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KR101156207B1 - 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법 - Google Patents

인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법 Download PDF

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KR101156207B1
KR101156207B1 KR1020110087155A KR20110087155A KR101156207B1 KR 101156207 B1 KR101156207 B1 KR 101156207B1 KR 1020110087155 A KR1020110087155 A KR 1020110087155A KR 20110087155 A KR20110087155 A KR 20110087155A KR 101156207 B1 KR101156207 B1 KR 101156207B1
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Abstract

본 발명은 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 골다공증 치료 약물인 비스포스포네이트계 약물을 국부전달하기 위한 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법{The process for preparing calcium phosphate microspheres drug delivery system}
본 발명은 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 골다공증 치료 약물인 비스포스포네이트계 약물을 국부전달하기 위한 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되고 있는 비스포스포네이트계 약물은 경구로 투여되고 있다. 이러한 제제가 갖는 단점은 5~10년간의 장기간 복용, 공복에 투여, 약물투여 후 직립상태 유지 등 환자가 복용하는데 불편함이 많고 위장장애 등 부작용이 수반되는 것으로 알려져 있다. 또한, 생체이용율(bioavailability)이 1~2%로 극히 낮아 높은 치료효율을 기대하기 어려운 단점이 있다.
이러한 경구용 비스포스포네이트계 제제는 인체를 구성하는 전체 뼈의 골밀도를 어느 정도 향상시키나, 골절위험이 큰 고관절, 척추 및 손목 등에 집중적인 치료가 이루어져야 한다. 따라서, 한번 시술로 장기간의 약물효과를 기대할 수 있는 비스포스포네이트계 약물의 국부전달을 위한 유용한 전달시스템의 필요성이 요구되고 있다.
인산칼슘계(calcium phosphate) 무기물은 인체뼈를 구성하는 미네랄과 조성 및 결정상이 유사하며 생체 적합성이 뛰어난 물질로, 체내 주입 시 주변 세포에 의해 재흡수가 잘 되고 칼슘 이온(Ca2 +)과 인산염 이온(PO4 3 -)으로 용해됨으로써 골 결손이 발생하였을 때 새로운 골 형성을 증진시키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 이러한 장점을 갖는 인산칼슘계 무기물을 이용한 약물전달체에 대하여 많은 연구가 진행중에 있으며, 특히 인산칼슘 제제의 표면에 골다공증 치료에 효과적인 약물 중 대표적인 약물인 비스포스포네이트계 약물을 흡착시켜 봉입하거나, 인산칼슘 제제와 비스포스포네이트계 약물을 압축하여 정제 또는 분말제로 만들어 투여하는 방법에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 이러한 조합에 의한 약물 전달 방법은 대퇴 경부(femur neck)나 척추 말단(distal radius) 그리고 척추(vertebral bodies) 등의 골 밀도 감소가 주로 일어나는 부위에 도입 시, 인산칼슘 제제와 약물이 서로 상보적인 작용에 의해 골 강화 현상이 발생하게 된다.
그러나 인산칼슘계 무기물 중에서, 대표적인 수산화아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2)는 인체 골 성분 중 70%를 차지하는 무기질의 주성분이지만 비스포스포네이트계 약물과의 화학적 연상(chemical association)에 대해 밝혀진 바가 없고, 순수 수산화아파타이트와 같은 경우 매우 느리게 용해가 일어나기 때문에 골 재생에 효과적인 인산칼슘계 무기물로는 적절하지 못하다.
또한 종래 인산칼슘 제제의 표면에 약물을 흡착시켜 약물전달체를 제조하는 경우 약물 봉입량이 낮고, 제조공정이 다소 복잡하다는 문제점이 있다.
이에 따라, 상기와 같은 단점을 보완할 수 있고 생체 활성이 더욱 뛰어난 인산칼슘 제제에 대한 연구와 이 제제의 재흡수와 새로운 골 형성 능력을 균형있게 증가시키기 위한 방법과 함께 기존에 사용되어 오던 경구 투여용 방식이 아닌 주입형 방식의 약물전달체에 대한 필요성이 요구되고 있다. 따라서, 이에 대한 연구가 많이 시도되고 있다.
이에, 본 발명자들은 약물 봉입량이 높고 제조공정이 간단하며 치료 효과를 극대화시킬 수 있는 주입형 방식의 약물전달체에 대해 연구하던 중, 수산화아파타이트, 비스포스포네이트계 약물 및 우레아가 함유된 산성 수용액을 오일 상에 에멀젼시킨 후, 우레아의 열분해에 의한 pH 상승을 통해 인산칼슘 마이크로스피어 결정 입자를 형성함으로써 비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 in-situ로 봉입하여 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체를 제조하였다. 상기 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체는 에멀젼에 의하여 마이크로 크기의 구형 입자를 고르게 형성함으로써 비스포스포네이트계 약물을 국부전달하기에 유용함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 골다공증 치료 약물인 비스포스포네이트계 약물을 국부전달하기 위한 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명에 따른 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제를 주사전자 현미경(SEM)으로 관찰한 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조시 알렌드로네이트를 봉입하기 위하여 도입한 in-situ 반응에서 우레아의 열분해에 따른 pH 변화를 측정한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제를 X-선 분말 회절기(X-ray powder diffraction, XRD)로 측정한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 봉입량을 확인하기 위하여 자외선-가시광선 분광 분석기(UV-VIS spectrophotometer)로 측정한 도이다.
본 발명은 비스포스포네이트계 약물이 수산화아파타이트 내부 및 표면에 봉입되어 있는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 비스포스포네이트계 약물 및 우레아 ((NH2)2CO)를 함유하는 산성 수용액(pH 2.5)을 미네랄 오일에 첨가하여 유중수형 (water-in-oil, W/O) 에멀젼을 형성하는 단계,
2) in-situ 반응으로, 상기 1)단계에서 형성된 유중수형 에멀젼을 승온시켜 우레아의 열분해에 의한 pH 상승을 통해 인산칼슘 마이크로스피어 결정이 형성됨과 동시에 비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 봉입하는 단계를 포함하는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체 내에 봉입되어 있는 비스포스포네이트계 약물은 골다공증 치료에 유용한 약물로서, 에티드로네이트 (etidronate), 클로드로네이트(clodronate), 팔미드로네이트(palmidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트 (risedronate), 졸레드로네이트(zoledronate), 틸루드로네이트(tiludronate), YH529, 이카드로네이트(icadronate), 올파드로네이트(olpadronate), 네리드로네이트(neridronate) 및 EB-1053 등을 포함하며, 특히 알렌드로네이트가 가장 바람직하다. 그러나 이에 한정되지 않는다.
수산화아파타이트와 비스포스포네이트계 약물의 중량비(w/w)는 1:0.01 내지 1:0.5인 것을 특징으로 한다. 만일 수산화아파타이트와 비스포스포네이트계 약물의 중량비가 1:0.5를 초과하면 봉입하려는 약물이 너무 많아 인산칼슘의 재결정을 방해하므로 구형의 인산칼슘 마이크로스피어의 형성이 어려우며, 1:0.01 미만이면 약물 봉입량이 너무 작아 효과적인 약물전달이 어렵다.
본 발명의 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법에서, 첫 번째 단계인 유중수형(water-in-oil, W/O) 에멀젼 형성 단계는 수산화아파타이트, 비스포스포네이트계 약물 및 우레아를 함유하는 산성 수용액을 마이크로 크기로 존재시키기 위한 것이다. 즉, 수산화아파타이트를 pH 2.5의 산성 수용액에 녹인 후, 비스포스포네이트계 약물과 우레아를 첨가한다. 이 산성 수용액을 강하게 회전하는 미네랄 오일에 천천히 떨어뜨려 미네랄 오일 속에서 마이크로 크기를 가지는 균일한 수용액 상태로 존재시키기 위해 에멀젼 단계를 거친다. 에멀젼 형성 시, 산성 수용액 마이크로 방울을 미네랄 오일 속에서 응집없이 균일한 크기로 유지시키기 위해 계면 활성제인 스판85(span85)를 첨가한다.
본 발명의 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법에서, 두 번째 단계는 상기 에멀젼 반응에 의해 형성된 마이크로 크기를 가지는 산성 수용액을 in-situ 반응을 통해 마이크로 크기의 인산칼슘 구형 입자를 형성함으로써 비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 봉입하는 것이다.
비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 봉입하는 in-situ 반응 메커니즘은, 산성 수용액의 승온에 의해 용액 내부 및 표면에 있는 우레아가 가수분해되며 이때 나타나는 pH 증가로 설명할 수 있다. 우레아의 가수분해는 반응식 1로 표시된다.
[반응식 1]
Figure 112011067607833-pat00001
우레아가 포함된 산성 용액을 서서히 상온에서 90℃까지 승온시키면 우레아의 가수분해가 일어나게 된다. 가수분해에 의해 인산칼슘 제제와 비스포스포네이트계 약물인 알렌드로네이트가 용해되어 있는 산성 수용액 속의 수소이온 농도가 pH 2.5에서 pH 6.5까지 증가한다.
Figure 112011067607833-pat00002
상기 구조식에서, R1은 OH 이고, R2는 -(CH2)3NH2 이다.
우레아의 열분해에 의해 산성 수용액 내부의 pH가 상승하게 되면 수산화아파타이트가 새로운 조성의 인산칼슘 제제로 재결정된다. 이때, 칼슘 이온(Ca2 +)과 알렌드로네이트의 인산그룹과의 강한 결합 친화력에 의해 마이크로 크기의 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 알렌드로네이트가 봉입되는 것이다.
본 발명에 따라 수산화아파타이트 내부 및 표면에 비스포스포네이트계 약물을 봉입하게 되면 균일한 마이크로 크기의 인산칼슘 제제 구형 입자를 형성할 수 있고, XRD 측정에 의해 순수 수산화아파타이트와 다른 회절 피크를 나타내며, 비스포스포네이트계 약물의 봉입량이 증가할수록 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 결절성이 떨어지고, 칼슘과 인의 비율이 비스포스포네이트계 약물의 함량이 증가함에 따라 낮아지는 것으로 보아 약물의 봉입량이 점차 증가함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 비스포스포네이트계 약물이 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제는 순수 수산화아파타이트가 아닌 새로운 인산칼슘 제제로 변화한 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 약물을 봉입하는 방법은 느린 용해에 의해 골재생 효과에 비효율적인 인산칼슘계 수산화아파타이트의 조성을 변화시켜 체내 주입 시 칼슘 이온(Ca2 +)과 인산염 이온(PO4 3 -)으로 용해됨으로써 골 결손이 발생하였을 때 새로운 골 형성을 증진시키는 새로운 조성의 인산칼슘 제제로 변화시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 새로운 조성의 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 골다공증 치료 약물인 비스포스포네이트계 약물, 특히 알렌드로네이트를 봉입하는 경우, 인산칼슘 제제로부터 알렌드로네이트의 서방형 방출(sustained release)이 기대된 골 밀도가 낮은 부위의 골 강화현상을 가져올 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조
1. 마이크로 크기의 산성 수용액 형성
마이크로 크기의 산성 수용액 형성은 에멀젼 반응을 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2) 0.1g을 20㎖의 증류수에 넣고, 염산 (1N HCl)을 이용하여 pH 2.5로 조절하였다. 일정한 함량(11.1㎎, 25㎎, 42㎎)의 알렌드로네이트(C4H18NNaO10P2)와 우레아((NH2)2CO) 1g을 동시에 넣고 상온에서 균일하게 혼합하였다. 미네랄 오일 79.2g에 스판85(span85) 0.8g을 넣고 1시간 동안 충분하게 혼합하였다. 상기 제조한 산성 수용액을 1000rpm으로 회전하는 미네랄 오일에 천천히 떨어뜨렸다. 이 후, 2시간 동안 회전시켜 수산화아파타이트, 알렌드로네이트 및 우레아가 존재하는 마이크로 크기의 산성 수용액을 형성하였다.
2. 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조
상기 1에서 형성된 마이크로 크기의 산성 수용액이 존재하는 미네랄 오일을 1000rpm을 유지하며 분당 0.5℃씩 상온에서 90℃까지 천천히 승온시킨 후, 90℃에서 7시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물을 2500rpm의 속도로 15분간 원심분리 후, 상층액을 제거하였다. 이 후, 에테르와 원심분리기를 이용하여 2500rpm의 속도로 15분간 3회 세척하였다. 48시간 동안 동결건조하여 내부 및 표면에 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제를 얻었다.
비교예 1 : 알렌드로네이트가 봉입되지 않은 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조
상기 실시예 1에서 알렌드로네이트를 사용하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 인산칼슘 마이크로스피어 제제를 제조하였다.
실험예 1 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 크기 및 모양 측정
상기 실시예 1에서 제조한 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제를 Cressington Scientific Instruments 108 auto sputter coater 위에서 금(Au)으로 코팅한 후, 주사전자 현미경(SEM, SM-300, TOPCON)으로 관찰하였다. 이때 SEM 영상의 가속전압(accelerating voltage)은 15kV이었다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 평균크기는 200 ㎛이고, 좁은 크기분포를 가지며, 구형 형상을 나타내었다.
실험예 2 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조 시 우레아의 열분해에 따른 pH 변화 측정
상기 실시예 1에서 제조한 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 제조시 알렌드로네이트를 봉입하기 위하여 도입한 in-situ 반응에서 우레아의 열분해에 따른 pH 변화를 측정하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, in-situ 반응 시, 온도를 상온에서 90℃까지 천천히 승온시키면 pH가 2.5에서 6.5까지 상승함을 알 수 있다. 이 반응을 통해 산성 수용액 내부의 수산화아파타이트가 새로운 조성의 인산칼슘 제제로 재결정됨을 알 수 있다.
실험예 3 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 정성분석
상기 실시예 1에서 제조한 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 결정상을 확인하기 위하여, X-선 분말 회절기(X-ray powder diffraction, XRD; Rigaku D/max_RB apparatus (Tokyo, Japan))를 이용하여 측정하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 약물이 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 결정 형태는 순수 수산화아파타이트와 다른 회절 피크를 나타내었다. 또한, 알렌드로네이트의 봉입량이 증가할수록 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 결정성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 봉입량 및 봉입 효율 측정
본 발명에 따른 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 봉입량 및 봉입 효율을 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 인산칼슘 마이크로스피어에 봉입된 알렌드로네이트의 함량을 결정하기 위하여, 산성용액에 알렌드로네이트가 봉입된 마이크로스피어를 용해시켜 염화철[iron(Ⅲ) chloride]을 첨가한 후, 알렌드로네이트-철(Ⅲ) 복합체의 흡광도를 자외선-가시광선 분광 분석기(UV-VIS spectrophotometer)로 측정하였다. 또한, 알렌드로네이트의 봉입 효율은 하기 수학식 1로 계산하였다.
결과는 표 1 및 도 4에 나타내었다.
[수학식 1]
알렌드로네이트의 봉입 효율(중량%) = (Wl/Wt) × 100%
Wl : 봉입된 알렌드로네이트의 중량,
Wt : 사용한 알렌드로네이트의 중량.
시료 수산화아파타이트 (HAp) (g) 알렌드로네이트
(㎎)		 약물 봉입량
(Drug-loading content) (wt%)		 봉입 효율
(Encapsulation efficiency) (%)
CaP-P-0 0.1 - - -
CaP-P-10 0.1 11.1 8.06 80.6
CaP-P-20 0.1 25 14.44 72.2
CaP-P-30 0.1 42 16.08 53.6
표 1 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 내부 및 표면에 봉입된 알렌드로네이트의 양은 알렌드로네이트의 주입양이 증가함에 따라 증가하였으며, 알렌드로네이트의 주입양이 11.1㎎ 일 때 봉입 효율이 가장 우수하였다.
실험예 5 : 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 칼슘과 인의 비율 측정
상기 실시예 1에서 제조한 알렌드로네이트가 함량별로 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제, 비교예 1에서 제조한 알렌드로네이트가 봉입되지 않은 인산칼슘 마이크로스피어 제제, 및 순수 수산화아파타이트의 칼슘과 인의 몰비율을 Perkin Elmer Sciex Elan 6100 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)을 이용하여 측정하였다.
결과는 표 2에 나타내었다.
시료 Ca/P 몰비율
HAp 1.67
CaP-P-0 1.56
CaP-P-10 1.35
CaP-P-20 1.24
CaP-P-30 1.21
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제의 칼슘과 인의 비율이, 순수 수산화아파타이트의 칼슘과 인의 비율인 1.67과 달리, 알렌드로네이트의 함량이 증가함에 따라 낮아지는 것으로 보아 약물의 봉입량이 점차 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 제제가 순수 수산화아파타이트가 아닌 새로운 인산칼슘 제제로 변화한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 알렌드로네이트가 봉입된 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체는 수산화아파타이트, 비스포스포네이트계 약물 및 우레아가 함유된 산성 수용액을 오일 상에 에멀젼시킨 후, 우레아의 열분해에 의한 pH 상승을 통해 인산칼슘 마이크로스피어 결정 입자를 형성함과 동시에 비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 제제 내부 및 표면에 in-situ로 봉입함으로써, 기존의 표면흡착방법으로 인산칼슘 제제 표면에 비스포스포네이트계 약물을 흡착시켜 봉입하는 기술에 비해 약물 봉입량이 높고, 제조공정이 간편한 장점이 있다.

Claims (5)

1) 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2), 비스포스포네이트계 약물 및 우레아 ((NH2)2CO)를 함유하는 산성 수용액(pH 2.5)을 미네랄 오일에 첨가하여 유중수형 (water-in-oil, W/O) 에멀젼을 형성하는 단계,
2) in-situ 반응으로, 상기 1)단계에서 형성된 유중수형 에멀젼을 승온시켜 우레아의 열분해에 의한 pH 상승을 통해 인산칼슘 마이크로스피어 결정이 형성됨과 동시에 비스포스포네이트계 약물을 인산칼슘 마이크로스피어 내부 및 표면에 봉입하는 단계를 포함하는 비스포스포네이트계 약물이 수산화아파타이트 내부 및 표면에 봉입되어 있는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 유중수형 에멀젼의 승온 조건은 상온에서 90℃까지 승온시키는 것을 특징으로 하는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 pH는 2.5에서 6.5까지 증가하는 것을 특징으로 하는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비스포스포네이트계 약물은 에티드로네이트 (etidronate), 클로드로네이트(clodronate), 팔미드로네이트(palmidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 이반드로네이트(ibandronate), 리세드로네이트 (risedronate), 졸레드로네이트(zoledronate), 틸루드로네이트(tiludronate), YH529, 이카드로네이트(icadronate), 올파드로네이트(olpadronate), 네리드로네이트(neridronate) 및 EB-1053으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비스포스포네이트계 약물은 알렌드로네이트인 것을 특징으로 하는 인산칼슘 마이크로스피어 약물전달체의 제조방법.
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