KR101225846B1

KR101225846B1 - 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 단백질의측정법

Info

Publication number: KR101225846B1
Application number: KR1020077019518A
Authority: KR
Inventors: 가즈키 사카모토; 요시이카즈 스기모토
Original assignee: 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2026-02-28
Also published as: KR20070115910A; TWI363763B; TW200643030A; JP4856381B2; CN101133085B; CA2599669A1; CN101133085A; AU2006219378A1; US20090208982A1; AU2006219378B2; JP2006241070A; HK1117848A1; EP1854811A4; WO2006093115A1; EP1854811A1

Abstract

본 발명은 인간 OPRT 면역 측정법의 확립을 과제로 한다.

또한 본 발명은 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체와, 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체를 조합하여 사용하는, 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 단백질의 측정법에 관한 것이다.

Description

인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 단백질의 측정법{Assay method for human orotate phosphoribosyltransferase protein}

본 발명은 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제에 대한 신규한 항체 및 상기 항체를 사용한 인간 오로트산 포시포리보실 트랜스퍼라아제 단백질의 측정법에 관한 것이다.

오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제(orotate phosphoribosyl transferase;EC2.4.2.10, 이하 「OPRT」라고 칭한다)는 오로트산으로부터 우리딜 1인산(UMP)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로, 핵산합성에 필수인 피리미딘 뉴클레오티드를 공급하는 역할을 가지며, 핵산 전구체 공급경로의 주요한 율속효소의 하나이다. 따라서, 세포증식이 활발한 종양 조직이나 소화관 상피에서 그 활성이 높은 것이 알려져 있다.

한편, 5-플루오로우라실계 항암제는 OPRT를 율속효소로하여 활성화되어 항종양 효과를 발휘하기 때문에, 종양세포 중의 OPRT량이 많은 환자에 대해서는 그 효과가 크고, 현저한 연명효과가 인정되는 것에 대해, OPRT량이 적은 환자에 대해서는 효과가 작은 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 따라서, 예를 들면 종양환자의 치료를 행할 때, 미리 적출 종양 중의 OPRT량을 측정하는 것은 치료방법의 결 정이나 투여하는 항암제 선정의 지표가 되는 등, 그 중요성은 높다.

종래, 조직 중 인간 OPRT의 정량은 mRNA량 또는 효소활성을 측정함으로써 행해져 왔다. 그러나, mRNA량의 측정에서는 전사 후의 조절 메커니즘 등에 의해 단백질량 및 효소활성을 충분히 반영하고 있지 않을 가능성이 있다. 또한, 효소활성의 측정에 의한 정량은 주로 방사능 표지된 기질을 사용하기 때문에, 그 조작은 매우 번잡하다. 인간 OPRT 정량법을 임상에서의 진단이나 치료에 응용하기 위해서는 간편하고 정확한 것이 중요하여, 이와 같은 정량법의 개발이 강하게 요망되고 있었다.

비특허문헌 1 : Br. J. Cancer., 2003, Oct, 20;89(8) : 1486-92.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

따라서, 본 발명은 인간 OPRT의 간편하고 정확한 측정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

이에, 본 발명자는 인간 OPRT 전체에 대한 다중클론 항체 및 인간 OPRT의 아미노산 서열 중의 각종 올리고펩티드에 대한 항체를 제작하고, 그들의 항체를 조합한 측정계를 설계하여 검토해온 바, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체와, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체를 조합한 인간 OPRT 면역 측정계가 다른 항체를 사용한 측정계에 비해 현저하게 감도가 높아, 인간 OPRT 단백질을 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체와, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체를 함유하는, 인간 OPRT 단백질 측정용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체와, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항 OPRT 항체를 조합하여 사용하는 인간 OPRT 단백질의 측정법을 제공하는 것이다.

또한, 인간 OPRT 단백질의 아미노산 서열은 Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 85, No. 6, 1988, 1754-1758에 기재된 것에 따랐다.

발명의 효과

본 발명 방법에 의하면, 인간 OPRT 전체를 항원으로 한 항체를 사용한 경우나, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 428번째~446번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항OPRT 항체를 사용한 경우에 비해, 인간 OPRT 단백질을 간편하고 정확하게 정량할 수 있다. 또한, 본 발명 측정법을 이용하여 검체의 인간 OPRT 단백질을 정량함으로써, 암의 진단, 치료효과 예측뿐 아니라, 치료방법의 선정, 항암제 투여의 여부를 결정할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 항OPRT 항체의 웨스턴 블로팅(western blotting)의 결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 항OPRT-A 항체, OPRT-B 항체 및 항OPRT-C 항체의 2종을 조합하여 사용한 샌드위치 ELISA계의 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 A-B : 항OPRT-A 항체 고상화(固相化)-항OPRT-B 항체 검출. 도면 중 B-A : 항OPRT-B 항체 고상화-항OPRT-A 항체 검출. 도면 중 B-C : 항OPRT-B 항체 고상화-항OPRT-C 항체 검출. 도면 중 C-A : 항OPRT-C 항체 고상화-항OPRT-A 항체 검출. 도면 중 C-B : 항OPRT-C 항체 고상화-항OPRT-B 항체 검출.

도 3은 고정화 항체로서 항OPRT-C 항체를 사용하고, 검출항체로서 항OPRT-A 항체를 사용한 ELISA계 검량선(檢量線)을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 인간 OPRT 단백질의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체의 항원으로서는, 인간 OPRT 단백질의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 서열, 또는 이 아미노산 서열의 연속된 80% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 이후 이 항원을 사용하여 얻어진 항체를 항OPRT-A 항체라고 칭한다.

본 발명의 인간 OPRT 단백질의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 영역에 존재하는 에피토프를 인식하는 항인간 OPRT 항체의 항원으로서는, 인간 OPRT 단백질의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 서열, 또는 이 아미노산 서열의 연속된 80% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 이후 이 항원을 사용하여 얻어진 항체를 항OPRT-C 항체라고 칭한다.

상기 합성 펩티드를 항원으로서 사용하는 경우, 면역응답을 촉진할 목적으로 프로인트 애주번트(Freund's adjuvant) 등의 애주번트를 항원과 혼합하여 사용하거나, 소 갑상선 글로블린(bovine thyroglobulin), BSA(Bovine Serum Albumin : 소 혈청 알부민), KLH(Keyhole limpet hemocyanine : keyhole limpet의 헤모시아닌) 등의 캐리어를 항원에 결합시켜서 사용할 수 있다.

본 발명의 항인간 OPRT 항체는 상기 아미노산 서열 영역에 존재하는 상기 에피토프를 인식하면 되고, 다중클론 항체여도 단일클론 항체여도 된다.

상기 항원을 사용하여 항인간 OPRT 다중클론 항체를 제작하는 경우, 이하와 같이 제작할 수 있다. 항인간 OPRT 다중클론 항체를 포함하는 항혈청은 통상적인 방법에 따라서, 상기 항원을 토끼, 랫트, 마우스, 염소 등 각종 동물에 필요횟수 면역하고, 채취함으로써 얻어진다. 바람직하게는 상기 합성 펩티드에 KLH를 결합시킨 것을 항원으로 하여 3주간에 2번의 비율로 토끼에게 면역한다. 항혈청으로부터 항OPRT 항체를 정제하기 위해서는 항체 정제의 통상적인 방법에 따라서, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 황산암모늄 염석, 이온교환 칼럼 크로마토그래피, 분자체(molecular sieve) 칼럼 크로마토그래피(겔여과), 프로테인 A 칼럼 크로마토그래피 등을 행하면 된다. 또한, 항체의 순도를 높일 목적으로 이들의 정제수단을 조합하거나 반복해도 된다.

친화성 크로마토그래피(항원 고정화 칼럼)를 행하는 경우, 상기 합성 펩티드를 칼럼에 고정하고, 항혈청을 충전하여 항OPRT 항체를 칼럼에 흡착시킨 후, 용출액을 사용하여 항OPRT 항체를 떼어내고, 이것을 회수함으로써 고순도의 항OPRT 항체를 얻을 수 있다.

상기 항원을 사용하여 항인간 OPRT 단일클론 항체를 제작하는 경우, 이하와 같이, 항인간 OPRT 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 제작함으로써 얻을 수 있다. 상기 하이브리도마는 예를 들면 상기 항원을 마우스, 랫트 등의 포유동물 또는 조류에 면역하고, 그의 비장세포와 마우스, 랫트 등의 포유동물의 골수종 세포(myeloma cell)를 쾰러(Koler) 및 밀스테인(Milstein)의 기본방법[Nature, 제256권, 495페이지(1975년) 참조]에 따라서 세포융합하고, 선택용 배지 중에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 그 때의 면역방법은, 예를 들면 조제한 항원을 인산 완충액, 생리 식염수 등에 용해하고, 필요에 따라서 애주번트를 혼합하여 동물의 피하, 비장 내, 복강, 정맥 등에 1~3주 마다 충분히 항체가가 상승할 때까지 수회 투여함으로써 행해진다. 세포융합에 사용되는 골수종 세포로서는 마우스 P3-NS-1/1Ag4.1, P3-X63-Ag8.653, Sp2/0Ag14, 랫트 YB2/0 등을 들 수 있다. 세포융합 시에는 융합 촉진제로서 폴리에틸렌글리콜, 센다이바이러스 등을 사용할 수 있고, 또한 전기펄스를 사용해도 된다. 세포융합에 사용하는 골수세포는 8-아자구아닌 내성주이고 뉴클레오티드 생합성의 샐비지 경로에 필요한 하이포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라아제가 결여되어 있기 때문에, HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함하는 배지) 중에서는 뉴클레오티드의 합성이 불가능하여 살아남을 수 없다. 따라서 세포융합을 행한 후, HAT 배지에서 1주간~2주간 배양함으로써 비장세포와 골수종이 융합된 하이브리도마만을 선택할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 항인간 OPRT 항체는 인간 OPRT 단백질의 면역학적 측정에 유용하고, 예를 들면 샌드위치 ELISA법, 경합법에 의한 방사면역측정법(radioimmunoassay), 효소면역측정법(enzyme immunoassay)이나, 면역크로마토그래피법(immunochromatography) 등에 적용할 수 있다. 이 중, 샌드위치 ELISA법이 특히 바람직하다.

본 발명의 인간 OPRT 단백질 측정용 키트는 항OPRT-A 항체와 항OPRT-C 항체를 함유한다. 이들 2종의 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA법을 행하기 위해서는 한쪽의 항OPRT 항체를 지지체에 고정화하고(고상화 항체), 다른쪽의 항OPRT 항체를 표지항체(검출항체)로 한다. 바람직한 조합은 항OPRT-C 항체를 고상화 항체로 하고, 항OPRT-A 항체를 검출항체로 하는 경우이다.

면역측정은 예를 들면 샌드위치 ELISA법의 경우, ELISA용 플레이트 등의 지지체에 한쪽의 항OPRT 항체를 고정화하고, 이어서 피검체를 반응시켜 추가로 표지 항OPRT 항체를 반응시킨 후, 세정하고, 샌드위치 면역반응이 발생한 표지량을 측정한다.

본 발명에 사용되는 피검체로서는 OPRT가 존재할 수 있는 인간의 조직, 체액이면 되고, 예를 들면 종양 조직, 소화관 조직, 혈액, 림프액 등을 들 수 있는데, 종양 조직이 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용되는 지지체로서는, 예를 들면 아가로오스, 셀룰로오스 등의 불용성 다당류, 실리콘 수지, 폴리스티렌 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 나일론 수지, 폴리카보네이트 수지 등의 합성수지나, 유리 등의 불용성 지지체를 들 수 있다. 이들의 지지체는 비즈나 플레이트 등의 형상으로 사용하는 것이 가능하다. 비즈의 경우, 이들이 충전된 칼럼 등을 사용할 수 있다. 플레이트의 경우, 멀티웰 플레이트(96웰 멀티웰 플레이트 등), 바이오센서 칩 등을 사용할 수 있다. 항OPRT 항체와 지지체의 결합은 화학결합이나 물리적인 흡착 등의 통상 사용되는 방법에 의해 결합할 수 있다. 이들의 지지체는 시판의 것을 사용할 수 있다.

항OPRT 항체와 피검체의 반응은 통상, 완충액 중에서 행해진다. 완충액으로서는, 예를 들면 인산 완충액, 트리스(Tris) 완충액, 구연산 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액 등이 사용된다. 또한, 인큐베이션의 조건으로서는, 예를 들면 4℃~실온에서 1시간~24시간의 인큐베이션이 행해진다. 인큐베이트 후의 세정은 피검체 중의 인간 OPRT 단백질과 항OPRT 항체의 결합을 방해하지 않는 것이라면 무엇이든지 되고, 예를 들면 Tween 20 등의 계면활성제를 포함하는 완충액 등이 사용된다.

본 발명의 인간 OPRT 단백질 측정방법에 있어서는, 인간 OPRT 단백질을 검출하고자 하는 피검체 외에 대조 시료를 설치해도 된다. 대조 시료로서는 인간 OPRT 단백질을 포함하지 않는 음성 대조 시료나, 인간 OPRT 단백질을 포함하는 양성 대조 시료 등이 있다. 이 경우, 인간 OPRT 단백질을 포함하지 않는 음성 대조 시료로 얻어진 결과, 인간 OPRT 단백질을 포함하는 양성 대조 시료로 얻어진 결과와 비교함으로써, 피검체 중의 인간 OPRT 단백질을 검출하는 것이 가능하다. 또한, 농도를 단계적으로 변화시킨 일련의 대조 시료를 조제하고, 각 대조 시료에 대한 검출결과를 수치로서 얻어 표준곡선을 작성하고, 피검체의 수치로부터 표준곡선을 토대로 피검체에 포함되는 인간 OPRT 단백질을 정량적으로 검출하는 것도 가능하다.

항OPRT 항체의 표지는 통상 알려져 있는 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 표지물질로서는 형광색소, 효소, 보효소, 화학발광 물질, 방사성 물질 등의 당업자에 공지의 표지물질을 사용하는 것이 가능하고, 구체적인 예로서는 라디오아이소토프(radioisotope)(³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ¹³¹I 등), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 단실 클로라이드(dansyl chloride), 움벨리페론(umbelliferone), 루시페라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴 등을 들 수 있다. 표지물질로서 비오틴을 사용하는 경우에는 비오틴 표지항체를 첨가한 후에, 알칼리포스파타아제 등의 효소를 결합시킨 아비딘을 추가로 첨가하는 것이 바람직하다. 표지물질과 항OPRT 항체의 결합에는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜 디설피드법, 과요오드산법 등의 공지의 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로는, 한쪽의 항OPRT 항체를 포함하는 용액을 플레이트 등의 지지체에 가하고, 해당 항OPRT 항체를 지지체에 고정한다. 플레이트를 세정한 후, 단백질의 비특이적인 결합을 막기 위해, 예를 들면 BSA, 젤라틴, 알부민 등으로 블로킹한다. 다시 세정하고, 피검체를 플레이트에 가한다. 인큐베이트 후, 세정하고, 다른쪽의 표지 항OPRT 항체를 가한다. 적절한 인큐베이션 후, 플레이트를 세정하고, 플레이트에 남은 표지 항OPRT 항체를 검출한다. 검출은 당업자에 공지의 방법에 의해서 행할 수 있고, 예를 들면 방사성 물질에 의한 표지인 경우에 액체 신틸레이션이나 RIA법에 의해 검출할 수 있다. 효소에 의한 표지인 경우에는 기질을 가하고, 기질의 효소적 변화, 예를 들면 발색을 흡광도계에 의해 검출할 수 있다. 기질의 구체적인 예로서는 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)디암모늄염(ABTS), 오르토페닐렌디아민, 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TME) 등을 들 수 있다. 형광물질의 경우에는 형광 광도계에 의해 검출할 수 있다.

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

비교예(항rhOPRT 항체를 사용한 ELISA법에 의한 OPRT의 정량)

(1) 항원제작

항원으로서는 대장균을 배양하여 얻어진 재조합 인간 OPRT(rhOPRT)를 이용하였다. 이 제법은 다음과 같다. PCR로 인간 OPRT의 전장 cDNA를 클로닝하고, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)와 rhOPRT의 융합 단백질을 발현하도록 제작된 플라스 미드를 도입한 대장균 BL21을 100 ㎍/mL의 암피실린 존재하, 100 mL의 LB 배지(와코준야쿠 공업사제) 중 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 그 배양액 10 mL를 1L의 LB 배지가 들어 있는 삼각플라스크로 옮기고, 37℃에서 추가로 4시간 배양하였다. 원심에 의한 집균 후, 100 mL의 집균 버퍼(50 mM Tris, 8 M Urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4)에 균체를 현탁한 후, 4℃에서 30분간 완만하게 교반하였다. 현탁액을 4℃에서 초음파 파쇄한 후, 15000×g, 4℃에서 30분간의 원심처리를 행하였다. 그 다음, 상청 중의 요소의 농도를 투석처리에 의해 서서히 1 M까지 떨어트리고, 리폴딩처리를 행하여 2 mL의 글루타티온(GSH)-세파로오스(시그마사제)를 충전한 칼럼에 통과시키고, 세정액(20 mM Tris, 1 M Urea, 5 mM EDTA, pH 7.4) 10 mL로 세정하였다. 용출용 버퍼(50 mM GSH, 50 mM Tris, pH 9.6)로 GST-rhOPRT를 용출하고, rhOPRT 용액을 얻었다.

(2) 면역

GST-rhOPRT를 면역원으로 하고, 추가로 프로인트(Freund)의 완전 애주번트(FCA) 또는 프로인트의 불완전 애주번트(FIA)를 사용하여 토끼(white 일본 백색종)를 이하에 의해 면역하였다.

1회째 : GST-rhOPRT 0.2 ㎎+FCA S.C.

2~8회째 : GST-rhOPRT 0.5 ㎎+FIA S.C.

(3) 항혈청의 정제

면역한 토끼의 전혈을 회수하고, 이를 1500×g, 4℃에서 5분간 원심하여 혈청을 분리하였다. 얻어진 항혈청 20 mL를 PBS(-)로 2배 희석하여 40 mL로 하였다. 이 항혈청 희석액을 GST 단백의 고정화 칼럼에 첨가하고, GST 반응성 항체를 흡착시킨 후, 플로우 스루 용액(flow-through liquid)을 프로테인 A 고정화 칼럼에 통과시키고, 항체(IgG)를 결합시켜 PBS(-)를 사용하여 280 nm의 흡광도가 없어질 때까지 잘 세정하였다. 그 다음, 0.2 M 글리신(Glycine)-HCl pH 2.5를 칼럼에 통과시켜 항원에 흡착된 항체를 용출시켰다. 또한, 이 때 pH를 중화하기 위해 용출된 항체를 받는 시험관에 1 M 트리스(Tris)를 미리 첨가해 두고, 회수한 항체의 변질을 막았다. 얻어진 항체 분획을 PBS(-)로 4℃에서 하룻밤 투석하여 정제항체로 하였다.

(4) 샌드위치 ELISA법에 의한 인간 종양세포 중의 OPRT의 정량

항rhOPRT 항체를 0.1 mM 탄산 완충액 pH 9.6에서 5.0 ㎍/mL로 조제하여 96웰의 ELISA용 플레이트에 0.1 mL 분주(分注)하고, 실링하여 4℃의 인큐베이터 내에서 하룻밤 코팅을 행하고, 항체 고정화 담체를 얻었다. 96웰 플레이트를 0.05% 트윈 20 함유 PBS(-)로 2회 세정한 후, 0.1% BSA 함유 PBS(-)를 0.1 mL 첨가하여 비특이 흡착의 블로킹을 행하였다. 세정액으로 2회 세정한 후, 3, 9, 27배로 희석한 인간 위암 유래 세포 TMK1 세포의 호모제네이트(5×10⁶의 세포로부터 0.2 mL의 단백 추출액을 조제하였다)를 0.1 mL 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정한 후, 0.5 ㎍/mL에 희석액으로 희석한 퍼옥시다아제 표지 항rhOPRT 항체를 0.1 mL씩 분주하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 7회 세정한 후, 1.3 ㎎/mL의 오르토페닐렌디아민과 0.01%의 과산화수소수, 1 mM EDTA를 포함하는 0.1 M 의 인산-구연산 완충액 pH 5.1(발색액)을 0.1 mL 첨가하고, 실온 암소에서 30분 효소반응을 행하였다. 마지막으로 0.1 M 황산 0.1 mL를 첨가하고 반응을 정지하여, 492 ㎚의 흡광도 측정을 행하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

흡광도(492 ㎜)가 너무 낮아, 희석배율과의 상관이 전혀 인정되지 않았기 때문에, OPRT의 전장 cDNA를 사용하여 제작한 항rhOPRT 항체는 샌드위치 ELISA법에는 적합하지 않은 것이 확인되었다.

실시예 1(항체의 제작)

다음의 조작에 의해 항OPRT 다중클론 항체를 얻었다.

(1) 펩티드 합성

인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 인간 OPRT의 N 말단으로부터 428번째~446번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 및 인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 합성하고, 이하의 펩티드 서열로 되는 인공 펩티드를 얻었다.

인간 OPRT의 N 말단으로부터 86번째~108번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(항원명 : OPRT-A)

인간 OPRT의 N 말단으로부터 428번째~446번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(항원명 : OPRT-B)

인간 OPRT의 N 말단으로부터 454번째~474번째의 아미노산 서열을 갖는 펩티드(항원명 : OPRT-C)

(2) 항원결합물의 제작

상기에 의해서 얻은 인공 펩티드 4 ㎎과 말레이미드 활성화 KLH(Pierce) 2 ㎎을 사용하여 펩티드-KLH 결합물(conjugate)을 각각의 펩티드에 대해서 제작하였다.

(3) 면역

인공 펩티드-KLH를 면역원으로 하고, 추가로 프로인트(Freund)의 완전 애주번트(FCA) 또는 프로인트의 불완전 애주번트(FIA)를 사용하여 토끼(white 일본 백색종)를 이하에 의해 면역하였다.

1회째 : 펩티드(Peptide)-KLH 0.5 ㎎+FCA S.C.

2~8회째 : 펩티드(Peptide)-KLH 0.5 ㎎+FIA S.C.

(4) 항혈청의 정제

면역한 토끼의 전혈을 회수하고, 이를 1600×g, 4℃에서 5분간 원심하여 혈청을 분리하였다. 얻어진 항혈청 20 mL를 PBS(-)로 2배 희석하여 40 mL로 하였다. 이 항혈청 희석액을 항원 펩티드 칼럼에 첨가하고, 항체(IgG)를 결합시켜 PBS(-)를 사용하여 280 nm의 흡광도가 없어질 때까지 잘 세정하였다. 그 다음, 0.2 M 글리신(Glycine)-HCl pH 2.5를 칼럼에 통과시켜 항원에 흡착된 항체를 용출시켰다. 또한, 이 때 pH를 중화하기 위해 용출된 항체를 받는 시험관에 1 M 트리스(Tris)를 미리 첨가해 두고, 회수한 항체의 변질을 막았다. 얻어진 항체 분획을 PBS(-)로 4℃에서 하룻밤 투석하여 정제항체로 하였다.

(5) 웨스턴 블로팅법에 의한 항OPRT 항체의 특이성의 확인

인간 폐암 유래 세포 LC-11 세포의 호모제네이트(단백 농도 20 ㎎/mL)에 전기영동용 시료조제액(4% SDS, 10% beta-메르캅토에탄올, 20% 글리세롤, 125 mM Tris, pH 6.8)을 등량 혼합하고, 2분간 자비처리(boiling treatment)를 행하여, 10 μL를 전기영동에 사용하였다. 시료는 10% 폴리아크릴아미드를 사용하여 영동한 후, PVDF 필터에 전기적으로 전사하고, 블록 에이스(블로킹제, 다이닛폰 제약사제)에 침지하여 블로킹을 행하였다. 20 mM PBS(-)로 1.2 ㎍/mL로 조제한 각 다중클론 항체를 1차항체로 사용하여 1시간의 반응을 행하고, 500 mM 염화나트륨 및 0.5% 트윈 20을 포함하는 20mM 트리스(Tris) pH 7.0(세정액)에서 필터를 세정한 후, 알칼리포스파타아제 표지 덱스트란 폴리머 결합 항토끼 다중클론 항체(Dako Cytomation)를 2차항체로 하여 1시간 반응하였다. 이어서 세정액으로 필터를 세정하고, 화학발광시약(CDP-star, Tropix)을 사용하여 효소반응을 행하고 OPRT의 검출을 행하였다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항인간 OPRT 항체는 모두 OPRT만을 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다.

실시예 2(샌드위치 ELISA법에 의한 인간 OPRT의 정량)

(1) Standard로서는 대장균을 배양하여 얻어진 rhOPRT를 이용하였다. 그 제법은 다음과 같다. PCR로 인간 OPRT의 전장 cDNA를 클로닝하고, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)와 rhOPRT의 융합 단백질을 발현하도록 제작된 플라스미드를 도입한 대장균 BL21을 100 ㎍/mL의 암피실린 존재하, 100 mL의 LB 배지(와코준야쿠 공업사제) 중 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 그 배양액 10 mL를 1L의 LB 배지가 들어 있는 삼각플라스크로 옮기고, 37℃에서 추가로 4시간 배양하였다. 원심에 의한 집균 후, 100 mL의 집균 버퍼(50 mM Tris, 8 M Urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4)에 균체를 현탁한 후, 4℃에서 30분간 완만하게 교반하였다. 현탁액을 4℃에서 초음파 파쇄 후, 15000×g, 4℃에서 30분간의 원심처리를 행하였다. 그 다음, 상청 중의 요소의 농도를 투석처리에 의해 서서히 1 M까지 떨어트리고, 리폴딩처리를 행하여 2 mL의 글루타티온(GSH)-세파로오스(시그마사제)를 충전한 칼럼에 통과시키고 세정액(20 mM Tris, 1 M Urea, 5 mM EDTA, pH 7.4) 10 mL로 세정하였다. 이 융합 단백이 결합된 글루타티온(GSH)-세파로오스에 600 U의 트롬빈(thrombin)을 첨가하고, 2.5 mM 염화칼슘 존재하 4℃에서 하룻밤 반응시키고, GST-OPRT 융합 단백의 결합부위를 절단하였다. 트롬빈(thrombin)과 rhOPRT의 혼합물은 벤즈아미딘-세파로오스(benzamidine-Sepharose) 칼럼을 통과시킴으로써, 목적의 rhOPRT 용액을 얻었다. 브래드포드법에 의한 단백 정량의 결과, 20 ㎍/mL 농도의 rhOPRT가 14 mL 얻어졌다.

(2) 항OPRT 항체 조합의 비교

항OPRT-A 항체, 항OPRT-B 항체 및 항OPRT-C 항체를 0.1 mM 탄산 완충액 pH 9.6에서 5.0 ㎍/mL로 조제하여 96웰의 ELISA용 플레이트에 0.1 mL 분주하고, 실링하여 4℃의 인큐베이터 내에서 하룻밤 코팅을 행하여 항체 고정화 담체를 얻었다. 96웰 플레이트를 0.05% 트윈 20 함유 PBS(-)로 2회 세정한 후, 0.1% BSA 함유 PBS(-)를 0.1 mL 첨가하여 비특이 흡착의 블로킹을 행하였다. 세정액으로 2회 세정한 후, 1.88 ng/mL 농도의 rhOPRT 용액을 0.1 mL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정한 후, 희석액(0.1% BSA, 0.05% 트윈 20 함유 PBS(-))으로 0.5 ㎍/mL로 희석한 항OPRT-A 항체, 항OPRT-B 항체 및 항OPRT-C 항체의 퍼옥시다아제 표지 항체를 0.1 mL씩 분주하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 7회 세정한 후, 1.3 ㎎/mL의 오르토페닐렌디아민과 0.01%의 과산화수소수, 1 mM EDTA를 포함하는 0.1 M의 인산-구연산 완충액 pH 5.1(발색액)을 0.1 mL 첨가하고, 실온 암소에서 30분 효소반응을 행하였다. 마지막으로 0.1 M 황산 0.1 mL를 첨가하고 반응을 정지하여, 492 ㎚의 흡광도 측정을 행하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.

항OPRT-B 항체를 사용한 경우에는, 어떠한 조합 시에도 충분한 흡광도가 얻어지지 않았다. 항OPRT-A 항체와 항OPRT-C 항체를 조합했을 때, 가장 고감도로 rhOPRT의 농도를 측정할 수 있는 것이 확인되었다.

(3) 샌드위치 ELISA법에 의한 인간 OPRT의 정량성

항OPRT-C 항체를 0.1 mM 탄산 완충액 pH 9.6에서 5.0 ㎍/mL로 조제하여 96웰의 ELISA용 플레이트에 0.1 mL 분주하고, 실링하여 4℃의 인큐베이터 내에서 하룻밤 코팅을 행하여 항체 고정화 담체를 얻었다. 96웰 플레이트를 0.05% 트윈 20 함유 PBS(-)로 2회 세정한 후, 0.1% BSA 함유 PBS(-)를 0.1 mL 첨가하여 비특이 흡착의 블로킹을 행하였다. 세정액으로 2회 세정한 후, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5 ng/mL의 농도로 조제한 rhOPRT 용액을 0.1 mL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정한 후, 0.5 ㎍/mL로 희석액으로 희석한 퍼옥시다아제 표지 항OPRT-A 항체를 0.1 mL씩 분주하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 7회 세정한 후, 1.3 ㎎/mL의 오르토페닐렌디아민과 0.01%의 과산화수소수, 1 mM EDTA를 포함하는 0.1 M의 인산-구연산 완충액 pH 5.1(발색액)을 0.1 mL 첨가하고, 실온 암소에서 5분 효소반응을 행하였다. 마지막으로 0.1 M 황산 0.1 mL를 첨가하여 반응을 정지하고, 492 ㎚의 흡광도 측정을 행하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

고상화 항체로서 항OPRT-C 항체를 사용하고, 검출항체로서 항OPRT-A 항체를 사용했을 때, 정량적으로 rhOPRT의 농도를 측정할 수 있는 것이 확인되어 여기에 샌드위치 ELISA 시스템이 확립되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Assay for human OPRT Protein <130> TH0040 <150> JP 2005-059221 <151> 2005.03.03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on human OPRT <400> 1 Cys Ser Thr Asn Gln Ile Pro Met Leu Ile Arg Arg Lys Glu Thr Lys Asp Tyr Gly Thr Lys Arg Leu 1 5 10 15 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on human OPRT <400> 2 Cys Leu Gly Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Gln Glu Val Ile Gly Lys Arg Gly Ser Asp Ile 1 5 10 15 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on human OPRT <400> 3 Cys Ile Ser Ala Ala Asp Arg Leu Glu Ala Ala Glu Met Tyr Arg Lys Ala Ala Trp Glu Ala Tyr 1 5 10 15 20

Claims

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서열번호 1의 아미노산 서열로 되는 펩티드를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체와, 서열번호 3의 아미노산 서열로 되는 펩티드를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체를 함유하는, 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 단백질 측정용 키트.
제3항에 있어서, 측정수단이 샌드위치 ELISA인 측정용 키트.
서열번호 1의 아미노산 서열로 되는 펩티드를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체와, 서열번호 3의 아미노산 서열로 되는 펩티드를 인식하는 항인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 항체를 조합하여 사용하는, 인간 오로트산 포스포리보실 트랜스퍼라아제 단백질의 측정법.
제5항에 있어서, 측정수단이 샌드위치 ELISA인 측정법.