KR101141733B1 - 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 형질전환 복제 소 및이의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 적중 및 도입 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 특정 질병에 대하여 내성을 가진 형질전환 복제동물의 생산방법 및 이 방법에 의해 생산된 복제동물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 광우병에 내성을 가지는 형질전환 복제 소의 생산방법은 소 유래의 체세포의 프리온을 코딩하는 유전자를 적중시켜 형질전환 체세포를 제작하고, 이를 소 유래의 탈핵 난자에 도입하여 프리온 유전자가 적중된 핵 이식란을 작제하여, 이를 대리모에 이식하여 광우병 내성 소를 생산하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제 소는 정상적인 프리온이 적중되어 광우병에 내성을 가지는 것을 특징으로 한다.
형질전환 복제소, 체세포 복제, 광우병, 프리온 유전자 적중, 광우병 내성
Description
도 1은 본 발명에서 프리온 유전자 적중을 위한 가능한 유전자 범위를 나타낸 것이다.
도2는 본 발명의 한 양태에 따른 프리온 유전자 적중 벡터의 작제 과정을 개략한 도이다.
도3은 본 발명의 한 양태에 따른 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도4는 본 발명의 한 양태에 따른 프리온 유전자 적중 벡터의 작제 과정을 개락한 도이다.
도5는 본 발명의 한 양태에 따른 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도6은 본 발명의 한 양태에 따른 푸로 저항성 유전자 및 프로모터를 포함하는 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도7은 본 발명의 한 양태에 따른 푸로 저항성 유전자를 포함하고 프로모터를 포함하지 않는 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도8은 본 발명의 한 양태에 따른 하이그로마이신 B 저항 유전자를 포함하는 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도9의 (A)는 본 발명의 한 양태에 따른 푸로 저항성 유전자 및 폴리A를 포함하는 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다. (B)는 본 발명의 한 양태에 따른 하이그로마이신 B, 프로모터 및 폴리A를 포함하는 프리온 유전자 적중 벡터의 작제도이다.
도10a의 (A)는 본 발명의 한 양태에 따른 프리온 적중 벡터로 적중된 세포주의 적중 여부를 PCR로 확인하기 위한 프라이머 작제에 대한 개략도이다. 도 10a의 (B)는 상기 (A)의 프라이머 1#을 이용하여 PCR한 결과를 나타낸 것이다. 도 10b의 (C)-1는 프라이머 2# 및 3#의 위치 및 서열을, (C)-2는 상기 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 10c의 (D)-1는 프라이머 4#의 위치 및 서열을, (D)-2는 상기 프라이머 4#을 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도11은 본 발명의 한 양태에 따른 적중 벡터로 적중된 세포의 적중 여부를 확인하기 위해 제작된 프라이머의 검증하기 위해 상기 유전자 적중 벡터를 주형으로 한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도12는 본 발명의 한 양태의 프리온 적중 벡터로 적중된 소의 섬유아세포 세포를 대상으로 상기 도11의 프라이머 쌍을 이용하여 PCT 분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도13은 상기 도12에서 PCR에 의해 적중이 확인된 세포를 다시 한번 검증하기 위하여 PCR 서던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.
도14는 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 수핵 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다.
도15는 탈핵 과정으로 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 것이다.
도16은 본 발명에서 사용되는 고정용 피펫과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다.
통상적으로 프리온 질병(Prion disease)은 사람 및 동물 모두의 신경계에 영향을 미치는 서로 밀접하게 연관된 전염병으로 인식되고 있다. 인간 및 포유동물에서 뇌의 스폰지양 병변(spongiform encephalopathy)이 보고 된(Prusiner, 1991; Cunninham, 1992) 이후로 프리온은 치명적이고 지속적인 퇴행성 신경증을 야기한다고 보고 되었다 (Prusiner et al. 1994). 동일한 병인으로 각 동물에서 발병되는데, 면양 및 산양의 스크래패(scrapie), 인간의 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt Jakob disease; CJD) 및 그 변종, 밍크의 전염성 뇌염(transmissible encephalopathy of minks), 사슴의 만성 소모성질환(chronic wasting disease of deer), 고양이 해면양뇌증(feline spongiform encephalopathy), 산양, 명주원숭이(marmosets), 마우스 및 타조에서 프리온 질병이 발생된다고 보고된 바 있다 (Prusiner, 1998).
특히, 소에서 발병하는 프리온 질병인 광우병(Bovine Spongiform Encephalopathy)은 잠복기가 매우 길며 치사율이 100%에 이른다 (Stekel et al. 1996). 주로 3~5년령의 소에서 발현되나 20개월령부터 15년령까지 발생되는 것으로 알려져 있다 (Stekel et al. 1996).
주요 임상증상으로는 광폭한 행동, 지각과민 및 운동실조, 소리나 접촉에 과민한 행동, 발길질 증가, 귀의 과대운동 및 털 핥기, 보폭의 감소 및 만곡성 보행, 후지 운동실조나 보행마비, 유량 및 체중감소, 아급성의 경우 광우병 특이적 면역결핍을 나타낸다 (David, 1992; DeArmond, 1995).
광우병의 특징적인 뇌 병변은 정상적인 뇌와 비교하여 신경세포 세포질의 심한 공포화(vacuolation) 및 변성, 뇌회백질 교질의 공포화 및 성상세포(astrocyte) 침윤, 오벡스(obex), 미측소뇌각(caudal cerebellar peduncle) 및 중뇌(mesencephalon) 등에서 양측, 대칭성 병변이 관찰된다 (Ironide, 1997).
이러한 광우병은 감염 후 면역반응이나 염증반응을 동반하지 않아 사망 전 진단이 어려운 실정이다. 즉, 폐사우 뇌의 병리조직학적 검사, 예를 들면 면역조직화학염색, 웨스턴 블랏팅을 통한 변형 프리온 검출 및 전자현미경을 이용한 검경 등이 유일한 진단법으로 알려져 있다.
한편, 광우병은 알츠하이머병과 유사한 발생기전 및 초기 임상증상을 가지는 것으로 보고 되었으며 (Gajdusek et al., 1989 ; Besssen, 1996), 포유류 신경(교)세포 체세포 막에 정상적으로 존재하는 프리온이 변형되면서 발생한다고 보고되었다 (Piccardo et al., 1990 ; Diedrich et al., 1991). 즉, 유전자의 점 돌연변이에 의하여 α-helical 구조가 β-sheet로 바뀐 변형 프리온은 신경세포의 라이소좀(lysosome)에 축적되게 된다고 보고되었다(Prusiner, 1998). 생쥐실험을 통하여 체내 정상 프리온이 인위적으로 증폭되면 광우병 감수성이 증가한다고 밝혀진 바 있다 (Westaway et al., 1994).
광우병은 Protein X에 의하여 이종간 감염이 가능하며 Bcl-60, Hsp-60 등의 단백질이 protein X 후보단백질로 추정된다 (Kurschner et al., 1996 ; Edenhofer et al., 1996). 이와 관련하여, 스크래피 감염이 된 면양 유래의 동물성 골?육분 사료가 광우병 감염원으로 보고된 바 있다 (Nathanson et al., 1997 ; Stekel et al., 1996).
위와 같이, 임상역학을 기반으로 한 감염원으로부터 격리시키는 것만으로는 광우병 발생을 근본적으로 차단할 수는 없으며, 광우병의 근본적인 예방대책은 감염원 노출이나 환경 변화에 의한 체내 프리온 변형을 방지하는 것이 하나의 방법이 될 수 있다 할 것이다. 구체적으로, 감염원에 대한 정상 프리온의 감수성을 낮추는 방법 또는 프리온 생합성 억제에 의한 감염원 영향 배제가 또한 추천될 수 있다.
이러한 방법의 예로 프리온 유전자 적중 생쥐를 생산하고 이에 변형 프리온을 인공 감염시킨 경우에 광우병이 유발되지 않는 사례가 있었으며 (Bueler et al., 1992), 프리온 유전자 적중으로 생산된 양 1두가 있었지만 생존하지 못하였다 (Denning et al., 2001).
이와 같이, 생쥐를 제외한 동물에서 프리온 유전자 적중으로 생산된 살아있는 동물이 생산된 없으며, 더욱이 소에 있어서 광우병을 유발하는 프리온이 적중된 동물의 생산이 알려져 있지 않았다.
이에, 본 발명자들은 생물정보처리를 기반으로 한 유전자 적중기술 및 체세포 핵이식 동물복제기술을 접목하여 광우병 내성소를 생산하는 것에 성공하고 본 발명에 이르게 되었다.
즉, 본 발명은 유전자 도입 및 적중기술을 이용하고 체세포 복제기술을 접목함으로써 특정 질병에 내성을 가진 동물 및 이의 생산방법을 제공하고자 한다. 더 구체적으로, 본 발명은 프리온이 변성되어 발생하는 광우병에 내성을 갖도록 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 소 및 이의 생산방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 형질전환복제소를 생산하기 위한 형질전환 재구성 핵 이식란 및 이의 생산방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 광우병에 내성을 가진 복제 소를 제공하고자 한다.
본 발명은 유전자 적중 및 도입 기술과 체세포 복제 기술을 접목한 특정 질병에 대하여 내성을 가진 형질전환 복제동물의 생산방법 및 이 방법에 의해 생산된 복제동물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 광우병에 내성을 가지는 형질전환 복제 소의 생산방법은 소 유래의 체세포의 프리온을 코딩하는 유전자를 적중시켜 형질전환 체세포를 제작하고, 이를 소 유래의 탈핵 난자에 도입하여 핵 이식란을 작제하여 이를 대리모에 이식하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 소 유래의 체세포에 프리온을 코딩하는 유전자를 적중시키 는 과정을 포함하는 체세포를 형질전환시키는 방법 및 이 방법으로 생산된 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 형질전환 체세포주에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 체세포주의 핵을 소 유래의 탈핵된 난자에 도입시키는 과정을 포함하는 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 형질전환 재구성 핵 이식란의 생산방법 및 이 방법에 의해 생산된 프리온을 코딩하는 유전자가 적중된 형질전환 핵 이식란에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 핵 이식란을 소에 이식하여 발생시키는 것을 포함하는 프리온 질병에 저항성을 갖는 형질전환 복제 소의 생산방법 및 이 방법에 의해 생산된 복제 소에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 형질전환 핵 이식란 및 복제 소는 정상적인 프리온이 적중된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 프리온이 적중된 형질전환 복제 소는 광우병에 대하여 내성을 가지게 된다.
용어의 정의
본 발명에 따른 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 그러나 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "프리온(prion)"은 사람 및 동물에서 해면상뇌증(spongiform encephalopathies)을 일으키는 감염성 인자로, 단백질(protein)과 감염(infection)의 축약형이다. 프리온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드(viroid)와는 전혀 다르며, 양 및 염소의 신경계의 전염성, 퇴행성 질병인 스크래피뿐 아니라, 소의 해면상뇌증 또는 광우병 또는 고양이의 고양이 해면상뇌증을 일으키기도 한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "유전자 적중(gene targeting)" 특정 구조의 적중 벡터를 염색체상의 특정 유전자에 도입함으로써 게놈 중의 특정 유전자를 파괴(knock-out)하는 것을 의미한다. 구체적으로 적중하고자 하는 유전자의 염기 서열에 유전자 산물의 기능을 상실하게 하는 변이를 도입한 DNA, 바람직하게는 선택 마커, 더 바람직하게는 약제에 대한 내성 유전자를 유전자 산물의 기능을 상실하도록 삽입된 DNA를 세포에 도입하고, 도입한 DNA와 표적 유전자 사이에서 상동성 재조합이 야기된 세포를 선택함으로써 표적 유전자에 변이를 도입시키는 기술을 말한다 (참고: Suzanne L. et al. Nature, 336, 348, 1988). 이 적중방법은 파괴된 유전자를 가지는 생물의 병리현상을 통해 개체 수준에서 파괴된 유전자의 본래의 기능을 연구하는 방법으로 사용되고 있다. 본 발명에서는 소의 광우병을 유발하는 원인이 되는 프리온을 코딩하는 유전자를 파괴시켜 소의 광우병 유발을 원천적으로 봉쇄하고자 하는 것이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "벡터(vector)"는 외래 유전자를 숙주세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 또한, "적중 벡터(targeting vector)"는 특정 유전자에 외래 유전자를 삽입시키거나 특정 유전자 형질발현을 붕괴(knock-out)시키는 기능을 하는 벡터를 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입해서 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 수정란 미세주입법과 본원에서 사용된 체세포 복제법이 대표적이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환 동물(transgenic animal)"은 '유전자 이식 동물' 이라 불리기도 하며, 동물 자신이 원래 가지고 있지 않은 외래의 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 말한다. 따라서 본원에서 형질전환 동물은 인간이 필요로 하는 생리활성 물질을 생산하는 생물반응기(Bioreator), 특정 질환을 유전적으로 나타내는 질환모델 동물, 인간의 이식용 장기 등을 생산할 수 있는 형질전환 동물 등을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "핵 이식"은 핵이 없는 난자와 인공적으로 결합시켜 동일한 우량형질을 갖는 여러 마리의 복제동물을 생산하기 위한 유전자 조작기술을 의미한다. 이렇게 생성된 수정란을 본 발명에서는 '핵 이식란'이라 한다.
구체적으로, 본 발명은 체세포 복제 기술을 이용하여 특정 질병에 내성을 가지는 형질전환 동물을 생산하기 위해서 체세포 상에서 특정 유전자를 적중하여 체세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 체세포를 이용하여 복제 동물을 생산하는 단계로 이루어진다.
더 구체적으로, 본 발명의 소 광우병에 내성을 가지는 형질전환 복제소의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 프리온 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 형질전환된 공여핵 세포를 준비하는 단계; 소 유래의 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 수핵 난자를 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계; 및 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출산하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 소의 프리온 유전자가 적중된 형질전환 핵 이식란의 생산방법은 소에서 유래한 체세포주에 소의 프리온을 발현하는 유전자를 도입 및 적중시키는 단계를 포함하는 형질전환 공여핵 세포를 준비하는 단계; 소 유래의 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 수핵 난자를 준비하는 단계; 및 상기 단계에서 준비된 공여핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고 융합시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 형질전환 체세포, 이를 포함하는 핵 이식란 및 이로부터 생산된 형질전환 복제소는 소의 프리온를 코딩하는 유전자가 적중된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 형질전환 복제소는 광우병에 내성을 지니는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 통상적인 핵 이식란 체외용 배지를 개선하여 핵 이식란의 발육율을 향상시킨 배지를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 핵 이식란 배양용 배지는 1.0 내지 2.0 mM의 프락토즈, 바람직하게는 1.5 mM의 프라락토즈를 첨가한 한 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 다른 양태의 배양배지는 1.0~1.5 mM의 글루코즈 및 2.5~3.0 mM의 프락토즈, 더 바람직하게는 1.5 mM의 글루코즈 및 3.0 mM의 프락토즈를 더 첨가한 것을 특징으로 한다.
이하에서는, 소의 광우병에 내성을 가지는 형질전환 복제소를 생산하는 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.
소의 프리온을 발현하는 유전자를 적중시켜 체세포를 형질 전환하는 단계
본 발명에서 소의 광우병에 내성을 가지는 소를 생산하기 위해서는 광우병의 원인이 되는 프리온의 발현을 붕괴(knock-out)시킴으로써 원천적으로 광우병의 발병을 봉쇄할 수 있으며, 이러한 특성의 형질전환 복제소를 생산하기 위해 소에서 유래한 체세포의 프리온 코딩 유전자를 적중하고, 더 나아가 체세포 복제 기술에 이용함으로써 본 발명의 광우병에 내성을 가지는 형질전환복제소의 생산을 가능하 게 한다.
제 1 단계: 체세포주의 확립
본 발명에는 소에서 수득한 세포를 배양한 세포주를 준비하고, 특정 유전자를 적중한 후 공여세포로 사용한다.
상기 체세포를 수득할 수 있는 소의 품종은 특별히 제한되지 않는다. 소에서 수득한 세포는 소의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포, 난구세포 또는 태아섬유아세포이며, 이들을 마더(Mather)와 바네스(Barnes)의 방법 (참조: Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, Vol.57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998)을 응용하여 배양함으로써 세포주를 작제할 수 있다.
예를 들어, 자궁관류액에 P/S 항생제(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심분리하여 세척한 다음, 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium)에서 39℃ , 5% CO2의 조건으로 배양할 수 있다.
자궁내막의 일부 또는 난관으로부터 난관상피 조직을 채취하여, 상기 PBS로 세정하고, 트립신과 EDTA가 포함된 용액에서 정치한 다음, 이를 원심세정하고, 상기한 조건에서 배양한다.
난구-난모세포 복합체를 하이알루로니다제(hyaluronidase)로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 상기 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고, 상기한 조건에서 배양한다.
귀의 피부 조직으로부터 채취된 연골 조직, 면한 피부 내측의 조직, 근육조직 또는 태아의 동체와 사지 부위에서 연골 조직을 포함하지 않는 부위의 조직을 세정하고 세절한 다음, 상기 트립신-EDTA 용액 및 콜라게나제(collagenase type II) 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심세정시키고, 상기한 조건에서 배양하여 체세포를 준비할 수 있다.
상기에서 작제된 세포주는 일정 시간 간격으로 세포주의 배양액을 제거하고 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 정치한 다음, 새로운 배양액으로 교체하며 배양하는 계대 배양, 윌머트(Wilmut) 등의 방법을 응용하여 배양 중인 세포주의 배양액을 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM으로 교체하여 배양하는 혈청기아배양 (참조: Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997) 또는 동결보존 등의 방법을 통하여 보존되며, 보존된 세포주는 공여세포로서 제공된다.
본 발명의 한 양태에서는 소 섬유아세포 또는 성체 귀 섬유아세포의 분리하여 배양을 유지한 후에 유전자 적중에 사용한다. 공여핵원 세포로 사용될 섬유아세포를 분리하기 위해 소 태아를 태막으로부터 분리하고 탯줄도 태아에 근접한 부위에서 제거한다. 남은 조직을 기계적으로 작게 분쇄한 후 바로 엑스플랜트(explant) 배양에 의해 조직에서 세포를 분리하거나, 효소(trypsin-EDTA and/or collagenase)를 이용하여 유리된 세포를 얻는 방법으로 태아 섬유아세포 (embryonic fibroblast)를 분리할 수 있다. 성우의 귀나 기타 부위에서 피부 조직을 채취하여 전술한 방법으로 섬유아세포를 분리한다. 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS)이 10% 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액을 기본으로 사용하였고 분리 후 배양 용기에 90-100% confluent 하면 계대배양을 실시하고 이들이 다시 80-90% confluent 로 증식하게 되면 일부는 계속 배양하고 잉여분은 동결?보존한다. 기본 배양액 내에 항산화제인 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine)이나 글루타치온(glutathione)과 같은 물질을 첨가하여 배양과정에서 일어날 수 있는 세포사멸 (apoptosis)을 억제하여 양질의 소 섬유아세포를 유지한다.
제 2 단계: 프리온을 코딩하는 유전자의 적중을 위한 벡터의 작제
(1) 프리온를 코딩하는 유전자 클로닝 및 게노믹 DNA 광우병 유전자 적중을 위한 삽입부분 결정
본 발명에 있어서, 효과적인 유전자 적중을 위하여 적중 벡터를 제작할 광우병 유전자의 삽입부분을 결정한다. 광우병 유전자의 시작점(start site)이 엑손 3에 위하고 있으므로 적중을 통한 광우병 유전자의 불활성화를 위해서는 인트론 2 부분과 엑손 3부분의 대부분을 포함하도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어 서, 78056bp의 광우병 프리온 단백질 코딩 유전자(prp)는 Gen Bank Accession Number AJ298878로부터 확인할 수 있다.
본 발명에서 광우병 유전자 적중을 위한 가능한 유전자 범위의 한 양태는 도1에서 보는 바와 같이, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3을 포함하는 (A), (B) 또는 (C)영역을 포함한다. 구체적으로 상기 (A)는 염기서열 60837 내지 70962까지 약 10.1kb 범위를, 상기 (B)는 염기서열 63928 내지 73924까지의 약 10kb 범위를, 상기 (C)는 염기서열 60718 내지 68158까지의 약 7.4kb 범위를 가진다.
이러한 결정부위를 클론닝하기 위하여 Bovine BAC Libarary를 스크리닝하여 광우병 유전자를 가지고 있는 BAC DNA를 선별할 수 있다.
(2) 선발 표지의 삽입 및 적중 벡터 제작
본 발명에 따라 소 유래의 체세포에 존재하는 프리온 유전자를 붕괴시킬 수 있는 DNA 표적화 분자 즉, 적중 벡터는 당해 기술분야에 널리 공지된 정보 및 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 적중 벡터는 2가지 기능을 가진다. 즉, 고유한 프리온 유전자에 삽입되거나 고유한 프리온의 형질발현이 가능하지 않도록 하는 것이다. 이러한 것이 가능하게 하는 구조적인 특성은 표적 유전자좌의 선택된 영역들과 상동성인 한 쌍의 영역을 갖는 것이다. 이러한 (서열의 동일성 및 길이를 포함하는) 상동성으로 인해 적중 벡터는 형질감염된 세포에서 표적 유전자좌의 선택된 부위에서 상동성 재조합 (또는 염기 짝 기작)에 의해 삽입된다.
상동성 재조합은 염기 짝 기작을 통한 DNA 분자들 내부 또는 상기 분자들 사이의 서열-특이적 부위에서의 DNA 단편들의 재배열을 의미한다. 본 발명은 소의 프리온 유전자를 적중할 수 있는 최적의 상동성 재조합 벡터 또는 적중 벡터를 제공한다.
적중 벡터는 변경되거나 또는 치환되는 염색체 유전자 (표적 유전자)와 하나 이상의 상동성 영역을 가진다. 표적 유전자와 적중 벡터 사이의 상동성 영역들은 상기 외래 서열의 부위-특이적 삽입 (또는 통합)을 가능하게 한다. 물론, 상기 외래 서열을 내재하는 유전자의 기존 결함을 보정하거나 또는 작용성의 내재 유전자를 무력 (또는 붕괴)하게 하도록 디자인할 수 있다. 본 발명은 소의 프리온 유전자를 붕괴시키는 적중 벡터에 관한 것이다.
당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 프리온 유전자를 적중하기 위한 적중 벡터에 대한 다수의 실시 태양들을 상기 개시된 구조적 및 기능적 요건에 부합되도록 구성할 수 있음은 자명하다 할 것이다. 본 발명에서 변화시킬 수 있는 적중 벡터의 변수들에는 상동성 영역들의 길이, 표적 유전자의 어느 영역들이 적중 벡터의 상동성 영역으로서 중복되는가에 대한 것, 붕괴 서열의 길이, 붕괴 서열의 실체 및 표적 유전자의 어떤 서열이 적중 벡터에 의해 치환되는가에 대한 것들이 있다.
적중하고자 하는 유전자 서열에 인접한 상동성 영역들의 길이는 본 발명의 실시에 현저한 영향을 주지 않으면서 상당히 변화시킬 수 있다. 상기 상동성 인접 영역들은 프리온 표적 유전자 좌에서 적중 벡터의 하나의 스트랜드(strand)와 형질 감염될 세포의 염색체의 하나의 스트랜드 간에 유효한 이종 이중사슬(heteroduplex)을 형성하기에 충분한 길이를 가지는 것이 바람직하다. 상기 상동성 영역들의 길이를 증가시키는 것은 이종2사슬 분자의 형성을 증가시켜 적중 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 프리온 유전자 적중을 위한 상동성 영역들의 길이는 바람직하게는 5.0kb 내지 12kb 정도의 범위를 가질 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명에서는 약 7kb 또는 약 10kb의 영역을 가진다. 또한, 유전자 적중에 요구되는 상동성의 길이에 대한 논의는 문헌[Hasty et al. Mol Cell Biol 11, 5586-91, 1991]을 참고할 수 있다.
적중 벡터의 상동성 영역으로서 중복되는 표적 유전자 좌 영역의 선택에 있어서, 붕괴 영역에 의해 치환되는 특정 프리온 유전자 서열을 적중 벡터에서 상동성 영역으로서 중복되는 표적 유전자 좌의 영역들 사이에 놓일 수 있고, 상기 표적 유전자 서열의 치환에 의해 프리온 유전자를 비-작용성으로 만들 수 있다. 적중 벡터의 상동성에 대해 선택된 표적 유전자 좌 뉴클레오타이드 서열은 상기 적중 벡터의 삽입 후에도 변하지 않으며, 표적 유전자 좌의 상기 서열들은 단지 적중 벡터의 상동성 (또는 중복성) 서열에 의해 치환될 뿐이다. 표적 유전자 좌의 선택된 영역들과 표적화 분자의 상동성 영역들과의 동일성은 상기 적중 벡터가 적중하고하자 하는 서열을 표적 유전자인 프리온 유전자 내로 정확하게 전달하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태로, 하나의 상동성 영역이 프리온 유전자의 5' 위치에 위치할 수 있으며, 다른 상동성 영역은 상기 프리온 유전자의 3' 위치에 위치할 수 있다. 또한, 프리온 개시 코돈과 상기 프리온 코드화 서열의 5'말단 영역을 선택된 상동성 영역들 사이에 놓아 중단 서열로 치환하여 어떤 단백질도 형질 발현되지 않도록 할 수 있다. 중단 서열이 선택성 표지 (또는 임의 다른 유전자)을 함유하는 경우 프리온 활성을 갖는 프리온 융합 단백질을 생산할 수 있는 것을 방지하기 위해 번역 해독을 방해하는 최소 필요 표지 코드화 서열 하부에 종결 코돈과 상기 표지 코드화 서열을 갖는 인-프레임이 존재할 수 있다.
한편, 본 발명의 적중 벡터에서 상기 상동성 영역들을 분리시키는 (프리온 유전자를 적중하는) 붕괴 서열의 길이는 본 발명의 실시에 현저한 영향을 주지 않으면서 상당히 변화시킬 수 있다. 상기 붕괴서열의 최소 길이는 1 염기 짝인데, 이 단열 염기 짝의 삽입은 프레임 이동 변이를 구성하여 작용성 단백질의 형질발현을 방해할 수 있다. 그러나 단일 염기 짝 변경은 자발적인 변이를 통한 야생형으로의 전환에 민감함을 인식해야 한다. 이러한 이유로 1 염기 짝보다는 긴 붕괴 서열이 유용하며 바람직하게는 2 내지 2,000 염기 짝일 수 있다. 한편으로, 붕괴 서열의 길이는 표적화 분자의 상동성 영역들과 일치하는 표적 유전자 좌 영역들간의 거리와 대략적으로 같은 길이이다.
상기 붕괴 서열의 선택에 있어서 소의 프리온을 형질 발현시키지 않고, 형질 전환된 세포에 독성인 단백질 또는 폴리펩티드도 형질발현하지 않는 것이 바람직하다. 또한 붕괴 서열은 형질감염된 세포의 게놈에서 광범위하게 부위 상동성이지 않는 것이 바람직한데, 이러한 상동성은 적중 벡터의 효율을 감소시키고 그 기능을 심각하게 손상시킬 수 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, 붕괴 서열이 이중 기능 즉, 선택적 표지와 특정 서열의 붕괴 기능을 가지는 것이 바람직하다. 붕괴서열의 길이 및 정체는 주로 선택성 표지 코드화 서열 및 관련된 형질발현 조절 서열에 의해 결정될 수 있다. 한편, 선택적 표지 유전자는 적중 벡터를 취하고 통합시킨 형질감염된 세포의 포지티브(positive) 선택을 위해 제공된다.
상기 선택성 표지의 필요성은 세포의 형질감염 및 형질전환 복제 소의 생산을 위해 선택된 방법에 따라 좌우될 수 있다. 또한, 형질감염될 세포주에 따라 달라질 수 있다. 선택성 표지에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 항생제 내성 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 ('네오'), 푸로마이신 포스포트랜스퍼라제 ('푸로'), 브라스티시딘 포스포트랜스퍼라제, 티미딘 키나제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 아스파라긴 신타제 및 CAD(카바밀 포스페이트 신타제/아스파테이트 트랜스카바밀라제/디하이드로오로타제) 등이 있다.
구체적으로 본 발명에 있어서, 프리온 유전자를 적중할 벡터는 표준 DNA 클로닝 과정과 PCR 방법에 의해 작제될 수 있다. 프리온 유전자 적중에 사용되는 벡터를 작제하기 위한 벡터는 상업적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따른 적중 벡터는 다음의 과정으로 작제될 수 있다. pPUR(Clontech)을 이용하여 양성 선별 마커(positive selection marker)인 Puro gene을 PCR을 통하여 증폭한다. 상기 Puro gene은 프로모터와 폴리 A가 포함된 경우와 프로모터 트랩(promoter trap) 및 프로모터/폴리A 트랩(promoter/polyA trap)을 위한 적중 벡터 설계 전략에 따라 다음의 3가지로 디자인할 수 있으며, pGEM T-easy vector System I (A1360, Promega) 에 클로닝한다 (도 2).
No. 7 - Promoter + Puro + PolyA 1.4Kb (U07648중 14bp-1435bp)
No. 8 - Puro + PolyA 1.0Kb (U07648중433bp-1435bp)
No. 9 - Puro 0.7Kb (U07648중 433bp-1182bp)
상기 No.7의 경우 프로모터와 폴리A가 포함된 Puro gene을 포함하고 No.8 및 No.9의 경우 프로모터 트랩 및 프로모터/폴리A 트랩을 위한 벡터로서 ATG 시작 코돈을 포함하지 않게 제작된다. No.7, No.8 및 No.9는 양쪽에 모두 특징적인 제한효소 부위(enzyme site)인 BamH I을 포함하며, 상기 준비된 프리온 유전자, PrP 7.4kb gene (도 1의 (C) 영역)의 60654bp에 특징적인 제한효소 부위인 BamH I 내로 상기 No.7, 8 및 9를 삽입하여 프리온 유전자 적중 벡터-10, 적중벡터-11 및 적중벡터-12을 완성할 수 있다 (도 3 및 하기 표 1).
또한, 본 발명의 다른 양태로, 음성 선별 마커(Negative Selection marker)로 이용하기 위하여 TK gene (PGK Promoter, HSV-TK, PGK PolyA : No.5) 과 DT gene (RNA polymerase II Promoter, DTA, SV40 PolyA : No.6) 을 pBluescript II SK (+)에 클로닝하여 준비하고, DT 의 경우 양끝에 특징적인 제한효소 부위인 Mlu
I을 포함한다. 앞에서 준비한 No.7, 8 및 9의 프리온 적중 벡터 내에 특징적인 제한효소 부위인 Mlu I내에 준비된 (No.6) DT gene 을 삽입하여 음성 선별 마커가 포함된 프리온 유전자 적중벡터-16, 적중벡터-17 및 적중벡터-18을 완성할 수 있다 (도 4).
| No. | Plasmid | Size (Insert N/Total) | Description |
| 1 | PrP 7.4 kb | 7351bp/10366bp | Intron 2의 일부와 Exon 3가 포함된 7.4 kb의 광우병 유전자 |
| 5 | DT | 1184bp/2989bp | Negative Selection Marker |
| 6 | TK | 2795bp/5756bp | Negative Selection Marker |
| 7 | PPuroA | 1421/7351bp | Positive Selection Marker (Promoter와 Poly A 포함) |
| 8 | PuroA | 1002/7351bp | Positive Selection Marker (Promoter 제거 및 Poly A 포함) |
| 9 | Puro | 749/7351bp | Positive Selection Marker (Promoter와 Poly A 제거) |
| 10 | pPrP-1 | 1421/7351/11787bp | 광우병유전자 적중 vector-1 (PPuroA 포함) |
| 11 | pPrP-2 | 1002/7351/11368bp | 광우병유전자 적중 vector-2 (PuroA 포함) |
| 12 | pPrP-3 | 749/7351/11115bp | 광우병유전자 적중 vector-3 (Puro 포함) |
| 16 | pPrP-DT-1 | 1421/7351/1271/13058bp | 광우병유전자 적중 vector-DT-1 (PPuroA 와 DT포함) |
| 17 | pPrP-DT-2 | 1002/7351/1271/112638bp | 광우병유전자 적중 vector-DT-2 (PuroA 와 DT포함) |
| 18 | pPrP-DT-3 | 749/7351/1271/12386bp | 광우병유전자 적중 vector-DT-3 (Puro 와 DT포함) |
본 발명의 또 다른 양태로, 상기의 방법과 동일한 방법으로 프로모터를 포함하거나 포함하지 않으며, 하이그로마이신 (hygromycin) 저항 유전자를 PCR 증폭한 후 광우병 유전자에 삽입시켜서 하이그로마이신에 저항성을 가지는 광우병적중 벡터를 제작한다 (도 8).
본 발명의 다른 양태에 따른 적중 벡터는 다음의 방법으로 작제될 수 있다. 프리온 유전자의 염기 60837-70962(도1의 (A) 영역, 10.1kb) 광우병 유전자의 푸로마이신(puromycin) 및 하이그로마이신(hygromycin) 저항 유전자 삽입을 통한 적중벡터 제작할 수 있다. 제작된 프라이머를 이용하여 상기 유전자 영역 (10.1kb)을 Long-range PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 pCR-XL-Topo (Invitrogen) 벡터에 클로닝한다. 도 5에서와 같이 광우병 유전자의 Bam HI-Kpn I 부분을 제거하기 위한 준비 단계로 pCR-XL-Topo 벡터 내에 존재하는 Bam HI 및 Kpn I 제한효소 절단부위를 Mlu I-Spe I으로 절단한 후 Klenow와 T4 DNA ligase를 이용하여 셀프 라이게이션(self ligation)하여 제거한다 (도 5).
이후, Bam HI 과 Kpn I으로 광우병 유전자를 잘라 엑손 3의 부분절편을 제거한다. PCR를 이용하여 프로모터가 포함되거나 (도 6), 또는 포함되지 않도록 (도 7) 푸로마이신 저항 유전자를 증폭한다. 다음 단계의 클로닝 목적으로 PCR 증폭용 프라이머 작제시 양 끝에 Bam HI 과 Kpn I 제한효소 절단 부위를 삽입한다. PCR 증폭된 DNA를 Bam HI과 Kpn I으로 절단하고 정제한 후 이미 준비된 벡터에 T4 DNA ligase를 이용하여 중합시켜 광우병 유전자 적중용 벡터를 각각 제작한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다음의 방법으로 프리온 유전자 적중 벡터를 작제할 수 있다. 프리온 유전자의 염기 63928-73924 영역(도 1의 (B) 영역, 10.0kb) 광우병 유전자에의 푸로마이신, 네오마이신, 블라스티시딘 저항 유전자 삽입을 통한 적중벡터 제작할 수 있다. 상기 방법과 같이 Long-range PCR 방법을 이용하여 상기 프리온 유전자 (10.0kb)을 증폭하여 클로닝하고, PCR 증폭된 푸로마이신, 네오마이신 (Clontech), 블라스티시딘 (Invitrogen) 저항 유전자와 같이 Bam HI과 Kpn I으로 절단한 후 중합시켜 광우병 유전자 적중용 벡터를 제작한다.
제 3 단계: 외래 유전자의 체세포로의 도입
외래 유전자의 세포 내로의 도입은 작제된 발현 플라스미드를 체세포 내로 도입시키는 방법으로 행한다.
외래 유전자를 세포 내로 도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 소의 프리온을 발현하는 유전자를 적중시키는 방법은 적절한 적중 벡터를 구축하고 이를 체세포에 도입함으로써 가능하다. 본 발명에서 소 프리온을 발현하는 유전자를 적중시킬 적중 벡터를 체세포에 도입하는 방법으로 생화학적 방법, 물리적 방법, 바이러스 매개 형질감염방법 등을 사용할 수 있다.
생화학적인 방법으로는 칼슘을 매개체로 하는 칼슘 침전법, 세포막 성분인 양이온 리피드를 매개체로 하는 리포펙션 또는 리피드는 아니지만 양전하를 지니는 폴리머를 매개체로 하는 방법 등을 사용할 수 있는데, 이는 실험의 용이성과 효율성 및 안정성 측면에서 많이 이용되는 방법이기도 하다. 구체적으로 FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA), 리포펙타민 플러스 (LipofectAmine Plus, Life Technologies) 및 엑스진 500 (ExGen 500, MBI Fermentas)을 사용할 수 있다. FuGene6는 다성분 지방계 시약으로서 다양한 세포 타입에서 높은 도입 효율 을 가지고 세포 독성이 없으며, 혈청 첨가 여부에 관계 없이 기능을 발휘하고 최소한의 최적화 작업이 쉬운 장점을 가진다. 리포펙타민 플러스는 양전하 지질(cationic lipid)이며, 엑스진 500은 비지방 양전하 중합체로 여러 가지 세포 타입에서 높은 효율이 보고 되어 있다.
물리적인 방법으로 전기충격법(electroporation), 유전자 총, 세포 내 직접 미세주입법 등을 사용할 수 있다.
바이러스 매개 방법으로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스의 바이러스 게놈에 원하는 DNA를 클로닝하여 세포에 감염시키는 방법이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서는 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하여 생화학적인 방법, 더 구체적으로 전기충격법을 이용하여 유전자를 도입 및 적중하는 방법을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, 유전자의 도입을 위한 벡터를 작제하고 리피드-매개 방법(lipid-mediated method)을 이용하여 소의 프리온을 코딩하는 유전자를 적중할 수 있다.
또한, 본 발명의 한 양태에서 프리온 유전자를 적중하기 위한 적중 벡터의 도입을 위해 FuGene6 또는 리포펙타민을 이용할 수 있다. 즉, 프리온 적중 벡터를 리포좀 형성 성분과 혼합하여 생성된 리포좀-DNA 구조 복합체를 세포 배양액에 첨가하여 일정시간 배양하고, 이 복합체의 DNA 구조가 세포 내로 도입되도록 50-70% 정도 증식한 체세포에 형질감염을 실시한다. 또한, FuGene6을 통한 효과적인 도입을 위해서는 세포마다 최적 방법을 선정하고 각 변수들을 최적화하여 유전자를 도입함으로써 적중 효율을 극대화한다.
또한, 본 발명의 한 양태에서 전기충격법에 의한 유전자 전이는 GFP와 Puro gene을 이용하여 적정 조건을 설정한 뒤 이를 광우병 유전자 적중 벡터의 유전자 전이에 이용할 수 있다.
제작된 광우병을 유발하는 프리온 유전자 적중 벡터를 서열분석을 통하여 확한 염기배열의 일치를 확인할 수 있다. 구체적으로 적중 벡터에 포함된 특정 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 작제하고 PCR을 수행하는 방법으로 확인할 수 있다.
또한, 적중 벡터에 삽입된 항생제 저항 유전자 등의 양성(positive) 선별 인자를 통해 선별할 수 있다. 구체적으로 특정 항생제 존재 하에서 배양함으로써 생존하는 세포를 선별함으로써 프리온 유전자가 적중된 세포를 선별할 수 있다.
또한, 적중 벡터의 제작시에 음성(negative) 선별 인자를 첨가함으로써 프리온 유전자의 특정 유전자를 적중하지 않은 경우에는 음성 선별인자에 의해 적중된 세포가 사멸하여 적중의 효율을 증진시킬 수 있다. 본 발명에서 음성 선별인자로는 DT 또는 TK를 포함한다.
제 4 단계: 프리온 유전자가 적중된 세포의 선별, 증식 및 동결 보존
프리온 유전자가 적중된 세포의 선별은 항생제 또는 마커 유전자를 이용하여 선별한다. 적중 벡터에 이용된 양성 마커(positive marker)인 항생제에 대한 저항 성 유전자는 적중 벡터가 세포에 도입되면 저항성 유전자도 발현된다. 따라서 적중 벡터의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체(construct)에 의해 적중된 세포는 항생제를 포함하여 배양하면 생존하게 되고, 그 외의 세포들은 항생제의 독성에 의해 사멸되어 일정 시간 후 배양 용기에는 유전자가 적중된 세포만 증식한다.
그러므로 전 단계에서 도입 후 정상 배양을 통한 일정 기간의 회복기가 지난 다음 프리온 유전자가 적중되지 않은 세포들은 제거하고 도입된 세포들만 선별 마커의 항생제를 사용하여 선별한다.
이 같은 항생제에 의한 선별은 항생제의 적정 선별 농도를 정함으로써 효과적으로 이루어지도록 한다. 세포의 종류에 따라 차이가 있으나, 적중된 세포는 하나의 세포로부터 증식을 시작하게 되므로 다음 단계의 확인을 위해서는 일정 수 이상으로 증식시켜야 한다. 항생제를 통한 선별 과정이 이루어지면 정상 배양으로 전환하고, 세포의 신속한 증식과 배양 시 세포 사멸에 의한 불필요한 손실을 감소시키기 위해 적절한 성장인자와 세포사멸 억제제 등을 첨가하는 방법을 적용한다.
또한, 본 발명은 적중된 세포 내에 존재하는 특정 서열의 존재여부를 PCR을 통해 확인하는 방법도 포함한다.
또한, 마커 유전자로 녹색 형광을 발광하는 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 적중 벡터의 도입으로 세포 내로 유입된 DNA 구조체로 적중된 세포는 GFP 유전자에 의해 현미경 하에서 자외선 필터를 이용하여 관찰하면 초록색을 띄는 세포만을 선별한다.
GFP 유전자 도입 세포의 증식 배양 및 동결 보존은 전술한 항생제 선별 및 GFP 발현유무로 선별한 형질전환 세포를 대상으로 한다. 핵 이식용 세포로 사용할 세포는 선별된 하나의 세포로부터 증식시키며, 특히 섬유아세포는 다수의 세포로 증식되기까지 상당한 시간이 소요되고 세포가 노화되어 증식이 둔화되면서 성장을 멈추기 때문에, 단 시간 내 건강한 다수의 적중된 세포를 배양해야 한다. 증식 배양한 세포의 효율적 보존을 위하여 각 단계마다 동결 보존한다. 특히 소수의 세포를 동결 보존하여 융해했을 때 생존성과 핵 이식 시 핵 공여세포로서의 안정성에 적합토록 해야 한다.
한편, 본 발명은 상기의 항생제 저항 유전자를 이용한 프리온 유전자의 적중 및 선별의 효율을 증진시키기 위해 적중 벡터의 작제 시에 프로모터를 제거하거나, 폴리 A를 제거하거나, 이 모두를 제거함으로써 프리온 유전자의 원하는 위치에서만 상동성 재조합이 일어난 경우에 한하여 적중된 세포로 선별되게 하는 방법을 포함한다.
외래 유전자가 도입 및 적중된 체세포의 핵 이식을 통한 형질전환 복제란 및 형질전환 복제 동물을 생산하는 단계
본 발명에서는 프리온 유전자가 적중된 형질전환 복제 소를 생산하기 위한 방법으로 동물복제 기술을 이용할 수 있다. 상기 단계의 프리온 유전자가 적중된 체세포의 형질을 동물 복제 기술을 이용하여 복제되는 산자에 그대로 발현되도록 함으로써 모자이크 현상이 없는 100% 형질전환 복제 소를 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명에서의 체세포 복제 기술은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 국제특허출원 PCT/KR00/00707 "체세포 복제동물 및 그 생산 방법"(황 등, 2000.6.30)의 기술을 이용할 수 있다. 즉, 체세포 핵 이식은 탈핵 과정을 통해 미수정란으로부터 유전 물질(genetic material)을 포함한 핵을 제거하고 다른 체세포의 핵(nucleus)을 주입함으로써 이루어진다. 또한 이렇게 생산된 핵 이식란을 '재구성된 핵 이식란(reconstructed embryo)'이라고 하고, 상기 핵 이식된 재구성 핵 이식란을 체외 배양하여 발육시켜 대리모에 이식하여 체세포 복제 동물을 생산한다.
제 1 단계: 수핵 난자의 준비, 생체 외 성숙
소의 난소에서 미성숙 난자를 채취 및 배양하여 성숙한 수핵 난자를 준비한다. 헤페스 (HEPES, N-[hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 완충용액에 TCM199 (Tissue Culture Medium 199)가 용해된 세정용 TCM199 배지에서 채취된 미성숙 난자를 선별한 후, 5% CO2의 조건 하에 16 내지 22시간 동안 배양하여 난자를 성숙시킨다.
이때, 사용되는 배양액은 TCM, 나트륨-피루브산 및 P/S 항생제가 포함된 배 양용 TCM199 배양액에 에스트라디올(Estradiol, E2), 난포자극호르몬(FSH, follicle stimulating hormone) 및 소 태아 혈청을 포함한다.
제 2 단계: 수핵 난자의 탈핵
상기 제 1 단계에서 준비된 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 수핵 난자의 투명대의 일부를 절개하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 난자를 작제한다.
먼저, 성숙한 수핵 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 TCM199 배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 세정용 TCM199 배양액으로 세정한다. 그런 다음, 난구 세포가 제거된 난자를 사이토칼라신 B(cytochalasin B) 용액으로 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator)를 이용하여 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵시킨다. 이어, 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시킨다. 이때 사용되는 사이토칼라신 B 용액은 사이토칼라신 B를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고, 이를 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석한 것이다
자외선 하에서 Hoechst 33342 (Sigma Co.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵을 확인할 수 있다.
제 3 단계: 공여 핵 세포의 준비
공여 핵 세포의 준비를 위해 상기에서 형질감염된 세포를 PBS에서 세척한다. 그 후, 단일 세포 현탁을 위해 0.1% 트립신-EDTA를 사용하여 배양된 세포들을 트립신 처리한다. 세포들을 펠릿화하고 0.5% (v/v) FBS가 포함된 200㎕ PBS에서 재현탁화시키고 핵 이식에 사용하기 전에 마이크로원심관으로 옮긴다.
제 4 단계: 공여핵 세포와 수핵 난자의 융합 및 활성화
상기에서와 같이 준비된 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하고, 이식된 핵 이식란을 전기융합을 통해 활성화시킨다.
먼저, 형질감염된 공여 핵 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 작제한다. 배양용 TCM199 배양액에 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 PHA-P (phytohemagglutinin) 용액으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 PHA-P 용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵 이식란을 작제한다. 이어, 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고 정치시킨다. 이때, 사용되는 PHA-P 용액은 PHA-P를 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 것이다.
상기 정치된 핵 이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기융합시킨다. 먼저, 핵이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨(mannitol) 용액에 넣고, 이를 세포 조작기에 연결시킨 2 개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣은 다음, 공여 세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10 내지 20㎲, 횟수는 0.01 내지 10초, 바람직하게는 1초 간격으로 1 내지 5회, 바람직하게는 2회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시킨다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액과 세정용 TCM199 배양액으로 세정하고, 전기 사이토칼라신 B 용액에서 정치한 후 활성화시킨다. 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 MgSO4 또는 MgCl2, BSA 및 만니톨이 용해된 pH 7.2 내지 7.4의 용액으로서 Ca2+가 포함되어 있다면 융합과 동시에 활성화되지만, Ca2+가 포함되어 있지 않다면 활성화시키는 과정을 수행한다.
Ca2+가 포함되지 않은 만니톨 용액을 사용하여 세포 융합을 수행한 경우, 활성화시키는 과정은 융합된 핵 이식란을 암실에서 이오노마이신(ionomycin) 용액에 정치하여 활성화시킨 후, 소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 세척하고 정치하여 이오노마이신을 제거한다. 이때, 이오노마이신 용액은 DMSO에 이오노마이신을 용해시켜서 원액을 만들고 사용할 때, BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액으로 희석하여 사용한다.
제 5 단계: 핵 이식란의 후활성화 및 체외 배양
활성화된 핵이식란을 후활성화시킨 후, 체외 배양한다.
소 태아 혈청 또는 BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액에 정치된 활성화된 핵 이식란을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 용액 또는 디엠에이피(DMAP, 4-dimethylaminopurine) 용액에 침지하여 배양하여 후활성화시킨 다음, 체외 배양용 배지에서 5% CO2 배양기 또는 5% CO2, 7% O2, 88% N2 배양기를 사용하여 배양한다.
이때, 사이클로헥시미드 용액은 에탄올에 사이클로헥시미드를 용해시킨 용액으로서, 체외 배양용 배지에 첨가하여 사용하고, DMAP 용액은 DMAP를 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용한다. 또한, 체외 배양용 배지는 NaCl, KCl, NaHCO3, NaH2PO4, CaCl2, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 글루타민 등을 포함하는 mSOF 배지(참조: 표 2)를 사용한다.
선택적으로, 상기의 체외 배양된 핵 이식란을 동결 보존한 후, 필요한 때에 이를 융해시켜서 사용할 수도 있다. 핵 이식란을 동결할 경우, 먼저 동결할 수정란을 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고, P/S 항생제, CaCl2, 포도당, MgCl2, Na-피루베이트 및 PBS를 포함하는 동결액에 넣은 다음, 온도를 천천히 저하시킨 후, 액체 질소로 동결시킨다.
이처럼 동결된 핵 이식란을 융해시킬 때는 액체질소에서 꺼낸 핵 이식란을 상온에서 일정기간 동안 정치했다가 온수에 넣어 융해시킨다. 융해된 핵 이식란을 글리세롤, 자당, BSA 및 PBS가 포함된 융해용 배지에 넣고, 글리세롤의 양이 많은 배지에서 적은 배지로 차례대로 정치시켜서 핵 이식란 내의 동결액을 제거한다.
상기의 소에서 유래한 프리온 유전자가 적중된 형질전환 체세포를 공여 핵 세포로 하여 재조한 핵 이식란을 SNU-B5로 명명하여, 이를 2003년 11월 25일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10555BP로 기탁하였다.
| 성 분 | 농 도 |
| NaCl | 99.1～106mM |
| KCl | 7.2mM |
| NaHCO3 | 25mM |
| NaH2PO4 | 1.2mM |
| Na-락테이트 | 5mM |
| CaCl2?2H2O | 1.7mM |
| MgCl2?6H2O | 0.5mM |
| Na-피루베이트 | 0.3mM |
| 포도당 | 1.5mM |
| 페놀레드 | 10㎍/ℓ |
| BSA | 8㎎/㎖ |
| 카나마이신 | 0.75㎍/㎖ |
| 필수아미노산 | 2% |
| 비필수아미노산 | 1% |
| L-글루타민 | 1mM |
| ITS | 0.5% |
제 6 단계: 프리온 유전자가 적중된 복제소의 출산
상기의 체외 배양된 핵 이식란을 대리모에 이식하여 송아지를 생산할 수 있다. 이때, 핵 이식란은 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적된 상태로 대리모의 자궁에 이식된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 체세포주의 확립
소의 귀에서 채취한 피부 내측의 조직을 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco BRL, Life Technologies, USA)로 세정하고 100 메시(mesh)의 크기로 세절한 다음, 이를 상기 인산염 완충 식염수에 넣고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 및 1mg/ml 콜라게나제(collagenase type II)를 첨가하여 39 , 5% CO2의 포화습도 배양기 내에 1시간 동안 정치시킨 후, 원심 세정하였다. 그 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1% 비필수 아미노산 용액 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles medium, Gibco BRL, Life Technologies, USA) 배양액에서 부유시키고, 이를 세포 배양용 디쉬로 옮겨 39℃ , 5% CO2의 조건 하에 포화습도 배양기 내에서 배양하여 세포주를 수득하였다.
DMEM에서 배양 중인 세포주를 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM에서 7일간 배양한 다음, 배지를 제거하고 0.25% 트립신, 1mM EDTA 용액을 첨가하여 2분간 정치시켰다. 그 다음, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 재부유시켜서 세포의 수가 2000개/0.1ml가 되도록 조절하고, 이를 에펜돌프(eppendorf) 시험관에 분주하여 공 여세포로 준비하였다.
<실시예 2> 광우병 유전자 적중 벡터 제작 및 유전자 도입
모든 플라스미드들은 표준 DNA 클로닝 과정 (Maniatis 등, 1982) 및 PCR 방법에 의해 작제하였다.
효과적인 유전자 적중을 위한 적중 벡터를 제작할 광우병 유전자의 삽입부분을 결정하였다. 광우병 유전자의 시작점이 엑손 3에 위치하고 있으므로 적중을 통한 광우병 유전자의 불활성화를 위해 인트론 2 부분과 엑손 3의 대부분을 포함하는 광우병 유전자 염기 60718 내지 68158까지의 영역 (7.4kb, 도 1의 (C))으로 결정하였다. 광우병 BAC DNA를 주형으로 하여 도 1의 (C)의 7.4kb의 광우병 유전자를 Long-range PCR을 통하여 증폭하였다.
또한, pPUR (Clontech)을 이용하여 양성 선별 마커인 Puro gene을 PCR을 통하여 증폭하였다. PCR은 사이키(Saiki) 등(1985)에 의해 처음으로 사용된 것의 변형 방법으로 수행되었다.
구체적으로, PCR 증폭은 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP (Takara Shuzo, Japan), 50 pmol의 업스트림 및 다운스트림 프라이머 및 2.5 유니트(unit)의 TaKaRaTA Taq 폴리머라제 (Takara)를 포함하는 50㎕ 반응 혼합물 내에서 10ng의 주형(template)과 함께 33 내지 49 사이클(cycle) 동안 수행되었다. 반응 사이클은 94℃ 에서, 30초간 변성(denature), 55℃ 에서 33초간 어닐링(annealing), 72℃ 에서 90초간 연장(extension) 및 72℃ 에서 15분간 마지막 연장(final extension)시키는 과정으로 수행되었다.
Puro gene 양 말단에 SV40 프로모터와 폴리 A를 연결되도록 디자인하여 pGEM T-easy vector system I (A1360, Promega)에 클로닝하였다. 상기의 프로모터+Puro gene+폴리 A (1.4kb)로 이루어진 유전체의 양쪽에 특이한 제한효소 부위 BamHI를 포함하고 있으므로 상기 7.4kb 광우병 유전자의 60654bp에 존재하는 특이한 제한효소 부위 BamHI 내로 삽입하여 프리온 적중 벡터를 완성하였다 (도 9의 A). 푸로마이신 저항 유전자를 가진 프리온 적중 벡터의 작제도는 도 9의 A에서와 같다. 즉, SV40 프로모터와 푸로마이신 저항 유전자 및 폴리 A를 포함하는 벡터의 특징을 나타내는 개략도이다.
또한, 상기의 방법과 동일하게 양성 선별 마커로 하이그로마이신 B(Hygromycin B)저항 유전자 양 말단에 pCMV 프로모터와 폴리 A를 연결하여 프리온 적중 벡터를 완성하였다 (도 9의 B). 하이그로마이신 B 저항 유전자를 가진 프리온 적중 벡터의 작제도는 도 9의 B에서와 같다. 즉, pCMV 프로모터와 하이그로마이신 B 저항 유전자 및 폴리 A를 포함하는 벡터의 특징을 나타내는 개략도이다. PCR 증폭으로 준비한 상기 유전자들을 TA 클로닝 방법으로 pCR XL TOPO (3.5kb) 벡터 내로 삽입하였다.
상기에서 작제된 프리온 적중 벡터에 대하여 시퀀싱 킷(U.S. Biochemical Co.)을 사용하여 서열 분석을 수행하여 벡터를 확인한 후에 광우병 유전자 적중 세 포주를 만드는데 사용하였다. 구체적으로, 뉴클레오티드 서열은 디데옥시 체인 종결 방법(dideoxy chanin termination method)에 의해 확인하였다(Sanger 등, 1997). 서열은 35S-dATP (800 Ci/mmol, Amersham)이 삽입된 시쿼나제(sequenaser)로 분석되었다. DNA는 완충-구배(buffer-gradient) 또는 전해질-구배(electrolyte-gradient) 방법을 사용하여 6% PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리되었다. 모든 서열분석 방법은 US Biochemicals에 의해 제공되는 서열분석 키트(Sequencing kit)의 안내문에 따라 수행되었다.
<실시예3>: 프리온 적중 벡터의 도입
(1) 전기충격법(electroporation)에 의한 유전자 전이
우선 GFP와 Puro gene을 이용하여 적정 조건을 설정한 뒤 이를 광우병 유전자 적중 벡터의 유전자 전이에 이용하였다. 상기 실시예 2에서 준비된 적중 벡터를 유일한 제한효소 부위인 Spe I으로 잘라 선형화하하여 DNA를 준비(Conc. 1㎍/㎕) 하였다.
전기 충격법의 조건으로는 소 섬유아세포를 Opti-MEM (10% FBS) 250㎕ 에 20㎍의 적중 벡터와 혼합하여 1000V, 50μF, 2 Pulse 의 조건으로 전기충격을 실시하였다.
(2) 리포좀(liposome)을 이용한 유전자 전이
상기와 마찬가지로 GFP와 Puro gene을 이용하여 적정 조건을 설정한 뒤 이를 광우병 유전자 적중 벡터의 유전자 전이에 이용하였다. 준비된 적중 벡터를 유일한 제한효소 부위인 Spe I으로 잘라 선형화 DNA를 준비(Conc. 1㎍/㎕) 하여 BEF, BLF cell 이용하여 리포펙션 리포펙타민(Lipofection Lipofectamine) (18324-012, Invitrogen) 으로 전이하였다.
<실시예 4> 프리온 유전자 적중 세포주의 선발 및 적중 여부 확인
상기 Puro gene를 포함하는 적중 벡터로 적중된 세포는 24시간 정도 정상배양액에서 회복을 실시한 뒤 2 ㎍/㎖ 선별농도로 푸로마이신 항생제 선발을 3-5일간 실시하였다. 항생제 선발에 의해 생존한 섬유아세포 colony들은 적절한 계대배양을 통하여 96-웰과 24-웰 디쉬를 거쳐 6-웰로 까지 확대 배양하였다. 이들의 반은 동결 보존하고 나머지 반은 게노믹 DNA를 분리하여 위에서 제작된 프라이머를 이용하여 적중세포 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 Puro gene를 포함하는 적중 벡터로 적중한 세포의 적중 여부를 확인하기 위해 PCR을 통해 하이그로마이신 항생제 marker PrP-KO 유전자의 존재 여부를 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다. 먼저, 제작된 프라이머의 검증하기 위해 상기 유전자 적중 벡터를 주형으로 하여 증폭한 결과 (도 11) 유효한 프라이머임을 확인할 수 있었다.
다음으로, 상기의 프라이머 쌍을 이용하여 적중시킨 소의 섬유아세포를 대상으로 PCT 분석을 한 결과 4개의 섬유아세포에서 프리온 적중 벡터가 프리온 유전자게 적중되었음을 확인하였다 (도 12, 레인 7, 14, 21, 29).
더 나아가, PCR에 의해 적중이 확인된 세포를 다시 한번 검증하기 위하여 PCR 서던 블랏 분석을 실시하였다. 그 결과 상기 4개의 세포주에서 올바른 위치에 광우병 유전자가 적중되었음을 확인하였다 (도 13).
또한, 하이그로마이신 B 항생제 내성 마커를 포함하는 적중 벡터로 적중된 세포주는 항생제(50 ㎍/m1 hygromycin)를 함유한 배양액을 이용하여 세포를 선별하였다. 선별된 세포를 체외에서 배양한 후 분자생물학적 방법에 의해 불활성화 여부를 확인하였다. 또한, 상기 하이그로마이신 B 항생제 내성 마커를 포함하는 적중 벡터의 intron II, exon III 부분과 주입된 하이그로마이신 B 영역의 처음과 끝 부분을 합성하기 위한 프라이머를 제작하였고, 약 600bp, 1.5kb, 4.6kb까지의 PCR 산물을 통해 세포주에 광우병 유전자가 적중되었음을 확인하였다(도 10).
도10a의 (A) 본 발명의 적중 벡터를 PCR을 통하여 확인하는 하고자 하는 프라이머의 작제에 관한 것이다.
프라이머#1은 PCR을 통하여 하이그로마이신 항생제 marker PrP-KO 유전자(1.5kb)의 존재여부를 확인할 수 있는 것으로 다음의 서열을 구성된다.
센스: TTGACATTGATTATTGACTAG (서열번호 1)
안티센스: CGCCTTTCTTGGTCGACCCC (서열번호 2)
프라이머#2는 PCR을 통하여 하이그로마이신 항생제 marker PrP-KO 유전자 (600bp)의 존재여부를 증폭할 수 있는 것으로 다음의 서열을 구성된다.
센스: GATGCCACTGCTATGCAGTCAT (서열번호 3)
안티센스: CCCTATTGACGTCAATGACGG (서열번호 4)
프라이머#3은 PCR을 통하여 하이그로마이신 항생제 marker PrP-KO 유전자 (800bp)의 존재여부를 증폭할 수 있는 것으로 다음의 서열을 구성된다.
센스: GATGCCACTGCTATGCAGTCAT (서열번호 5)
안티센스: AGCACGAAAGTCGAGCTACATC (서열번호 6)
프라이머#4은 PCR을 통하여 하이그로마이신 항생제 marker PrP-KO 유전자 (4.6kp)의 존재여부를 증폭할 수 있는 것으로 다음의 서열을 구성된다.
센스: CAACTGAGCTATCAGGGAAGCCC (서열번호 7)
안티센스: CCCTATTGACGTCAATGACGG (서열번호 8)
상기의 각 프라이머 쌍을 이용하여 세포의 적중 여부를 확인한 결과 도 10a의 (B) 내지 도 10c에서 보는 바와 같이, 본 발명의 하이그로마이신 B 항생제 내성 마커를 포함하는 적중 벡터로 적중시킨 세포 내에서 예상된 크기의 밴드를 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 최적의 핵 공여핵 세포의 확인
최적의 핵 공여핵 세포를 확인하기 위해, 공여핵원으로 태아섬유아세포(BEF), 피부 섬유아세포(BSF), 폐 섬유아세포(BLF) 및 난구세포(BCC)를 이용하여 상기 실시예와 동일한 방법으로 프리온 유전자를 적중하였다. 이중에서 피부 섬유아세포에서 가장 많은 생존 콜로니(colony)가 나왔다.
또한, 최적의 유전자 적중을 위해 2부터 5 계대까지의 세포를 사용한 결과 2-3계대에서 가장 좋은 결과를 보였다. 공여핵원 세포의 종류에 따른 유전자 적중 결과는 다음과 같다.
| DNA 구조체 | 합 | |||||||
| No.10 | No.11 | No.12 | No.16 | No.17 | No.18 | |||
| Cell Type | BEF | 14 | 2 | - | - | 2 | 2 | 20 |
| BSF | 108 | 35 | - | 5 | - | - | 148 | |
| BLF | 1 | - | - | - | - | - | 1 | |
| BCC | - | - | - | - | - | - | - | |
| Total | 123 | 37 | - | 5 | 2 | 2 | 169 | |
* 상기 DNA 구조체의 No. 10은 상기 실시예의 Puro gene을 가지는 적중 벡터를 나타낸다.
<실시예 6> 수핵 난자의 준비
도축장에서 채취된 소의 난소로부터 18G 주사침(needle)이 장착된 10ml 주사 기를 사용하여 직경 4mm 내외의 난포를 흡입한 다음, 1cm 간격의 격자 눈금을 그은 100mm 디쉬에 난포를 옮긴 후, 난구 세포가 충분히 부착되어 있고 세포질이 균질한 난자를 선별하였다.
선별된 난자를 세정용 TCM199 배양액(참조: 표 4)이 2ml씩 분주된 35mm 디쉬에서 3회에 걸쳐 세정하고, 배양용 TCM199 배양액(참조: 표 5)으로 최종적으로 세정한 다음, 에스트라디올(Estradiol) 용액 (참조: 표 6) 0.5㎕, 난포자극호르몬 용액 (참조: 표 7) 12.5㎕, 배양용 TCM199 배양액 450㎕ 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 5% CO2의 조건 하에 20시간 동안 배양하여 수핵 난자를 준비하였다.
| 성 분 | 농 도 |
| TCM 분말 | Gibco 31100-027 |
| HEPES | 10mM |
| NaHCO3 | 2mM |
| BSA | 0.5% W/V |
| P/S항생제 | 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) |
| 성 분 | 농 도 |
| TCM 액체 | Gibco 11150-059 |
| Na-피루베이트 | 1mM |
| P/S항생제 | 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) |
| 성 분 | 농 도 |
| 에스트라디올 | 5mg |
| 에탄올 | 10ml |
| 성 분 | 농 도 |
| 난포자극호르몬 | 2AU |
| 배양용 TCM199배양액 | 10ml |
<실시예 7> 체세포의 핵 이식
상기 실시예 6에서 준비된 수핵 난자를 세정용 TCM199 배양액에서 1회 세정하고, 5ml의 세정용 TCM199 배양액에 하이알루로니다제(hyaluronidase, Sigma Chemical Co., USA) 0.0500g을 용해시킨 용액 111㎕과 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합하여 최종 농도를 0.1%로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 세정용 TCM199 배양액에서 3회 세정하고 정치시켰다. 이어, 7.5mg/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B (Sigma Chemical Co., C-6762, USA)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 TCM199 배양액 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세작업장치(micromanipulator, Narishige, Japan)를 사용하여 정치된 수핵 난자 의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 량의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.
좀 더 구체적으로 탈핵 과정을 설명하면, 작업용 디쉬를 미세작업장치의 미세작업판(micromanipulator plate) 위에 놓고, 미세작업장치의 왼쪽 암(arm)에는 고정용 피펫을, 오른쪽 암에는 절개용 피펫을 장착하였다. 그런 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고 절개용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 피펫 조정기를 중립에 놓아 피펫이 상하 좌우로 자유롭게 움직일 수 있도록 조정하였다. 두 피펫을 작업용 미소적에서 상하 유동시키면서, 피펫이 디쉬의 테두리에 닿지 않도록 각도를 조정하고, 피펫 끝을 미소적의 중앙에 위치시켰다. 내경 200㎛ 이상의 세정용 마우스 피펫을 이용하여 세정용 TCM199 배양액에서 난자를 사이토칼라신 B 용액으로 이동시켰다. 이어, 미세작업장치의 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자에 먼저 초점을 맞추고, 2개의 피펫을 상하로 움직여 초점을 조정하였다. 2개의 피펫을 움직여서 고정용 피펫의 12시 방향에 제 1극체가 위치하도록 하고, 고정용 피펫을 난자의 9시 방향에 밀착시킨 뒤, 유압을 걸어 난자를 고정시켰다.
도 14은 고정용 피펫과 절개용 피펫으로 수핵 난자의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 14에서 보듯이, 절개용 피펫(2)을 1시 방향에서 찔러서 투명대를 통과시킨 후, 세포질에 손상을 가하지 않도록 주의하며 11시 방향으로 관통시켰다. 고정용 피펫(1)에 압력을 걸어 난자(3)를 분리하고, 절개용 피펫이 통과한 제 1극체 상단부의 투명대에 고정용 피펫을 접촉시킨 다음, 두 피펫을 마찰하여 투명대를 절개하였다.
도 15는 수핵 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하는 탈핵 과정을 나타낸다. 도 15에서 보듯이 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 배양용 TCM199 배양액에 정치시켰다.
그런 다음, 미세작업장치를 사용하여 탈핵된 수핵 난자에 준비된 공여세포를 이식하였다. 먼저, 5mg의 PHA-P(phytohemagglutinin)를 10ml의 세정용 TCM199 배양액에 용해시킨 용액 100㎕과 400㎕의 세정용 TCM199 배양액을 혼합한 PHA-P 용액으로 작업용 디쉬 상단 중앙에 4㎕의 이식용 미소적을 만들고, 1% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 이식용 미소적 위 아래에 각각 1개씩의 4㎕의 공여세포 미소적을 만들었다. 이들 미소적을 미네랄 오일로 도포한 후, 작업용 디쉬를 미세작업판에 위치시켰다.
미세작업장치에 장착된 절개용 피펫을 이식용 피펫으로 교체한 후, 정치된 탈핵된 난자를 세정용 TCM199 배양액으로 3회 세정하고, 이식용 미소적으로 이동시킨 다음, 이식용 피펫을 사용하여 공여세포를 이식용 미소적으로 이동시켰다.
도 16은 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도 16에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)의 절개창을 양 피펫과 1시 방향으로 놓고 고정용 피펫(1)으로 고정한 다음, 이식용 피펫(4)을 절개창으로 주입하고, 유압으로 공여세포를 주입하여 핵이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양 액으로 옮겨서 3회 세정 후, 정치시켰다.
<실시예 8> 세포 융합 및 활성화
BTX-세포 조작기(electro cell manipulator, ECM 2001, BTX, USA)를 사용하여 핵 이식란을 전기 융합하여 활성화시켰다.
0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO4, 0.05% BSA 및 0.28M 만니톨(mannitol)을 용해시킨 만니톨 용액 15㎕을 세정용 마우스 피펫으로 핵 이식란이 있는 세정용 TCM199 배양액에 첨가하고, 1분간 정치시켰다. 그런 다음, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 세정용 TCM199 배양액이 첨가된 만니톨 용액에 주입하여 다시 1분간 정치시키고, 세정용 마우스 피펫을 이용하여 핵 이식란을 만니톨 용액에 넣었다. 이어, 핵 이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여세포가 (+)전극을 향하도록 핵 이식란을 위치시켰다. 전압은 1kV/cm, 시간은 15㎲, 횟수는 1초 간격으로 2회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵 이식란을 전기융합시켰다. 융합된 핵 이식란을 만니톨 용액을 거쳐 세정용 TCM199 배양액으로 옮긴 후, 3회 세정하였다.
DMSO 1.34ml에 이오노마이신(Sigma Chemical Co., USA) 1mg을 용해시키고, 최종농도가 5 M이 되도록 1% BSA가 첨가된 세정용 TCM199 배양액을 첨가하여 제조된 이오노마이신 용액에 융합된 핵 이식란을 암조건에서 4분간 정치하여 활성화시 킨 후, 융합된 핵 이식란을 10% 소 태아 혈청이 첨가된 세정용 배지가 분주된 35mm 디쉬 내에서 5분간 정치시켜서 이오노마이신을 제거하였다.
<실시예 9> 융합된 핵 이식란의 후활성화 및 배양
에탄올 100ml에 사이클로헥시미드(Sigma Chemical Co., USA) 1g을 용해시키고, 최종농도가 10㎍/㎖가 되도록 체외 배양용 배지인 mTALP (참조: 표 2)과 혼합한 사이클로헥시미드 용액 25㎕에 전기 활성화된 핵 이식란을 침지하고, 4시간 동안 배양하여 후활성화시켰다. 그런 다음, 검란하여 선별된 핵이식란을 mTALP에 넣고, 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하였다.
본 발명자들은 상기 실시예에 따라 제조한 핵 이식란을 SNU-B5로 명명하여, 이를 2003년 11월 25일자로 국제기탁기관인 생명공학연구소(KRIBB) 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 10555BP로 기탁하였다.
<실시예 10> 당원의 배양배지 내 첨가 농도에 따른 체외수정란 및 핵이식란의 발율률 검토
체외 배양시 핵 이식란의 배반포 발육률을 높이기 위해 배양배지에 첨가된 당원과 그 농도에 따른 핵이식란 및 체외수정란의 발육률을 비교하였다. 글루코즈(Glucose), 프락토즈(fructose) 및 갈락토즈(galactose)를 몇 가지 농도로 첨가하여 배양하였다. 배양결과 1.5mM 프락토즈 첨가군에서 핵 이식란과 체외수정란 모두 40% 수준의 배반포 발육율을 보였다(표 8, 9).
| 처리 | 배양된 핵 이식란의 수 | 다음의 단계로 발달된 핵 이식란 % | |||
| 2 셀[48] | 8 셀[72] | 상실배[120] | 배반포[168] | ||
| 글루코즈 제거 | 120 | 70a | 48a | 20a | 13a |
| 배지 변경없음 | 120 | 73ab | 51a | 31ab | 23b |
| 글루코즈, 5.6mM | 116 | 28c | 14b | 5c | 2c |
| 프락토즈, 1.5mM | 126 | 80b | 55a | 37b | 33d |
| 프락토즈, 5.6mM | 120 | 73bc | 53a | 33b | 28bd |
| 갈락토즈, 1.5mM | 108 | 75bc | 42a | 25a | 22b |
| 갈락토즈, 5.6mM | 100 | 21c | 10b | 0c | 0c |
괄호 속이 숫자는 핵 이식 후의 경과시간을 나타낸다.
a-d 각 변수에서의 다른 첨자는 현저하게 차이가 남, p<0.05.
| 처리 | 배양된 체외 수정란의 수 | 다음의 단계로 발달된 수정란 % | |||
| 2 셀[48] | 8 셀[72] | 상실배[120] | 배반포[168] | ||
| 글루코즈 제거 | 132 | 78a | 50ab | 23a | 11a |
| 배지 변경없음 | 160 | 73ab | 53b | 33b | 26b |
| 글루코즈, 5.6mM | 123 | 63b | 36a | 15a | 11a |
| 프락토즈, 1.5mM | 162 | 79a | 56b | 39b | 34c |
| 프락토즈, 5.6mM | 124 | 72` | 54b | 33b | 27bc |
| 갈락토즈, 1.5mM | 120 | 60c | 40a | 3c | 0d |
| 갈락토즈, 5.6mM | 120 | 16d | 8c | 0c | 0d |
괄호 속이 숫자는 핵 이식 후의 경과시간을 나타낸다. 각 처리에 p 값은 0.0001이었다. a-d 각 변수에서의 다른 첨자는 현저하게 차이가 남, p<0.05.
<실시예 11> 프락토즈 농도에 따른 핵이식란의 발육
상기 실시예 10에서 양호한 배반포로의 발육률을 보였던 프락토즈의 농도에 따른 핵이식란의 발육률을 비교하기 위해 mSOF 배양 배지에 프락토즈를 각각 0, 0.75, 1.5, 3.0 및 5.6mM의 농도로 첨가하여 배양하였다. 그 결과 상기의 결과와 유사하게 1.5mM의 농도로 첨가한 경우 발육율이 가장 좋았다 (표 10).
| 처리 농도 | 배양된 핵 이식란의 수 | 다음의 단계로 발달한 핵 이식란 % | |||
| 2-셀 | 8-셀 | 상실배 | 배반포 | ||
| 0 | 90 | 68ab | 46 | 23a | 11a |
| 0.75 | 133 | 63b | 41 | 15a | 11a |
| 1.5 | 120 | 73b | 56b | 45b | 41c |
| 3.0 | 119 | 76b | 54b | 33b | 27bc |
| 5.6 | 125 | 73b | 8c | 0c | 0d |
a-c 각 변수에서의 다른 첨자는 현저하게 차이가 남, p<0.05.
<실시예 12> 배양배지 내의 글루코즈 및 프락토즈 농도에 따른 핵이식란의 발육
글루코즈 및 프락토즈의 농도에 따른 핵이식란의 발육률을 알아보기 위해 글루코즈와 프락토즈의 농도를 각각 4개 군으로 달리하여 핵이식란을 배양하였다. 실험 결과, 1.5mM 글루코즈 및 3.0mM 프락토즈 군에서 유의적으로 높은 배반포로의 발육률을 보였다 (표 11).
| mSOF 내의 1.5mM의 첨가(+) 또는 미첨가(-) | 프락토즈 농도 (mM) | 배양된 핵 이식란의 수 | 다음의 단계로 발달된 핵 이식란 % | |||
| 2셀[48] | 8셀[72] | 상실배 [120] | 배반포[168] | |||
| - | 1.5 | 121 | 73a | 50a | 36 | 31a |
| + | 1.5 | 101 | 85b | 56a | 37 | 33b |
| + | 3.0 | 88 | 74a | 58a | 48 | 35a |
| + | 5.6 | 72 | 65a | 34b | 32 | 22c |
괄호 속의 숫자는 체세포 핵 이식 후의 시간을 나타낸다.
ab 각 변수에서의 다른 첨자는 현저하게 차이가 남, p<0.05.
<실시예 13> 배양배지 내의 당단백(Glycosaminoglycans) 첨가 여부에 따른 핵이식란의 발육
배양배지 내의 첨가된 당단백(GAGs)의 종류와 농도에 따른 핵 이식란의 발육률과 배반포에서의 발육상태를 알아보기 위해 대표적인 GAGs인 히알루론산(hyaluronic acid), 헤파린(heparin), 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate)을 배양 배지에 0, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 첨가하여 핵이식란을 배양하였다. 배양결과 GAGs가 0.5mg/ml 군에서 유의적으로 높은 발육률을 보였고, 배반포를 분별염색한 결과 다른 군에 비해 영양막 세포 비율이 유의적으로 높아 핵 이식란의 생존도(viability)가 증가됨을 알 수 있었다(표 12).
| 재구성된 핵 이식란 (n=15) | 대조 | HA* | Heparin | CS** |
| ICM*** | 32.2 ±4.6a | 32.8 ± 4.5a | 31.7 ± 2.8a | 33.2 ± 4.5a |
| TE**** | 51.2 ±4.5a | 64.2 ± 5.4b | 62.5 ± 3.5b | 60.1 ± 4.6b |
| Total | 83.4 ±6.0a | 97.0 ± 5.7b | 94.2 ± 3.5b | 93.4 ± 6.4b |
HA*:히알루론산, CS**:황산콘드로이틴, ICM***:내세포괴, TE****
T영양막 세포
<실시예 14> 공여핵 세포의 종류에 따른 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율
상기의 실시예와 동일한 과정을 공여핵 세포를 달리하여 형질전환 핵 이식란의 발육률 및 발현율을 비교하였다. 3 개의 세포주로 40~50일령의 태아에서 유래한 소 태아의 섬유아세포, 성숙한 소의 귀 섬유아세포 및 성숙한 소의 난구 세포를 사용하였다.
준비된 3개의 세포주에 프리온 적중 벡터를 도입 및 적중하고, 외래 유전자가 도입 및 적중된 세포를 탈핵 난자와 융합하여 발생되는 경과를 살펴 보았다. 그 결과는 다음의 표 13 및 표 14에 나타내었다.
| 공여핵 세포의 종류 |
엠브리오의 수 | ||||
| 주입 | 융합(%) | 분할(%) | 배반포로의 발생(%) | 배반포에서의 발현(%) | |
| 태아 섬유아세포 | 363 | 214(59.0) | 109(50.9) | 15(7.0) | 4(26.7) |
| 난구 세포 | 426 | 334(78.4) | 245(73.4) | 96(28.7) | 52(54.2) |
| 귀 섬유아세포 | 379 | 303(79.9) | 203(67.0) | 46(15.2) | 13(28.3) |
| 공여핵 세포의 종류 | 이식된 엠브리오의 수 | 대리모의 수 | 임신된 수(%) |
| 태아 섬유아세포 | 3 | 2 | 0 |
| 난구 세포 | 31 | 28 | 1(3.6) |
| 귀 섬유아세포 | 27 | 24 | 2(8.3) |
상기의 결과로부터 태아 섬유아세포보다는 성숙한 소로부터 유래한 난구 세포 또는 귀 섬유아세포를 핵 공여세포로 한 경우에 배반포에서의 발현률이 높고, 또한 핵 이식란의 임신 성공율이 높다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 15> 핵 이식란의 동결보존, 융해 및 이식
상기 핵 이식란을 장기간 보존하기 위하여, 동결 보존을 수행하였다. 먼저, 동결용 배지(참조: 표 15, 표 16)를 35mm 디쉬에 분주하고, 동결기를 가동하여 -5 를 유지시킨 다음, 동결할 핵 이식란을 선발하여 10% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS로 세정하고 동결용 배지에 넣어 20분간 정치시켰다. 이어, 0.25ml 스트로우(straw)의 양 끝단에 공기층을 2층씩 만들어, 가운데에 수정란이 포함된 동결용 배지를 흡입하여 수정란을 장착하고, 가열한 집게(forcep)를 사용하여 열 밀봉(heat sealing)하였다. 그런 다음, -5℃ 에서 동결기에 스트로우를 장착하고, 5분간 이 온도를 유지시킨 다음, 액체질소로 예냉한 집게로 스트로우의 하단을 살짝 집어주어 식빙(seeding)시켰다. 식빙한 직후, -0.3 /min의 속도로 -30℃ 까지 온도를 하강시킨 다음, -30℃ 가 되면 10분간 온도를 유지시키고, 이를 액체질소 탱크에서 동결보존하였다.
| 성 분 | 농 도 |
| PBS(1x) | Gibco 14190-144 |
| Na-피루베이트 | 0.033mM |
| 포도당 | 0.15mM |
| CaCl2?2H2O | 0.171mM |
| P/S항생제 | 1% (페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) |
| MgCl2?6H2Om | 0.049mM |
| 성 분 | 농 도 |
| 동결용 PBS(표 8) | 2.25ml(45%) |
| 소 태아 혈청 | 2.25ml(45%) |
| 글리세롤 | 0.5ml(10%) |
이처럼 동결 보존한 핵 이식란을 융해시키기 위하여, 먼저 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS와 융해용 배지를 35mm 디쉬에 3ml씩 분주하고, 각각에 글리세롤을 첨가하여 포함된 글리세롤 농도가 0%, 3% 및 6%가 되도록 제조하였다 (참조: 표 15 및 표 17). 그런 다음, 액체질소 탱크로부터 동결된 스트로우를 꺼내 공기 중에서 5초간 노출시킨 후, 직경 20cm 이상인 용기에 담겨진 30℃ 의 온수에 30초간 담가서 융해시켰다. 이어, 무균적으로 스트로우의 양 끝단 공기층을 절단하여, 스트로우 내의 배지를 디쉬에 밀어내고, 현미경 하에서 수정란을 확인한 다음, 차례대로 핵 이식란을 6% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하고, 3% 글리세롤의 융해용 배지에서 5분간 정치하며, 글리세롤이 없는 융해용 배지에서 5분간 정치시킴으로써, 핵 이식란에 함유된 동결용 배지를 제거하였다.
| 성 분 | 6% 글리세롤 PBS | 3% 글리세롤 PBS | 0% 글리세롤 PBS |
| PBS | (표 8) | (표 8) | (표 8) |
| BSA | 0.5% | 0.5% | 0.5% |
| 글리세롤 | 6% | 3% | 0% |
| 자당 | 0.3M | 0.3M | 0.3M |
<실시예 16> 핵 이식란의 대리모에의 이식
상기 핵 이식란을 20% 소 태아 혈청이 첨가된 PBS에 침적시키고, 이를 스트로우에 장착한 다음, 대리모의 자궁각내 심부에 이식하였다.
<실시예 17> 프리온 유전자가 적중된 광우병에 내성을 가진 복제 소의 산자 생산 및 산자의 유전자 확인
상기의 실시예를 통해 생산된 형질전환 복제소를 분자생물학적 방법으로 유전자 분석을 하였다. 프리온 유전자가 적중된 복제소는 조직을 이용한 서던블랏, 웨스턴 블랏 및 세포배양을 통하여 유전자 적중 여부를 분석하였다.
본 발명은 체세포에 외래 유전자를 도입 및 적중하는 기술 및 체세포 복제 기술을 접목함으로써 특정 질병에 대하여 내성을 가진 복제 동물을 생산하는 방법 및 이 방법으로 생산된 특정 질병에 대한 내성을 가진 복제 동물을 제공한다. 특히, 본 발명의 형질전환 복제 소는 광우병에 내성을 가지는 것을 특징으로 한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 기술은 단지 바람직한 실시예 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seoul National University Industry Foundation
<120> Transgenic cloned cow carrying a knock-out prion-encoding gene
and method for producing the same
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ttgacattga ttattgacta g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
cgcctttctt ggtcgacccc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gatgccactg ctatgcagtc at 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ccctattgac gtcaatgacg g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
gatgccactg ctatgcagtc at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
agcacgaaag tcgagctaca tc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
caactgagct atcagggaag ccc 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ccctattgac gtcaatgacg g 21
Claims (25)
- 소의 프리온 유전자 (Gen bank Accession Number AJ298878) 중 인트론 2 및 엑손 3 부위를 포함하는 염기서열 60718 내지 68158 부위가 적중된, 소 유래의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포 및 난구세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포주.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 세포주의 핵을 소 유래의 탈핵된 난자에 이식하여 형성된, 소의 프리온 유전자 (Gen bank Accession Number AJ298878) 중 인트론 2 및 엑손 3 부위를 포함하는 염기서열 60718 내지 68158 부위가 적중된 핵 이식란.
- 삭제
- 제4항에 있어서, 상기 핵 이식란은 수탁번호 KCTC 10555BP인 것을 특징으로 하는 핵 이식란.
- 제4항에 따른 핵 이식란을 대리모에 이식하여 생산된 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 복제 소의 유전형질은 제1항의 세포주 또는 제4항의 핵 이식란의 유전형질과 동일한 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소.
- (1) 소의 프리온 유전자 (Gen bank Accession Number AJ298878) 중 인트론 2 및 엑손 3 부위를 포함하는 염기서열 60718 내지 68158 부위를 적중시키는 적중 벡터를 작제하는 단계; 및(2) 상기 적중 벡터를 소 유래의 자궁관류액, 자궁내막, 난관, 귀 또는 근육으로부터 분리된 세포 및 난구세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포주에 도입하는 단계를 포함하는 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포의 작제 방법.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 상기 적중 벡터는 항생제 선별 마커 또는 프로모터 또는 폴리A를 더 삽입시키는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포의 작제 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 항생제 선별 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 푸로마이신 포스포트랜스퍼라제, 브라스티시딘 포스포트랜스퍼라제, 티미딘 키나제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 아스파라긴 신타제 및 CAD(카바밀 포스페이트 신타제/아스파테이트 트랜스카바밀라제/디하이드로오로타제)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포의 작제 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 적중 벡터가 항생제 선별 마커로 푸로마이신 저항 유전자, 프로모터 및 폴리 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포의 작제 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 적중 벡터가 항생제 선별 마커로 하이그로마이신 B 저항 유전자, 프로모터 및 폴리 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포의 작제 방법.
- 삭제
- (1) 소 유래의 수핵 난자의 난구 세포를 제거하고, 수핵 난자의 제 1극체를 포함한 세포질을 제거하여 난자를 탈핵하는 과정을 포함하는 소 유래의 수핵 난자를 준비하는 단계; 및(2) 상기 제10항, 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따른 소의 프리온 코딩 유전자가 적중된 소 유래 체세포를 탈핵된 수핵 난자에 이식하고 융합시켜 핵 이식란을 작제하는 단계를 포함하는 소의 프리온 유전자 (Gen bank Accession Number AJ298878) 중 인트론 2 및 엑손 3 부위를 포함하는 염기서열 60718 내지 68158 부위가 적중된 핵 이식란 작제 방법.
- 제17항에 있어서, 작제된 핵 이식란을 핵 이식란 배양배지에서 체외 배양하는 과정을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 핵 이식란 작제 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 배양배지가 1.0 내지 2.0 mM의 프락토즈가 더 첨가된 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 핵 이식란 작제 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 배양배지가 1.0~1.5 mM의 글루코즈 및 2.5~3.0 mM의 프락토즈가 더 첨가된 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 핵 이식란 작제 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 작제된 핵 이식란이 KCTC 10555BP인 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 핵 이식란 작제 방법.
- 제17항에 따른 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는 소의 프리온 유전자 (Gen bank Accession Number AJ298878) 중 인트론 2 및 엑손 3 부위를 포함하는 염기서열 60718 내지 68158 부위가 적중된 형절전환 복제 소의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 핵 이식란이 KCTC 10555BP인 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 형절전환 복제 소의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하기 전에 전기 융합을 통한 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소의 프리온 유전자가 적중된 형절전환 복제 소의 생산 방법.
- 제 24항에 있어서, 상기 전기 융합이 직류전압을 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간을 10 내지 20㎲, 횟수는 0.01초 내지 10초 간격으로 1 내지 5회에 걸쳐 실시하는 것을 특징으로 하는 형질전환 복제 소의 생산방법.
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| KR20010005426A (ko) * | 1999-06-30 | 2001-01-15 | 황우석 | 체세포 복제동물 및 그 생산방법 |
| KR20010047362A (ko) * | 1999-11-19 | 2001-06-15 | 복성해 | 체세포 핵치환 복제수정란의 대량생산방법 |
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-
2003
- 2003-12-09 KR KR1020030088987A patent/KR101141733B1/ko not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
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