KR101256206B1

KR101256206B1 - 태아의 성별 결정을 위한 분석방법 및 장치

Info

Publication number: KR101256206B1
Application number: KR1020120022039A
Authority: KR
Inventors: 류현미; 박소연; 임지혜; 김신영
Original assignee: 의료법인 제일의료재단
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-04-19
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: WO2013129727A1

Abstract

본 발명은 태아의 성별 결정을 위한 분석 방법 및 장치에 관한 것이다. 구체적으로, 태아의 성별을 판별하는데 임산부 혈장 중의 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 의한 방법은 임산부 혈장 중 태아 DNA의 농도가 매우 낮은 임신 초기(5 또는 6주)에서도 태아의 성별을 정확하게 판별할 수 있다.

Description

태아의 성별 결정을 위한 분석방법 및 장치{An analysis method for determining the fetal gender and apparatus therefor}

본 발명은 태아의 성별 결정을 위한 분석 방법 및 장치에 관한 것이다.

태아의 성별 판별은 혈우병, X-연관 정신지체, 색소성 망막염 등 X-연관 질병 유전자의 운반자(carrier)인 임산부에 있어서 중요한 의미를 가지는데, 이는 태아가 남자인 경우 이들 질병이 나타날 가능성이 높기 때문이다. 또한 여자 태아를 남성화시키는 선천성 부신과형성(congenital adrenal hyperplasia)과 같은 내분비 질병은 출산 전의 치료로 예방할 수 있으므로 임신초기에 태아의 성별 판별이 필요하다.

일반적으로 많이 사용되는 초음파를 사용한 태아 성별 감별 방법은 임신 첫 3개월(first trimester) 시기에는 외부 생식기의 발달이 완전하지 않아서 신뢰성이 낮다. 임신 초기 태아 성별 감별은 융모막 융모 채취 또는 양수천자와 같은 침습적 과정에 의하여 이루어져 왔다. 그러나 이러한 침습적 방법은 아직도 1-2%의 유산 위험성을 수반하며 임산 11주가 될 때까지는 실시할 수 없다.

순환 태아 DNA (circulating fetal DNA)는 태반의 영양포(trophoblasts)에서 생기고 임산부의 순환계로 방출되며, 임산부의 순환계에 존재하는 총 cell-free DNA의 ~3-6%를 차지한다는 것이 알려지면서, 순환 태아 DNA를 이용하여 비침습적으로 태아의 성별을 판별하기 위한 연구가 진행되었다. SRY(sex-determining region Y)와 TSPY 유전자 내에 위치한 multicopy 마커인 DYS14와 같은 Y 염색체 특이 서열을 사용하여 PCR을 기본으로 한 검출방법이 보고되었다. 그러나, 순환 태아 DNA는, 특히 임신초기에 검출하기 어려울 정도로 농도가 낮고, DYS14 분석 등에서와 같이 PCR 조건에서 비특이적인 증폭이 일어나는 경우가 있는 등의 이유로 태아의 성별 판별의 정확도가 떨어진다.

한편, 최근 임산부의 DNA와 태아의 DNA 사이의 후생적 차이 (epigenetic difference)를 이용한 태아 DNA 확인자(identifier)를 찾으려는 연구가 진행되고 있는데, 예를 들어 PDE9A, SERPINB5, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2,PYCARD 등은 태아의 성별과 무관하게 존재하며 임산부의 혈액과 태반에서 메틸레이션이 달라지므로 임산부의 혈청 내에 순환 태아 DNA가 존재하는지를 확인하는데 사용되고 있다. PDE9A 및 SERPINB5는 임산부의 혈액세포 중에는 주로 메틸화 형태로 존재하며 태반에서는 주로 비메틸화상태로 존재한다고 보고되었다(Biol Reprod . 82(4):745-50, 2010). 반면, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, 및 PYCARD는 임산부의 혈액세포 중에는 비메틸화 형태, 태반에서는 메틸화형태로 존재한다고 알려져 있다(미국등록특허 제7754428호).

정확하고 간단하며 효율이 좋은 비침습적 태아 성별 판별하는 방법 및 그를 위한 장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이자 해결하고자 하는 과제이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 일실시예로서 1) 채취된 임산부의 혈장으로부터 태아 DNA를 추출하는 단계, 2) 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 단계 및 3) 측정된 DYS14 및 GAPDH의 농도로부터 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 계산하는 단계를 포함하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법을 제공한다.

또한 본 발명의 일실시예로서 상기 분석 방법에 태아의 성별과 무관한 태아 DNA 마커의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예로서, 상기의 분석방법들은 최적 cutoff값 산출집단의 산모의 혈액 내의 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하고, DYS14/GAPDH의 농도 비율에 대하여 specificity (실제 여자 태아인데 여자 태아로 검출되는 비율)가 100%일 때의 값을 평가하여 최적 cutoff 값을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예로서, 상기의 분석방법들을 사용하여 태아의 성별을 판단하는 방법도 제공된다.

본 발명의 다른 일실시예로는 태아 DNA를 템플레이트로 하여 DYS14 및 GAPDH 또는 그의 일부를 증폭하는 수단; DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 수단; DYS14/GAPDH의 농도의 비율을 계산하는 수단; 및 계산된 DYS14/GAPDH 의 농도의 비율을 출력하는 수단을 포함하는 태아의 성별 판별 장치를 포함한다.

상기 장치는 bisulfite-처리된 태아 DNA의 U-PDE9A를 증폭하는 수단 및 U-PDE9A의 농도를 측정하는 수단 및/또는 DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도를 미리 입력된 DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도의 cutoff 값을 비교하여 태아의 성별을 판단하는 수단을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예는 태아 DNA의 DYS14 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트; 태아 DNA의 GAPDH 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트; bisulfite-처리된 태아 DNA의 U-PDE9A의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트를 포함하는 태아의 성별 판별 장치용 시약 패키지이다.

본 발명에 따른 DYS14/GAPDH의 비율을 사용하는 비침습적 태아 성별 판별 방법은 효과적이고 간단하며, 기술적으로 쉽고 비용이 저렴하고, 모든 기본적인 진단 실험실에서 사용이 가능하다. 따라서 임상작업에서 루틴하게 활용이 가능하다. 또한, X-연관 염색체 이상을 가진 임산부에 있어서 침습적인 과정을 실시하는 것을 줄여 주며, 결정을 내리기에 애매한 초음파 결과를 명확하게 해 준다.

도 1은 PDE9A의 bisulfite 유전자 시퀀싱 결과이다. 화살표들은 PDE9A 유전자의 메틸화 사이트를 나타낸다. A) 임산부의 혈액세포 및 태반 조직에서 검출된 PDE9A의 메틸화된 CpG 사이트. B)태반 조직에서만 검출된 PDE9A의 비메틸화된 CpG 사이트.
도 2는 남자 태아 출산 참가자들에서 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 연관성을 나타낸 그래프이다. DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도는 서로 의미있는 양성적인 연관성을 보였다 (P<0.001). 농도들 사이의 연관성은 Spearman's rank correlation을 사용하여 평가되었다. A) DYS14와 U-PDE9A B) DYS14 및 GAPDH C) U-PDE9A 및 GAPDH
도 3은 위-음성(false-negative) 결과 및 정확한(correct) 결과들 사이의 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도를 비교한 그래프이다. 각 박스의 상한과 하한선은 각각 75번째 백분위수 (75th percentile) 및 25번째 백분위수 (25th percentile), 박스를 가로지르는 선은 중앙값(median)을 나타낸다. 에러바의 상한 및 하한은 각각 90번째 백분위수 (90th percentile) 및 10번째 백분위수 (10th percentile)을 나타낸다. 원은 가외치(outlier)을 나타낸다. 데이터는 Mann-Whitney U test로 비교되었다. A)U-PDE9A B)DYS14 C)GAPDH
도 4는 위-음성 결과 및 정확한 결과에서 DYS14/GAPDH 비율 및 U-PDE9A/GAPDH 비율을 비교한 것이다. 각 박스의 상한과 하한선은 각각 75th 및 25th percentile, 박스를 가로지르는 선은 중앙값(median)을 나타낸다. 에러바의 상한 및 하한은 각각 90번째 백분위수 (90th percentile) 및 10번째 백분위수 (10th percentile)을 나타낸다. 원은 가외치(outlier)을 나타낸다. 데이터는 Mann-Whitney U test로 비교되었다. A) DYS14/GAPDH의 농도 비율 B) U-PDE9A/GAPDH의 농도 비율

본 발명은 태아의 성별 결정을 위한 분석 방법 및 장치, 태아의 성별결정방법에 관한 것이다. 비침습적 태아의 성별 판별에 있어서, 임신 초기의 경우 임산부의 혈장 내의 순환 태아 DNA가 아주 작은 양으로 존재하기 때문에 정확도가 떨어지는 경우가 많다. 본 발명의 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위하여 연구한 결과, 임산부의 혈장 중의 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 사용할 경우 태아의 성별을 정확하게 판별할 수 있다는 것을 알아내었다. 특히, 임산부 혈장 중 태아 DNA의 농도가 매우 낮은 임신 초기 5 또는 6주에서도 태아의 성별을 정확하게 판별할 수 있었다.

동시에, 순환 태아 DNA (circulating feral DNA)의 존재를 U-PDE9A 유전자를 사용하여 확인하여, 순환 태아 DNA의 농도가 검출이 불가능할 정도로 낮기 때문으로 인한 위-음성(false negative: 태아가 남자인데 여자로 판단하는 경우) 결과의 가능성을 배제할 수 있어서 더욱 정확한 판별이 가능함을 밝혔다.

보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 단일아를 임신한 임신 12주 또는 그 이전의 203명의 참가자들로부터 얻은 혈장으로부터 순환 태아 DNA (circulating fetal DNA)를 추출하고, Y 염색체 특이적인 DYS14 유전자 및 레퍼런스인 GAPDH 유전자를 분자마커로 사용하여 정량적 동시다중실시간 중합효소연쇄반응(multiplex quantitative real-time PCR)을 실시하고 각각의 농도를 측정하여 1ml당 copy 수로 환산하였으며, DYS14/GAPDH의 농도의 비율을 구하였다(표 3). 참가자들이 태아를 출산한 후 태아의 남녀의 성별을 확인하고, DYS14 Cq(Quantification cycle), DYS14의 농도, DYS14/GAPDH의 농도의 비율에 있어서 specificity (태아가 여자일 때 100% 여자로 판단될 수 있는 비율)가 100% 일 때의 값을 cutoff 값으로 설정하였다(표 4). 이 cutoff 값을 기준으로 각 참가자들의 태아의 성별을 판단한 결과와 실제 성별을 비교한 결과, 임신 8주 이하의 경우 DYS14 Cq나 DYS14의 농도의 cutoff 값으로 판단한 결과는 실제 성별과 동일하게 판단되는 정확도가 떨어지지만, DYS14/GAPDH의 농도의 비율의 cutoff 값으로부터 판단한 결과는 임신주수(gestational week)와 관계없이 실제 성별과 100% 일치함을 확인하였다(표 5).

또한, 발명자들은 임산부의 혈액에는 존재하지 않고 태반에만 존재하는 형태인 비메틸화 PDE9A(U-PDE9A)가 존재하는지 여부를 확인하였다. 일반적으로, 태아의 성별을 판별하기 위하여 순환 태아 DNA를 사용하는 대부분의 연구에 있어서, 여자 태아는 직접적으로 판별할 수 없고 Y 염색체에 특이적인 서열에 대한 음성적인 결과로써 유추된다. 따라서, DYS14 또는 SRY와 같은 Y-염색체 특이적 서열에 대한 음성적인 결과가 나왔을 때 태아 DNA의 존재를 확인하는 것이 가장 중요하다. 본 발명에서 사용된 U-PDE9A 유전자는 태아의 성별과 관계없이 모든 태아 DNA에서 검출되었으며 성별 차이에 따른 농도의 차이가 관찰되지 않았다(표 3). 더욱이 U-PDE9A의 농도는 DYS14의 농도와 의미있게 양성적인 관련성을 나타내었다(도 2). 이러한 결과들은 본 발명의 실험에서 순환태아 DNA의 농도가 검출이 불가능할 정도로 낮기 때문으로 인한 위음성 결과의 가능성을 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 태아의 성별과 무관하게 순환 태아 DNA를 정량하는데 유용함을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 일 실시예로서, 1) 채취된 임산부의 혈장으로부터 태아 DNA를 추출하는 단계; 2) 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 단계; 및 3) 측정된 DYS14 및 GAPDH의 농도로부터 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 계산하는 단계를 포함하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 일 실시예로서 1) 채취된 임산부의 혈장으로부터 태아 DNA를 추출하는 단계; 2) 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 단계; 및 3) 측정된 DYS14 및 GAPDH의 농도로부터 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 계산하는 단계를 포함하는 태아의 성별을 판단하는 방법을 제공한다.

혈장은 혈액을 항응고제가 처리된 주사기를 사용하여 채혈한 후 원심분리하여 얻을 수 있다. 혈장으로부터 태아 DNA를 추출하는 단계는 예를 들어 QIAGEN protease 를 포함하는 상용의 QIAamp kit를 사용하여 실시할 수 있으며, 이 기술분야에서 알려진 어떤 방법을 사용하여도 무방하다. 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 단계에서는 DYS14, GAPDH 또는 그의 일부를 증폭할 수 있도록 프라이머 및 프로브를 포함하는 용액을 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR), 바람직하게는 multiplex real-time PCR을 실시하는 단계가 선행될 수 있다. PCR 반응에 사용되는 프라이머쌍의 예로는 표 2에 기재된 것을 포함하며 이로 제한되지 않고 DYS14, GAPDH 또는 그들의 일부를 증폭할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용이 가능하다.

DYS14 또는 GAPDH의 농도는 농도를 이미 알고 있는 타겟유전자를 포함하는 표준품 DNA를 여러 단계로 희석하고 PCR을 실시하여 작성하고 검량선을 사용하여 구할 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예는 1) 채취된 임산부의 혈장으로부터 태아 DNA를 추출하는 단계; 2) 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 단계; 및 3) 측정된 DYS14 및 GAPDH의 농도로부터 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 계산하는 단계 외에 태아의 성별과 무관한 태아 DNA 마커의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법 또는 태아의 성별을 판별하는 방법이다. 태아의 성별과 무관한 태아 DNA 마커는 비메틸화된 PDE9A (U-PDE9A), 비메틸화된 SERPINB 5, 메틸화된 RASSF1A, 메틸화된 APC, 메틸화된 CASP8, 메틸화된 RARB, 메틸화된 SCGB3A1, 메틸화된 DAB2IP, 메틸화된 PTPN6, 메틸화된 THY1, 메틸화된 TMEFF2, 메틸화된 PYCARD 등을 포함할 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다.

태아의 성별을 예측하기 위하여 사용된 시료로부터 DYS14/GAPDH의 농도 비율을 구한 후 그 값으로부터 태아가 여자인지 남자인지 판단하기 위해서는 이를 구분하는 기준 값(또는 cutoff 값)을 정하는 것이 필요하다. 이를 위해서는 미리 다수의 시료들을 사용하여 cutoff값을 산출하는데, 예를 들어, 최적 cutoff값 산출집단의 산모 혈장 내의 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하고, DYS14/GAPDH의 농도 비율에 대하여 specificity (실제 여자 태아가 여자 태아로 검출되는 비율)가 100%일 때의 값을 평가하여 최적 cutoff 값을 결정할 수 있다.

본 발명의 임신부 혈장 중의 DYS14/GAPDH의 농도 비율로 태아의 성별을 판단하는 방법은 임신기간의 2번째 및 3번째 3개월 (second trimester, third trimester) 뿐만 아니라 첫번째 3개월 (first trimester)에도 정확도가 높다.

본 발명은 또 다른 일실시형태로서, 태아 DNA를 템플레이트로 하여 DYS14 및 GAPDH 또는 그의 일부를 증폭하는 수단, DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 수단, DYS14/GAPDH의 농도의 비율을 계산하는 수단, 계산된 DYS14/GAPDH 의 농도의 비율을 출력하는 수단을 포함하는 태아의 성별 판별 장치를 제공한다. 또한, 상기 장치에는 bisulfite-처리된 태아 DNA의 U-PDE9A유전자의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머를 사용하여 bisulfite-처리된 태아 DNA의 U-PDE9A을 증폭하는 수단 및 U-PDE9A의 농도를 측정하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 또한, DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도를 미리 입력된 DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도의 cutoff 값을 비교하여 태아의 성별을 판단하는 수단을 추가로 더 포함할 수 있다.

태아 DNA를 템플레이트로 하여 DYS14 및 GAPDH 또는 그 일부를 증폭하거나 bisulfite-처리된 태아 DNA의 U-PDE9A유전자를 증폭하는 수단으로는 반응챔버 및 열블록을 포함하는 PCR 장치를 예로 들 수 있으며 이로 제한되지 않는다. DYS14, GAPDH 또는 U-PDE9A유전자의 농도를 측정하는 수단은 흡광도, 형광 또는 방사선 등을 측정하는 방법을 채택할 수 있으며 이로 제한되지 않는다.

DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도를 미리 입력된 DYS14/GAPDH의 농도의 비율 및 U-PDE9A의 농도의 cutoff 값을 비교하여 태아의 성별을 판단하는 수단은 컴퓨터 등의 연산이 가능한 장치가 포함되나 이로 제한되지 않는다.

계산된 DYS14/GAPDH 의 농도의 비율을 출력하는 수단으로는 메모리장치, 스크린, 팩스, 프린터, 단말기, 휴대폰 등을 예로 들 수 있으며 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일실시형태는 태아 DNA의 DYS14 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트; 태아 DNA의 GAPDH 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트; bisulfite-처리된 태아 DNA의 PDE9A의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트를 포함하는 태아의 성별 판별 장치용 시약 패키지이다. 이 때 사용되는 프라이머쌍의 예로는 표 2에 기재된 것을 포함하며 이로 제한되지 않는다. PCR용 시약세트에는 타겟유전자에 대한 프라이머쌍, 가수분해 프로브, 완충용액 등 PCR을 실시하는데 필요한 시약들이 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 통계 분석은 Statistical Package for Social Sciences 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 실시되었다. 모든 실험에서, P<0.05일 때 통계적으로 의미있는 것으로 처리하였다.

< 실시예 1> 연구대상 집단의 임상적 특징

제일병원의 비침습적 산전 진단 연구 (Cheil General Hospital Noninvasive Prenatal Diagnosis Study)에 등록된 여성들을 대상으로 네스티드 코호트연구(nested cohort study)를 진행하였다. 연구에 참가한 사람들은 의학적 또는 산부인과학적인 문제없이 임신 37주 이후에 건강한 신생아를 분만한 정상적인 임산부들로서 모두 단일아(singleton)를 임신한 여성들이다. 이들은 고혈압, 당뇨병, 간질환, 만성신질환의 전력이 없었다.

연구집단의 임상적 특징을 Mann-Whitney U test 및 χ² test 를 사용하여 태아의 남녀 성별 간을 비교하였다 (표 1). 혈액채취 시, 임산부의 나이 및 임신 주수(gestational week)은 남아출산 및 여아출산 참가자들 그룹간에 의미있는 차이를 보이지 않았다. 임신 7주 이전 (5-6주 범위)에 실험이 실시된 경우는 남아 출산 참가자들의 18%, 여아 출산 참가자들의 21%이었다. 남아 출산 참가자들의 22%, 여아 출산 참가자들의 23%가 35세 이상이었다. 출산시의 출산체중 및 임신 주수 또한 두 그룹간에 차이가 없었다.

	특성	태아의 성별		P 값
	특성	남자 (n=99)	여자 (n=104)	P 값
채혈시	임산부의 나이 (년)	33 (29-35)	32 (29-34)	0.379^a
	35세이상 임산부[n.(%)]	22 (22.3)	24 (23.1)	0.599^b
	임신주수 (주)	8.1 (7.2-12.0)	8.1 (7.1-11.3)	0.890^a
	임신6주이하[n, (%)]	18 (18.2)	21 (20.2)	0.716^b
출산시	임신 주수 (주)	39.0 (37.6-40.3)	39.0 (38.3-40.2)	0.428^a
출산시	출생시 체중 (g)	3,365 (3,080-3,555)	3,362 (3,097-3,553)	0.920^a

수치들은 괄호안의 제1사분위수와 제3사분위수 사이의 범위(interquartile range)를 가지는 중앙값(median). a: Mann-Whitney Utest, b:χ²test

<연구집단의 임상학적 특성>

< 실시예 2> 샘플의 채취 및 처리

혈액을 채취하기 전에 단일아를 임신하였는지 여부 및 마지막 월경일로부터 계산된 임신 주수(gestational week)을 확인하기 위하여 초음파 검사를 하였다.

임신 12주 또는 그 이전의 참가자들로부터 혈액 샘플을 얻었다. 항응고제로서 EDTA를 사용하여 말초혈액(10ml)을 얻은 후, 즉시 2500g에서 10분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하였다. 회수된 혈장을 임산부의 DNA가 유리되는 것을 최소화 하며 16000g에서 추가로 10분간 원심분리하였다. QIAamp DSP virus kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조자의 방법에 따라 혈장 1ml로부터 순환 태아 DNA를 추출하였다. DNA를 30ul의 멸균된 DNase-free water로 용출시켰다. 모든 샘플은 다음부터 진행되는 태아의 성에 대한 블라인드 분석 (blinded analysis)를 위하여 코드화되었다.

< 실시예 3> PDE9A 유전자의 bisulfite sequencing 에 의한 조직 특이적 후생적 특성 (epigenetic characteristics )

PDE9A 유전자는 임산부의 혈액세포에서는 완전히 메틸화되고, 임신 초기(frist trimester)와 말기(third trimester)의 태반에서는 비메틸화 되어 있는 것으로 밝혀졌다(Chim, S.S et al. Clin. Chem. 54, 500-511, 2008). 이러한 PDE9A 유전자의 특성을 bisulfite 시퀀싱으로 확인하였다.

임산부의 혈액세포 및 태반조직으로부터 추출된 DNA 샘플을 CpGenome universal DNA modification kit (Chemicon, Temecula, CA, USA)을 사용하여 제조자의 방법에 따라 bisulfite 전환을 시켰다. Bisulfite-처리된 DNA를 PDE9A유전자의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머를 사용한 PCR로 증폭시켰다.

PDE9A 유전자의 메틸화된 CpG 사이트의 시퀀싱에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

5’-CGGTGAGTGCGCGTCGC-3’ (앞방향 프라이머)

5’-CCAACCATCCCGAAAAAGCG-3’(역방향 프라이머)

PDE9A 유전자의 비메틸화된 CpG 사이트의 시퀀싱에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

5'-GGTTTGTTTTGGTGAGTGTGTGTCGT-3’ (앞방향 프라이머)

5’-CCCAACCATCCCAAAAAAGCA-3’(역방향 프라이머)

PCR 반응용액은 전체 반응용액 50μl 당, genomic DNA 10ng, 프라이머 10pM, dNTPs 0.25mM, MgCl₂ 1.5mM, 1X 완충액 및 Taq 폴리머라제 0.25U를 함유하였다. PCR 조건은 94^oC에서 5분간의 pre-denaturation 후, 94^oC에서 45초, 60^oC에서 45초, 72^oC에서 45초로 35사이클을 반응시키고, 60^oC에서 30분간 final extension 시켰다.

PCR 증폭을 수행한 후, PCR 산물을 PCT purification kit (Bioneer, Daejon Korea)을 사용하여 정제하고 Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA)을 사용하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱한 결과를 Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하고 Genescan 3.7 software (Applied Biosytems)로 해석하였다. Genotyper 3.7 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 유전자형을 결정하였다.

PDE9A 유전자의 조직-특이적 후생적 특성 (epigenetic characteristics)은 도 1에서 보는 바와 같다. 메틸화된 PDE9A 유전자 패턴은 임산부의 혈액세포 및 태반 조직 모두에서 검출되었다. 그러나, 비메틸화된 PDE9A 패턴은 태반 조직에서만 검출되었다. 따라서 본 발명에서는 U-PDE9A가 임산부 혈장 내의 태아 DNA 존재여부를 확인하기 위한 마커로 사용되었다.

< 실시예 4> qMSP 를 사용한 임산부 혈장내의 비메틸화된 PDE9A (U- PDE9A )의 검출

실험에 사용된 임산부의 혈장 내에 태아 DNA가 존재하는지를 확인하기 위하여 정량적 메틸화-특이적 PCR(quantitative methylation-specific PCR, qMSP) 방법을 사용하여 U-PDE9A를 측정하였다.

qMSP 분석은 Clin. Chem, 54, 500-511 (2008)에 기재된 방법으로 실시하였다. 순환 태아 DNA (circulating fetal DNA)의 시퀀스를 EZ DNA methylation kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA)로 변환시켰다. EX DNA methylation kit는 sodium bisulfite를 포함하고 있으며, 비메틸화된 시토신(cytosine)을 우라실(uracil)로 변환하며, 메틸화된 시토신은 시토신으로 그대로 유지시킨다. 따라서, 임산부 혈장의 순환 태아 DNA는 sodium bisulfite에 의해 변환된 형태로 존재하게 된다. Bisulfate 변환을 검정(validation)하기 위하여, U-PDE9A 영역의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드가 양성대조군으로 사용되었으며, 임산부 혈액세포로부터 추출된 DNA가 음성대조군으로 사용되었다.

임산부 혈장 1ml로부터 추출된 총 DNA (30μl)를 EZ DNA methylation kit를 사용하여 bisulfate 변환시켜 DNase-free water 25μl로 용출시켰다. 용출된 DNA를 PCR 반응의 템플레이트로 사용하였다. 프라이머세트 및 dual-labled fluorescent hydrolysis 프로브를 사용하여 U-PDE9A의 qMSP 분석을 실시하였다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 2와 같다.

타겟		서열
U- PDE9A	앞방향 프라이머	5'- GGT TTG TTT TGG TGA GTG TGT GTC GT-3'
	역방향 프라이머	5'- CCC AAC CAT CCC AAA AAA GCA-3'
	가수분해 프로브	5'-(FAM)-TTT GTT TGG TGA TGT TAT GTG GTT T-(MGBNFQ) -3'
DYS14	앞방향 프라이머	5'-GGG CCA ATG TTG TAT CCT TCT-3'
	역방향 프라이머	5'-GCC CAT CGG TCA CTT ACA CTT C-3 '
	가수분해 프로브	5'-(FAM)-TCT AGT GGA GAG GTG CTC-(TAMRA)-3'
GAPDH	앞방향 프라이머	5'-CCC CAC ACA CAT GCA CTT ACC-3'
	역방향 프라이머	5'-CCT AGT CCC AGG GCT TTG ATT-3 '
	가수분해 프로브	5'-(HEX)-AAA GAG CTA GGA AGG ACA GGC AAC TTG GC-(TAMRA)-3'

FAM: 6-Carboxyfluorescein ,

MGBNFQ: minor groove-binding nonfluorescent quencher

HEX: 2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein

TAMRA: 6-carboxytetramethyl-rhodamine

PCR 반응용액은 총 반응 부피인 25 μl 당 iQ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 12.5μl, 가수분해 프로브 (Applied Biosystems) 200nM, 프라이머들 400nM 및 변환된 DNA 5μl를 함유하였다. qMSP 분석의 thermal 프로파일은 95^oC 10분간의 초기 변성단계 (initial denaturation step), 95 ^oC 15초, 60 ^oC 30초, 72 ^oC 30초로 50사이클을 반응시켰다.

분석을 위한 calibration curve를 U-PDE9A에 특이적인 단일 사슬 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 calibrator를 연속적으로 희석하여 구하였다. 사용된 calibrator의 서열은 다음과 같다:

5’-GGT TTG TTT TGG TGA GTG TGT GTT GTG GGT TTT GTT TGG TGA TGT TAT GTG GTT TTT TTG TTT TTT TGG GAT GGT TGG G-3’

본 실험에 사용된 모든 임산부의 혈액 샘플에서, U-PDE9A가 검출되었으며 남자 태아 및 여자 태아에서의 농도는 표 3에서 보이는 바와 같다. 순환 태아 DNA의 존재를 U-PDE9A 유전자를 사용하여 확인하였으므로, 순환태아 DNA의 농도가 검출이 불가능할 정도로 낮아 발생할 수 있는 위음성 결과의 가능성을 배제할 수 있다.

< 실시예 5> DYS14 및 GAPDH 에 대한 정량적 동시다중실시간 중합효소연쇄반응

태아의 성별 검출을 위하여 Y 염색체 특이적인 DYS14 유전자 및 레퍼런스인 GAPDH 유전자를 분자마커로 사용하여 DNA Engine Opticon 2 system (MJ Research, Waltham, MA, USA)으로 정량적 동시다중실시간 중합효소연쇄반응(multiplex quantitative real-time PCR)을 실시하였다. .

동시다중반응은 iQ Supermix (Bio-Rad Laboratories) 12.5μl 및 추출된 혈장 DNA 5μl를 사용하여 25μl의 부피에서 실시되었다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 2에서 나타낸 바와 같다. 프라이머 및 프로브는 최종 농도로서 DYS14에 대해서는 각각 400nM 및 200nM, GAPDH에 대해서는 각각 300nM 및 100nM을 사용하였다. 95^oC 10분간의 초기 변성단계 (initial denaturation step), 95 ^oC 15초, 60 ^oC 1분으로 50사이클을 반응시켰다.

기지 농도의 상업적으로 구입 가능한 남자 genomic DNA(Promega, Madison, WI, USA)를 사용한 표준희석곡선 (standard dilution curve)와 비교하여 혈장 샘플 중의 남자 태아 DNA의 수준이 결정되었다. 표준곡선은 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001과 같이 연속적으로 10배씩 희석한 레퍼런스 남자 genomic DNA를 증폭하여 작성되었다. 각 표준품은 독립적으로 3개가 증폭되었으며, 매 PCR 플레이트에 포함되었다.

표준곡선에서, 기울기값 및 R² 값은 각각, DYS14에 대해서는 -3.371 및 0.996, GAPDH에 대해서는 -3.337 및 0.997이었다. 다음식을 사용하여 곡선의 기울기(slope)로부터 PCR 효율(efficiency)을 구하였다: Efficiency=10^-(1/ ^slope ⁾ - 1. DYS14에서의 효율은 98%, GAPDH에서의 효율은 99%로, 두 분석 모두 최적 효율에 근접하였다.

실험 도중 오염이 발생되지 않도록 매우 조심하였으며, 매 분석마다 음성대조군 water blanks를 복수개 포함시켰다. 실험간의 차이를 줄이기 위하여, PCR 을 독립적으로 3번 실시하였다. 최종 데이터는 결과들의 평균치이다.

< 실시예 6> 태아 성별에 따른 DYS14 , U- PDE9A 및 GAPDH 의 농도

실시예 4 및 실시예 5의 PCR 후 측정된 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도를 1밀리리터 당 카피(copy)로 표현하였으며, 6.6pg의 표준 factor가 데이터를 copy number로 변환시키기 위하여 사용되었다 (Am. J. Hum. Genet., 62, 768-775 참조) .

Mann-Whitney U test 를 사용하여 태아의 남녀 성별 간의 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도 및 비율을 비교하였다. DYS14/GAPDH의 비율 및 U-PDE9A/GAPDH의 비율을 각각 다음 식으로 계산하였다: (DYS14 농도/GAPDH 농도)X100, (U-PDE9A 농도/GAPDH 농도)X100.

태아 성별에 따른 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도 및 비율은 표 3과 같다.

		남자 (n=99)	여자 (n=104)	P 값
농도 (copies/ml)	DYS14	177.2 (108.1-325.9)	36.5 (16.0-58.3)	<0.001
	U- PDE9A	110.2 (74.8-172.6)	118.8 (82.4-179.7)	0.427
	GAPDH	3285.3 (1988.5-5516.0)	3491.4 (2530.5-5393.2)	0.168
비(ratio)	U- PDE9A / GAPDH	3.7 (2.9-4.8)	3.4 (2.7-4.1)	0.108
비(ratio)	DYS14/GAPDH	5.7 (4.8-7.5)	0.8 (0.3-2.1)	<0.001

수치들은 괄호안의 제1사분위수와 제3사분위수 사이의 범위(interquartile range)를 가지는 중앙값(median). 데이터들은 Mann-Whitney U test로 비교되었다.

<태아 성별에 따른 DYS14, U-PDE9A 및 GAPDH의 농도 및 비율>

U-PDE9A 및 GAPDH의 농도는 남아출산참가자 및 여아출산 참가자 그룹 간에 통계적으로 의미있는 차이가 없었다 (모두 P>0.05). 그러나, DYS14의 농도에 있어서는 남아출산 참가자들에 있어서 여아출산 참가자들보다 의미있게 높았다 (P<0.001).

각 농도별 연관성이 Spearman's rank correlation에 의하여 계산되었다. 남아출산 참가자들에 있어서, DYS14의 농도는 U-PDE9A 및 GAPDH의 농도와 각각 r=0.823 및 r=0.889로 양성적인 연관성이 있었다(모두 P<0.001 도 2). U-PDE9A의 농도 역시 GAPDH의 농도와 r=0.823, P<0.001로 양성적인 연관성이 있었다 (도 2).

DYS14 및 U-PDE9A를 사용하여 결정한 결과로부터 순환태아 DNA 농도들 사이에 강력한 양성적인 연관성 (positively correlated) 이 있음을 알 수 있었으며, 또한 태아 DNA 및 총 DNA 확인자(identifier)로서 DYS14와 GAPDH 또 U-PDE9A와 GAPDH를 비교할 경우 강한 양성적인 연관성이 있었다. 이와 같은 결과들은 본 실험의 시스템에서 임산부의 혈장으로부터 추출된 태아 DNA의 양은 임산부의 혈장으로부터 추출된 총 DNA의 양에 비례한다는 것을 의미한다. 따라서, 발명자들은 세계 최초로 DYS14 분석에서 DYS14의 농도를 동일한 PCR 조건에서 동시에 증폭된 GAPDH의 농도로 보정을 하여 DYS14/GAPDH의 농도비율을 계산하였으며 이렇게 함으로써 위음성 결과를 제거할 수 있었다.

이로부터, GAPDH와 같은, 임산부의 혈장으로부터 추출된, 총 DNA 확인자가 태아 성별 검출에서 중요한 인자로 작용하며 DYS14/GAPDH의 농도 비율이 초기 태아성별검출에서 효과적인 바이오마커 임을 알아 내었다.

농도 비율의 분석에 있어서, U-PDE9A/GAPDH의 비율은 태아성별에 따라 차이가 없었으나 (P=0.108), DYS14/GAPDH 비율은 여아출산 참가자들보다 남아 출산 참가자들 그룹이 통계적로 의미있게 더 높았다 (p<0.001).

실시예 7 정량적 PCR 의 검출한계

임신 초기의 임산부 혈장 내의 평균 태아 DNA 농도는, Am. J. Hum. Genet., 62, 768-775 에서 25.4 copies/ml (3.3-69.4의 범위)인 것으로 측정된 바 있다

본 발명의 실험의 PDE9A 유전자의 qMSP 에서, 임산부 혈장 1ml를 사용하여 추출이 수행되었고, 25μl로 용출되었고, 그 중 5μl가 각 PCR을 위하여 사용되었으므로, 각 PCR은 태아 DNA를 >4 copies 함유한다. 정량적 실시간 PCR 실험(MIQE) 가이드라인에 의하면 실시간 PCR을 위하여 타겟 3 copies 이상이 필요하므로, 본 발명의 실험의 PCR은 충분히 sensitive 하다. 본 발명의 실험에서 순환태아 DNA 및 총 DNA 가 존재한다고 본 최소 값은 DYS14 및 U-PDE9A에 대해서는 20 copies/ml, GAPDH에 대해서는 1000 copies/ml 이었다.

실시예 8 각 인자들의 태아 성별 검출 정확도

태아 성별 결정과 관련된 DYS14 정량 사이클(quantification cycle, Cq), DYS14 농도, DYS14/GAPDH의 비율과 같은 각 인자(factor)들에 따라 태아 성별 검출 정확도를 분석하였다. 태아성별 검출 정확도는 최종 분만 기록에 의하여 결정되었다.

최적 cutoff 값을 평가하기 위하여 Receiver operating characteristics (ROC) 곡선 분석이 실시되었다 (Obstet. Gynecol. 111, 1403-1409, 2008 참조). 각 인자에 대하여 specificity (실제 여자 태아가 여자 태아로 검출되는 비율)가 100%일 때의 값이 최적 cutoff 로 설정되었다.

진단효율 (diagnostic efficiency)를 구하기 위하여 EpiMax Table Calculator (http://www.healthstrategy.com/epiperl/epiperl.htm) 을 사용하여 위음성율(false-negative rate), 양성예측치(positive predictive value, PPV), 음성예측치(negative predictive value, NPV)가 계산되었다. 전체적인 정확도는 ROC의 95% confidence interval(CI)의 곡선하면적(area under the curve)로 계산되었다.

성별의 검출에 사용된 각 인자들의 정확도가 표 4에 기재되어 있다. DYS14 농도, DYS14 Cq, DYS14/GAPDH 비율의 PPV는 100.0% 이었다. DYS14/GAPDH 비율은 NPV 및 AUC에서 가장 높은 값을 보였으며, 위음성비율에서 가장 낮은 값을 보였다. DYS14 Cq, DYS14농도 및 DYS14/GAPDH 비율에 있어서, 출산 후의 표현형으로 확인된 결과와 각각 95.6%(194/203), 96.6%(196/203) 및 100%(203/203) 일치하였다.

Parameter	Cutoff	Specificity (%)	False-Negative Rate (%)	PPV (%)	NPV (%)	AUC 및 95% CI
DYS14 Cq	37.0	100	9.1	100	92.0	0.994 (0.988-1.000)
DYS14 농도	85.0	100	7.1	100	93.7	0.997 (0.993-1.001)
DYS14/GAPDH ratio	4.0	100	0.0	100	100	1.000 (1.000-1.000)

<성별의 검출에 사용된 각 인자들의 정확도>

남아출산 참가자들에 있어서, U-PDE9A, DYS14, GAPDH의 농도는 정확한 결과(correct result)일 때보다 위음성결과(false-negative result)일 때 통계적으로 유의하게 낮았다 (U-PDE9A에서 113.0 copies/ml 대 49.1 copies/ml, DYS14 에서 184.9 copies/ml 대 76.6 copies/ml, GAPDH에서 3449.9 copies/ml 대 1414.2 copies/ml; 모두 P≤0.001, 도 3). 그러나, DYS14/GAPDH 비율 및 U-PDE9A/GAPDH 비율은 위음성결과를 나타낸 참가자들과 정확한 결과를 나타낸 참가자들 사이에 의미있는 차이를 보이지 않았다 (DYS14/GAPDH 비율에서 5.2 대 5.8, U-PDE9A/GAPDH 비율에서 4.2 대 3.7, 모두 P>0.05, 도 4).

혈액 채취시의 임신 주수를 기초로 한 성별 판별의 정확도를 계산하였다(표 5). DYS14 분석의 위음성결과가 임신 8주 또는 그 이전에 관찰되었다. DYS14/GAPDH 농도의 비율은 임신주수(gestational weeks)와 상관없이 100%의 판별 정확도를 보였다.

임신 주수 (주)	전체태아 (명)	파라메타
임신 주수 (주)	전체태아 (명)	DYS14 Cq	DYS14 농도	DYS14/GAPDH ratio
5-6	39	87.2 (34/39)	89.7 (35/39)	100.0 (39/39)
7	35	91.4 (32/35)	94.3 (33/35)	100.0 (35/35)
8	33	97.0 (32/33)	97.0 (32/33)	100.0 (33/33)
9	31	100.0 (31/31)	100.0 (31/31)	100.0 (31/31)
10-11	24	100.0 (24/24)	100.0 (24/24)	100.0 (24/24)
12	41	100.0 (41/41)	100.0 (41/41)	100.0 (41/41)

수치들은 괄호안의 정확한결과/총측정에 의한 %이다.

종전의 연구에서, 임산부 혈장 내의 남자 태아 DNA를 남자 유전체 당 복수의 카피를 가지는 서열을 증폭하여 확인할 수 있음이 보고되었다 (Prenat. Diagn. 28, 525-530, 2008). 따라서, DYS14 분석은 멀티카피 서열을 타겟으로 하므로 SRY 와 같은 단일카피 유전자보다 sensitivity가 높다. 그러나 Scheffer 등은 Cq 값이 높더라도 여아출산 참가자들의 DYS14 분석에서 증폭 시 그 값이 나타나기 때문에, 실험의 전체적인 specificity를 높이기 위하여 SRY 분석을 해야 한다고 강조하였다 (Obstet Gynecol, 115, 117-126, 2010). 발명자들 역시 Cq 값이 40보다 큰 높은 Cq 값을 갖는 여아출산 참가자들에 있어서 DYS14의 증폭 시 그 값을 확인하였다. 이러한 결과는 프라이머의 이합체화(dimerization)와 같은 artifact의 비선택적인 증폭 및 높은 Cq 값에서의 형광프로브의 불안정성에 의하여 유도될 수 있을 것이다. 그러나 여아 태아를 검출할 때는 DYS14 Cq 분석에 사용된 cutoff 값보다 더 높은 Cq 값 및 낮은 농도이므로 이러한 조건은 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 임신 8주 이전의 남아 출산 참가자들의 높은 Cq 및 DYS14의 낮은 농도에서 위음성 결과가 발견되었다.

태아 DNA 확인자로서 사용된 U-PDE9A 및 DYS14의 농도는 정확한 결과일 때보다 위음성 결과일 때 유의적으로 낮았다. 총 DNA 확인자로 사용된 GADPH의 농도 역시 같은 패턴을 보였다. 그러나, 위음성 결과에서의 모든 인자들의 값은 순환태아 DNA 및 총 DNA의 존재여부를 확인하기 위하여 사용된 최소값보다 컸다. 이러한 결과들은 위음성 결과들은 태아 성별 결정을 위하여 사용된 cutoff 값보다 순환태아 DNA 및 총 DNA의 양이 작기 때문에 기인하는 것으로 보인다. 더욱이 위음성 결과들은 임신 8주 이전의 임신 초기 첫 3개월에서 관찰되었다. 따라서, 임신 5-7주의 초기는 DYS14 분석 만으로 태아 성별을 판별하는 것보다 DYS14/GDPDH의 농도 비율을 사용하는 것이 바람직하다.

<110> Cheil General Hospital & Women's Health Care Center <120> An analysis method for determining the fetal gender and apparatus therefor <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for the methylated CpG sites of PDE9A gene <400> 1 cggtgagtgc gcgtcgc 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for the methylated CpG sites of PDE9A gene <400> 2 ccaaccatcc cgaaaaagcg 20 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for the unmethylated CpG sites of PDE9A gene <400> 3 ggtttgtttt ggtgagtgtg tgtcgt 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for the unmethylated CpG sites of PDE9A gene <400> 4 cccaaccatc ccaaaaaagc a 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrolysis probe for U-PDE9A <400> 5 tttgtttggt gatgttatgt ggttt 25 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for DYS14 <400> 6 gggccaatgt tgtatccttc t 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for DYS14 <400> 7 gcccatcggt cacttacact tc 22 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrolysis probe for DYS14 <400> 8 tctagtggag aggtgctc 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 ccccacacac atgcacttac c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 cctagtccca gggctttgat t 21 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrolysis probe for GAPDH <400> 11 aaagagctag gaaggacagg caacttggc 29 <210> 12 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA oligonucleotide calibrators specific to U-PDE9A <400> 12 ggtttgtttt ggtgagtgtg tgttgtgggt tttgtttggt gatgttatgt ggtttttttg 60 tttttttggg atggttggg 79

Claims

1) 최적 cutoff값 산출집단의 임산부의 혈장으로부터 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하여 DYS14 및 GAPDH의 농도 비율 (DYS14/GAPDH)에 대하여 specificity (실제 여자 태아가 여자 태아로 검출되는 비율)가 100%일 때의 값을 평가하여 최적 cutoff 값을 결정하는 단계;
2) 성별을 판단하고자 하는 태아를 임신한 임산부의 혈장으로부터 추출된 태아 DNA로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하고, 측정된 DYS14 및 GAPDH의 농도로부터 DYS14 및 GAPDH의 농도 비율(DYS14/GAPDH)을 계산하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 계산된 DYS14/GAPDH을 1)단계의 cutoff 값과 비교하는 단계를 포함하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법.

제1항에 있어서, 태아의 성별과 무관한 태아 DNA 마커의 존재여부를 확인하기 위하여 임산부 혈장으로부터 추출된 태아 DNA로부터 DNA 마커의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법.

제2항에 있어서, 태아의 성별과 무관한 태아 DNA 마커가 비메틸화된 PDE9A (U-PDE9A), 비메틸화된 SERPINB 5, 메틸화된 RASSF1A, 메틸화된 APC, 메틸화된 CASP8, 메틸화된 RARB, 메틸화된 SCGB3A1, 메틸화된 DAB2IP, 메틸화된 PTPN6, 메틸화된 THY1, 메틸화된 TMEFF2, 메틸화된 PYCARD 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법.

삭제

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임신 초기 첫 3개월 이내의 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석 방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DYS14, GAPDH 또는 태아 성별과 무관한 태아 DNA 마커 또는 그의 일부를 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법.

제6항에 있어서, 상기 증폭하는 단계가 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)으로 수행되는 것을 특징으로 하는 태아의 성별 판단에 필요한 정보를 제공하기 위한 시료의 분석방법.

태아 DNA를 템플레이트로 하여 DYS14 및 GAPDH 또는 그의 일부를 증폭하는 수단;DYS14 및 GAPDH의 농도를 측정하는 수단;DYS14/GAPDH의 농도의 비율을 계산하는 수단; 계산된 DYS14/GAPDH 의 농도의 비율을 출력하는 수단을 포함하는 태아의 성별 판별 장치.

제8항에 있어서, Bisulfite-처리된 태아 DNA의 PDE9A유전자의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머를 사용하여 Bisulfite-처리된 태아 DNA의 PDE9A유전자를 증폭하는 수단 및 U-PDE9A의 농도를 측정하는 수단을 추가로 포함하는 태아의 성별 판별 장치.

제9항에 있어서, DYS14 및 GAPDH의 농도의 비율 (DYS14/GAPDH)을 미리 입력된 DYS14/GAPDH의 cutoff 값과 비교하여 태아의 성별을 판단하는 수단을 추가로 포함하는 태아의 성별 판별 장치.

태아 DNA의 DYS14 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트;
태아 DNA의 GAPDH 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트;
bisulfite-처리된 태아 DNA의 PDE9A의 메틸화된 CpG 사이트와 비메틸화된 CpG 사이트를 구별할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 시약세트를 포함하는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 판별 장치용 시약 패키지.