KR101225473B1 - ＩｇＥ 시그날 펩티드 및/또는 ＩＬ-15를 암호화하는 핵산 서열 및 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

융합 단백질 및 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 기재하고 있다. IL-15 단백질 서열에 연결된 비-IL-15 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터; 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포 뿐만 아니라 재조합 백신 및 융합 단백질을 암호화하는 약독화된 생 병원체가 기재되어 있고, 이들을 사용한 방법이 기재되어 있다. 면역원을 함유하거나 함유하지 않은 IL-15 및 CD40L을 전달한 후의 면역조절 효과가 기재되어 있고, 이러한 조성물을 사용한 방법 및 이러한 단백질을 전달하기 위해 사용된 이의 조성물 및 각종 핵산 분자가 기재되어 있다.

Description

ＩｇＥ 시그날 펩티드 및/또는 ＩＬ-15를 암호화하는 핵산 서열 및 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법{Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same}

본 발명은 면역원에 대해 개체를 예방학적으로 및 치료학적으로 면역화시키기 위한 개선된 백신, 개선된 방법 및 개선된 면역치료학적 조성물 및 개선된 면역치료 방법에 관한 것이다.

면역치료는 사람의 면역 반응을 조절하여 요망되는 치료 효과를 부여하는 것이다. 면역치료제는 개체에 투여되는 경우, 개체의 면역계를 충분히 조절하여 궁극적으로 요망되지 않는 면역 반응과 관련된 증상을 감소시키거나 요망되는 면역 반응을 증가시켜 궁극적으로 증상을 완화시키는 조성물을 언급한다. 몇몇 경우에, 면역치료는 개체를 면역원에 노출시켜 개체가 면역 반응을 생성하도록하는 백신을 개체에 투여하는 백신 접종 프로토콜의 일부이다. 당해 경우에, 면역치료제는 면역 반응을 증가시키고/시키거나 특정 증상, 감염 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 요망되는 면역 반응(예를 들어, 세포성 면역 또는 체액성 면역)의 일부를 선택적으로 증진시킨다.

백신은 알레르기 항원, 병원체 항원 또는 사람 질환에 관여하는 세포와 관련된 항원에 대해 개체를 면역화시키는데 유용하다. 사람 질환에 관여하는 세포와 관련된 항원은 암 관련 종양 항원 및 자가면역 질환에 관여하는 세포와 관련된 항원을 포함한다.

당해 백신을 디자인하는데 있어서, 백신 접종된 개체의 세포에서 표적 항원을 생성하는 백신이 면역계의 세포성 면역을 유도하는데 효과적인 것으로 인지되었다. 특히, 약독화된 생백신, 비독성 벡터를 사용하는 재조합 백신 및 DNA 백신 각각은 백신 접종된 개체의 세포에서 항원의 생성을 유도하여 면역계의 세포성 면역을 유도한다. 한편, 사멸된 또는 불활성화된 백신 및 단백질만을 포함하는 서브유니트 백신은 이들이 체액성 반응을 유도하지만 세포성 면역 반응의 유도에는 양호하지 못하다.

세포 면역 반응은 흔히 병원체 감염에 대한 보호를 제공하고 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위해 효과적인 면역 매개 치료를 제공할 필요가 있다. 따라서, 약독화된 생백신, 비독성 벡터를 사용하는 재조합 백신 및 DNA 백신과 같은, 백신 접종된 개체의 세포에서 표적 항원을 생성시키는 백신이 종종 바람직하다.

당해 백신은 흔히 병원체 감염 또는 사람 질환에 대해 예방학적으로 또는 치료학적으로 개체를 면역화시키는데 효과적이지만 백신을 개선시킬 필요가 있다. 증진된 면역 반응을 생성시키는 조성물 및 방법이 필요하다.

또한, 몇몇 면역치료제가 환자에서 면역 반응을 조절하는데 유용하지만 면역치료학적 조성물 및 방법을 여전히 개선시킬 필요가 있다.

유전자 치료는, 단백질에 의해 암호화된 단백질에 의한 이득을 필요로하거나 이득이 될 수 있는 환자에게 유전자를 전달하는 것이다. 개체가 충분하고/하거나 완전히 기능성인 단백질을 생성하는 해당 유전자를 갖고 있지 않는 단백질을 전달하기 위한 새로운 전략이 개발되었다. 따라서, 유전자 치료는 완전히 충분하게 기능하는 내인성 단백질의 결핍을 보상한다. 몇몇 유전자 치료 전략에서, 치료학적 유효량의 단백질을 생성하도록 디자인된 작제물을 사용하여 치료학적으로 유효한 단백질을 환자에게 제공하는 것이다. 유전자 치료는 단백질 치료제를 전달하기 위한 또 다른 방법을 제공한다. 여전히, 유전자 치료 조성물 및 방법을 개선시킬 필요가 있다.

핵산 분자를 개체에 직접 투여하는 것 뿐만 아니라, 흔히 단백질이 전달된다. 재조합 방법에 의한 당해 단백질의 생성은 흔히 이들을 제조하기 위해 가장 효율적인 방법이다. 여전히, 조성물 및 방법을 구성하기 위한 개선된 단백질이 필요하다.

본 발명은 면역원을 암호화하는 핵산 서열 및 IL-15 단백질 서열에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 임의로, CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신; 및 개체에 당해 재조합 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질 서열에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 임의로 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 약독화된 생병원체; 및 개체를 면역화시키는 방법 및 개체에 당해 약독화된 생병원체를 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 임의로 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 CD40L 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 임의로 핵산 분자중 어느 하나 또는 둘다에 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 다양한 상이한 단백질을 암호화하는 다양한 핵산 서열은 동일한 핵산 분자상에 및/또는 상이한 핵산 분자상에 또는 둘다의 핵산 분자상에 존재할 수 있다.

본 발명은 IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 면역원을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

다양한 상이한 단백질을 암호화하는 다양한 핵산 서열은 동일한 핵산 분자상에 및/또는 상이한 핵산 분자상에 또는 이의 조합으로 존재할 수 있다.

본 발명은 면역원을 암호화하는 핵산 서열, IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신 및 이러한 재조합 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 약독화된 생병원체 및 이러한 약독화된 생병원체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 비-IgE 단백질 서열과 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질(여기서, IgE 시그날 펩티드 및 비-IgE 단백질 서열은 동일한 동물 종으로부터 기원하는 것이다)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포에서 작동 가능한 발현 벡터를 포함하는 시험관내 숙주 세포 배양물, 당해 핵산 분자 및 당해 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 발현을 위해 요구되는 조절 인자에 작동적으로 연결된 비-IgE 단백질 서열과 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 발현을 위해 요구되는 조절 인자에 작동적으로 연결된 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서, 융합단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자와 동일하지 않다.

본 발명은 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 분리된 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 면역조절 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 면역조절 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상이한 단백질에 대한 다양한 암호화 서열은 동일한 핵산 분자 및/또는 상이한 핵산 분자상에 존재할 수 있다.

본 발명은 면역원을 암호화하는 핵산 서열 및 면역조절 단백질에 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신 및 당해 재조합 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 면역조절 단백질에 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 약독화된 생병원체 및 당해 약독화된 생병원체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 당해 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 당해 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 IL-15 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, CD40L을 암호화하는 핵산 서열은 융합 단백질 및/또는 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 또는 별도의 핵산 분자에 존재할 수 있다.

본 발명은 IL-15 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 임의로 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 다양한 상이한 단백질을 암호화하는 다양한 핵산 서열은 동일한 핵산 분자 및/또는 상이한 핵산 분자 또는 둘다에 존재할 수 있다.

본 발명은 IL-15 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 면역원을 암호화하는 핵산 서열 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 다양한 상이한 단백질을 암호화하는 다양한 핵산 서열은 동일한 핵산 분자 및/또는 상이한 핵산 분자상에 또는 이의 조합으로 존재할 수 있다.

정의

본원에 사용된 바와 같이 용어 "표적 단백질"은 면역 반응을 위한 표적 단백질로서 작용하는 본 발명의 유전자 작제물이 암호화하는 펩티드 및 단백질을 의미한다. 용어 "표적 단백질" 및 "면역원"은 상호교환적으로 사용되고 면역 반응이 유발될 수 있는 단백질을 언급한다. 표적 단백질은 병원체 또는 암세포 또는 면역 반응이 요구되는, 자가면역 질환에 관여하는 세포와 같은 요망되지 않는 세포 유형으로부터 기원하는 단백질과 하나 이상의 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질이다. 표적 단백질에 대한 면역 반응은 개체를 표적 단백질과 연관된 특이적 감염 또는 질환으로부터 보호하고/하거나 치료한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 작제물"은 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 언급한다. 암호화 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 조절 인자와 작동적으로 연결된 개시 및 종결 시그날을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현가능한 형태"는 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 암호화하는 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 인자를 포함하여 개체의 세포에 존재하는 경우 암호화 서열이 발현되도록 하는 유전자 작제물을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프의 공유"는 실질적으로 기타 단백질의 에피토프와 유사하거나 동일한 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단백질을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 유사한 에피토프"는 단백질의 에피토프와 동일하지는 않지만 당해 단백질와 교차 반응하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유발하는 구조를 갖는 에피토프를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포내 병원체"는 이의 생식 주기 또는 생활 주기의 적어도 일부가 숙주 세포내에 존재하고 여기에서 병원체 단백질을 생산하거나 생산되도록 하는 바이러스 또는 병원성 유기체를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "과증식 질환"은 세포의 과증식을 특징으로 하는 질환 및 장애를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "과증식 연관 단백질"은 과증식 질환과 연관된 단백질을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역조절 단백질"은 면역조절 단백질이 전달되는 사람의 면역계를 조절하는 단백질을 언급한다. 면역조절 단백질의 예는 다음을 포함한다: IL-15, CD40L, TRAIL; TRAILrecDRC5, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, F461811or MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, CD30, CD153 (CD30L), Fos, c-jun, Sp-1, Apl, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK, SAP K, SAP1, JNK2, JNK1B2, JNK1B1, JNK2B2, JNK2B1, JNK1A2, JNK2A1, JNK3A1, JNK3A2, NF-카파-B2, p49 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, plOO 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, p105 스플라이싱 형태, NF-카파-B 50K 쇄 전구체, NFkB p50, 사람 IL-1α, 사람 IL-2, 사람 IL-4, 쥐 IL-4, 사람 IL-5, 사람 IL-10, 사람 IL-15, 사람 IL-18, 사람 TNF-α, 사람 TNF-β, 사람 인터류킨 12, MadCAM-1, NGF IL-7, VEGF, TNF-R, Fas, CD40L, IL-4, CSF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, LFA-3, ICAM-3, ICAM- 2, ICAM-1, PECAM, P150.95, Mac-1, LFA-1, CD34, RANTES, IL-8, MIP-lα, E-셀렉톤, CD2, MCP-1, L-셀렉톤, P-셀렉톤, FLT, Apo-1, Fas, TNFR-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 (TRAIL), DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE, VLA-1 및 CD86 (B7.2).

개요

본 발명은 하기의 발견으로부터 유래한다: 1) IL-15 단백질이 "절단된" IL-15 단백질로서 또는 비-IL-15 시그날 펩티드, 특히 IgE 시그날 펩티드와 연결된 IL-15 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현되든지 간에 IL-15 시그날 펩티드가 존재하지 않는 경우 IL-15 단백질 발현 수준은 보다 높다. "절단된" IL-15 단백질 또는 비-IL-15 시그날 펩티드, 특히 IgE 시그날 펩티드에 연결된 IL-15 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질이든지 간에 IL-15 시그날 펩티드가 결핍된 IL-15 단백질은 특히, 면역조절 단백질로서 IL-15 단백질의 전달을 위한 백신 및 작제물에 유용하다. 2) CD40L과 배합된 IL-15의 전달에 관여하는 백신 및 면역조절 조성물은 특히 유용하다. 3) IgE 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질은 증진된 발현을 촉진시키고 특히, 단백질 생산, 면역 조절 단백질과 같은 단백질의 전달을 위한 백신 및 유전자 치료제에 유용하다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명은 IL-15 시그날 펩티드가 결핍된, 바람직하게는 IL-15 코작 영역 및 비해독 영역이 결핍된 사람 IL-15 암호화 서열을 포함하는 단백질 또는 사람 IL-15 암호화 서열이 비-IL-15 시그날 펩티드, 특히 IgE 시그날 펩티드와 함께 제공되는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 백신 및 면역 조절 조성물 및 방법을 제공한다. IL-15 암호화 서열은 바람직하게 IL-15 시그날 서열 및 바람직하게는 IL-15 코작 영역 및 비해독 영역이 결핍되어 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명은 1) IL-15 시그날 펩티드가 결합된 IL-15 단백질 또는 IgE 시그날 펩티드와 같은 비-IL-15 시그날 펩티드와 연결된 IL-15 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 이와 배합된 2) 사람 CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 백신 및 면역조절 조성물 및 방법을 제공한다. IL-15 암호화 서열은 바람직하게 IL-15 시그날 서열 및 바람직하게는 IL-15 코작 영역 및 비해독 영역이 결핍되어 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명은 IgE 시그날 펩티드가 비-IgE 단백질 서열, 바람직하게는 사람 IL-15 단백질 서열에 연결되어 있는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 백신 및 면역조절 조성물 및 방법을 제공한다.

비-IgE 단백질에 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 작제물

따라서, 본 발명의 한가지 일반적인 양태는 비-IgE 단백질에 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 작제물 및 발현 벡터, 백신 및 면역조절 조성물에서 당해 작제물의 용도에 관한 것이다.

몇몇 양태에 따라, 비-IgE 단백질 서열과 작동가능하게 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.

비-IgE 단백질의 특성은 작제물의 의도된 용도에 의존한다. 예를 들어, 유전자 치료 양태를 위해, 단백질 서열은 환자가 충분한 양으로 또는 온전하게 기능하는 단백질을 갖고 있지 않은 단백질과 같은 목적하는 단백질의 서열이다. 상기 유형의 목적하는 단백질의 예는 DNAse와 같은 효소, 성장 호르몬(사람, 소, 돼지)과 같은 성장 인자, 응고 인자, 인슐린, 디스트로핀등을 포함한다. 목적하는 단백질은 또한 환자에서 발현되는 경우, 치료학적 이득을 제공하는 단백질일 수 있고 이의 예는 에리트로포이에틴, IL-2, GM-CSF 및 TPA등이다. 몇몇 양태에서, 비-IgE 단백질 서열은 면역원이다. 당해 작제물은 면역원의 발현이 면역 반응을 위한 표적으로서 제공되는 백신에서 유용하다. 몇몇 양태에서, 비-IgE 단백질 서열은 면역 조절 단백질이다. 당해 작제물은 면역원의 발현이 면역 반응을 위한 표적으로서 제공되는 백신에서 유용할뿐만 아니라 목적하는 효과가 환자의 면역계에 제공하거나 치료될 환자의 증상에 따라 면역계가 상향조절되거나 하향조절되는 특정 양태를 제공하는 면역 조절 조성물에서 유용하다. 면역계를 상향조절하는 면역조절제는 예를 들어, 면역억제 또는 감염성 질환을 앓는 환자를 치료하는데 유용한 반면 면역계를 하향조절하는 면역조절제는 예를 들어, 면역 억제가 요망되는 자가면역 질환, 기관 이식, 조직 이식 또는 세포 치료를 받은 환자를 치료하는데 유용하다. 몇몇 양태에서, IgE 시그날 서열은 IgE 단백질의 생산이 요망되는 시스템에 사용하기 위해 비-IgE 단백질 서열에 연결되어 있다. 바람직한 양태에서, IgE 시그날 펩티드는 연결된 단백질 서열과 동일한 종의 동물로부터 유래한다. 바람직한 방법에서, 당해 작제물이 투여된 동물은 IgE 시그날 펩티드 및 단백질 서열이 유래하는 동물과 동일한 종이다. 당해 융합 단백질은 비면역원성인 것으로 사료된다.

몇몇 양태에서, 면역조절 단백질인 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날의 암호화 서열을 포함하는 작제물을 포함하는 조성물은 또한 동일한 핵산 분자 또는 상이한 핵산 분자상에 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 하기에 논의되는 면역원은 알레르기 항원, 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환과 연관된 세포에 연결된 항원을 포함하는 임의의 면역원성 단백질일 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역원은 병원체 항원이고 가장 바람직하게는 HIV, HSV, HCV 및 WNV로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원체이다.

상기 주지된 바와 같이, 비-IgE 단백질 서열은 바람직하게 IL-15 단백질이고 보다 바람직하게는 IL-15 시그날 서열이 결핍된 IL-15 단백질, 보다 바람직하게는 IL-15 시그날 서열이 결핍된, IL-15 코작 영역이 결핍된 및 IL-15 비해독 서열이 결핍된 IL-15 단백질이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 당해 조성물은 추가로, CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당해 뉴클레오티드 서열은 융합 단백질로서 동일한 핵산 분자 또는 상이한 분자상에 포함될 수 있다. CD40L은 면역원에 대한 암호화 서열을 포함하는 백신 조성물에 포함되어 개선된 백신을 제공할 수 있다. 기타 양태에서, CD40L은 개선된 면역조절 조성물을 제공하는, 면역원에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는 면역조절 조성물에 포함될 수 있다.

몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 작제물은 플라스미드이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 우두, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 백신으로서 유용한 기타 수용가능한 바이러스 벡터 또는 유전자 치료 벡터에 혼입된다.

면역조절 단백질인 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 유전자 작제물은 본 발명의 몇몇 양태에 따라 약독화된 생병원체에 직접 혼입될 수 있다. 백신으로서 유용한 당해 병원체의 예는 하기에 제시되어 있다. 바람직한 양태에서, 면역 조절 단백질은 IL-15, 보다 바람직하게는 IL-15 시그날 서열이 결핍된 IL-15 단백질, 보다 바람직하게는 IL-15 시그날 서열, IL-15 코작 영역 및 IL-15 비해독 서열이 결핍된 IL-15 단백질이다. 몇몇 양태에서, 당해 약독화된 병원체는 CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 추가로 제공된다.

또한 본 발명의 양태는 비-IgE 단백질 서열에 작동가능하게 연결된 IgE 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 양태에서, 융합 단백질의 비-IgE 단백질 서열은 효소이다. 몇몇 양태에서, 융합 단백질의 비-IgE 단백질 서열 부분은 면역원이다. 몇몇 양태에서, 융합 단백질의 비-IgE 단백질 서열 부분은 면역조절 단백질이다. 바람직한 비-IgE 서열은 IL-15 단백질, 가장 바람직하게는 IL-15 시그날 서열이 결핍된 IL-15 단백질이다.

IL-15 단백질에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 작제물

본 발명의 하나의 일반적인 양태는 IL-15 단백질에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 작제물 및 백신 및 면역조절 조성물에서 당해 작제물의 용도에 관한 것이다. 몇몇 상이한 양태 및 형태는 당해 양태과 관련하여 제공된다. 일반적으로, IL-15는 사람 IL-15를 언급한다. 그러나, 작제물은 또한 예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 양과 같은 기타 종 기원의 IL-15를 언급할 수 있다.

본 발명의 당해 양태는 고유 IL-15 mRNA에 의해 발현되는 단백질내 서열이 발현을 억제하는 시그날 또는 인자를 함유하고 있다는 관찰로부터 비롯된다. 당해 억제 인자를 제거함에 의해, 개선된 발현이 성취된다. 바람직한 양태에서, IL-15 암호화 서열은 IL-15 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열이 결핍되어 있고 바람직하게 IgE 시그날 단백질과 같은 또 다른 시그날 단백질이 이 대신에 제공된다. 더욱이, IL-15 코작 및 비해독 영역은 또한 제거되어 억제 인자를 제거한다. 작제물이 바람직하게 포함하는 유일한 IL-15 서열은 IL-15 시그날 펩티드가 결핍된 성숙한 IL-15 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 IL-15 서열이다.

몇몇 양태에 따라, IL-15 단백질에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 융합 단백질은 비-IL-15 시그날 서열이 IL-15 단백질에 연결되어 이루어진다. 몇몇 바람직한 양태에서, IL-15 단백질은 IL-15 시그날 서열이 결핍되어 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 융합 단백질은 IL-15 서열이 유래하는 종과 비교하여 비면역원성이다. 따라서, 사람 IL-15를 포함하는 비면역원성 융합 단백질은 사람에서 비면역원성이다.

몇몇 양태에 따라, IL-15 단백질에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하고 또한 동일한 핵산 분자 또는 상이한 핵산 분자상에 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 작제물을 함유하는 조성물이 제공된다. 일반적으로 하기에 논의되는 면역원은 알레르기 항원, 병원체 항원, 암관련 항원 또는 자가면역 질환과 연관된 세포에 연결된 항원을 포함하는 임의의 면역원성 단백질일 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역원은 병원체 항원, 가장 바람직하게는 HIV, HSV, HCV 및 WNV로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원체이다.

바람직한 양태에서, 당해 조성물은 추가로 CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당해 뉴클레오티드 서열은 융합 단백질로서 동일한 핵산 분자상에 또는 상이한 분자상에 포함될 수 있다. CD40L은 면역원에 대한 암호화 서열을 포함하는 백신 조성물에 포함되어 개선된 백신을 제공할 수 있다. 기타 양태에서, CD40L은 면역원에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는 면역조절 조성물에 포함되어 개선된 면역조절 조성물을 제공할 수 있다.

몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 작제물은 플라스미드이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 우두, 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 백신으로서 유용한 임의의 기타 수용가능한 바이러스 벡터 또는 유전자 치료 벡터에 혼입된다.

IL-15 단백질에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물은 발명의 몇몇 양태에 따라 약독화된 생병원체에 직접 혼입될 수 있다. 백신으로서 유용한 당해 병원체의 예는 하기에 제시되어 있다. 바람직한 양태에서, 바람직하게 IL-15 시그날 서열이 결핍된 사람 IL-15가 사람 IgE 시그날 서열에 연결되어 있다. 몇몇 양태에서, 당해 약독화된 병원체는 CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 추가로 제공된다.

본 발명의 한 양태는 IL-15 단백질 서열에 연결된 비-IL-15 시그날 서열을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 융합 단백질은 비-IL-15 시그날 서열이 IL-15 단백질에 연결되어 이루어진다. 몇몇 바람직한 양태에서, IL-15 단백질은 IL-15 시그날 서열이 결핍되어 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 시그날 서열은 IgE 시그날 서열이다. 서열은 바람직하게 사람 기원이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 융합 단백질은 비면역원성이다. 비면역원성은 IL-15 서열이 유래하는 종과 비교하여 비면역원성인 단백질을 언급한다.

IL-15 및 CD40L을 암호화하는 유전자 작제물을 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법

본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 IL-15 및 CD40L을 암호화하는 유전자 작제물을 포함하는 조성물 및 백신 및 면역조절 조성물에서 당해 작제물의 용도에 관한 것이다. 몇몇 상이한 양태 및 형태는 당해 양태과 관련하여 제공된다. 일반적으로 IL-15는 사람 IL-15를 언급한다. 그러나 작제물은 또한 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 양과 같은 기타 종으로부터 유래하는 IL-15를 언급할 수 있다. IL-15는 즉, IL-15 시그날 서열을 갖는 천연 형태일 수 있다. 바람직하게, IL-15는 비-IL-15 시그날 서열을 포함하고 가장 바람직하게는 IL-15 시그날 서열이 추가로 결핍된 융합 단백질의 일부이다. 바람직한 양태에서, IL-15는 IgE 시그날 서열에 연결된다.

몇몇 양태에 따라, IL-15 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열를 포함하는 분리된 핵산 분자 또는 IL-15를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 분자 및 CD40L을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 분자를 포함하는 2개의 상이한 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 바람직한 양태에서, IL-15를 포함하는 단백질은 IL-15 서열이 유래하는 종과 비교하여 비면역원성이다.

몇몇 양태에 따라, IL-15 및 CD40L에 대한 암호화 서열 및 동일한 핵산 분자 또는 상이한 핵산 분자상에 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 작제물을 함유하는 조성물이 제공된다. 일반적으로, 하기에 논의되는 면역원은 알레르기 항원, 병원체 항원, 암관련 항원 또는 자가면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원을 포함하는 임의의 면역원성 단백질일 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역원은 병원체 항원, 가장 바람직하게, HIV, HSV, HCV 및 WNV로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원체이다.

면역원에 대한 암호화 서열을 포함하는 조성물은 백신으로서 유용하다. 면역원에 대한 암호화 서열을 포함하지 않는 조성물은 면역조절 조성물로서 유용할 수 있다. 몇몇 양태에서, 단백질 면역원은 또한 IL-15 및 CD40L의 배합에 의해 증진된 면역 반응을 위한 표적으로서 제공된다.

몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 작제물은 플라스미드이다. 몇몇 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 우두, 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 백신으로서 유용한 임의의 기타 수용가능한 바이러스 벡터 또는 유전자 치료 벡터에 혼입된다.

IL-15 및 CD40L을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물은 본 발명의 몇몇 양태에 따라 생존 약독화된 병원체로 직접 혼입될 수 있다. 백신으로서 유용한 당해 병원체의 예는 하기에 제시되어 있다. 바람직한 양태에서, 바람직하게 IL-15 시그날 서열이 결핍된 사람 IL-15는 사람 IgE 시그날 서열에 연결된다.

백신 및 면역조절 조성물

본 발명의 몇몇 양태에 따라, 본 발명의 조성물은 면역원 및/또는 면역원성 단백질에 대한 암호화 서열을 포함하는 유전자 작제물을 포함한다. 당해 조성물은 개체에 전달되어 개체의 면역계의 활성을 조절함으로써 면역원에 대한 면역 반응을 증진시킨다. 면역조절 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수되는 경우, 면역조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 세포에서 발현되고 이로써 당해 단백질이 개체에 전달된다. 본 발명의 양태는 재조합 백신의 일부로서 및 약독화된 백신의 일부로서 하나 이상의 다양한 전사 인자 또는 중간체 인자를 암호화하는 상이한 핵산 분자를 포함하는 조성물에서 단일 핵산 분자상에 단백질의 암호화 서열을 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명의 몇몇 양태에 따라, 조성물 및 방법은 병원체 또는 비정상적인 질환 관련 세포에 대해 개체를 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 면역화시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 백신은 약독화된 생백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신과 같은 임의의 유형의 백신일 수 있다.

본 발명은 면역조절 단백질을 전달하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

핵산 분자는 DNA 주입(또한 DNA 백신 접종으로서 언급됨), 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 관련 바이러스 및 재조합 우두와 같은 재조합 벡터를 포함하는 여러 널리 공지된 기술중 하나를 사용하여 전달될 수 있다.

DNA 백신은 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 제5,676,594호 및 이들에 인용된 우선권 출원에 기재되어 있다. 당해 출원에 기재된 전달 프로토콜 뿐만 아니라, DNA를 전달하는 또 다른 방법이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있다.

투여 경로는 국소, 경피적으로, 흡입 또는 좌제 또는 세척에 의한 질내, 직장내, 요도내, 협측 및 설하 조직과 같은 점막 조직 뿐만 아니라 근육내, 비강내, 복강내, 표피내, 피하내, 정맥내, 동맥내, 안구내 및 경구내를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 투여의 바람직한 경로는 점막 조직, 근육내, 복강내, 표피내 및 피하 주사를 포함한다. 유전자 작제물은 통상적인 주사기, 바늘없는 주사 장치 또는 "미세추진 충격 유전자 총"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수단에 의해 투여될 수 있다.

세포에 의해 흡수되는 경우, 유전자 작제물은 세포에서 기능성 염색체외 분자로서 잔류할 수 있고/있거나 세포의 염색체 DNA에 통합할 수 있다. DNA는 플라스미드 또는 플라스미드들의 형태로 도입될 수 있고 이것은 별도의 유전자 물질로서 잔류한다. 또한, 염색체에 통합할 수 있는 선형 DNA는 세포로 도입될 수 있다. DNA를 세포로 도입하는 경우, 염색체로의 DNA 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 통합 촉진에 유용한 DNA 서열은 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다. 또한 RNA가 세포에 투여될 수 있다. 동원체, 텔로미어 및 복제 오리진을 포함하는 선형 소형염색체로서 유전자 작제물을 제공하는 것이 고려된다. 유전자 작제물은 약독화된 생존 미생물 또는 세포에서 생존하는 재조합 미생물 벡터에서 유전자 물질의 일부로서 잔류할 수 있다. 유전자 작제물은 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부일 수 있고 여기서 유전자 물질은 세포의 염색체로 통합하거나 염색체외부에 잔류한다. 유전자 작제물은 핵산 분자의 유전자 발현을 위해 필요한 조절 인자를 포함한다. 당해 인자들은 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 추가로, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 암호화하는 서열의 유전자 발현을 위해 인핸서가 요구된다. 이들 인자는 목적하는 단백질을 암호화하는 서열과 작동가능하게 연결되고 당해 조절 인자가 이들이 투여되는 개체에서 작동가능할 필요가 있다.

개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로 목적하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부인 것으로 사료된다. 그러나, 이들 인자는 유전자 작제물이 투여되는 개체에서 기능성일 필요가 있다. 개시 및 종료 코돈은 암호화 서열과 프레임내에 있어야 한다.

사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포에서 기능성이어야만 한다.

본 발명을 수행하기 위해, 특히 사람용 유전자 백신의 제조에 유용한 프로모터의 예는 시미안 바이러스 40(SV40), 마우스 포유동물 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역결핍 바이러스(MV)의 BIV 롱 터미날 리피트(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 CMV 이메티데이트 어얼리 프로모터, 엡슈타인 바르 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 뿐만 아니라 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 사람 메탈로티오네인과 같은 사람 유전자 기원의 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명을 수행하기 위해, 특히, 사람용 유전자 백신의 제조에 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, pCEP4 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA)내에 있는 SV 40 폴리아데닐화 시그날(SV40 폴리아데닐화 시그날로서 언급됨)이 사용된다.

DNA 발현을 위해 요구되는 조절 인자 뿐만 아니라, 기타 인자가 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다. 당해 추가의 인자는 인핸서를 포함한다. 당해 인핸서는 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴 및 바이러스(CMV, RSV 및 EBV) 인핸서를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

유전자 작제물에는 포유동물 복제 오리진이 제공되어 염색체외부에서 작제물이 유지되고 세포내에서 다중 복제의 작제물이 생성될 수 있다. 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4(Invitrogen(San Diego, CA))는 엡슈타인 바르 바이러스의 복제 오리진 및 통합 없이 높은 복제수의 에피좀 복제를 생성시키는 핵 항원 EBNA-1 암호화 영역을 함유한다.

면역화 적용과 관련된 몇몇 바람직한 양태에서, 표적 단백질, 면역조절 단백질를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 추가로 당해 표적 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자가 전달된다. 당해 유전자의 예는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNF, GM-CSF, 상피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 시그날 서열이 결실되고 IgE의 시그날 서열을 임의로 포함하는 IL-15를 포함하는 IL-15와 같은 기타 사이토킨 및 림포킨을 암호화하는 유전자들이다. 임의의 이유때문에 유전자 작제물이 투여된 세포를 제거하는 것이 요구되는 경우, 세포를 파괴하기 위한 표적으로서 작용하는 추가의 인자가 첨가될 수 있다. 발현 형태의 헤르페스 티미딘 키나제(tk) 유전자는 당해 유전자 작제물에 포함될 수 있다. 약제 갱사이클로비르는 개체에 투여될 수 있고 약제는 tk를 생산하는 임의의 세포를 선택적으로 사멸시켜 유전자 작제물을 사용하여 세포를 선택적으로 파괴하기 위한 수단을 제공한다.

단백질 생산을 최대화하기 위해, 또한 작제물이 투여되는 세포에서 유전자 발현을 위해 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 더욱이, 세포에서 보다 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 당업자는 세포에서 기능성인 DNA 작제물을 제조할 수 있다.

본 발명의 한 방법은 근육내, 비강내, 복강내, 피하내, 표피내 또는 국소적으로 또는 흡입, 질내, 직장내, 요도내, 협측내 및 설하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세척에 의한 점막 조직으로 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다.

몇몇 양태에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오티드 기능성 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 연계하여 세포로 전달된다. 폴리뉴클레오티드 기능성 인핸서는 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 1994년 1월 26일자로 출원된 국제 출원 번호 제PCT/US94/0089호에 기재되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 본원에 참조로서 인용되는 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 특허원 제021,579호에 기재되어 있다. 핵산 분자와 연계하여 투여되는 보조 제제는 핵산 분자와의 혼합물로서 투여되거나 핵산 분자를 투여하기 전 또는 후에 별도로 동시에 투여된다. 추가로, 형질감염 제제 및/또는 복제 제제 및/또는 염증 제제로서 기능할 수 있고 GVF와 동시 투여될 수 있는 기타 제제는 성장 인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들어, α-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNF, 상피 성장 인자(EGF), ILA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15를 포함하고 뿐만 아니라 섬유아세포 성장 인자, 면역 자극 복합체(ISCOMS)와 같은 표면 활성 제제, 프륜트 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A(WL)을 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌과 같은 소포체 및 하이알루론산이 또한 유전자 작제물 투여와 연계하여 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 면역조절 단백질은 GVF로서 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 핵산 분자는 PLG와 연계하여 제공되어 전달/흡수가 증진된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 1ng 내지 약 2000㎍의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 5 ng 내지 약 1000㎍의 DNA를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 약 10ng 내지 약 800㎍의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500㎍의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350㎍의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250㎍의 DNA를 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200㎍의 DNA를 함유한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화된다. 약제학적 조성물이 주사가능한 약제학적 조성물인 경우에, 이들은 발열원 부재 및 입자 부재의 멸균성이다. 바람직하게 등장 제제가 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 인산 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 몇몇 양태에서, 혈관수축 제제를 당해 제제에 첨가한다.

본 발명의 몇몇 양태에 따라, 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 본 발명의 조성물을 개체에 전달함에 의해 제공된다. 백신은 약독화된 생백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다.

유전자 백신을 개선하기 위해 단백질 암호화 서열을 면역조절하는 발현가능한 형태를 사용하는 것 뿐만 아니라 본 발명은 개선된 약독화된 생존 백신 및 항원을 암호화하는 외래 유전자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신에 관한 것이다. 약독화된 생존 백신의 예 및 외래 항원을 전달하는 재조합 벡터를 사용하는 백신의 예는 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제4,722,848호; 제5,017,487호; 제5,077,044호 ;제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제105,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호; 제5,462,734호; 제5,470,734호 및 제5,482,713호에 기재되어 있다. 면역조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 백신에서 작용하여 발현에 효과적일 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 작제물이 제공된다. 유전자 작제물은 약독화된 생존 백신 및 재조합 백신에 혼입되어 본 발명에 따른 개선된 백신을 생성한다.

본 발명은 DNA 백신, 약독화된 생존 백신 및 재조합 백신을 포함하는 백신 조성물의 일부가 제공되는, 개체의 세포에 유전자 작제물을 전달하는 단계를 포함하는, 개체를 면역화시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 유전자 작제물은 면역조절 단백질을 암호화하고 백신에서 작용하여 발현에 효과적일 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 개선된 백신은 증진된 세포 면역 반응을 유도한다.

면역원

본 발명은 표적 단백질, 즉, 병원체, 알레르기 항원 또는 개체 자체의 "비정상" 세포와 특이적으로 연합한 단백질에 대한 증강된 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 본 발명은, 병원체 단백질에 대한 면역 반응이 병원체로부터 방어 면역을 제공하도록 병원성 인자 및 세균에 대하여 개체를 면역화하는데 유용하다. 본 발명은 과다증식 세포와 특이적으로 연합하는 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도함으로써 암과 같은 과다증식 질환 및 질병을 제거하는데 유용하다. 본 발명은 자가면역 질환과 관련된 세포와 특이적으로 연합하는 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도함으로써 자가면역 질환을 제거하는데 유용하다.

본 발명의 몇몇 양태에 따라서, 표적 단백질 및 면역조절 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 개체의 조직 세포내로 도입하고, 여기서, 이는 발현되어 암호화된 단백질을 생성시킨다. 표적 단백질, 및 하나 또는 둘다의 면역조절 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA는 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 연결된다. DNA 발현용 조절 인자로는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 또한, 기타 성분, 예를 들어 코작 영역이 또한 유전자 작제물에 포함될 수 있다.

몇몇 양태에서, 표적 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열 및 면역조절 단백질 둘다를 암호화하는 발현가능한 형태의 서열이, 개체에게 전달된 동일한 핵산 분자상에서 발견되었다.

몇몇 양태에서, 표적 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열은 하나 이상의 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열을 함유하는 핵산 분자와는 개별적 핵산 분자상에서 발생한다. 몇몇 양태에서, 표적 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열 및 하나 이상의 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열은 하나 이상의 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열을 함유하는 핵산 분자와는 개별적인 하나의 핵산 분자상에서 발생한다. 다수의 상이한 핵산 분자가 생성되어 본 발명에 따라 전달되고, 개체에게 전달될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 양태에서, 표적 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열은, 하나 이상의 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열을 함유하는 핵산 분자와는 개별적인 하나의 핵산 분자상에서 발생하는, 2개의 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 서열을 함유하는 핵산 분자와는 개별적인 하나의 핵산 분자상에서 발생한다. 이러한 경우, 모든 3개의 분자는 개체에게 전달된다.

핵산 분자(들)은 재조합 벡터의 핵산 분자인 플라스미드 DNA로서, 또는 약독화된 백신 또는 세포 백신중에 제공된 유전자 물질의 일부로서 제공될 수 있다. 대안으로, 몇몇 양태에서, 표적 단백질 및/또는 둘중의 하나 또는 둘다의 면역조절 단백질은 이들을 암호화하는 핵산 분자에 추가하여 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자 대신에 단백질로서 제공될 수 있다.

유전자 작제물은 유전자 발현에 필요한 조절 인자에 작동적으로 연결된 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 표적 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것과 면역조절 단백질을 암호화하는 발현가능한 형태의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 포함하는 유전자 작제물의 배합물이 제공되고 있다. 유전자 작제물의 배합물을 포함하는 DNA 또는 RNA를 생세포내로 혼입함으로써 DNA 또는 RNA의 발현 및 표적 단백질 및 하나 이상의 면역조절 단백질의 생성을 야기시킨다. 표적 단백질에 대한 증강된 면역 반응이 야기된다.

본 발명은 모든 병원체, 예를 들어 바이러스, 원핵생물 및 병원체성 진핵 세균, 예를 들어 병원체성 단세포 세균 및 다세포 기생충에 대해 개체를 면역화하는데 사용될 수 있다. 본 발명은, 세포를 감염시키면서 캡슐화되지 않는 병원체, 예를 들어 바이러스, 및 임질균, 리스테리아 및 쉬겔라와 같은 원핵생물에 대해 개체를 면역화하는데 특히 유용하다. 또한, 본 발명은, 생활 사이클에서 이들이 세포내 병원체가 되는 단계를 포함하는 원충 병원체에 대해 개체를 면역화하는데 또한 유용하다. 표 1은, 본 발명에 따라 백신이 제조될 수 있는 몇몇 바이러스 부류 및 속의 목록을 제공하고 있다. 표에 나열된 항원과 같은 병원체 항원상에 나타나는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물이 백신에 유용하다. 또한, 본 발명은 표 2에 나열된 것과 같은 다세포 기생충 뿐만 아니라 원핵 및 진핵 원충 병원체를 포함한 다른 병원체에 대해 개체를 면역화하는 데에도 유용하다.

병원체 감염으로부터 예방하기 위한 유전자 백신을 제조하기 위해서, 방어 면역 반응이 생길 수 있는, 면역원성 단백질을 암호화하는 유전자 물질이 표적에 대한 암호화 서열로서 유전자 작제물중에 포함되어야 한다. 병원체가 세포내(본 발명은 세포내에서 특히 유용하다) 또는 세포외로 감염시키는지의 여부에 상관없이, 모든 병원체 항원이 방어 반응을 유도하는 것 같지는 않다. DNA 및 RNA 둘다 비교적 작고, 비교적 용이하게 제조될 수 있으므로, 본 발명은 다수의 병원체 항원으로 백신접종할 수 있다는 추가의 이점을 제공한다. 유전자 백신에 사용된 유전자 작제물은 다수의 병원체 항원을 암호화하는 유전자 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 수개의 바이러스 유전자는 단일 작제물에 포함되어, 이로써 다수의 표적을 제공할 수 있다.

표 1 및 2는 몇몇 병원성 인자 및 세균의 목록을 포함하고, 이를 위한 유전자 백신을 제조하여 이들에 의한 감염으로부터 개체를 보호할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 병원체로부터 개체를 면역시키는 방법은 HIV, HSV, HCV, WNV 또는 HBV에 대한 것이다.

본 발명의 또다른 방법은 과다증식 질환을 특징으로 하는, 과다증식하는 세포에 대한 방어 면역 반응을 제공하는 방법 및 과다증식 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 과다증식 질환의 예로는 모든 형태의 암 및 건선이 포함된다.

면역원성 "과다증식하는 세포"-연합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체의 세포내로 도입함으로써 백신접종된 개체의 세포에서 이들 단백질을 생성시키는 것으로 발견되었다. 과다증식 질환을 면역시키기 위해서, 과다증식 질환과 관련된 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체에게 투여한다.

과다증식-연합 단백질을 효과적인 면역원성 표적으로 하기 위해서, 정상 세포와 비교하여 과다증식 세포에서 보다 높은 수준으로 또는 오로지 과다증식 세포에서만 생성되는 단백질이어야 한다. 표적 항원은 이러한 단백질, 이의 단편 및 펩티드를 포함한다; 이는 이러한 단백질상에 발견된 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 몇몇 경우, 과다증식-연합 단백질은 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이 생성물이다. 돌연변이된 유전자는 정상 단백질상에서 발견되지 않는 상이한 에피토프를 야기하는 약간 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 제외하고는, 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 암호화한다. 이러한 표적 단백질에는 발암유전자, 예를 들어 myb, myc, fyn 및 전위 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 암호화된 단백질이 포함된다. 표적 항원으로서의 발암유전자 생성물 이외에, 항암 치료 및 예방 섭생용 표적 단백질은 B 세포 림프종에 의해 생성된 항체의 가변부, 및 몇몇 경우에서 또한 자가면역 질환에 대한 표적 항원으로서 사용되는 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변부가 포함된다. 다른 종양-관련 단백질은 종양 세포에서 보다 높은 수준으로 발견되는 단백질, 예를 들어 모노클로날 항체 17-IA에 인지된 단백질 및 엽산 결합 단백질 또는 PSA와 같은 표적 단백질로서 사용될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 수개 형태의 암으로부터 개체를 면역시키는데 사용되면서, 본 발명은 특정 암이 발생할 소인이 있거나, 암에 걸렸고 따라서 재발하기 쉬운 개체를 예방적으로 면역시키는데 특히 유용하다. 역학에서 뿐만 아니라 유전학 및 기술이 발달하여 개체에서의 암 발생 확률 및 위험 평가가 가능하다. 유전자 스크리닝 및/또는 건강 가족력을 사용하여, 특정 개체에서 여러형의 암에서 어떠한 하나가 발생할 확률을 예측할 수 있다.

유사하게, 이미 암이 발생한 개체 및 암 제거 치료를 받은 개체 또는 그렇지 않으면 완화된 개체는 특히 재발 및 재발생하기 쉽다. 치료 섭생의 일부로서, 암에 걸린 것으로 진단된 개체에서 재발을 막기 위해 개체를 암으로부터 면역시킬 수 있다. 따라서, 일단 개체가 하나의 유형의 암에 걸렸고, 재발의 위험이 있는 것으로 공지되는 경우, 임의의 미래의 암 발생을 막는 이들의 면역 시스템을 생성시키기 위해서 이들을 면역시킬 수 있다.

본 발명은 과다증식 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 유전자 작제물의 도입은 표적 단백질을 생성하는 과다증식 세포를 없애도록 개체의 면역 시스템을 지시되고 자극하는 면역치료로서 작용한다.

본 발명은 세포 수용체 및 "자가"-지시된 항체를 생성하는 세포를 포함하여 자가면역과 연관된 표적에 대한 광범위한 방어 면역 반응을 일으킴으로써 자가면역 질환 및 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

T 세포 매개된 자가면역 질환에는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 웨게너 육아종증, 크론씨병 및 궤양성 대장염이 포함된다. 이들 질환 각각은 내인성 항원과 결합하여 자가면역 질환과 관련된 염증성 연쇄반응을 개시하는 T 세포 수용체를 특징으로 한다. T 세포의 가변부에 대한 백신접종은 CTL을 포함한 면역 반응을 유도하여 이러한 T 세포를 제거한다.

RA에서, 이러한 질환과 관련된 수개의 특이적인 T 세포 수용체(TCR)의 가변부를 특징으로 하고 있다. 이들 TCR에는 Vβ-3, Vβ-14, 20 Vβ-17 및 Vα- 17이 포함된다. 따라서, 하나 이상의 이들 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 사용한 백신접종은 RA와 관련된 T 세포를 표적화하는 면역반응을 유도할 것이다[참조: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Piliard, X., et al, 1991 Science 253: 325- 329; Williams, W.V., et al., 1992 J Clin. Invest. 90: 326-333; 이들 각각은 본원 참조로서 인용된다]. MS에서, MS 질환과 관련된 TCR의 수개의 특이적 변이부가 특징지어졌다. 이들 TCR에는 VfP 및 Va-10가 포함된다. 따라서, 하나 이상의 이들 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 사용한 백신접종은 MS와 관련된 T 세포를 표적화하는 면역반응을 유도할 것이다[참조: Wucherpfennig, K.W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J. R., et al, 1990 Nature 345: 344-346; 이들 각각은 본원 참조로서 인용된다].

경피증에서는, 경피증과 관련된 TCR의 수개의 특이적 가변부가 특징지어졌다. 이들 TCR에는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12가 포함된다. 따라서, 하나 이상의 이들 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 사용한 백신접종은 경피증과 관련된 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유도할 것이다.

T 세포 매개된 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해서, 특히 TCR의 가변부가 또한 특징지어진 환자에 있어서, 활막 생검을 수행할 수 있다. 존재하는 T 세포의 샘플을 얻어 이들 TCR의 가변부를 표준 기술을 사용하여 동정하였다. 이러한 정보를 사용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

B 세포 매개된 자가면역 질환에는 루푸스(SLE), 증갑상선기능항진, 중증근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 천식, 한랭글로불린혈증, 원발성 담즙성 경화증 및 악성 빈혈이 포함된다. 이들 각각의 질환은 내인성 항원에 결합하여 자가면역 질환과 관련된 염증성 연쇄반응을 개시하는 항체를 특징으로 한다. 항체의 가변부에 대한 백신접종은 CTL을 포함한 면역 반응을 유도하여 항체를 생성하는 이들 B 세포를 제거한다.

B 세포 매개된 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해서, 자가면역 활성과 관련된 항체의 가변부를 동정해야만 한다. 생검을 수행할 수 있고, 염증 부위에 존재하는 항체의 샘플을 얻을 수 있다. 이들 항체의 가변부를 표준 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

SLE의 경우에서, 하나의 항원은 DNA인 것으로 여겨진다. 따라서, SLE에 대해 면역시킨 환자에서, 이들의 혈청은 항-DNA 항체에 대하여 스크리닝될 수 있고, 혈청에서 발견된 이러한 항-DNA 항체의 가변부를 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.

TCR 및 항체 둘다의 가변부 사이의 통상적인 구조적 특징은 익히 공지되어 있다. 특정 TCR 또는 항체를 암호화하는 DNA 서열은 일반적으로 본원 참조로서 인용된 문헌[참조: Kabat, et al., 1987 Sequence of 단백질s of immnunological Interest U. S. Department of Health and 사람 Services, Bethesda MD]에 기재된 것과 같이 익히 공지된 방법에 따라 발견할 수 있다. 또한, 항체로부터 기능적 가변부를 클로닝하는 일반적 방법은 본원 참조로서 인용된 문헌[참조: Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad Sci. USA 87: 1066]에서 발견할 수 있다.

재조합 단백질 제조

본 발명은 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포에 작동적인 발현 벡터를 포함하는 시험관내 숙주 세포 배양물; 이러한 핵산 분자; 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하는 분리된 융합 단백질에 관한 것이다.

융합 단백질은 상기 기재된 바와 같이 용이하게 입수가능한 출발 물질을 사용하여 통상적인 수단으로 제조할 수 있다. 목적하는 단백질을 암호화하는 적합한 DNA 서열을 제공함으로써 당해 기술분야의 지금까지 공지된 재조합 기술을 사용하여 단백질 제조가 가능하다.

당해 기술분야 숙련가는 익히 공지된 기술을 사용하여 익히 공지된 발현 시스템에서 사용하기 위한 시판중인 발현 벡터내로 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 삽입할 수 있다. 효모의 에스. 세레비지에 균주에서의 제조를 위해 시판중인 플라스미드pYES2(Invitrogen사, San Diego, Calif.)를 사용할 수 있다. 곤충 세포에서의 제조를 위해 시판중인 MaxBacTM(Invitrogen사, San Diego, Calif.) 완전 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용할 수 있다. 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난자 세포에서 제조하기 위해 시판중인 플라스미드 pcDNA I(Invitrogen사, San Diego, Calif.)를 사용할 수 있다. 당해 기술분야 숙련가는 통상적인 기술 및 용이하게 입수할 수 있는 출발 물질을 사용하여 융합 단백질을 제조하는데 이들 시판중인 발현 벡터 시스템을 사용할 수 있다.

당해 기술분야 숙련가는 다른 시판중인 발현 벡터 및 시스템을 사용하거나, 익히 공지된 방법 및 용이하게 입수가능한 출발 물질을 사용하여 벡터를 제조할 수 있다. 필수적인 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 및 바람직하게는 인핸서를 함유하는 발현 시스템은 용이하게 입수할 수 있고, 다수의 숙주에 대하여 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. 따라서, 목적하는 단백질을 원핵 및 진핵 시스템 둘다에서 제조하여, 일정 범위의 단백질의 프로세싱된 형태를 야기할 수 있다.

또한, 광범위한 진핵 숙주가 재조합 이종 단백질의 제조를 위해 현재 사용가능하다. 진핵 숙주는 IgE 시그날 펩티드를 사용하여 목적하는 단백질을 직접적으로 제조하는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다.

통상적으로 사용된 진핵 시스템에는, 효모, 진균 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 조류 세포 및 고등 식물 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 말단 서열 및 인핸서일 뿐만 아니라 각각의 상기 숙주 유형에서 사용하기에 혼화성 및 작동성인 적합한 프로모터, 예를 들면, 바쿨로바이러스 다면체 프로모터가 입수가능하다. 상기와 같이, 프로모터는 구성성이거나 유도성일 수 있다. 예를 들면, 포유동물 시스템에서, 마우스 메탈로티오넨 프로모터를 중금속 이온을 첨가함으로써 유도할 수 있다.

목적하는 숙주에 적합한 발현 시스템을 작제하기 위한 사항들은 당해 기술분야 숙련가에게 공지되어 있다. 이를 암호화하는 DNA를 선택한 발현 벡터내로 적합하게 연결한 후, 수용적격 숙주를 형질전환시킨 후, 단백질의 재조합 제조를 위해서, 이종 유전자 발현이 발생하는 조건하에서 배양하고 유지시킨다. 따라서, 제조된 본 발명의 단백질은, 세포를 용해시킴으로써 배양물로부터 또는 바람직하게는 당해 기술분야 공지되고 적합한 배양 배지로부터 회수된다.

당해 기술분야 숙련가는 익히 공지된 기술을 사용하여 상기와 같은 발현 시스템을 사용하여 제조한 융합 수용체 단백질 및 이의 단편을 분리할 수 있다.

본 발명은 면역원에 대해 개체를 예방학적으로 및 치료학적으로 면역화시키기 위한 백신이나 면역학적 조성물 및 방법을 개선시킬 수 있다.

도 1은 IL-15, 및 CD3에 대한 모노클로날 항체로 사람 PBMC를 자극한 후 IFN-γ의 생성을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. PBMC는 3중 치료(HAART)로 치료된 HIV-1 만성 감염된 피검체로부터 수득하였다. 모든 공여체의 바이러스 로드는 500복제/ml 미만이고 이들의 CD4 수는 500세포/ml 초과이다. IL-15가 이펙터 기능의 지표로서 IFN-γ 생성을 증진시키는지를 측정하기 위해, 당해 세포를 IL-15 및 항-CD3으로 자극시키고 표준 ELI스팟 분석으로 분석하였다.
도 2는 IL-15, 및 CD3에 대한 모노클로날 항체의 자극 후 IFN-γ의 생성이 주로 CD8 매개됨을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. 도 1에 기재된 바와 같이, 3중 치료(HAART)로 치료된 HIV-1 만성 감염된 피검체 기원의 PBMC로부터 CD4 또는 CD8 T 세포를 제거시킴에 이어서 당해 PBMC를 IL-15 및 항-CD3으로 자극시키고 표준 ELI스팟 분석으로 분석하였다.
도 3a, 3b, 3c 및 3d는 사람 PBMC를 HIV-1 펩티드 및 IL-15로 자극시킨 후 IFN-γ의 항원 특이적 생성을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. 3중 치료(HAART)로 치료된 HIV-1 만성 감염된 피검체로부터 수득한 PBMC는 표준 ELI스팟 분석에서 25ng/ml의 IL-15(도 3a 및 3c) 및 IL-15와 배합된 HIV-1 Gag 펩티드(도 3b 및 3c)에 응답하여 IFN-γ를 분비하는 이들의 능력에 대해 분석하였다. CD8을 제거시키고 HIV-1 펩티드 및 IL-5로 자극 후 IFN-γ의 생성을 또한 평가하였다(도 3D).
도 4의 패널, a, b 및 c는 HIV-1 DNA 백신 및 IL-15로 면역화시킨 후 HIV-1 항원 특이적 세포 면역 반응을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. Balb/c 마우스에 0주 및 2주째에 50㎍의 pCenv 또는 pCgag 또는 50㎍의 pIL-15(IL-15 발현 플라스미드)를 동시 주사하였다. 최종 면역화시킨 후 2주째에 비장 세포를 수거하였다. 도 4의 패널 a에서, HIV-1 외피 및 재조합 우두 감염된 P815 세포에 대한 CTL 활성에 대한 표준 크롬 방출 분석에 의해 비장 세포를 시험하였다. 도 4의 패널 b에서, HIV-1 항원 특이적 케모킨 분비 수준을 분석하였다. HIV-1 env 재조합 우두 감염된 P815 세포로 비장 세포를 자극하였다. 제3일째에 상등액을 수거하고 MIP-1β의 분비에 대해 시험하였다. 도 4의 패널 c에서, IFN-감마의 항원 특이적 분비 수준을 평가하였다. 비장세포를 5 x 10⁶ 세포/ml로 재현탁시켰다. 100㎕의 적정액을 96웰 미세역가 평저 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 재조합 p24 단백질을 3회 웰에 첨가하여 최종 농도가 5㎍/ml 및 1㎍/ml이 되게한다. 세포를 3일동안 5% CO₂에서 37℃에서 배양하고 상등액을 수거하였다. 분비되는 사이토킨의 수준은 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
도 5의 패널 a 및 b는 Th1 사이토킨에 대한 세포내 염색을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. 마우스에 pCgag 단독 또는 pCgag와 pIL-15 DNA 플라스미드를 2회 주사하였다. 1주 후에, 비장 세포를 수거하고 p55 펩티드 풀(11aa 중복체를 갖는 127개의 15량체 스패닝 HIV-1 p55를 함유) 및 브레펠딘 A를 함유하는 매질에서 5시간동안 시험관내에서 배양하였다. 자극 후, 세포를 항-마우스 CD3 및 항-마우스 CD8 항체를 사용하여 세포외로 염색하고 이어서 항-마우스로 세포내로 염색시켰다. 도 5의 패널 a는 IFN-γ에 대한 데이타를 보여준다. 도 5의 패널 b는 종양 괴사 인자-α에 대한 데이타를 보여준다. 도트 플롯은 CD3+/CD8+ 림프구로부터의 반응을 보여준다.
도 6은 쥐 T 헬퍼 세포 증식 분석에 관한 실시예 1의 데이타를 보여준다. Balb/c 마우스에 0주 및 2주째에 50㎍의 pCgag 또는 pCenv 및 IL-2R 의존성 Th1 사이토킨 IL-2 또는 IL-15의 cDNA를 발현하는 50㎍의 플라스미드를 동시 주사하였다. 5 x 10⁵ 세포를 함유하는 100㎍의 1 적정액을 즉시 96웰 미세역가 평저 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 재조합 p24 단백질을 3회 웰에 첨가하여 최종 농도가 5㎍ g/ml 및 1㎍ g/ml이 되도록 한다. 자극 지수를 측정하였다. 자발적 계수 웰은 비관련성 단백질 대조군으로서 사용되는 10% 태아 소 혈청을 함유한다. 유사하게, pCgag 또는 대조군은 통상적으로 이들의 비관련성 gp 120 단백질에 대해 1의 SI를 갖는다. 세포가 건강함을 확인하기 위해, PHA 또는 Con A(Sigma)를 폴리클로날 자극인자 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 7은 DNA 백신 pCgag로 면역화시킨 후 Balb/c 마우스에서 Gag의 에피토프 맵핑에 대한 실시예 1의 데이타를 도시한다. Balb/c 마우스에 0 및 2주째에 50㎍의 pCgag 및 50㎍의 pIL-15 플라스미드 또는 유전자 IL-15 또는 벡터 골격을 발현하는 벡터 골격을 동시 주사하였다. 비장 세포를 분리하고 일련의 펩티드를 사용하는 표준 ELI스팟 분석을 셋업하였다. 펩티드는 매트릭스 포맷으로 일련의 22개의 풀에 혼합하고 세포를 활성화시켜 IFN-γ를 생성하는 이의 능력에 대해 시험하였다.
도 8의 패널 a, b 및 c는 CD4 녹아웃 마우스로부터 유래하는 비장 세포의 자극 후 IFN-γ의 생성을 보여주는 실시예 1의 데이타를 도시한다. 도 8의 패널 a에서, Balb/c 마우스에 0주 및 2주째에 50㎍의 pCgag 및 50㎍의 pIL-15(IL-15 발현 플라스미드)를 동시 주사하였다. 비장 세포를 최종 면역화 후 2주째에 수거하고 ELI스팟을 사용하여 IFN-γ의 HIV-1 특이적 생성에 대해 시험하였다. 도 8의 패널 b에서, Cd4^tm1Knw 마우스를 pIL-15의 존재 및 부재하에 pCgag로 면역화시켰다. 도 8의 패널 c의 Cd4^tm1Knw 마우스를 pIL-15, pCD40L 또는 이 둘다와 배합된 pCgag로 면역화시켰다. 비장세포를 최종 면역화후 2주째에 수거하고 HIV-1 Gag 펩티드로 시험관내 자극 후 IFN-감마의 HIV-1 Gag 특이적 생성에 대해 분석하였다.
도 9는 백신 부위에서 IL-15 및 CD40L의 국부적 생성이 CD8 이펙터 T 세포의 확장을 위해 요구되는 T 세포의 조력을 대체할 수 있음을 보여주는 실시예 2의 데이타를 도시한다.
도 10, 도 11, 도 12의 패널 a 내지 c, 도 13의 패널 a-b, 도 14 및 15는 실시예 3에 제시된 기재내용을 언급한다.
도 16은 실시예 4에 제시된 데이타를 언급한다.

실시예 1

도입

감염된 피검체에서 바이러스 수를 감소시키기 위한 항-레트로바이러스 배합 치료의 성공으로 다수의 HIV-1 포지티브 개체에 있어서 예후가 향상되었다. 그러나, 다수의 실험실에서는, 확립된 바이러스 병원소가 약물 배합 섭생에 의해 약하게 효과를 받는 것으로 보고하고 있다(하기 참조문헌 1 내지 3). 지금까지, 어떠한 배합 치료 접근도 바이러스 제거를 야기하지 못하였고, 최종적으로 환자 순응도에 영향을 미치고, 질환 진행에 효과를 주는 최근의 치료적 섭생과 관련된 상당한 부작용이 있다. 따라서, HIV-1에 대한 효과적인 면역치료적 접근을 포함한 대안적 형태의 치료의 탐구가 상당히 요구되고 있다. CD8+ T 세포 반응이 HIV-1 감염을 조절하고, 질환 진행을 늦추는 데 중요한 것으로 여겨지고 있다. 바이러스 복제를 조절하는 HIV-1 특이적 CD8+ T 세포 반응의 명확한 기능은 완전하게 밝혀진 것은 아니지만, HIV-1에 대해 혈청반응 포지티브인 개체에서 장기간 비-진행과 특이적 CD8+ T 세포 매개된 세포 반응 사이의 관련성은 확립되었다(하기 참조문헌 4 내지 7). 또한, 감비아에서 상당히 노출되었지만 HIV 네거티브인 개체의 코호트에 의해 항체 반응을 증명하였고, 항-HIV-1 CD8+ T 세포 면역 반응을 제시하였다(하기 참조문헌 8 및 9). 실제로, HIV-1 감염후, 건강한 세포 면역 반응이 바이러스 수가 동시에 감소하면서 유도된다. 그러나, 높은 수준의 HIV 특이적 세포독성 T 림프구(CTL)의 존재에도 불구하고, HIV-1 감염은 제거되지 않는다. 높은 CD8 매개된 반응과 연속된 질환 진행 사이의 이러한 불일치가 관심이 되고 있다. 바이러스를 제거하는 CTL의 무능력은 부분적으로 CTL 도피 돌연변이(하기 참조문헌 10 내지 14), 가능성이 있는 바이러스의 면역병리기전인, 예를 들어 Nef-관련된 MHC I형의 하위 조절 또는 숙주 면역상의 Vpr 또는 Env 영향에 인한 것일 수 있다(하기 참조문헌 15 내지 18). 부가의 문제점은 CD8+ T 림프구에 효과적인 CD4+ T 세포 조력의 결핍이다(하기 참조문헌 19 및 20). 순환하는 CD8+ 세포가 손상된 기능을 가질 수 있는 것으로 관찰되었다(하기 참조문헌 21). HIV-1 면역병리기전이 효과적인 CD8 반응의 발생을 제한하는 경우, 항-레트로바이러스 치료에 있어서 HIV-1 항원의 제공은 CD8 기억 세포 및 이펙터 세포를 제한된 방식으로 증가시킬 수 있다. 이러한 발생은 질환 과정상에 강력한 효과를 가질 수 있다. 그러나, CD8+ T 세포 증식을 위해 도움을 제공하는 것이 중요할 수 있다. 이와 관련하여, CD8+ 기억 T 세포의 생존이 연속된 항원 제공에 의존적인 것은 아닌 것으로 발견되었고(하기 참조문헌 22), 오히려 말초 환경에서 특이적 사이토킨의 생성에 의존적일 수 있다.

CD8+ T 세포에 상당한 효과가 있는 것으로 보이는 하나의 이러한 사이토킨은 인터루킨-15(IL-15)이다. 발트만(Waldmann) 및 그의 동료들은, 먼저 IL-15가 시그날 T 세포에 독특한 알파 쇄와 함께 IL-2 수용체 복합체의 감마 및 베타 쇄를 사용하는 15kDa의 단백질인 것으로 보고하였다(하기 참조문헌 23). IL-15는 항-아폽토시스 활성을 나타내고, 기억 CD8+ T 세포 표현형을 자극하는 역할을 하는 것으로 보인다. HIV-1 감염에서의 IL-15의 역할을 다수의 그룹에 의해 연구하고 있다. IL-15는 HIV-1 감염된 피검체로부터 분리된 림프구의 아폽토시스를 감소시키고(하기 참조문헌 24), 천연 킬러 세포의 활성 및 증식을 증가시키는(하기 참조문헌 25 내지 27) 것으로 증명되었다. 또한, IL-15는 HIV-1 감염된 피검체의 B 세포 증식(하기 참조문헌 28 및 29) 및 대식세포의 활성화(하기 참조문헌 30)와 관련되어 있다. 중요하게는, IL-15는 또한 HIV-1 이펙터 T 세포 증식 및 인터페론-감마(IFN-γ) 생성(하기 참조문헌 31 및 32)에 직접적 역할을 하는 것으로 보인다. 그러나, IL-15는, HIV-1에 대해 혈청검사 포지티브였던 시험된 다수의 피검체에서 IFN-γ를 자극할 수 없었다. 따라서, 항원 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응에 대한 IL-15의 효과를 탐구하였다.

만성적으로 감염된 HIV-1 혈청반응 포지티브인 피검체로부터 분리된 T 세포에 대한 IL-15의 효과를 연구하였다. rhIL-15가 CD8 T 세포의 증식을 증강시키는 것으로 발견되었고, 중요하게는 IL-15는 모든 피검체에서 이펙터 항원 특이적 CD8+ IFN-γ 생성을 증가시켰다. 면역화 모델에서, IL-15는 CD8+ 이펙터 기능을 증가시켰고, 이는 면역화 모델 시스템에서 탐구되었다. 마우스로부터의 CD8+ 림프구는, IL-15가 트랜스로 제공된 경우, 보다 높은 수준으로 HIV-1 항원을 발현하는 표적을 용해시킬 수 있었다. 이 효과는 CD4+ T 세포의 강한 증식의 부재하에 발생하였다. 그러나, CD4 녹아웃(KO) 마우스에서, IL-15는 CD8 이펙터 반응의 생성에서 CD4 조력에 대한 필요성을 완전하게 피할 수는 없었다. 이는, IL-15가 CD8 기억 세포의 증식에 상당히 효과적이지만, 단독의 IL-15가 이들의 초기 생성에 충분한 것은 아님을 제시하는 것이다.

물질 및 방법

사람 PBMC상의 ELI스팟 분석

기본적인 피콜-하이파크(ficoll-hypaque) 기술에 의해 HIV-1 포지티브 지원자로부터 분리한 PBMC를 표준 ELI스팟 분석으로 이펙터 기능에 대해 평가하였다. PBMC를 10% FCS(R10)를 함유하는 RPMI중에 1 x 10⁶세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 항체 1-DIK(Mabtech, Mariemont OH; Nacka,SE)를 0.1M의 탄산염-중탄산염 용액(pH 9.6)중에 15㎍/ml로 희석하고, 96-웰 니트로셀룰로스 막 플레이트(Millipore, Bedford, MA)를 피복하는데 사용하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 200㎕의 PBS를 사용하여 6회 세척하였다. 122개의 멸균 펩티드 혼합물을 DMSO중의 50㎍/㎕(각 펩티드에 있어서)의 농도로 칵테일로서 제조하였다. 펩티드는 15개 아미노산 길이의 일련의 중복 펩티드이고, 모든 HIV-1 Gag(AIDS Reagent and Reference Repository, ARRR)를 포함한다. 100,000개 PBMC를 니트로셀룰로스 항체-피복된 플레이트의 각각의 웰(100㎕ ＠ 1.0 x 10⁶세포/ml)에 50ng/ml의 IL-15를 함유하거나 함유하지 않은 R10중에 1:200으로 희석시킨(최종 농도 25ng/ml) 100㎕의 펩티드 칵테일과 함께 첨가하였다. 각각의 샘플을 3회 분석하였다. PHA를 5㎍/ml로 포지티브 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 37℃에서 대략 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 200㎕의 PBS로 6회 세척하였다. 100㎕의 항체 7-B6-1-비오틴(Mabtech)을 PBS중의 1㎍/ml의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 플레이트를 200㎕의 PBS로 6회 세척하였다. 100㎕의 스트렙타비딘-ALP(Mabtech)를 PBS중의 1㎍/ml의 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 200㎕의 PBS로 6회 세척하였다. 100㎕의 기질 용액(BCIP/NBT, Sigma)을 각각의 웰에 첨가하였다. 현상액을 수돗물로 제거하였다. CD8 또는 CD4중 하나에 특이적인 모노클로날 항체에 커플링된 Dynabeads(Dynal Biotech, Lake success, NY; Oslo, NO)를 사용하여 CD8 및 CD4 집단을 제거하였다.

CD3에 대한 모노클로날 항체를 사용한 PBMC의 동시자극

HIV-1에 대해 혈청반응 포지티브인 피검체로부터 분리된 PBMC를, IL-15(50ng/ml)를 함유하거나 함유하지 않은 Dynabeads(Dynal Biotech)에 결합된 CD3에 특이적인 모노클로날 항체로 자극하고, 상기 기재된 바와 같이 ELI스팟에 의해 IFN-γ의 생성을 분석하였다. CD8 또는 CD4중 하나에 특이적인 모노클로날 항체에 커플링된 Dynabeads(Dynal Biotech)를 사용하여 CD8 및 CD4 집단을 제거하였다.

CD40L를 사용한 PBMC의 동시자극

CD40L 단백질을 IL-15와 배합하여 시험하고, 펩티드를 250㎍/ml의 농도로 혼합하여 상기 기재된 바와 같이 ELI스팟에 의해 IFN-γ의 생성을 분석하였다.

마우스에서 플라스미드 면역화

암컷 Balb/c 마우스에게 0 내지 2주째에 50㎍의 pCgag 또는 pCenv 및 상기 기재된 바와 같이 IL-2R-의존성 Thl 사이토킨 IL-15의 유전자를 발현시키는 50㎍의 플라스미드를 동시-백신접종하였다(하기 참조문헌 33). Cd4^tmIKnm 표적화된 돌연변이에 대한 동형접합체 마우스를 또한 사용하였다. 이들 마우스에게 CD4 유전자에서의 돌연변이로 인한 CD4⁺ T-세포 발생을 완전하게 차단시켰다; 이들 순환하는 T-세포중 90%는 CD8⁺이다. 동형접합체 돌연변이 마우스는 또한 헬퍼 T-세포 활성 및 기타 T-세포 반응에서 II형 제한된 결손을 나타낸다. B6.129S6-Cd4^tmIKnm에게 0 및 2주째에 50㎍의 pCgag, 및 CD40L, IL-15 또는 이들 둘다를 발현시키는 50㎍의 플라스미드를 배합하여 동시-백신접종하였다. 모든 DNA를 Qiagen 칼럼을 사용하여 제조하였고, 최종 제제는 등장성 시트레이트 완충액 중의 0.25% 부피바카인이었다. 비장을 2차 주사 1주일 후 수거하였다.

쥐 세포독성 T 림프구 분석

CTL 반응을 재조합 우두 감염된 세포를 표적으로서 사용하여 5시간 ⁵¹Cr 방출 CTL 분석으로 평가하였다. 비장세포를 백신접종 1주일 후 분리하고, 시험관내 자극하였다. 이펙터를 관련된 우두-감염된 세포로 자극하였다. P815를 gag/pol에 있어서는 vDK1로, env에 있어서는 (ARRR) 또는 vMN462(ARRR)로 감염시켰다. 자극제를 상기 기재된 바와 같이 0.1% 글루타르알데하이드로 고정하고, CTL 배양 배지에서 4 내지 5일 동안 1:20의 비로 비장세포와 함께 배양하였다. CTL 배양 배지는 1:1의 비의 Iscove 변형된 둘베코(Dulbecco) 배지(Gibc--BRL, Grand Island, NY) 및 10%의 소태아혈청 1640(Gibco-BRL)을 함유하는 행크스(Hanks) 평형 염용액(Gibco-BRL) 및 Con A(Becton Dickinson Labware, Bedford,MA)를 함유하지 않는 10% RAT-T-STIM으로 이루어져 있다. 37℃에서 12시간 동안 10의 감염 다중도(MOI)로 3 x 10⁶ P815 세포를 감염시킴으로써 우두-감염된 표적을 제조하였다. 표준 크롬 방출 분석을 수행하였고, 여기서, 표적 세포를 120분 동안 20μCi/ml의 Na₂ ^5lCrO₄로 표지하고, 37℃에서 6시간 동안 자극된 이펙터 비장세포와 함께 배양하였다. CTL 용해물을 50:1 내지 12.5:1의 범위인 이펙터:표적(E:T)의 비에서 측정하였다. 상등액을 수거하고, LKB CliniGamma 감마-계수기상에서 계수하였다. 특이적 용해율을 다음 식으로 계산한다:

최대 방출을 1% 트리톤 X-100을 함유하는 배지에서 표적 세포의 용해에 의해 측정하였다. '자발적 방출' 수에 대한 값이 '최대 방출'의 20%를 초과하는 경우, 분석은 유효한 것으로 간주하지 않았다.

CD8+ T 세포의 보체 용해물

항-CD8 모노클로날 항체(Pharmingen, San Diego, CA)로 처리한 후, 래빗 보체(Sigma)와 함께 상기 기재된 바와 같이 37℃에서 45분 동안 배양하여 비장세포로부터 CD8+ T 세포를 제거하였다(하기 참조문헌 33).

쥐 T 헬퍼 세포 증식 분석

림프구 증식 분석을 사용하여 림프구의 전반적인 면역적격성을 평가하고, 항체 특이적 분열 세포를 검출하였다. 림프구를 비장으로부터 수거하고, 적혈구를 제거하고, 상기 기재된 신선 배지로 수회 세척하여 제조하였다(하기 참조문헌 34). 분리된 세포를 5 x 10⁶세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 5 x 10⁵세포를 함유하는 100㎕의 분취량을 96웰 미세역가 평저 플레이트의 각각의 웰에 바로 첨가하였다. 재조합 p24 단백질을 최종 농도 5㎍/ml 및 1㎍/ml가 되도록 3회 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5% C0₂하에 3일 동안 배양하였다. 1μCi의 삼중수소화 티미딘을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 12 내지 18시간 동안 배양하였다. 플레이트를 수거하고, 삼중수소화 티미딘의 혼입된 양을 Beta 플레이트 판독기(Wallac, Turku, Finland)로 측정하였다. 자극 지수를 다음 수학식으로 계산하였다:

자극 지수(SI) = (실험적 수/자발적 수)

자발적 수 웰은 10% 소태아혈청을 포함하고, 이는 비관련된 단백질 대조군으로서 작용할 것이다. 유사하게, pCgag 또는 대조군 면역시킨 마우스로부터의 비장세포는 일반적으로 이들의 비관련 단백질 표적에 대해 SI 1의 값을 갖는다. 세포가 건강한지를 확인하기 위해서, PHA 또는 Con A(Sigma)를 폴리클로날 자극제 포지티브 대조군으로서 사용하였다.

자극된 쥐 세포의 사이토킨 및 케모킨 분석

림프구를 비장으로부터 수거하고, 분리된 세포를 5 x 10⁶세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 5 x 10⁵세포를 함유하는 100㎕의 분취량을 96웰 미세역가 평저 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 재조합 p24 또는 외피 단백질을 최종 농도 5㎍/ml 및 1㎍/ml가 되도록 3회 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5% C0₂하에 3일 동안 배양하고, 상등액을 수거하였다. 사이토킨 및 케모킨을 시판중인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

자극된 쥐 세포의 인터페론-γ에 대한 세포내 염색

마우스에게 pCgag DNA 또는 pCgag DNA 플라스미드와 함께 pIL-15를 함유하는 2개의 주사를 제공하였다. 1주후, 비장세포를 p55 펩티드 칵테일(11aa 중복체를 갖는 122개의 15량체 스패닝 HIV-1 p55를 함유) 및 브레펠딘(브레펠딘)A를 함유하는 배지에서 5시간 동안 시험관내 배양하였다. 자극후, 세포를 항-마우스 CD3 및 항-마우스 CD8 항체로 세포외 염색한 후, 항-마우스 IFN-γ로 세포내 염색하였다. 점 플롯은 CD3+/CD8+ 림프구로부터의 반응을 나타내는 것이다.

에피토프 맵핑

비장세포를 10% FCS(R1O)을 함유하는 RPMI에서 1 x 10⁶세포/ml의 농도로 재현탁하였다. AIDS Reference and Reagent Repository로부터 수득한 일련의 122개 펩티드를 최종 농도 20㎍/ml/펩티드로 풀(pool)당 10개 펩티드의 풀로서 혼합하였다. 각각의 펩티드는 총 22개 펩티드 풀에 대해 2개의 별개의 풀에 포함되었다. 풀을 매트릭스 포맷으로 배열하고, 비장세포 자극을 위해 사용하였다. IFN-γ 생성을 ELI스팟(R 및 D 시스템)으로 평가하였다. 플레이트를 37℃에서 대략 24시간 동안 배양하였다. 각각의 샘플을 3회 분석하였다.

결과

CD3 및 IL-15을 사용한 림프구의 자극

IL-15에 있어서, T 세포 수용체 자극시 상승작용 방식으로 T 세포 이펙터 활성화를 증가시키는 이의 능력에 대해 평가하였다. PBMC를 HIV-1 감염된 개체로부터 분리하였다. PBMC를 CD3에 표면 결합된 항체로 자극한 후, IL-15와 함께 밤새 배양하였다. 예상된 바와 같이, PBMC의 CD3 자극 단독은 IFN-γ의 생성을 유도한 반면, IL-15 보충물 단독은 낮은 반응 내지 어떠한 반응도 유도하지 않았다. 그러나, 림프구를 CD3 및 IL-15로 함께 자극한 경우, IFN-γ를 분비하는 세포수에서 수배 증가하는 것으로 관찰된다(도 1). 자극된 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 제거한 후, IL-15로 보충하고, 다시 활성을 시험하였다. 다시, CD8 세포의 손실로 활성화 시그날이 제거되었다. 이 데이타는, 만성적으로 감염된 HIV-1 개체로부터의 CD8+ 이펙터 T 세포가 IL-15/CD3 자극으로 증가할 수 있음을 나타내는 것이다(도 2).

IL-15 자극후, HIV-1 포지티브 샘플의 항원 특이적 IFN-7 생성

HIV-1 항원 특이적 CD8+ 반응을 증강시키는 IL-15의 능력을 시험관내 평가하였다. 샘플을 재조합 항-레트로바이러스 요법(HAART)으로 치료중인 만성적으로 감염된 HIV-1+ 피검체로부터 수거하였다. PBMC에 있어서, IL-15의 존재 또는 부재하에 HIV-1 특이적 펩티드로 자극한 후, IFN-γ를 분비하는 이의 능력에 대해 평가하였다. PBMCS를 HIV-1 gag 단백질의 개방 판독 프레임 전체를 포함하는 중복 HIV-1 아미노산 펩티드로 자극하였다. 펩티드로 자극된 피검체로부터의 PBMC는, IL-15로 처리했을 때 증가된 IFN-γ 생성을 나타내었고(도 3a 및 3b), IL-15를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 IFN-γ 생성 사이에 유의적 차이가 있었다(p= 0.009)(도 3c). 몇몇 피검체에서는 IL-15 단독으로 자극한 경우 높은 수준의 IFN-γ 분비가 있었고(도 3a), 이는, 이들이 차단된 부분적 T 세포 활성화를 갖고, 효과적인 사이토킨 보충을 필요로 한다는 것을 제시하는 것이다. CD8 세포 집단을 제거했을 때, IFN-γ 생성이 손실된 바와 같이, 이의 활성은 완전하게 CD8 매개되었다(도 3d).

IL-15는 마우스 생체내 CD8+ CTL 반응을 증강시킨다.

HIV-1 반응 및 IL-15의 상기 연구에 의해, IL-15가 프라이밍된 T 세포 집단에서 IFN-γ 생성을 증강시킬 수 있는 것으로 확립되었다. 그러나, IL-15가 생체내에서 CD8+ T 세포의 기능적 유도상에 어떠한 효과를 갖는지는 불명확하였다. 이러한 의문점을 해결하기 위해서, 마우스 모델 시스템을 사용하였다. 마우스에게, HIV-1 항원을 전달하여 생체내 CD8 면역성 유도를 연구하는 방식으로, HIV-1 플라스미드로 백신접종하였다. HIV-1을 발현하는 플라스미드를, IL-15를 발현하는 플라스미드 또는 대조군 플라스미드중 하나로 동시주사하고, 수득한 면역 반응을 비교하였다. 용적 CTL 분석에서, HIV-1 외피 및 IL-15를 발현하는 플라스미드로 동시주사한 것은, 외피 플라스미드 및 대조군 벡터를 사용한 경우 관찰된 11%의 용해와 비교하여 50:1의 이펙터:표적 비의 HIV-1 외피-발현 표적의 거의 40% 용해를 야기하였다(도 4, 패널 a). 이들 결과는 CD8 T 세포 의존적이었고, 이는 이펙터 T 세포 반응상의 IL-15의 유의적 효과를 나타낸다.

IL-15는 마우스에서 항원 자극후, MIP-lβ 및 IFN-g 분비를 유도한다.

백신-유도된 세포 면역 반응을 면역 활성화 마커로서 β-케모킨 MIP-1β의 발현 프로필을 조사함으로써 추가로 평가하였다. 케모킨은 면역 및 염증 반응의 중요한 조절인자이다. 이들은 혈관에서부터 숙주 방어의 말초 부위까지 백혈구의 트래픽킹(trafficking)의 분자 조절에 특히 중요하다. 또한, MIP-1β를 포함한 T 세포-생성된 케모킨이 세포 면역 증식에 결정적 역할을 한다고 이미 보고되어 있다(하기 참조문헌 24). 따라서, 자극된 T 세포에 의해 생성된 케모킨 수준은 항원-특이적 세포 면역 반응의 수준 및 질에 대한 추가의 통찰을 제공할 수 있다. 자극된 T 세포로부터의 상등액(물질 및 방법에 기재된 바와 같음)을 분석하고, MIP-1β 방출에 대해 시험하였다. IL-15로 동시 면역화한 것은 높은 수준의 MIP-1β 분비를 야기하였다(도 4, 패널 b).

또한, Th1 사이토킨, IFN-γ의 생성에 대해서도 상등액을 평가하였다. HIV-1 외피를 발현하는 재조합 우두로 감염된 자극 세포로 림프구를 자극한 3일 후, 세포를 CTL 분석에 사용하기 직전, 샘플을 수득하였다. 도 4, 패널 c는, IL-15로 동시 동시-주사한 마우스로부터의 비장세포가 플라스미드 백신 단독 또는 대조군으로 주사한 것과 비교하여 보다 높은 수준의 IFN-γ(120pg/ml)를 유도하였음을 제시하고 있다. 대조적으로, 임의의 배양에 의해 IL-4의 어떠한 유의적 생성도 이들 연구에서 관찰되지 않았다(데이타는 제시되지 않음).

IFN-γ 및 TNF-α에 대한 세포내 염색.

HIV-1 백신에 대한 T 세포 반응을 정량하기 위해서, 세포내 사이토킨 염색 분석을 수행하였다. 면역시킨 동물을 희생시키고, 비장세포를 수거하여 p55 칵테일 혼합물 및 브레펠딘 A를 함유하는 배지에서 5시간 동안 시험관내 배양하였다. CD8+ CD3+ T 세포를 유동세포측정기에 의해 IFN-γ 또는 TNF-α 생성에 대하여 분석하였다(도 5, 패널 a 및 도 5, 패널 b). IL-15 동시-백신접종된 동물은, CD8+ T 세포의 2.6%가 IFN-γ를 생성하고, 3.7%가 TNF-α를 생성하는, 높은 CD8 이펙터 T 세포 반응을 나타내었다. 이들 데이타는, IL-15가 기능적 CD8+ T 세포 반응상에 상당한 효과를 나타냄을 예시하는 것이다.

IL-15 및 HIV-1 백신으로 동시-면역화된 쥐 비장세포의 림프구 증식.

T 헬퍼 림프구의 활성화 및 증식은 체액성 및 세포성 면역 증가에 필수적이다. 면역시킨 마우스로부터의 비장세포를 재조합 HIV-1 항원의 자극에 대한 반응에서 증식하는 능력에 대해 기본적 림프구 증식 분석으로 평가하였다. IL-15는 증식 반응에 상당한 효과를 갖는 것으로 보이지는 않았다(도 6). 그러나, IL-2는 대조군으로서 사용되었고, IL-12 플라스미드로 동시-주사된 마우스에서 gpl20 env 단백질에 대한 비장세포 증식에서 상당한 증가가 명확하게 관찰되었다. IL-12로 동시-주사된 마우스의 비장세포는, 대조군, pCgag 단독 또는 pCEnv + IL-15로 면역시킨 마우스의 비장세포보다 약 3배 이상 큰 자극 지수를 야기하였다(도 6). 이들 데이타는, IL-15가 T 세포 조력의 상당한 증대없이 CD8 T 세포 기능을 증강시키는 것으로 보인다. 또한, 이는, IL-15에 의한 이들의 증대가 IL-2에 의존적이지 않음을 예시하는 것이다. 이는, 이러한 경우, CD8 이펙터 기능 뿐만 아니라 CD4도 증가함을 제시하는 것이다.

에피토프 맵핑

IL-15 처리한 CD8+ T 세포 반응의 증강이 반응된 에피토프 수의 증가(즉, 에피토프 확산)에 인한 것인지, 동일한 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포 수의 전반적 증가에 인한 것이지에 대한 의문을 해결하기 위해서, ELI스팟 분석 및 AIDS Reference and Reagent Repository로부터 수득된 일련의 펩티드(매트릭스 포맷으로 풀로서 혼합됨)를 사용하였다. 2개의 에피토프를 동정하였다. 우성 에피토프를 Gag 아미노산 197 내지 211(AMQMLKETMEEAAE-서열번호: 1)(도 7)에 맵핑하였다. 패터슨(Paterson) 등은 재조합 엘. 모노사이토게네스(L. monocytogenes) HIV-1 백신으로 면역시킨 후, 우성 CD8 에피토프로서 AMQMLKETI-서열번호: 2(하기 참조문헌 35)를 이미 정의하였다. 아-우성 에피토프인 Gag 아미노산 293 내지 307(FRDVDRFYKTRAE-서열번호: 3)(도 7)을 추가로 정의하였다. Gag만 면역시킨 그룹에서 관찰된 에피토프 둘다에 대한 반응에서와 같이 반응된 에피토프의 수에서는 어떠한 증가도 없었다. 그러나, IL-15는 이들 에피토프에 대한 반응의 범위를 상당히 증가시켰다. IL-15 동시-백신접종된 동물에서만 아-우성 에피토프가 명확하게 증명되었다. IL-15는 이펙터 CD8 세포의 증가에 효과가 있다.

CD4 녹아웃 마우스

본 발명자들은, IL-15가 HIV-1 감염된 개체로부터의 PBMC에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 증가시킴을 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 당해 백신 모델에서 CD4 증가에 의존적인 상당한 CD8 이펙터 세포 유도를 관찰하였다. 따라서, IL-15 면역 증가에 대한 CD4 헬퍼 세포의 기여는 의문점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, CD4 세포의 완전한 부재하에 CD8 이펙터 집단을 유도하는 IL-15의 능력을 시험하였다. Cd4^tmIKmw 표적화된 돌연변이에 대한 마우스 동형접합체(하기 참조문헌 36)을 면역시켰다. 이들 마우스에서 CD4+ T-세포 발생을 차단하였고, 따라서, 순환하는 대부분의 림프구는 CD8 세포이다. 평균적으로, 정상 마우스에서 100만 림프구당 대략 200개 IFN-γ를 생성하는 세포가 유도되는 플라스미드 동시-면역화 모델에서, CD4 세포의 완전 부재하에, IL-15는 유도된 CD8 이펙터 기능을 구제할 수 없었다(도 8, 패널 b). IL-15의 효과는 CD4 증가와 관련된 것으로 보이지 않으므로(도 6), 상기 결점은 T 헬퍼 세포에 의해 제공된 또다른 기능의 결손으로 인한 것이고, CD4 T 헬퍼 세포는 또한 항원 제공 세포(APC)의 활성화를 통해 CD8 증가에 도움을 제공한다. APC 활성화의 이러한 모델에서, APC상에서 CD40을 T 세포 CD40 리간드와 연결하는 것은 T 세포 활성화를 가능하게 하는 B7 발현을 상향조절한다. B7 분자는 MHC I형 펩티드 제공에 있어서, CD8 T 세포 증가에 대한 동시자극을 제공한다. 또한, 부르게오이스(Bourgeois) 등은(하기 참조문헌 37) CD40L이 CD8 기억 세포 발생에 직접 효과를 미칠 수 있음을 증명하였다.

CD4 도움에서의 결점이 동시자극의 결손 수준으로 그자체를 명백하게 한다는 것은, 다음에 고려되고 탐구되었다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 마우스를 IL-15 및 CD40L 둘다를 함유하는 플라스미드와 pCgag와 함께 동시-면역시켰다. 고정된 CD40L 분자를 사용하였다. 고정된 CD40L은 국소적으로 발현되지만, 면역 세포 트래픽킹에서는 분비되지 않고, 이는 실험을 복잡하게 하였다(하기 참조문헌 38). 이러한 백신접종으로 플라스미드 모델에서 트랜스 동시자극을 제공할 수 있다(하기 참조문헌 38). 실제로, pCgag를 pCD40L과 배합하여 연구한 경우, Gag 특이적 CD8 면역 반응이 CD40 KO 마우스에서 유도되었다(도 8). 이 데이타는, IL-15가 기억 CD8 림프구상에 직접 효과가 있음을 추가로 나타내는 것이다. CD4 세포의 부재하에, IL-15는 비감작 세포로부터의 항원 특이적 CD8 세포 반응을 유도할 수 없다.

논의

HIV-1 특이적 CD8 면역 반응을 유지시키고 증강시키는 것은 다수의 연구의 근거가 되었다. 최근에 연구에 의하면, IL-15는 기억 세포 생존을 지지하는데 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 보고되었다. 마우스 모델에서, IL-15의 존재가 기억 세포 분열을 야기할 수 있는 것으로 관찰되었다(하기 참조번호 39). IL12, IL-15 또는 이들의 특이적 수용체가 유전적으로 결핍된 형질도입 마우스를 사용한 연구에서 뿐만 아니라 체외 기능적 분석은 IL-15에 의한 역할을 특징짓는데 중요하였다. 실제로, 장(Zgang) 등은 (하기 참조문헌 39), 생체내 마우스 모델에서, IL-15가 기억 표현형인 CD44hi CD8+ T 세포의 효과적이고 차별적인 자극을 제공한다는 것을 증명하였다. 그리고, 구(Ku) 등은 (하기 참조문헌 40), 기억 CD8+ T 세포의 분열이 IL-15에 의해 자극되지만, IL-2에 의해서는 억제된다고 보고하였다. 또한, IL-2가 CD8+ 기억 T 세포의 증식을 억제한 것으로 발견되었다.

본원에 기재된 문헌은, IL-15가 또한 시험관내 및 생체내 CD8+ 이펙터 T 세포를 유도하는데 특히 효과적임을 증명하고 있다. HIV-1 감염된 환자로부터 분리된 CD8+ T 세포는, 펩티드 및 IL-15와 함께 배양하는 경우, 항원 특이적 방식으로 IFN-γ를 분비할 수 있었다. IL-15는 TCR과 함께 림프구를 자극하여 IFN-γ를 생성하도록 작용하고, 이펙터 표현형을 나타낸다. 몇몇 피검체에서, IL-15는 항원 부재하에 IFN-γ의 생성을 야기하였다. 이는, HIV 감염에서, 몇몇 세포가 부분적으로 활성화되고, 이들 부분적 활성화 상태가 IL-15에 의해 구제될 수 있음을 나타내는 것이다. 그러나, 모든 피검체에서, PBMC를 IL-15 및 HIV-1 항원 둘다로 자극하는 경우, 이펙터 기능에서 상당한 증가가 있음이 중요하다.

최근에, 폰 아드리안(von Adrian) 및 그의 동료들(하기 참조문헌 41)은, 림프구의 IL-15 자극이 비감작 세포로부터 직접 기억 세포 표현형을 발생시키는 CD8+ T 세포를 야기할 수 있는 것으로 제시하고 있다. 그러나, 본원 데이타에서는, TCR의 연대가 보다 완전한 CD8+ T 림프구의 활성화를 야기할 수 있음을 제시하고 있고, 이는 비감작 세포상의 IL-15 단독 효과가 최소일 것이라는 것을 나타내는 것이다. 또한, IL-15가 비-기능적인 기억 세포를 야기하는 것으로 제시되어 있다(하기 참조문헌 41). 본원 데이타는, IL-15 증가가 마우스 연구에서 뿐만 아니라 사람에서도 평가된 바와 같이 완전 기능적 CD8+ T 세포를 야기함을 증명하는 것이다. 마우스에서, IL-15는 CD8+ T 세포 반응 뿐만 아니라 β-케모킨 및 IFN-γ 반응의 증강을 상당하게 증가시키고, 이는 항원 특이적 증가를 제시하는 것이고, 선행 문헌을 이루는 것이다(하기 참조문헌 33 및 42). 이러한 CD8+ T 세포 기능의 증가는 CD4+ T 세포 증가의 부재하에 관찰되었다. 또한, CD8 반응의 발생에서 CD4 T 세포는 중요한 역할을 한다. CD4 녹아웃 마우스에서의 연구에서, CD4 T 세포에 대한 필요성이 CD40L을 사용함으로써 극복될 수 있었다. 이러한 발견은 바이러스 감염의 면역치료에서 결정적으로 중요할 수 있다.

다수의 면역치료 전략은 CD8+ T 세포 반응을 증가시키는데 초점을 두고 있다. HIV-1 감염은, 효과적인 CD4+ T 세포 조력의 결핍에 기여하는 바이러스 유도된 면역 억제를 통해 면역 요법을 악화시킨다. 또한, 이러한 조력의 결핍은 비생산성 CD8+ T 세포 반응에 책임이 있는 것으로 보인다. 일반적으로, 만성 감염은 바이러스 복제 조절을 유지하기 위해 CD4+ 조력을 필요로 하고, 이는 HIV-1 감염에 있어서의 경우와 유사하다. 세르비나(Serbina) 등은 (하기 참조문헌 43), CD8+ 세포독성 T 세포가 CD4+ T 세포 의존적임을 증명하였다. 이들은, CD4 T 세포 녹아웃 마우스에서, IL-15 생성이 감소하였음을 추가로 발견하였다. 그러나, IL-15는 CD4+ T 세포에 의해 생성되지 않는다. 이는 주로, 간질 세포, 단핵구 및 대식세포에 의해 지배적으로 생성된다. CD4+ T 세포가 IL-15의 생성을 증강시키는 몇몇 피드백 메카니즘이 있을 수 있고, 감소된 CD4 조력의 경우, 결국 CD8+ T 세포 기능은 감소된다. 이러한 피드백 메카니즘으로 6명의 피검체중 3명에서 IL-15 단독 첨가후, IFN-γ의 생성 원인을 설명할 수 있다. CD4의 부재시, 따라서, 보다 낮은 수준의 IL-15에서, 잔류하는 바이러스는 HIV-1에 대한 혈청반응 포지티브인 피검체에서 CD8+ T 림프구를 오직 부분적으로 활성화시킬 수 있다. 중요하게는, IL-15를 트랜스로 첨가하여 바이러스 면역억제로 야기된 결점을 대체할 수 있을 것으로 보인다. 이러한 가설로부터의 의미는, HIV-1에 대한 면역 요법의 영역에서 고려되어야 한다.

요약하자면, IL-15는 마우스에서 CD8+ T 세포 이펙터 기능을 증가시키고, HIV-1 감염에 대해 포지티브인 피검체로부터 분리된 CD8+ T 세포의 기능성을 증가시킨다. 활성 면역 요법에 대한 보충제로서의 IL-15의 용도는 HAART에 대한 보조 요법으로서 간주되어야 한다.

참조문헌(본원 참조로서 각각 인용된다)

실시예 2

항종양 면역학에서 뿐만 아니라 면역 손상 개체에서 바이러스 복제를 조절하기 위해 CD4 (+) Th 세포 및 IFN-γ의 생성이 필요하다. 수행된 실험으로부터의 데이타에 의하면, CD8 이펙터 또는 T 세포의 발현을 돕는 T 세포의 필요는 백신 부위에서 IL-15 및 CD40L의 국소적 생성에 의해 대체될 수 있는 것으로 증명되고 있다. CD4(+) T 세포가 MHC II형 베타쇄(MHC II KO)의 유전자 녹아웃에 의해 제거된 마우스를 사용한 실험으로부터, 항원 gag + IL-15 + CD40L을 갖는 동물의 프라이밍은 CD8 T 세포의 활성화를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 활성화는 점으로서 IFN-γ 생성에 의해 측정된다. 이러한 분석에서 50 점 이상은 포지티브이다. 표 9에 제시된 바와 같이 이들 데이타는, 이펙트 또는 CD4 (+) T 세포 조력과는 독립적인 CD8 T 세포의 활성화를 위한 간단한 방법을 예시하고 있다. 이들 연구는 면역 손상된 개체의 치료에 중요하다.

실시예 3

사람, 마우스 및 유인원 IL-15cDNA는, 절단되어 114 aa 잔기 성숙 IL-15를 생성시키는, 48 aa 잔기 리더를 함유하는 162개 아미노산(aa) 잔기 전구체 단백질을 암호화한다. 사람 IL-15는 각각 유인원 및 마우스 IL-15와 대략 97% 및 73% 동일한 서열을 갖는다. 사람 및 유인원 IL-15 둘다는 마우스 세포상에서 활성이다. IL-15의 구조가 결정되지는 않았지만, 4중-나선형 다발 구조의 사이토킨 패밀리의 기타 구성원 및 IL-2와 유사한 것으로 예측된다[참조: Grabstein, K. et al. (1994) Science 264: 965, Anderson, D. M. et al. (1995) Genomics 25:701; and Bamford, R. N. et al. (1995) cytokine 7: 595, Brandhuber, B. J. et al. (1987) Science 238: 1707, 이들 둘다 본원 참조로서 인용된다].

IL-15 mRNA는 심장, 폐, 간, 태반, 골격 근육, 부착 말초혈액 단핵구, APC(수지상 세포), 및 상피 및 섬유모세포주에서 검출되었다. 그러나, IL-15 mRNA는 활성화된 말초혈액 T 세포에서는 검출할 수 없고, 높은 수준의 IL-2 mRNA를 함유한다. IL-15는 천연 킬러 세포, 활성화된 말초혈액 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL) 및 B 세포의 증식을 자극하는 것으로 나타났다. 또한, IL-15는 사람 혈액 T 림프구에 대한 화학유인물질로 NK 세포에서 림포카인-활성화 킬러(LAK) 활성을 유도하고, 세포용해 이펙터 세포의 생성을 유도하는 것으로 나타났다[참조: Armitage, R.J. et al. (1995) J. Immunol. 154:483; P. Wilkinson and F. Liew (1995) J. Exp. Med. 181:1255; Grabstein, K. et al. (1994) Science 264:965; Giri, J.G. et al. (1994) EMBO J. 13:2822; and Giri, J.G. et al. (1995) EMBO J. 15:3654, 이들 각각은 본원 참조로서 인용된다].

IL-15가 원형의 Thl 사이토킨이고, T 세포, NK 세포, LAK 세포 및 TIL의 자극원으로서의 이의 활성으로 인하여, IL-15는 세포 면역 반응을 증강시키는 HIV 백신과 같은 DNA 백신과 함께 분자 아쥬반트로서 사용하기 위한 흥미로운 후보자이다. IL-15는 HIV 특이적 CTL을 증가시키고, IL-15의 과생성은 크론씨병과 같은 염증성 질환과 관련있다.

노던 블롯 분석에는 IL-15의 넓게 퍼진 항상성 발현을 나타낸다. 발현의 대조군은 전사후에 해독 및 전위 수준(세포내 트래픽킹)으로 발생한다. IL-15 mRNA는 다음을 포함하는 단백질로의 이의 전사를 방해하는 다수의 인자를 포함한다: 1) 효과적인 IL-15 해독을 방해하는 상류 AUG와 함께 부하된 5' AUG(마우스중 5마리, 사람중 12명); 2) 약한 코작 환경(GTAATGA)을 갖는, IL-15 암호화 서열에 대한 출발 코돈; 및 3) IL-15 성숙 단백질 암호화 서열의 C-말단내 네거티브 인자의 존재[참조: Grabstein et al., (1994) Science 264: 965-968, Bamford et al., (1996) PNAS 93: 2897-2902; Bamford et al., (1998) J. Immunol 160:4418-4426 ; and Kozak et al., (1991) J. Cell Biol. 115: 887-903, 이는 본원 참조로서 인용된다]. 이들 3개의 각각의 대조군은 발현을 향상시키기 위해 제거될 수 있다.

본래 IL-15 이소형은 2개의 리더 펩티드를 함유한다: 21 aa 시그날 펩티드(SSP) 또는 48 aa 시그날 펩티드(LSP)[참조: Waldmann et al. Ann. Rev > Immunol. (1999) 17: 19-49, 이는 본원 참조로서 인용된다].

면역화를 위해 IL-15 DNA 작제물을 최적화함으로써 IL-15의 발현을 증가시키기 위한 다음의 전략을 따랐다. 시그날 펩티드의 출발로부터 IL-15를 증폭시키도록 프라이머를 디자인하고, 따라서 상류 억제성 AUG는 최종 IL-15 메시지에 존재하지 않는다. 강한 코작 환경(GCCGCCACC)을 포함하도록 프라이머를 디자인하였다. C-말단 네거티브 조절 인자를 PCR 안티센스 프라이머 디자인을 사용하여 제거하였다. 프라이머를 도 10에 제시하고 있다.

IgE 리더를 함유하는 48개 아미노산 IL-15 시그날 펩티드(LSP)의 치환을 통해 IL-15 발현을 증가시키기 위한 다음의 전략을 수행하였다. 안티센스 프라이머를 종결 부위로부터 증폭시키면서, 48 aa LSP 다음부터 출발하도록 센스 프라이머를 디자인하였다. 강한 코작 환경(GCCGCCACC-서열번호: 4)를 포함하도록 프라이머를 디자인하였다. IgE 리더 서열 + ATG 출발 부위에 대한 서열을 함유하도록 센스 프라이머를 디자인하였다. 프라이머를 도 11에 제시하고 있다.

다양한 작제물을 제조하고, RD 세포를 형질감염하는데 사용하였다. IL-15 단백질 생성에 대해 다양한 작제물에 대해 측정하였다. 데이타를 도 12, 패널 a 내지 c에 제시하고 있다. 도 13A는, IL-15에 연결된 21개 아미노산 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(IL-15SSP-좌측) 및 사람 48개 아미노산 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(IL-15 LSP-우측)을 포함하는 사람 작제물에 의한 발현의 비교를 나타내고 있다. 도 12, 패널 b는 48개 아미노산 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(사람 IL-15 LSP-좌측) 및 IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(사람 IL-15-IgE-우측)을 포함하는 사람 작제물에 의한 발현의 비교를 나타내고 있다. 도 12, 패널 c는 48개 아미노산 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(Mac IL-15 LSP-좌측) 및 IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열(Mac IL-15- IgE-우측)을 포함하는 짧은꼬리원숭이 작제물에 의한 발현의 비교를 나타내고 있다.

다양한 작제물로부터 생성된 IL-15 단백질의 IL-15 생체활성을 측정하였다. 데이타를 도 13 패널 a 및 b에 나타내고 있다. 도 13, 패널 a는 48개 아미노산 시그날 펩티드를 포함하는 사람 작제물(사람 IL-15 LSP-좌측) 및 IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 사람 작제물(사람 IL-15-IgE-우측) 사이의 IL-15 생체활성의 비교를 나타내고 있다. 도 13, 패널 b는 48개 아미노산 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 짧은꼬리원숭이 작제물(Mac IL-15 LSP-좌측) 및 IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 짧은꼬리원숭이 작제물(Mac IL-15- IgE-우측) 사이의 IL-15 생체활성에 대한 비교를 나타내고 있다.

IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열에 연결된 IL-15 암호화 서열을 삽입하여 발현 벡터 pVAX를 사용하여 작제물을 제조하였다. HIV-1 Gag를 암호화하는 작제물을 또한 생성시켰다. HIV-1 Gag와 배합된 IL-15 가공된 플라스미드를 사용하여 면역 반응상의 효과를 비교하는 면역학적 실험을 수행하였다. Balb/c 마우스를 도 14에 제시된 면역화 스캐쥴에 따라 백신접종하였다.

3차 면역화후, 5주째에 항원-특이적 IFN-γ 생성의 재자극을 비교함으로써 면역 반응을 연구하였다. 데이타를 도 15에 제시하고 있다. 백신 그룹에는 비감작 마우스, 벡터 pCDN3으로 백신접종된 마우스, HIV-1 Gag를 암호화하는 작제물로 백신접종된 마우스, 48개 아미노산 시그날 펩티드에 연결된 HIV-1 Gag 및 IL-15를 암호화하는 작제물로 백신접종된 마우스 및 IgE 시그날 펩티드에 연결된 HIV-1 Gag를 암호화한 작제물로 백신접종된 마우스가 포함되었다.

실시예 4

가공된 IL-15 플라스미드 백신을 본래 IL-15 코작 영역, AUG 및 UTR을 제거함으로써 작제하였다. IgE 시그날 펩티드에 대한 암호화 서열을 갖는 가공된 IL-15 플라스미드를 제공하였다. 가공된 IL-15는 야생형 플라스미드와 비교할 만하게 관찰된 것보다 30 내지 50배 이상의 수준으로 발현되었다. 가공된 IgE 시그날-IL-15 및 HIV-1 gag 작제물로 동시-면역화된 마우스에서 관찰된 면역 반응은 HIV-1 gag 작제물 단독으로 면역시킨 마우스에서 보다 상당 배수였다. 데이타를 도 16에 제시하고 있다.

실시예 5

면역조절 단백질을 암호화하는 분리된 cDNA가 상기 면역조절 단백질을 제조할 수 있는 작제물의 작제에 출발 물질로서 유용하다. 몇몇 양태에서, 다음의 면역조절 단백질중 하나에 대한 암호화 서열이 IgE 시그날 펩티드에 연결된 작제물이 제공된다. 몇몇 양태에서, 이러한 작제물은 본원에 기재된 것과 같은 백신 및 면역조절 조성물의 부분으로서 제공된다.

표준 기술 및 용이하게 입수가능한 출발 물질을 사용하여, 면역조절 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제조하고, 본원에 기재된 작제물, 벡터 및 백신 등에 혼입시킬 수 있다.

진뱅크 수탁번호 AF031167은 사람 IL-15 mRNA의 완전 암호화 서열을 나타낸다. 진뱅크 수탁번호 Y09908, X91233, X94223 및 X94222는 또한 사람 IL-15 서열을 나타낸다. 각각의 서열은 참조로서 본원에 인용된다.

진뱅크 수탁번호 L07414는 사람 CD40-리간드 mRNA의 완전 암호화 서열을 나타낸다. 상기 서열은 본원 참조로서 인용된다.

Bax에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 L22473이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRAIL에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U37518 또는 AF023849이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRAILrecDRC5에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U90875 또는 AF016266이고, 이는 본원 참조로서 인용된다. 또한, TRAIL-R2 AF016849; TRAIL-R3 AF014794; 및 TRAIL-R4 AF021232가 참조로서 인용된다.

RANK에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 AF018253이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

RANK 리간드에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 AF019047 또는 AF333234이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Ox40에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X75962이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Ox40 리간드에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X79929 또는 AB007839이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2D에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 AF46181l 또는 X54870이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

MICA에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X92841이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

MICB에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U65416이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2A에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X54867이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2B에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X54868이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2C에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 X54869 또는 AjO016984이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2E에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 L14542이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NKG2F에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 AH006173, U96845 또는 U96846이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

CD30에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 M83554[참조: Durkop, H et al. Cell 68 (3), 421-427 (1992)]이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

CD153(CD30L)에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 L09753[참조: Smith, C. A., et al. Cell 73 (7), 1349-1360 (1993)]이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Fos에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 K00650 또는 V01512이고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

c-jun에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 J04111 또는 M29039이고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

Sp-1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 BC021101, BC005250, BC002878, M31126, J02893 또는 X15102이고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

Apl에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Lee et al, 1987 Cell 49: 741-752, Rauscher et al. 1988 Science 240: 1010-1016, and Chiu et al, 1988 Cell 54: 541-552]에 기재된 바와 같이 동정될 수 있고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

Ap-2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 M36711, 이는 본원 참조로서 인용된다.

p38에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U66243이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

p65Rel에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 L19067이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

MyD88에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U70451이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

IRAK에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 NM001569이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRAF6에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U78798이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

IkB에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Gilmore et al. Trends Genet 1993 Dec; 9(12): 427-33]에 기재된 바와 같이 발견될 수 있고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NIK에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 Y10256이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

SAP K에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Franklin et al. Oncogene. 1995 Dec 7; 11(11): 2365-74]에 기재된 바와 같이 발견될 수 있고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

SAP1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 M85164 또는 M85165이고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

JNK2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 L31951이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK1B2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U35005이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK1B1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U35004이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK2B2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U35003이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK2B1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U35002이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK1A2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U34822이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK2A1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U34821이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK3A1에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U34820이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

JNK3A2에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 U34819이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NF-카파-B2, p49 스플라이싱 형태에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 A57034이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NF-카파-B2, p100 스플라이싱 형태에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 A42024이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NF-카파-B2, p105 스플라이싱 형태에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 S17233이고,이는 본원 참조로서 인용된다.

NF-카파-B 50K 쇄 전구체에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 진뱅크 수탁번호는 A37867이고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NFkB p50에 대한 뉴클레오티드 서열은 문헌[참조: Meyer R., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(3), 966 970]에 기재되어 있고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-1 α의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Telford, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9955-9963, Furutani, et al. (1985) Nucl. Acids Res. 14: 3167-3179, March, et al. (1985) Nature 315: 641-647, 및 수탁코드 Swissprot P01583]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Holbrook, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1634-1638, Fujita, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7437-7441, Fuse, et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9323-9331, Taniguchi, et al. (1983) nature 302: 305-310, Meada, et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047, Devos, et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323 및 수탁번호 Swissprot P01585]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-4의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Arai, et al. (1989) J. Immunol. 142: 274-282 Otsuka, et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 333-344, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 5894-5898, Noma, et al. (1984) Nature 319: 640-646, Lee, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2061-2063, 및 수탁코드 Swissprot 05112(쥐 IL-4에 대한 수탁코드는 Swissprot 07750이다)]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Campbell, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6629-6633, Tanabe, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 16580-16584, Campbell, et al. (1988) Eur. J. Biochem. 174: 345-352, Azuma, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9149-9158, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7388-7392, 및 수탁코드 Swissprot P05113]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-10의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Viera, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1172-1176, 및 수탁코드 Swissprot P22301]에 제시되어 있다.

사람 IL-15의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Grabstein, et. al. (1994) Science 264: 965-968, 및 수탁코드 Swissprot U03099]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 IL-18의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Ushio, et al. (1996) J. Immunol. 156: 4274-4279, 및 수탁코드 D49950]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 TNF-α의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Pennica, (1984) Nature 312: 724-729, 및 수탁코드 Swissprot P01375]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 TNF-β의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Gray, (1984) Nature 312: 721-724, 및 수탁코드 Swessprot P01374]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용되어 있다. 사람 IL-10의 아미노산 서열은 익히 공지되어 있고, 문헌[참조: Viera, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1172-1176, 및 수탁코드 Swissprot P22301]에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

사람 인터루킨 12 mRNA에 대한 완전 암호화 서열은 진뱅크 수탁번호 AF180563(P40 mRNA) 및 AF180562(P35 mRNA) 및 미국 특허 제5,840,530호에 제시되어 있으며, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

MadCAM-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U80016[참조: Leung, E., et al, Immunogenetics 46(2), 111-119(1997)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

MadCAM-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U43628[참조: Shyjan, A. M., et al, J. Immunol. 156(8), 2851-2857(1996)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

NGF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M57399[참조: Kretschmer, P. J., et al., Growth Factors 5,99-114 (1991)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

IL-7에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 J04156[참조: Goodwin, R. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(1), 302-306(1989)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

VEGF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M32977[참조: Leung, D. W., et al., Science 246, 1306-1309 (1989)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

TNF-R에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M60275[참조: Gray, P. W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 7380-7384 (1990)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

TNF-R에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M63121[참조: Himmler, A., et al. DNA Cell Biol. 9, 705-715 (1990)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

Fas에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M67454[참조: Itoh, N., et al., Cell 66 (2), 233-243 (1991)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

CD40L에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 L07414[참조: Gauchat, J. F. M., et al. FEBS Lett, 315, 259-266 (1992)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

IL-4에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M23442[참조: Arai, N., et al., J. Immunol. 142 (1), 274-282 (1989)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

IL-4에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M13982[참조: Yokota, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (16),5894-5898 (1986)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M37435[참조: Wong, G. G., et al. Science 235 (4795), 1504-1508(1987)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

G-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X03656[참조: Nagata, S., et al, EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

G-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X03655[참조: Nagata, S., et al., EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

GM-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 Ml1220[참조: Lee, F., et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. U.S.A. (13), 4360-4364 (1985)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

GM-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M10663[참조: Wong, G. G., et al., Science228 (4701), 810-815 (1985)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

M-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M27087[참조: Takahashi, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (2), 892-901 (1989)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

M-CSF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M37435[참조: Wong G. G., et al., Science 235 (4795),1504-1508 (1987)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

LFA-3에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 Y00636[참조: Wallner, B. P., et al., J. Exp. Med. 166 (4), 923-932 (1987)]에서 발견되고, 이들은 각각 본원 참조로서 인용된다.

ICAM-3에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X69819에서 발견되고, 이들은 본원 참조로서 인용된다.

ICAM-2에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X15606[참조: Staunton, D. E., et al., Nature 339 (6219), 61-64 (1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

ICAM-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 J03132[참조: Staunton, D. E., et al., Cell 52 (6), 925-933 (1988)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

PECAM에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M28526[참조; Newman, P. J., et al., Science 247, 1219-1222 (1990)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

P150.95에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 Y00093[참조: Corbi, A. L., et al., EMBO J. 6 (13), 4023-4028 (1987)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Mac-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 J03925[참조; Corbi, A. L., et al., J. Biol. Chem. 263 (25), 12403-12411(1988)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

LFA-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 Y00796[참조; Larson. R., et al., J. Cell Biol. 108 (2), 703-712(1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

CD34에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M81104[참조: Simmons, D. L. et al., J. Immunol. 148, 267-271 (1992)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

RANTES에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M21121[참조: Schall, T. J., et al., J. Immunol. 141,1018-1025(1988)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

IL-8에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M28130[참조: Mukaida, N., et al., J. Immunol. 143 (4), 1366-1371 (1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

MIP-lα에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U72395[참조: Fridell, R. A., et al., J. Cell. Sci 110 (pt 11), 1325-1331 (1997)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

E-셀렉톤에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M24736[참조; Bevilacqua, M. P., et al., Science 243 (4895), 1160-1165 (1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

CD2에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M14362[참조: Sewell, W. A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83,8718-8722 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84, 7256-7256 (1987)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

MCP-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 S69738[참조: Li, Y. S., et al., Mol. Cell. Biochem. 126 (1), 61-68 (1993)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

L-셀렉션(selection)에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X16150[참조: Tedder, T. F., et al., J. Exp. Med. 170 (1), 123-133 (1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

P-셀렉션에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M25322[참조; Johnston, G. I., et al., Cell 56, 1033-1044 (1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

FLT에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X94263[참조; Mandriota, S. J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19), 11500-11505 (1996)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

FLT에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X51602[참조: Shibuya, M. et al. Oncogene 5 (4), 519-524 (1990) Han, H. J., et al. Hum. Mol. Genet. 2 (12), 2204 (1993)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Apo-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X63717[참조: Oehm, et al, J. Biol. Chem., (1992), 267(15), 10709-15)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Fas에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M67454[참조: Itoh, et al., Cell, (1991), 66 (2), 233-43)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TNFR-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M67454[참조: Nophar, et al., EMBO J., 1990, 9 (10), 3269-78]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

p55에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M58286[참조: Loetscher, et al., Cell, 1990, 61, 351-359)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

WSL-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 Y09392[참조: Kitson, et al., Nature, 1996, 384 (6607), 372-5)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

DR3에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U72763[참조: Chinnaiyan, et al., Science, 1996, 274(5829), 990-2)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRAMP에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U75381[참조; Bodmer, et al., Immunity, 1997, 6 (1), 79-88)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

Apo-3에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U74611[참조: Marsters, et al., Curr. Biol., 1996, 6 (12), 1669-76)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

AIR에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U78029에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

LARD에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U94512[참조: Screaton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94 (9), 4615-19)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

NGRF에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 M14764[참조: Johnson, et al., Cell, 1986, 47 (4), 545-554)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

DR4(TRAIL)에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U90875[참조: Pan, et al., Science, 1997, 276 (5309), 111-113)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

DR5에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 AF012535[참조: Sheridan, et al., Science, 1997, 1227 (5327), 818-821)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

KILLER에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 AF022386[참조; Wu, et al., Nat. Genet. 17 (2), 141-143 (1997)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRAIL-R2에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 AF020501에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

TRICK2에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 AF018657에서 발견된다.

DR6에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 AF068868에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

ICE에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U13697, U13698 및 U13699[참조: Alnemri, E. S., et al., J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

VLA-1에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 X17033[참조: Takada., et al., J. Biol. Chem. 109 (1), 397-407(1989)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

CD86(B7.2)에 대한 서열 정보는 진뱅크 수탁번호 U04343[참조: Azuma, et al., Nature. 366 (6450), 76 (1993)]에서 발견되고, 이는 본원 참조로서 인용된다.

표 1a

표 1b

표 1c

표 2

<110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> Nucleic Acid Sequences Encoding and Compositions Comprising IgE Signal Peptide and/or IL-15 and Methods for Using the same <130> UPAP0020-5000-DIv <150> US 60/478,205 <151> 2003-06-13 <150> US 60/478,210 <151> 2003-06-13 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Arificial Sequence <220> <223> chemically synthsized peptide <400> 1 Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Met Glu Glu Ala Ala Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Arificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 2 Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Arificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 3 Phe Arg Asp Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 4 gcccccgtcg acgccgccac catgagaatt tcgaaaccac atttgag 47 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 5 atcgggctcg agtcaagaag tgttgatgaa catttgg 37 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 6 gcccccggta ccgccgccac catggtattg ggaaccata 39 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 7 atcgggggat cctcaagaag tgttgatgaa cat 33 <210> 8 <211> 47 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 8 gcccccgaat tcgccgccac catggattgg acttggatct tattttt 47 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Arificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 9 agttgctgct gctactagag ttcattctaa ctgggtgaat gtaataagt 49

Claims (25)

1. 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 이때 IgE 시그날 펩티드와 비-IgE 단백질 서열이 동일한 종의 동물로부터 유래되고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 분리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 비-IgE 단백질이 효소인 분리된 핵산 분자.
3. 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 이때 비-IgE 단백질이 면역조절 단백질이고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 분리된 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 면역조절 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진, 분리된 핵산 분자.
5. 제3항에 있어서, IgE 시그날 펩티드 및 비-IgE 단백질 서열이 동일한 종의 동물로부터 유래된, 분리된 핵산 분자.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 분리된 핵산 분자가 플라스미드인, 분리된 핵산 분자.
7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 분리된 핵산 분자가 바이러스 벡터내로 혼입되는, 핵산 분자.
8. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 병원체, 세균 병원체 및 병원성 진핵생물로부터 선택된 병원체의 감염; 암 및 건선으로부터 선택된 과증식질환; 또는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 웨게너 육아종증, 크론씨병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 주사용 약제학적 조성물.
9. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 병원체, 세균 병원체 및 병원성 진핵생물로부터 선택된 병원체의 감염; 암 및 건선으로부터 선택된 과증식질환; 또는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 웨게너 육아종증, 크론씨병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 재조합 백신.
10. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 병원체, 세균 병원체 및 병원성 진핵생물로부터 선택된 병원체의 감염; 암 및 건선으로부터 선택된 과증식질환; 또는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 웨게너 육아종증, 크론씨병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약독화된 생병원체.
11. 비-IgE 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드를 포함하고, 이때 IgE 시그날 펩티드와 비-IgE 단백질이 동일한 종의 동물로부터 유래되고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 융합 단백질.
12. 제11항에 있어서, 비-IgE 단백질이 효소인 융합 단백질.
13. 제11항에 있어서, 비-IgE 단백질이 면역조절 단백질인 융합 단백질.
14. 비-IgE 단백질에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어지고, 이때 비-IgE 단백질이 면역조절 단백질이고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 융합 단백질.
15. 제14항에 있어서, IgE 시그날 펩티드 및 비-IgE 단백질이 동일한 종의 동물로부터 유래된 융합 단백질.
16. 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 작제물을 포함하는 세포를 포함하는 배양물로서, IgE 시그날 펩티드 및 비-IgE 단백질이 동일한 종의 동물로부터 유래하거나, 비-IgE 단백질이 면역조절성 단백질이고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 시험관내 세포 배양물.
17. 비-IgE 단백질 서열에 연결된 IgE 시그날 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 작제물을 포함하는 세포를 배양함을 포함하는 방법으로서, IgE 시그날 펩티드와 비-IgE 단백질이 동일한 종의 동물로부터 유래하거나, 비-IgE 단백질이 면역조절성 단백질이고, IgE 시그날 펩티드가 서열번호 8 및 서열번호 9로부터 선택된 프라이머의 암호화 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는, 비-IgE 단백질을 제조하는 방법.
18. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자 및 면역원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물.
19. 제18항에 있어서, 면역원이 병원체 항원, 암-관련 항원 또는 자가면역 질환과 관련된 세포에 연결된 항원인 조성물.
20. 제19항에 있어서, 병원체 항원이 바이러스 항원인 조성물.
21. 제20항에 있어서, 병원체 항원이 HIV, HSV, HCV 및 WNV로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원체로부터 유래된 조성물.
22. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자 및 CD40L을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물.
23. 제1항 또는 제3항에 따른 핵산 분자 및 면역원을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 병원체, 세균 병원체 및 병원성 진핵생물로부터 선택된 병원체의 감염; 암 및 건선으로부터 선택된 과증식질환; 또는 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 사르코이드증, 인슐린 의존성 진성당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 웨게너 육아종증, 크론씨병 및 궤양성 대장염으로부터 선택된 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 주사용 약제학적 조성물.
24. 제18항에 있어서, 비-IgE 단백질이 IL-15, CD40L, TRAIL; TRAILrecDRC5, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, F461811or MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, CD30, CD153 (CD30L), Fos, c-jun, Sp-1, Apl, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK, SAP K, SAP1, JNK2, JNK1B2, JNK1B1, JNK2B2, JNK2B1, JNK1A2, JNK2A1, JNK3A1, JNK3A2, NF-카파-B2, p49 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, plOO 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, p105 스플라이싱 형태, NF-카파-B 50K 쇄 전구체, NFkB p50, 사람 IL-1α, 사람 IL-2, 사람 IL-4, 쥐 IL-4, 사람 IL-5, 사람 IL-10, 사람 IL-15, 사람 IL-18, 사람 TNF-α, 사람 TNF-β, 사람 인터류킨 12, MadCAM-1, NGF IL-7, VEGF, TNF-R, Fas, CD40L, IL-4, CSF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, LFA-3, ICAM-3, ICAM- 2, ICAM-1, PECAM, P150.95, Mac-1, LFA-1, CD34, RANTES, IL-8, MIP-lα, E-셀렉톤, CD2, MCP-1, L-셀렉톤, P-셀렉톤, FLT, Apo-1, Fas, TNFR-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 (TRAIL), DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE, VLA-1 및 CD86 (B7.2)로부터 선택되는 면역조절성 단백질인, 조성물.
25. 제23항에 있어서, 면역원이 바이러스 병원체, 세균 병원체 및 병원성 진핵생물로부터 선택된 병원체로부터의 병원체 항원이고, 비-IgE 단백질이 IL-15, CD40L, TRAIL; TRAILrecDRC5, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, F461811or MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, CD30, CD153 (CD30L), Fos, c-jun, Sp-1, Apl, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK, SAP K, SAP1, JNK2, JNK1B2, JNK1B1, JNK2B2, JNK2B1, JNK1A2, JNK2A1, JNK3A1, JNK3A2, NF-카파-B2, p49 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, plOO 스플라이싱 형태, NF-카파-B2, p105 스플라이싱 형태, NF-카파-B 50K 쇄 전구체, NFkB p50, 사람 IL-1α, 사람 IL-2, 사람 IL-4, 쥐 IL-4, 사람 IL-5, 사람 IL-10, 사람 IL-15, 사람 IL-18, 사람 TNF-α, 사람 TNF-β, 사람 인터류킨 12, MadCAM-1, NGF IL-7, VEGF, TNF-R, Fas, CD40L, IL-4, CSF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, LFA-3, ICAM-3, ICAM- 2, ICAM-1, PECAM, P150.95, Mac-1, LFA-1, CD34, RANTES, IL-8, MIP-lα, E-셀렉톤, CD2, MCP-1, L-셀렉톤, P-셀렉톤, FLT, Apo-1, Fas, TNFR-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 (TRAIL), DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, ICE, VLA-1 및 CD86 (B7.2)로부터 선택되는 면역조절성 단백질인, 조성물.

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