을 이용하여 세포를 염색하였으며 50개 이상의 세포로 이루어진 콜로니를 카운팅하였다.

그 결과, U87과 U373 세포주의 내재적 microRNA-21의 기능을 anti-microRNA-21(서열번호 1) 이용하여 기능을 억제한 후, 방사선 조사한 결과, anti-microRNA-21(서열번호 1)을 처리한 실험군이 anti-microRNA-negative control을 형질도입한 대조군에 비해 방사선 민감성이 증진된 것을 확인할 수 있었다(도 4a 및 4b).

상기 실험들로부터 microRNA-21이 방사선 저항성과 밀접한 상관관계가 있음을 확인하였으며 anti-microRNA-21(서열번호 1)을 이용하여 방사선 민감성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 마이크로RNA-21 저해제, 특히 마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있으며, 기존의 항암제가 가지는 세포 독성 등의 부작용이 거의 없다.

이에, 본 발명에 따른 마이크로RNA-21 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 신경교종을 포함하여 마이크로RNA-21의 발현 수준이 높아 방사선 저항성이 증대된 암 치료를 위한 방사선 치료 증진제 개발에 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1a는 방사선 내성 세포 clone RRC7과 RRC7의 모세포주 U251과 microRNA-21의 발현량을 측정한 그래프이고, 도 1b는 뇌종양세포주 U87, U373, LN 18의 microRNA-21의 발현량을 측정한 그래프이다.

도 2a는 방사선 내성 세포 clone RRC7과 RRC7의 모세포주 U251에서 방사선 선량에 따라 방사선에 대한 생존율은 측정한 그래프이고, 도 2b는 U373, U87, LN18 (뇌종양세포주), MCF-7 및 MB-MDA-231(유방암세포주), A549 (폐암세포주), HeLa (자궁암 세포주)에서 방사선 선량에 따라 방사선에 대한 생존율은 측정한 그래프이다.

도 3은 anti-microRNA-21(서열번호 1)의 방사선에 의한 세포주기 G2/M 구간 어레스트 증진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4a 및 4b는 본 발명의 anti-microRNA-21(서열번호 1)를 이용하여 방사선 민감성 증진효과를 나타낸 그래프이다.

<110> national cancer center <120> Composition containing microRNA-21 inhibitor for enhancing radiation sensitivity <130> PA080340 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seqence of anti-microRNA 21 oligonucleotide <400> 1 tcaacatcag tctgataagc ta 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> mature sequence of hsa-miR-21 <400> 2 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims

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마이크로RNA-21 염기서열에 상보적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
마이크로 RNA-21에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머, 또는 리보자임을 포함하고, 상기 siRNA, RNA 앱타머, 또는 리보자임은 서열번호 1의 염기서열의 티민을 우라실로 치환한 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
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제2항에 있어서, 마이크로RNA-21 발현 정도가 높은 상태의 암세포의 방사선 민감성을 증진시키기 위한 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 방사선 민감성 증진용 조성물은 세포주기 조절 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항 또는 3항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.