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KR101250021B1 - 완화된 부작용을 갖는 신규 재조합 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

완화된 부작용을 갖는 신규 재조합 아데노바이러스 벡터 Download PDF

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KR101250021B1
KR101250021B1 KR1020087023921A KR20087023921A KR101250021B1 KR 101250021 B1 KR101250021 B1 KR 101250021B1 KR 1020087023921 A KR1020087023921 A KR 1020087023921A KR 20087023921 A KR20087023921 A KR 20087023921A KR 101250021 B1 KR101250021 B1 KR 101250021B1
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다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 생체내 투여동안 아데노바이러스 게놈에 삽입된 외래 프로모터에 의한 아데노바이러스 유전자 발현의 유도를 억제하여 염증반응이 경감되는 신규 아데노바이러스 벡터, 상기 벡터의 제조방법, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 사용하기 위한 세포주, 또는 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하는 유전자 치료법을 제공한다.
재조합 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스, 염증반응, 유전자 치료, 프로모터

Description

완화된 부작용을 갖는 신규 재조합 아데노바이러스 벡터{NOVEL RECOMBINANT ADENOVIRUS VECTOR WITH RELIEVED SIDE EFFECTS}
본 발명은 유전자치료용 재조합 아데노바이러스 벡터 및 상기 벡터의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 아데노바이러스 게놈에 삽입된 외래 프로모터에 의해 아데노바이러스의 유전자 발현의 유도를 억제함으로써 생체내 투여 후의 염증을 경감시키는 신규한 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 상기 벡터의 제조방법, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 사용하기 위한 세포주, 또는 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하는 유전자 치료방법에 관한 것이다.
아데노바이러스 벡터는, 유전자 전달의 높은 효율, 비분열 세포로 유전자를 전달되도록 하는 능력, 높은 적가 (titer) 의 바이러스 저장물(stock)의 제조의 용이성 등으로 인해, 우수한 동물세포용 유전자 전달 벡터이며, 유전자 치료에 사용하기 위한 벡터로서 그의 임상 적용이 시도되어 왔다. 현재 광범위하게 사용되는 아데노바이러스 벡터는, 아데노바이러스의 복제 및 모든 아데노바이러스 단백질의 발현에 필수적인 E1 유전자가 삭제된 복제 결함 벡터이며, 상기 벡터는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터로서 불려진다 (이들중 일부는 E3 유전자의 삭제를 추가적으로 포함한다).
제 1 세대 아데노바이러스 벡터는 E1 유전자가 결함되어 있으므로, E1 단백질을 발현하지 않는 인간 세포와 같은 정상 세포에서는 아데노바이러스 단백질 어느 것도 발현되지 못할 것으로 생각되었다. 그러나, 최근의 연구들은, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터를 사용하여 생체내로 유전자를 전달하는 경우, 전달유전자의 발현이 일시적이었고, 염증 반응이 유전자 전달 부위에서 발생하는 것을 입증하였다 (Yang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411 (1994); 및 Wilmott R.W. 등, Hum. Gene Ther., 7: 301-318 (1996)).
이러한 원인의 해석으로써, 하기의 가설이 제안되었다. 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 감염된 세포에서, 아데노바이러스 초기 유전자, 예컨대 E2A 유전자가 세포 유래의 전사인자에 의해 낮은 수준으로 발현되어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (MLP)를 활성화시킨다. 이어서, 주요 후기 단백질이 발현되고, 이들에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL)의 생성이 유발되고, CTL은 외래 유전자가 전달된 세포를 제거한다. 따라서, 이는, 아데노바이러스 초기 단백질의 발현을 통한 아데노바이러스 후기 단백질의 발현이 염증반응 및 전달유전자의 지속적인 발현의 결함의 원인이라는 이론이다 (Engelhardt J.F. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6196-6200 (1994); 및 Yang Y. 등, Nature Gnent., 7: 362-368 (1994)).
이러한 가설에 기초하여, E1 유전자 외에 아데노바이러스의 복제에 필수적인 다른 유전자를 삭제시킨 다양한 개선된 아데노바이러스 벡터가 구축되었고, 이후 이러한 벡터에 바이러스 생산 세포 유래의 유전자에 의해 코딩된 단백질을 공급하 여, 상기 바이러스가 복제될 수 있었다. 예를 들면, E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터 (Zhou H. 등, J. Virol., 70. 7030-7038 (1996); 및 Gorziglia M.I. 등, J. Virol., 70L 4173-4178 (1996)), E2A 유전자와 같은 초기 유전자로서 E4 유전자를 삭제시킨 아데노바이러스 벡터 (Krouglicak V. 등, Hum. Gene Ther., 6: 1575-1586 (1995); 및 Wang Q. 등, Gene Ther., 2: 775-783 (1995), Yeh P. 등, J. Virol., 70: 559-565 (1996)) 등이 보고되었다. 그러나, E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터의 경우, 전달 유전자의 발현 기간을 연장시켜주는 효과 및 염증 반응을 감소시키는 효과가 거의 관찰되지 않았다 (Morral N. 등, Hum. Gene Ther., 8: 1275-1286 (1997); 및 Lusky M. 등, J. Virol., 72: 2022-2032 (1998), 및 O'neal W.K. 등, Hum. Gene Ther., 9: 1587-1598 (1998)). 또한, E4 유전자가 삭제된 아데노바이러스에서, 적당한 개선이 관찰되었지만 여전히 만족할만한 수준은 아니라고 보고되었다 (Gao G-P, 등., J. Virol., 70: 8934-8943 (1996), Wang Q. 등, Gene Ther. 4: 393-400 (1997), 및 Dedieu J-F. 등, J. Virol., 71: 4626-4637 (1997)).
따라서, 더욱 개선된 벡터로서, 반전 말단 반복부 (inverted terminal repeat; ITR) 및 패키징 시그널 (packaging signal)을 제외한 모든 아데노바이러스 유전자를 삭제시키고 헬퍼 비이러스(helper virus)에 의존하여 복제하는 헬퍼 의존 아데노바이러스 벡터 (HD 벡터)가 제안되었다 (Kochanek S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5746 (1996), 및 Parks R. J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13565-13570 (1996)). 상기 HD 벡터는 또한 구트 벡터 (gutted vetor) 또는 구트리스 벡터 (gutless vector)라 불려진다. 상기 HD 벡터는 전달유전자의 발현기간의 연장 및 염증 반응의 감소와 같은 개선된 벡터의 효과를 나타내는 것으로 보고되었다 (Morsky M.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7866-7871 (1998), Schiedner G. 등, Nature Gnent. 18: 180-183 (1998), 및 Morral N. 등, Hum. Gene Ther. 9: 2709-2716 (1998)).
그러나, 상기 HD 벡터가 약학적 약물로서 임상적으로 사용될 경우, 벡터의 낮은 생산성이 큰 문제점이다. 그 이유는 다음과 같다: 첫째로, HD 벡터의 제조에 있어서, HD 벡터는 복제에 요구되는 모든 단백질의 공급을 위해 그들의 공급원으로서의 헬퍼 아데노바이러스에 의존된다. 헬퍼 바이러스가 항상 일정한 비율로 유지되면서 HD 벡터의 복제를 가능하게 하는 제조 원리로부터, 세포당 생산된 HD 벡터의 기록된 수율은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터와 비교하여 명백히 낮다 (Morsy M.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7866-7871 (1998), Schiedner G. 등, Nature Gnent. 18: 180-183)). 또한, 요구되는 HD 벡터는 제조에 사용되는 헬퍼 바이러스에 의해 항상 오염되고, 이러한 헬퍼 바이러스는 바이러스 사이의 미세한 비중 차이에 근거하여 초원심분리에 의해 바이러스를 분리함으로써 제거되어야만 한다. 때때로, 제 1 세대 아데노바이러스가 초원심분리에 의해 정제되지만, 그의 목적은 아데노바이러스 압자로부터 오염 단백질을 제거하는 것이다. 반면, HD 벡터의 정제에 있어서는, 오염 단백질을 제거해야할 뿐만 아니라, 상기에서 언급한 바와 같이 헬퍼 바이러스도 제거해야만 하고, 따라서 한 번의 원심분리 작동에 의해 정제한 수율은 제 1 세대 아데노바이러스보다 낮아지게 된다. 헬퍼 바이러스가 충분히 제거되지 않는 경우, 바이러스 자체의 안정성이 문제로 남겨진다. 또한, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터가, 또한 초원심분리 방법에 의한 것보다 더욱 다량의 바이러스를 취급할 수 있는 컬럼 방법 (Huyghe B.D. 등, Hum. Gene Ther. 6: 1403-1416 (1995))에 의해서 정제될 수 있을지라도, HD 바이러스에 대한 헬퍼 바이러스의 제거의 필요성으로 인해, 컬럼 방법은 현재 기술 상태로는 적용할 수 없다. 상기한 이유로, HD 벡터의 생산성은 배양 세포로부터의 생산 및 뒤이은 정제 단계에서 모두 제 1 세대 아데노바이러스 벡터보다 분명히 낮다. 따라서, 임상 적용을 위한 충분한 양으로 HD 벡터를 생산하는 것이 극도로 어렵고 현실적이지 못한 것으로 여겨지고 있다.
또한, 바이러스 유래의 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus, CMV) 프로모터 및 로우스 사르코마 바이러스 (RSV) 프로모터는, 이들의 프로모터 활성이 높은 수준이기 때문에, 아데노바이러스를 포함한 유전자 치료용 벡터에 폭넓게 사용되고 있다. 그러나, 이러한 프로모터로부터 목적 단백질의 생채내에서의 장기간 발현을 얻기 위해서는, 아데노바이러스 E4 유전자에 의해 코딩된 단백질이 요구된다는 것이 보고되었다 (Armentano D., 등, J. Virol., 71: 2408-2416 (1997); 및 Brough D.E. 등, J. Virol. 71: 9206-9213 (1997)). 지속적인 프로모터 활성의 관점에서, 바이러스 유래의 고활성 프로모터를 삽입한 아데노바이러스 벡터는, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 구조와 유사한 구조를 갖는 벡터를 사용하여야만 한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 헬퍼 바이러스와는 독립적으로 복제할 수 있는 신규 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이며, 상기 벡터는 생체내에서 아데노바이러스 단백질을 거의 발현하지 않고, 결과로서, 어떠한 면역반응도 유발하지 않으며, 전달유전자의 지속적인 발현을 가능하게 하는 특성을 갖는다. 또한, 본 발명의 목적은 유전자 치료에 상기 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은, E1 유전자를 삭제시킨 제 1 세대 아데노바이러스 벡터가 개체 동물에 투여되었을 때, 염증반응이 발생하는 이유에 대해서 집중적이고 광범위한 연구를 수행하였다. 결과로서, E1 단백질을 생산하지 않는 세포가 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 감염되었을 때, 아데노바이러스 단백질이 발현되는 메커니즘이 통상의 가설과 다르다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 발명자는, 아데노바이러스 단백질의 발현을 유도하는 것은 통상적으로 여겨졌던 초기 유전자의 발현이 아니라, 아데노바이러스 벡터에 삽입된 외래 프로모터라는 것을 해명하였다. 구체적으로는, 새로운 메커니즘은, 외래 프로모터의 특정 요소 (인핸서(enhancer) 등)가 상기 프로모터의 주변에 존재하는 아데노바이러스 프로모터에 작용하여, 결과적으로 아데노바이러스 유전자가 발현된다는 것을 명시한다. 이외에도, 본 발명자들은, 주로 발현되는 아데노바이러스 유전자는 종래에 통상적으로 여겨져온 주요 후기 프로모터 (MLP)에 의해서 조절되고, 헥손 (hexon) 등을 코딩하는 주요 후기 유전자가 아니라, 독립적인 프로모터를 갖는 단백질 IX 유전자라는 것을 발견하였다.
단백질 IX는 아데노바이러스의 복제에 필수적인 단백질이 아니라, 완전한 아데노바이러스 입자의 형성에 요구되는 단백질이다. 따라서, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터로부터 단백질 IX 유전자를 단순히 삭제시키는 것은, 본 발명자들이 얻고자 하는 정상적인 아데노바이러스 벡터를 생산하지 못한다. 따라서, 본 발명자는 또한 집중적이고 광범위한 연구를 수행한 결과, 두 가지 다른 방법에 의해서 상기한 문제점이 해결될 수 있음을 발견하였다. 하나는, 상기 아데노바이러스 벡터의 단백질 IX 유전자를 정상적인 위치에서 외래 프로모터의 영향을 받지 않는 위치로 재위치화시키는 방법이다 (이하, "단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터"라 함). 다른 하나는, 상기 아데노바이러스 벡터로부터 단백질 IX 유전자를 삭제시키고, 단백질 IX를 생산하는 신규 세포주를 구축하고, 이 세포주로부터 단백질 IX 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법이다 (단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터).
또한, 본 발명자들에 의한 연구는, 외래 프로모터의 효과에 반응하여 발현이 유도되는 아데노바이러스 유전자가 주로 단백질 IX 유전자일지라도, 단백질 IVa2 및 L1 유전자의 발현이 또한 유도될 가능성이 있다는 것을 증명하였다. 따라서, 단백질 IVa2 유전자 및 L1 유전자의 프로모터가 외래 프로모터의 영향을 받지 않도록 변형된 아데노바이러스 벡터가, 아데노바이러스 단백질을 발현하지 않으면서도 염증을 거의 유발하지 않는 벡터로서, 단독으로 또는 단백질 IX 유전자의 변형과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상기한 발견에 기초하여 완성되었다.
따라서, 본 발명은 다음에 관한 것이다.
1. 생체내 투여동안 염증이 경감되며, 하기 (1) 내지 (4)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터:
(1) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E2B 유전자가 삭제되고;
(2) 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 아데노바이러스 게놈에 삽입되며;
(3) 하기 (A) 및/또는 (B)의 특성을 가지며:
(A) 외래 프로모터에 의해 발현이 유도된 아데노바이러스의 게놈중의 유전자가, 정상적인 위치로부터 외래 프로모터에 의한 발현 유도가 발생하지 않는 위치로 재위치화되거나, 상기 유전자가 삭제되고; 및
(B) 외래 프로모터에 의한 발현 유도가 발생하는 아데노바이러스 게놈 유전자의 프로모터의 뉴클레오티드 서열이, 외래 프로모터의 영향을 받지 않도록 치환되며; 및
(4) 아데노바이러스 야생형과 동일한 특성을 갖는 정상적인 바이러스 입자가 형성됨.
2. 제 1 에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 프로모터가 MLP 및/또는 IVa2 유전자 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
3. 제 1 또는 제 2 에 있어서, 하기 (5) 내지 (8)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터:
(5) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고;
(6) 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입되며;
(7) 상기 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자가 정상적인 위치로부터 외래 프로모터에 의한 발현 유도가 발생하지 않는 위치로 재위치화되고; 및
(8) 아데노바이러스 야생형의 양과 유사한 양의 단백질 IX를 함유하고, 정상적인 바이러스 입자를 형성함.
4. 제 1 내지 제 3 중 어느 하나에 있어서, 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자 삭제 부위에 삽입된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
5. 제 1 내지 제 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자 이외의 다른 유전자 하나 이상의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
6. 제 3 내지 제 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자 및 단백질 IX 유전자 이외의 다른 유전자 하나 이상의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
7. 제 1 내지 제 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 E3 유전자의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
8. 제 1 내지 제 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 E2A 유전자의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
9. 제 1 내지 제 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 하나 이상의 ORF를 보유함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
10. 제 9 에 있어서, 상기 벡터가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 ORF3를 보유함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
11. 제 10 에 있어서, 상기 벡터가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 ORF3 이외의 ORF의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
12. 제 3 내지 제 11 중 어느 하나에 있어서, 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터로부터 18kb 이상 떨어진 위치에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
13. 제 12 에 있어서, 단백질 IX 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 L3 유전자와 E2A 유전자 사이에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
14. 제 3 내지 제 11 중 어느 하나에 있어서, 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터로부터 24kb 이상 떨어진 위치에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
15. 제 14 에 있어서, 단백질 IX 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E3 유전자 삭제 부위에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
16. 제 3 내지 제 11 중 어느 하나에 있어서, 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터로부터 30kb 이상 떨어진 위치에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
17. 제 16 에 있어서, 단백질 IX 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자의 상류 영역과 3'-말단 ITR 사이에 재위치화된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
18. 제 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 외래 프로모터가 포유동물 및/또는 동물 바이러스 유래의 요소를 함유한 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
19. 제 18 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 인핸서를 함유한 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
20. 제 19 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
21. 제 19 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CAG 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
22. 제 18 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 RSV 프로모터 또는 SRα프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
23. 제 18 에 있어서, 상기 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
24. 제 23 에 있어서, 상기 아데노바이러스가 2형 아데노바이러스 또는 5형 아데노바이러스임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
25. 제 1 또는 제 2 에 있어서, 하기 (9) 내지 (11)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
(9) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자 및 단백질 IX 유전자가 삭제되고;
(10) 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자는 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입되며; 및
(11) 아데노바이러스 야생형의 양과 유사한 양으로 단백질 IX를 함유하고, 일반 바이러스 입자를 형성함.
26. 제 25 에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈 중 E3 유전자의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
27. 제 25 또는 26 에 있어서, 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자의 삭제 부위 또는 E3 유전자 삭제 부위에 삽입된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
28. 제 25 내지 제 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈 중 E1A 및 E1B 유전자, E3 유전자, 및 단백질 IX 유전자 이외에 다른 유전자 하나 이상이 전부 또는 일부 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
29. 제 25 내지 제 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈 중 E2A 유전자의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 재조합 아데노바이러스 벡터.
30. 제 25 내지 제 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 하나 이상의 ORF를 보유함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
31. 제 30 에 있어서, 상기 벡터가 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 ORF3를 보유함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
32. 제 31 에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자 중 ORF3 이외의 ORF의 전부 또는 일부가 삭제된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
33. 제 25 내지 제 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 외래 프로모터가 포유동물 및/또는 동물 바이러스 유래의 요소를 함유한 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
34. 제 33 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 인핸서를 함유한 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
35. 제 34 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
36. 제 34 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CAG 프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
37. 제 33 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 RSV 프로모터 또는 SRα프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
38. 제 25 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
39. 제 38 에 있어서, 상기 아데노바이러스가 2형 아데노바이러스 또는 5형 아데노바이러스임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
40. 하기 (12) 및 (13)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 포유동물 유래의 세포.
(12) 아데노바이러스의 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자를 발현하고; 및
(13) 제 25 내지 제 39 중 어느 하나에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터를 증폭시킬 수 있음.
41. 제 40 에 있어서, 아데노바이러스의 단백질 IX 유전자의 발현이 상기 유전자의 본래의 프로모터와는 다른 외래 프로모터에 의해 조절됨을 특징으로 하는 세포.
42. 제 40 또는 제 41 에 있어서, 아데노바이러스의 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자 이외의 다른 아데노바이러스 유전자 하나 이상을 더 발현함을 특징으로 하는 세포.
43. 제 42 에 있어서, 아데노바이러스의 E1 유전자, 단백질 IX 유전자 및 E2A 유전자를 발현함을 특징으로 하는 세포.
44. 제 40 내지 제 43 중 어느 하나에 따른 세포가 사용됨을 특징으로 하는 제 25 내지 제 39 중 어느 하나에 따른 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조방법.
45. 생체내 투여동안 염증이 경감되고, 하기 (14) 및 (15)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터:
(14) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고; 및
(15) 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도시키지 않는 외래 프로모터가 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입됨.
46. 제 45 에 있어서, 하기 (16) 내지 (18)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터:
(16) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전가가 삭제되고;
(17) 상기 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자가 본래 위치에서 유지되며; 및
(18) 단백질 IX 유전자의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터가 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입됨.
47. 제 45 또는 제 46 에 있어서, 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 유전자 및 E1B 유전자 삭제 부위에 삽입된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
48. 제 45 내지 제 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 인핸서를 함유하지 않은 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
49. 제 45 내지 제 48 중 어느 하나에 있어서, 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 좌측 방향으로 삽입된 것임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
50. 제 45 내지 제 49 중 어느 하나에 있어서, 외래 프로모터가 EF1α프로모터임을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
51. 생체내 투여동안 염증이 경감되고, 하기 (19) 및 (21)의 특성을 가짐을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터:
(19) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전가가 삭제되고;
(20) 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈에 삽입되며; 및
(21) 외래 프로모터에 의한 아데노바이러스 유전자 발현의 유도를 억제하는 특성을 갖는 염기서열이 외래 프로모터와 아데노바이러스 유전자 사이에 삽입됨.
52. 제 51 에 있어서, 외래 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 유전자 및 E1B 유전자의 삭제 부위에 삽입됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
53. 제 51 또는 제 52 에 있어서, 상기 외래 프로모터가 CMV 인핸서를 함유함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 벡터.
54. 제 1 내지 제 39 및 제 45 내지 제 53 중 어느 하나로부터 선택된 재조합 아데노바이러스 벡터를 활성성분으로서 포함하고, 생체내 투여동안 염증을 경감하거나 유발하지 않는 약학 조성물.
55. 제 1 내지 제 39 및 제 45 내지 제 53 중 어느 하나로부터 선택된 재조합 아데노바이러스 벡터를 포유동물에게 투여함을 특징으로 하는, 생체내 투여동안 염증의 경감방법.
56. 제 1 내지 제 39 및 제 45 내지 제 53 중 어느 하나로부터 선택된 재조합 아데노바이러스 벡터를 포유동물에게 투여함을 특징으로 하는, 생체내 투여동안 염증을 경감하는 유전자 치료법
57. 생체내 투여동안 염증이 경감하거나 유발하지 않는 약학 조성물의 제조를 위한, 제 1 내지 제 39 및 제 45 내지 제 53 중 어느 하나로부터 선택된 재조합 아데노바이러스 벡터의 용도.
58. 생체내 투여동안 염증이 경감하거나 유발하지 않는 유전자 치료용 약학조성물의 제조를 위한, 제 1 내지 제 39 및 제 45 내지 제 53 중 어느 하나로부터 선택된 재조합 아데노바이러스 벡터의 용도.
본 발명은 바이러스 단백질의 발현이 억제되고 염증이 경감되는 유전자 치료를 위한 매우 안전한 아데노바이러스 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 최적의 실시 양태
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따르면, 재조합 아데노바이러스 벡터의 생체 내 투여 후에 일어나는 염증이 외래 프로모터에 의해 야기된다는 것을 처음으로 밝혔다. 구체적으로, 본래 발현되지 않아야 하는 아데노바이러스 게놈의 유전자가 외래 프로모터의 작용에 의해 발현되고, 아데노바이러스 유래의 발현 단백질이 염증을 야기한다는 것을 처음으로 명확히 하였다.
그리하여, 아데노바이러스 벡터의 생체 내 투여 후에 염증을 경감시키기 위해, 아데노바이러스 유전자의 발현이 외래 프로모터의 작용에 의해 영향을 받지 않도록, 적절히 재조합 아데노바이러스 벡터의 게놈 구조를 변형시키는 것은 자명하다. 따라서, 아데노바이러스 유전자의 발현이 외래 프로모터의 작용에 의해 영향을 받지 않도록, 재조합 아데노바이러스 벡터의 게놈 구조를 변형하는 것은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 당업자에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 아데노바이러스 유전자 발현이 외래 프로모터에 의해 영향을 받지 않도록 변형시킨 재조합 아데노바이러스 벡터의 임의의 게놈 구조는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 범주에 포함된다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 바람직한 구현예로서, 하기 (1) 내지 (4)의 특성을 갖는 것을 언급할 수 있다:
(1) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고;
(2) 외래 프로모터를 포함하는 외래 유전자가 아데노바이러스 게놈내로 삽입되고;
(3) 하기 특성 (A) 및/또는 (B)를 가지며:
(A) 외래 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아데노바이러스 게놈의 유전자가 정상적인 위치에서 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하지 않는 위치로 재위치화되거나, 상기 유전자가 삭제되고;
(B) 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하는 아데노바이러스 게놈 유전자의 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 외래 프로모터의 영향을 받지 않도록 치환되고;
(4) 아데노바이러스 야생형과 동일한 특성을 갖는 정상적인 바이러스 입자가 형성됨.
본원에 사용된 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축에 사용된 아데노바이러스는 천연 숙주로서 동물을 이용하는 바이러스이고, 구체적으로는 숙주로서 인간을 이용하는 인간 아데노바이러스가 바람직하게 이용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 서브군 C의 인간 아데노바이러스, 예를 들면, 2형 또는 5형 아데노바이러스가 이용된다. 본 명세서에서, 아데노바이러스 게놈내의 유전자의 위치를 보여주기 위해, 맵 단위 (map unit) (이후부터 m.u.라 언급함; 1 m.u.는 약 360 염기쌍이다)를 사용할 수 있고, 그 값은 5형 아데노바이러스에 기초한다. 상기 아데노바이러스 게놈의 구조는 공지되어 있고, 예를 들면, 인간 2형 아데노바이러스 게놈의 전체 뉴클레오티드 서열은 GenBank 에 등록되었고 (등록 번호 J01949), 인간 5형 아데노바이러스 게놈의 전체 핵산 서열이 GenBank 에 등록되었다 (등록 번호 M73260).
상기 (1)에서, 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 유전자의 삭제는 양 유전자의 염기의 전부 또는 일부가 존재하지 않는 것을 의미하고, 삭제로 기능성 E1A 단백질 및 E1B 단백질이 생산되지 않는 것이라면, 삭제의 범위는 구체적으로 제한되지 않는다. 더욱이, 단백질 IX 유전자가 E1B 유전자의 일부와 완전히 겹치는 위치에 존재하지만, E1B 유전자의 삭제에는 통상 단백질 IX 유전자의 삭제가 포함되지 않는 다. E1A 및 E1B 유전자 삭제의 예로서, 5형 아데노바이러스의 1.3 - 9.3 m.u.의 삭제를 언급할 수 있다 (E1A 유전자의 전부 및 E1B 유전자의 대부분이 삭제된다; Trapnell B.C., Advanced Drug Delivery Reviews, 12: 185-199 (1993), Elsevier Science Publishing B.V.). 상기 삭제는 그러한 기초 교과서, 예컨대 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis 등, 편저, 제 2 판 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory]에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 수행될 것이다.
본 발명에 따르면, E1A 유전자 및 E1B 유전자는 일괄적으로 E1 유전자 또는 E1 부위로서 간단하게 언급될 것이다.
상기 (2)에서, 외래 프로모터는 아데노바이러스의 본래 프로모터 이외의 프로모터이고, 외래 유전자는 프로모터, 단백질을 코딩하는 유전자, 폴리(A) 서열 등을 포함하는 전사를 수행하는 핵산 서열이다. 유전자 치료를 수행할 경우에, 상기 외래 유전자는 대상 질병을 치료하는데 이용되는 단백질을 발현하는 유전자를 말한다. 외래 유전자는 예를 들면, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 다양한 시판되는 발현 벡터내로 삽입함으로써 용이하게 구축될 수 있다. 또한 구축된 외래 유전자의 아데노바이러스 게놈내로의 삽입은 참고문헌(Graham F.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802-8806 (1994), 및 Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996) 등)에 기재된 공지의 방법에 기초하여 용이하게 수행될 수 있다. 외래 유전자는 바람직하게는 상기 E1 유전자 삭제 부위내로 삽입된다.
상기 (3)에서, 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하는 아데노바이러스 게놈 유전자는 외래 프로모터내의 특정 성분의 작용에 의해 전사를 일으키는 아데 노바이러스 게놈 유전자를 말한다. 구체적으로, 단백질 IX 유전자, 단백질 IVa2 유전자, 및 L1 유전자 등을 언급할 수 있다.
상기 (3)의 (A)에서, 상기 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하는 아데노바이러스 게놈의 유전자가 정상적인 위치에서 외래 프로모터의 영향을 받지 않는 위치로 재위치화되거나, 상기 유전자가 삭제되어, 생체 내 투여 후에 상기 유전자의 발현을 막을 수 있다. 특정 예로는 단백질 IX 유전자가 포함된다. 그리하여, 생체 내 투여 후에 염증을 경감시키는 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 상기에서 유전자를 삭제하는 경우에, 정상적인 바이러스 입자를 형성하기 위해서는, 삭제 유전자가 사전에 세포에 도입되어야만 하고, 재조합 아데노바이러스 벡터를 복제할 수 있는 세포에서 발현되어야 하는 것이 필요하다.
유전자의 상기한 재위치화 또는 삭제의 특정예가 하기에 더욱 상세히 언급될 것이지만, 기본적으로 다양한 재위치화 또는 삭제 재조합 아데노바이러스 벡터가 구축되고, 실시예 5에 기재된 생체 내 투여 후의 염증의 유무를 조사하거나 실시예 6에 기재된 노던 블롯팅 분석 등에 의해, 어떤 종류의 재위치화 또는 삭제가 본 발명의 목적을 만족시킬 수 있는지에 관하여 평가된다.
상기 (3)의 (B)에서 유전자의 특정 예로서, 주요 후기 프로모터 (major late promoter: MLP) 및/또는 IVa2 유전자 프로모터를 언급할 수 있다. 본래의 기능을 손상시키지 않는 범위에서, 외래 프로모터에 의해 영향을 받지 않도록, 아데노바이러스 게놈의 프로모터내의 염기를 치환함으로써, 생체 내 투여 후에 상기 아데노바이러스 게놈의 프로모터의 조절하의 유전자 발현을 막을 수 있다. 따라서, 아데노 바이러스 벡터의 생체 내 투여 후의 염증을 경감시키는 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 특정 염기의 치환은 하기 실시예를 참고하여 당업자에 의해 적절하게 수행될 수 있다. 따라서, 다양한 염기 치환을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 구축할 수 있고, 실시예 5에 기재된 생체 내 투여 후의 염증의 존재 또는 부재를 조사하거나 실시예 6에 기재된 노던 블롯팅 분석에 의해 어떠한 종류의 염기 치환이 본 발명의 목적을 만족시킬 수 있는지에 대해 평가할 수 있다.
상기 (3)의 (A) 및 (B)에 기재된 아데노바이러스 유전자의 재위치화, 삭제, 및 치환의 구체적인 절차는 기초 교과서, 예를 들면 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis 등, 편저, 제 2 판 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory], 또는 재조합 아데노바이러스 구축에 대한 공지 기술 [Graham F.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802-8806 (1994), 및 Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996) 등] 등에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 수행될 것이다.
상기 (4)에서, 아데노바이러스 야생형과 동일한 성질을 갖는다는 것은, 단백질과 같은 바이러스 입자의 조성비 및 바이러스 입자의 이화학적 성질뿐만 아니라, 세포에 대한 감염성 보유의 면에서 야생형과 거의 동일한 성질을 갖는 것을 말한다.
상기에 언급한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터에서, 상기 E1A 및 E1B 유전자 이외에 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 유전자의 전부 또는 일부를 추가로 삭제하는 것이 가능하다. 구체적으로, E3 유전자, E2A 유전자, 및/또는 E4 유전자의 전부 또는 일부를 삭제하는 것이 가능하다. 본원에 사용된, E4 유전자의 삭제의 경우에, E4 유전자의 하나 이상의 ORF를 보유하면서 삭제하는 것이 바람직하다. 특히, 적어도 ORF3를 보유하면서 삭제하는 것이 바람직하다. 상기 삭제는 하기에서 상세히 설명한다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 바람직한 구현예로서, 하기 (5) 내지 (8)의 특성을 갖는 것을 언급할 수 있다:
(5) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고;
(6) 외래 프로모터를 포함하는 외래 유전자가 아데노바이러스 게놈내로 삽입되고;
(7) 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자가 정상적인 위치에서 외래 프로모터에 의해 발현유도가 발생하지 않는 위치로 재위치화되고;
(8) 아데노바이러스 야생형의 양과 유사한 양의 단백질 IX를 함유하고, 정상적인 바이러스 입자를 형성함.
상기 특성은 상기 특성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 예시하면서, 하기에서 상세히 설명한다.
상기 (6)의 외래 유전자는 바람직하게는 E1 유전자 삭제 부위내로 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 외래 유전자는 바이러스 게놈의 1.3 - 11.2 m.u. 의 삭제된 부위, 및 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자 전부가 삭제된 (재위치화로 인함) 부위내로 삽입된다.
상기 (7)의 아데노바이러스 단백질 IX (이후부터 pIX라 언급함)는 아데노바 이러스 비리온의 캡시드내의 9 개의 헥손 군을 구성하는 소량 성분이고, 비리온의 열안정성 및 패키징될 수 있는 바이러스 게놈의 크기에 관련된다. 단백질 IX는 아데노바이러스 복제의 필수 성분은 아니지만, pIX 가 결여된 비리온은 열 불안정성인 경향이 있고 (Colby W.W. 등, J. Virol. 39: 977-980 (1981)), 야생형의 약 90% 크기를 갖는 게놈 DNA를 단지 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury G. 등, EMBO J. 6: 1733-1739 (1987)). 따라서, pIX는 정상적인 바이러스 입자를 형성하는데 필요하다.
상기 (7)에서, 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자가 정상적인 위치에서 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하지 않는 위치로 재위치화된다는 것은, 단백질 IX 유전자가 야생형 아데노바이러스 게놈의 본래의 존재한 위치, 즉, 인간 5형 아데노바이러스 게놈의 9.7 - 11.2 m.u. 위치(Maat J. 등, Gene 10: 27-38 (1980))에 단백질 IX 유전자가 존재하지 않고, 단백질 IX 유전자가 아데노바이러스 게놈의 임의의 다른 위치에 존재한다는 것을 의미한다. 또한, 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하지 않는다는 것은, 단백질 IX 유전자의 전사가 외래 프로모터에 의해 유도되지 않는다는 것을 의미한다. 이후부터, 단백질 IX 유전자가 재위치화된 아데노바이러스 벡터를 "단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터"로 언급될 수 있다.
상기 (7)에서, 단백질 IX 유전자가 재위치화된 위치는 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터에 의해 발현 유도가 발생하지 않고, 단백질 IX 의 발현이 벡터의 복제 주기를 현저히 억제하지 않는 한 구체적으로 제한되지 않는다. 그러나, 단백질 IX 유전자가 외래 프로모터로부터 몇 십 kb 떨어져 있고, 외래 유전자의 클로닝이 용이하게 수행될 수 있는 위치로 재위치화되는 것이 바람직하다. 그러한 위치의 바람직한 예로서, 외래 프로모터로부터 약 18 kb 이상 떨어진 위치를 언급할 수 있고, 이의 특정 예에는 아데노바이러스 게놈의 L3 유전자 및 E2A 유전자 사이의 위치가 포함된다 (일본 공개특허 공보 제 8-308585호). 또 다른 바람직한 예로서, 외래 프로모터로부터 약 24 kb 이상 떨어진 위치를 언급할 수 있고, 이의 특정 예에는 아데노바이러스 게놈의 E3 유전자의 삭제 부위가 포함된다. 또한, 또 다른 바람직한 예로서, 외래 프로모터로부터 약 30 kb 이상 떨어진 위치를 언급할 수 있고, 이의 특정 예에는 아데노바이러스 게놈의 E4 유전자의 상류 부위 및 3' 말단 ITR (inverted terminal repeat) 사이의 위치가 포함된다 (Saito I. 등, J. Virol. 54: 711-719 (1985)). 단백질 IX 유전자의 정상적인 위치로부터의 삭제 및 상기 위치로의 재위치화는 표준 재조합 DNA 기술 및 상기에 언급한 재조합 아데노바이러스 구축에 대한 공지 기술에 기초하여 용이하게 수행될 수 있다. 구축된 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터가 본 발명의 목적을 만족시킬 수 있는지는 실시예 5에 기재된 생체 내 투여 후의 염증의 유무를 조사하거나 실시예 6에 기재된 노던 블롯팅 분석 등에 의해 평가될 수 있다.
상기 (8)에서, 아데노바이러스 야생형과 유사한 양의 단백질 IX를 함유하는 바이러스 입자는, 야생형 아데노바이러스 입자내에 함유된 단백질 IX와 거의 동일한 비율의 단백질 IX를 함유하는 아데노바이러스 입자를 나타낸다. 또한, 정상적인 바이러스 입자는 세포에 대한 감염성을 보유하고, 이의 열 안정성 및 패키징될 수 있는 게놈 DNA의 크기가 야생형 아데노바이러스의 안정성 및 크기와 거의 동일한 아데노바이러스 입자를 의미한다.
상기한 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터에서, E1A 및 E1B 유전자가 삭제될 수 있고, 단백질 IX 유전자가 재위치화될 수도 있고, 또한 아데노바이러스 게놈의 다른 유전자의 전부 또는 일부가 삭제될 수도 있다. 구체적으로는, E3 유전자, E2A 유전자, 및/또는 E4 유전자의 전부 또는 일부를 삭제하는 것이 가능하다. 본원에 사용된 "전부 또는 일부"의 길이는, 삭제가 기능성 단백질의 생산을 허용하지 않는 한 구체적으로 제한되지 않는다. 아데노바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 상기 E3 유전자, E2A 유전자, 및 E4 유전자는 참고문헌에 기재되어 있고 (The Adenoviruses, Ginsberg H.S. 편저, 1984, Plenum Press, New York), 당업자는 상기 유전자를 아데노바이러스 벡터로부터 삭제하는 절차를 용이하게 수행할 수 있다.
상기 유전자 중에서 E3 유전자의 전부 또는 일부를 삭제함으로써, 더 큰 크기의 외래 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 상기 E3 유전자의 전부 또는 일부를 삭제할 경우에, 재조합 아데노바이러스 벡터를 복제시키는 세포에서 상기 E3 유전자를 발현시킬 필요가 없다. 반대로, E2A 유전자 및 E4 유전자의 전부 또는 일부를 삭제할 경우에, 정상적인 바이러스 입자를 형성하기 위해 재조합 아데노바이러스 벡터가 복제되는 세포에 이전에 삭제된 유전자를 도입하고, 이를 발현시킬 필요가 있다.
E4 유전자를 삭제할 경우에, E4 유전자의 하나 이상의 개방형해독틀 (ORF)을 보유하는 것이 바람직하다. 특히, E4 유전자의 ORF3 를 보유하는 것이 바람직하다. 5형 및 2형 아데노바이러스에서는, 전사 후의 RNA 스플라이싱에서의 차이로 인해 E4 유전자내에서 7 개의 상이한 폴리펩티드가 코딩되고, ORF3 는 그러한 폴리펩티드 중의 하나이다. 아데노바이러스의 증식 주기에서, ORF3 는 바이러스 유전자의 발현 및 DNA 복제를 촉진시키는 기능을 가진다. 다른 한편으로는, 하기에 기재된 CMV 프로모터의 몇몇의 외래 프로모터에 대해, 장기간 생체 내에서 그 프로모터 활성을 유지하기 위해서, E4 유전자의 ORF3 가 필요하다고 한다 (Lusky M. 등, J. Virol. 73: 8308-8319 (1999), 및 Yeew N.S. 등, Hum. Gene Ther. 10: 1833-1843 (1999)). 상기 이유로, 상기 ORF3를 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터를 생산하는 세포주는, 이들이 E1 유전자를 발현하고, 인간 배아 신장 세포 (ATCC CRL-1573) 유래의 293 세포처럼, 아데노바이러스 벡터의 생산에 적합하다면, 구체적으로 제한되지 않는다. 그러나, 유사한 DNA 서열이 세포주의 염색체내로 통합된 아데노바이러스 DNA 및 벡터의 게놈 사이에 존재한다면, 상동 재조합에 의해 바람직하지 않은 아데노바이러스가 생성될 가능성이 존재한다. 그리하여, 상기 아데노바이러스 벡터의 생산을 위해, 겹치는 DNA 서열이 벡터의 게놈 및 세포주의 염색체 사이에 가능한 한 존재하지 않도록 하기 위해, E1 유전자의 최소 부분을 단지 포함하는 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 예로서, 인간 배아 망막 (HER) 유래의 PER 세포주를 언급할 수 있다 (Fallaux F.J. 등, Hum. Gene Ther. 9: 1909-1917 (1998)). E1 유전자 외에, 다른 아데노바이러스 유전자, 예를 들면, E2A 유전자를 발현하는 세포주를 필요시 또한 사용할 수 있다. 상기 다른 아데노바이러스 유전자를 발현하는 세포주는 예를 들면, 상기 아데노바이러스 유전자를 적당한 발현 벡터내로 삽입함으로써 구축된 발현 벡터를 상기 E1 유전자를 발현하는 세포로 표준 방법에 의해 형질감염시킴으로써 구축할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 또 다른 바람직한 구현예로서, E1 유전자 및 단백질 IX 유전자가 게놈으로부터 삭제되고, 단백질 IX의 정상적인 양이 상기 바이러스 입자에 함유된 아데노바이러스 벡터를 언급할 수 있다. 따라서, 하기 (9) 내지 (11)의 특성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 언급할 수 있다:
(9) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자 및 단백질 IX 유전자가 삭제되고;
(10) 외래 프로모터를 포함하는 외래 유전자가 아데노바이러스 게놈내로 삽입되고;
(11) 아데노바이러스 야생형의 양과 유사한 양의 단백질 IX를 함유하고, 정상적인 바이러스 입자를 형성함.
상기 벡터는 "단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터"로 언급될 수 있다.
상기 (9)에서, 단백질 IX 유전자가 삭제되는 범위는, 삭제로 단백질 IX의 부분 펩티드 또는 단백질 IX 유전자로부터 유도된 펩티드의 발현이 허용되지 않는 한 구체적으로 제한되지 않는다. 적어도 단백질 IX 유전자의 코딩 부위의 전부를 삭제시키는 것이 바람직하다. 또한, 바이러스 게놈의 1.3 - 11.2 m.u. 를 삭제시키고, E1 유전자 및 단백질 IX 유전자의 전부를 삭제시키는 것이 더욱 바람직하다. 상기 삭제는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.
단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위해, 단백질 IX를 발현하는 세포주가 필요하고, 상기 세포주는 하기에서 설명한다.
*상기 (10)의 외래 유전자는 바람직하게는 E1 유전자 삭제 부위내로 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 외래 유전자는 바이러스 게놈의 1.3 - 11.3 m.u.의 삭제된 부위, 즉 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자의 전부가 삭제된 부위내로 삽입된다. 상기 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터에서와 같이, 아데노바이러스 E3 유전자의 전부 또는 일부가 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터에서 또한 삭제될 수 있고, 또한 외래 유전자를 E3 유전자 삭제 부위내로 삽입하는 것이 가능하다.
상기 (11)에서, 아데노바이러스 야생형의 양과 유사한 양의 단백질 IX를 함유하는 바이러스 입자는, 야생형 아데노바이러스 입자내에 함유된 단백질 IX와 거의 동일한 비율의 단백질 IX를 함유하는 아데노바이러스 입자를 의미한다. 정상적인 바이러스 입자는 세포에 대한 감염성을 보유하고, 이의 열 안정성 및 패키징될 수 있는 게놈 DNA의 크기의 면에서 야생형 아데노바이러스와 거의 동일한 성질을 가진 아데노바이러스 입자를 의미한다. 상기 바이러스 입자는 단백질 IX 삭제 아데노바이러스를 단백질 IX를 발현하는 세포주에 감염시키고, 이를 복제하게 함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터에 대해, 단백질 IX 유전자 뿐만 아니라 E1A 및 E1B 유전자를 그로부터 삭제시킬 수 있고, 추가로 아데노바이 러스 게놈의 다른 유전자의 전부 또는 일부를 삭제시킬 수 있다. 구체적인 삭제는 상기 언급한 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터와 동일하고, E3 유전자, E2A 유전자 및/또는 E4 유전자의 전부 또는 일부를 삭제시킬 수 있다. 본원에 사용된 삭제를 한 "전부 또는 일부"의 길이는, 삭제로 기능성 단백질의 생산이 허용되지 않는 한 구체적으로 제한되지 않는다. 아데노바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 상기 E3 유전자, E2A 유전자, 및 E4 유전자가 참고문헌에 기재되어 있고 (The Adenoviruses, Ginsberg H.S. 편저, 1984, Plenum Press, New York), 당업자는 상기 유전자를 아데노바이러스 벡터로부터 삭제하는 절차를 용이하게 수행할 수 있다.
상기 유전자 중에서 E3 유전자의 전부 또는 일부를 삭제함으로써, 더 큰 크기를 갖는 외래 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 상기 E3 유전자를 삭제할 경우에, 상기 E3 유전자를 재조합 아데노바이러스 벡터가 복제되는 세포에서 발현할 필요가 없다. 반대로, E2A 유전자 및 E4 유전자의 전부 또는 일부를 삭제할 경우에, 재조합 아데노바이러스 벡터가 복제되는 세포에 이전에 삭제된 유전자를 도입하고, 발현하게 할 필요가 있다.
E4 유전자를 삭제할 경우에, E4 유전자의 하나 이상의 개방형해독틀 (ORF)을 보유하는 것이 바람직하다. 특히, E4 유전자의 ORF3 를 보유하는 것이 바람직하다. ORF3 를 보유하는 장점에 대해, 상기 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 섹션을 참고할 수 있다.
본 발명의 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 단백질 IX 삭제 아데 노바이러스 벡터로 대표되는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터에 대해, 치료용 유전자와 같은 목적 외래 유전자의 발현용 벡터내에 외래 프로모터를 위치하는 것이 필요하다. 외래 프로모터로서, 포유동물 세포에서 기능하고, 원하는 양으로 목적 유전자를 발현할 수 있는 한, 임의의 프로모터, 예를 들면, 동물 바이러스 유래 프로모터, 포유동물 세포 유래 프로모터, 또는 두가지 프로모터의 혼성 프로모터 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 외래 프로모터의 예로서, 대개의 경우에 치료용 유전자를 높은 수준으로 발현하는 것이 바람직하기 때문에, 소위 고발현 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터 (Foecking M.K. 등, Gene 45: 101-105 (1986)) 및 CAG 프로모터 (Niwa H. 등, Gene 108: 193-200 (1991)) 등을 사용하는 것이 바람직하다. CMV 프로모터는 거대세포바이러스(cytomegalovirus: CMV)의 극초기 발현 (immediate early: IE) 유전자의 인핸서 및 프로모터로 구성되고, CAG 프로모터는 CMV 의 IE 인핸서, 병아리 β-액틴 프로모터, 스플라이스 수용체(splice acceptor) 및 토끼 β-글로빈의 폴리(A) 서열로 구성된다. 따라서, CMV 프로모터 및 CAG 프로모터 양자는 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 포함한다 (Boshart M. 등, Cell 41: 521-530 (1985)). 본원에 사용된, CMV의 IE 유전자의 상기 인핸서는 간단히 "CMV 인핸서"로 언급될 수 있다.
하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 단백질 IX 유전자의 발현 유도는, CMV 인핸서를 갖는 프로모터인 임의의 CMV 프로모터 및 CAG 프로모터를 사용할 경우에 관찰되었다. 반대로, CMV 인핸서를 포함하지 않는 프로모터인 EF-1α프로모터를 사용할 경우에, 단백질 IX 유전자의 발현 유도는 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 CMV 프로모터 및 CAG 프로모터가 공유하고 있는 CMV 인핸서가 아데노바이러스 유전자, 예를 들면, 단백질 IX 유전자의 발현을 유도하는 인자로 고려된다고 이해된다. 따라서, CMV 인핸서는 단백질 IX 유전자와 같은 프로모터에 작용한 결과, 단백질 IX 등이 발현된다고 생각된다.
프로모터 활성의 강도로부터, CMV 프로모터 또는 CMV 인핸서를 포함하는 혼성 프로모터를 현재 임상적으로 연구하고 있는 거의 모든 아데노바이러스 벡터에서 사용하고 있다. 따라서, 임상 적용에서, 그것의 생체 내 투여 후 염증이 경감되는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 매우 효율적으로 사용할 수 있다.
CMV 인핸서를 포함하는 상기 프로모터에 부가하여, 바이러스로부터 유사하게 유래한 프로모터, 예를 들면, SV40 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 프로모터 (Takebe Y. 등, Mol. Cell Biol. 8: 466-472 (1998))를 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터내로 삽입되는 외래 유전자는 구체적으로 제한되지 않고, 단백질, 예를 들면, 시토카인, 효소, 수용체, 바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 유전자, 안티센스 RNA 및 리보자임 등을 코딩하는 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터는, E1 유전자를 발현하나 단백질 IX를 발현하지 않는 세포주, 예를 들면, 인간 배아 신장 세포 유래의 293 세포에서조차 복제할 수 있다. 그러나, 단백질 IX를 발현하지 않는 세포주에서 생산된 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터는 바이러스 입자내에 원하는 양의 단백질 IX를 함유하지 않기 때문에, 본 발명의 목적 성질을 갖는 아데노바이러스 벡터를 수득하는 것이 불가능하다. 따라서, 본 발명의 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위해, 적어도 E1 유전자 및 단백질 IX를 발현하는 특정 세포주가 요구된다. 즉, 본 발명의 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 복제하기 위해, 하기 (12) 및 (13)의 특성을 갖는 포유동물 세포를 사용한다:
(12) 아데노바이러스의 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자를 발현하고;
(13) 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 증식할 수 있음.
단백질 IX를 발현하는 세포주의 구축방법으로서, E1 유전자를 이미 발현하는 세포주, 예를 들면, 인간 배아 신장 세포 유래의 293 세포 (ATCC CRL-1573)를 추가로 단백질 IX 유전자를 포함하는 발현 벡터로써 형질전환할 수 있거나, E1 유전자를 발현하지 않는 세포를, E1 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 단백질 IX 유전자를 포함하는 발현 벡터로 연속적으로 또는 동시에 형질전환할 수 있다. 그러나, E1A, E1B 및 단백질 IX 유전자의 1.3 - 11.2 m.u. 의 전부를 포함하는 DNA 단편을 이용한 세포의 형질전환은 단백질 IX를 발현하는 세포주를 제공하지 않기 때문에, 단백질 IX 유전자의 상류에 적당한 프로모터가 첨가된 DNA 단편으로 형질전환되어야만 한다. 단백질 IX 유전자의 전체 길이를 포함하는 인간 5형 아데노바이러스의 위치 1-4344 의 뉴클레오티드가 삽입됨에도 불구하고 (Louis N., Virology 233: 423-429 (1997)), 293 세포는 단백질 IX를 거의 발현하지 않고 (Krougliak V. 등, Hum. Gene Ther. 6: 1575-1586 (1995)), 단백질 IX 유전자의 전체 길이를 포함하는 E1 유전자가 삽입됨에도 불구하고, 다른 세포주는 단백질 IX를 거의 발현하지 않는다 고 보고되었다 (Fallaux F.J. 등, Hum. Gene Ther. 9: 1909-1917 (1998)). 단백질 IX 가 상기 세포에서 발현되지 않는 이유는, E1B 유전자가 단백질 IX 프로모터를 거쳐서 전사될 경우에, 단백질 IX 유전자의 전사가 억제되기 때문이라고 생각된다 (Vales L.D., Genes Dev., 3: 49-59 (1989)).
본 발명의 단백질 IX를 발현하는 세포주에 관하여, 단백질 IX의 발현에 사용된 프로모터는 구체적으로 제한되지 않고, 외래 프로모터 또는 단백질 IX 유전자의 본래 프로모터일 수 있다. 외래 프로모터를 사용할 경우에, 대상 세포주가 확립되고, 유지될 수 있고, 또한 상기 세포주에서 증폭되고 생산된 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터가 정상적인 양의 단백질 IX 를 함유하는 바이러스 입자를 형성하는 한, 항시 발현 (constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 항시 발현 프로모터의 예에는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α프로모터, SRα프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (MLP) 등이 포함된다. 유도성 프로모터의 예에는 메탈로티오네인 유전자 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 등이 포함된다. 또한, 항시 발현 프로모터의 발현이 테트라사이클린 또는 엑디손(ecdysone)에 의해 유도되는 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 프로모터를 갖는 발현 벡터 및 발현 유도 시스템은 시판되거나 공공 단체로부터 이용할 수 있다. 가능하다면, 상업적인 제품을 Invitrogen Inc., Clontech Inc. 등으로부터 구입할 수 있다.
상기 단백질 IX를 발현하는 세포주는 단백질 IX 유전자의 코딩 부위를 PCR 방법에 의해 클로닝하고, 이것을 시판되는 발현 벡터 (예를 들면, pcDNA3.1(+), Invitregen Inc.) 내로 삽입한 후, 인간 배아 신장 세포 유래의 293 세포내로 도입하고, 세포에서 단백질 IX를 발현하게 함으로써 구축될 수 있다. 상세한 것은 하기 실시예를 참조한다.
또한, 아데노바이러스 E1 유전자 및 단백질 IX 유전자 이외의 다른 아데노바이러스 유전자를 추가로 삭제한 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 복제할 경우에, 상기 삭제된 유전자를 추가로 발현하는 세포주가 종종 요구될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터의 E1 유전자, 단백질 IX 유전자, 및 E2A 유전자를 삭제할 경우에, 상기 3 종류의 유전자를 발현하는 세포주를 사용한다. E2A 유전자를 세포내로 형질도입할 수 있고, 상기 단백질 IX 유전자에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 발현되도록 한다.
상기에 기재된 세포주를 이용한 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, COS-TPC 방법 (Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996))을 구축을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 대표적인 구현예로서, 상기 (1) 내지 (4)의 특성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 언급하였고, 이의 바람직한 구현예로서, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 예시하여 설명하였다. 상기 기재한 것 이외의 구현예로서, 외래 프로모터가 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하지 않도록 변형되거나, 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터를 사용한 재조합 아데노바이러스 벡터를 언급할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡 터의 또 다른 바람직한 구현예로서, 하기 (14) 및 (15)의 특성을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 언급할 수 있다:
(14) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고;
(15) 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터를 아데노바이러스 게놈내로 삽입한다.
본원에 사용된, "아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터"는 적어도 단백질 IX 유전자의 발현을 유도하지 않는 임의의 프로모터일 수 있다. 그러한 외래 프로모터를 사용할 경우에, 단백질 IX 유전자는 상기 언급한 재위치화 및/또는 삭제를 필요로 하지 않고, 단지 아데노바이러스 게놈의 본래 위치에 있을 필요가 있다. 어떤 종류의 외래 프로모터가 단백질 IX의 발현을 유도하지 않는지는 다양한 외래 프로모터를 포함하는 외래 유전자가 삽입된 재조합 아데노바이러스 벡터를 구축하고, 실시예 5에 기재된 생체 내 투여 후의 염증 발생의 유무를 조사하거나 실시예 6에 기재된 노던 블롯팅 분석을 수행함으로써 평가될 수 있다. 상기 외래 프로모터는 적어도 CMV 인핸서를 포함하지 않고, 구체적으로 EF-1α프로모터를 언급할 수 있다 (Kim D.W. 등, Gene 91: 217-223 (1990)). 상기 EF-1α프로모터가 단백질 IX 의 발현을 유도하지 않고, 염증을 유도하지 않는 사실에 관하여, 하기 실시예 8 및 9를 참조한다.
또한, 상기 EF-1α프로모터와 같은 단백질 IX의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터를 포함하는 발현 단위는 바람직하게는 왼쪽 방향으로 삽입된다 (E1 유전자의 전사 방향의 역 방향). 발현 단위를 오른쪽 방향으로 삽입할 경우에, 외래 프로모터로부터의 전사는 정상적인 부위에서 부분적으로 종결되지 않고, 전사가 단백질 IX 유전자까지 연장되는 것이 염려된다.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터의 또 다른 구현예로서, 하기 특성 (19) - (21)을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 언급할 수 있다:
(19) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 삭제되고;
(20) 외래 프로모터를 포함하는 외래 유전자를 아데노바이러스 게놈내로 삽입하고;
(21) 외래 프로모터에 의해 아데노바이러스 유전자 발현의 유도를 억제하는 성질을 갖는 염기 서열을 외래 프로모터 및 아데노바이러스 유전자 사이에 삽입함.
본원에 사용된 "외래 프로모터에 의해 아데노바이러스 유전자 발현의 유도를 억제하는 성질을 갖는 염기 서열"은 외래 프로모터에 존재하는 인핸서에 의해 아데노바이러스 게놈의 프로모터의 활성화를 억제하는 활성을 가지는 DNA 서열을 의미한다. 이의 예는 초파리에서 최초로 발견된 "scs" 및 "gypsy"로 대표되는 인슐레이터(insulator)이다. 인슐레이터는 인핸서와 프로모터 사이에 위치할 경우에 인핸서에 의한 프로모터의 활성화를 막는 DNA 서열이다 (Chung J.C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 575-580 (1997), 및 Bell A.C. 등, Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 191-198 (1999)).
따라서, 인슐레이터가 E1 유전자 삭제 부위로 삽입된 외래 유전자 (인핸서/프로모터 포함)의 오른쪽 (MLP 쪽)에 삽입된 아데노바이러스 벡터는, 단백질 IX 유전자가 아데노바이러스 게놈의 본래 위치에 존재할 경우조차, 단백질 IX 를 포함한 아데노바이러스 단백질을 발현하지 않거나 염증을 유도하지 않는다.
인슐레이터의 구체적 구현예로서, 상기 언급한 "scs" 및 "gypsy" 에다가, 병아리 β-글로빈좌의 5' HS4 부위의 약 1.2 kb DNA 단편 (Chung J.C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 575-580 (1997), 및 인간 T 세포 수용체 α/δ좌의 BEAD-1 (Bell A.C. 등, Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 191-198 (1999)) 등을 언급할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터내로 삽입되는 인슐레이터는 구체적으로 제한되지 않고, 인슐레이터가 외래 인핸서/프로모터가 아데노바이러스의 유전자 발현을 유도하지 않도록 하는 것을 허용하지 않는 기능을 가지는 한, 사용되는 DNA 단편의 기원 및 크기 등은 제한되지 않는다. 인슐레이터가 삽입되는 아데노바이러스 벡터로서, 상기 언급한 β-글로빈 인슐레이터 및 유도성 프로모터가 삽입된 아데노바이러스 벡터 (Steinwaerder D.S. 등, Gene Ther. 7: 556-567 (2000)), 소 성장 호르몬의 전사 정지 신호의 인슐레이터 및 조직 특이적 프로모터가 삽입된 아데노바이러스 벡터 (Vassux G. 등, Gene Ther. 6: 1192-1197 (1999)) 등이 보고되었다. 그러나, 이들 중의 어느 것도 외래 인핸서/프로모터에 의해 아데노바이러스의 유전자 발현을 억제할 의도가 아니나, 이의 목적은 아데노바이러스의 인핸서에 의해 외래 프로모터의 활성화를 억제하는 것이다. 따라서, 양 보고의 아데노바이러스 벡터에서, 외래 인핸서/프로모터에 의한 아데노바이러스의 유전자 발현이 억제된 증거가 없어, 상기 보고는 아데노바이러스 유전자 발현의 유도 및 염증을 억제하기 위해 인슐레이터가 삽입된 본 발명과는 본질적으로 상이하다.
이어서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 발명이 완성된 내력을 하기에서 설명한다. 본 발명의 정수의 내력, 또는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 의한 염증의 개시가 외래 프로모터에 의한 아데노바이러스의 유전자 발현의 유도에 기인한 것이라는 발견을 설명한다.
본원에 사용된, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 E1 유전자가 삭제된 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 의미한다. 제 1 세대 아데노바이러스 벡터는 293 세포처럼 E1 유전자를 발현하는 세포주에서만 단지 복제가능하다. 제 1 세대 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자가 삭제되거나 되지 않을 수 있다.
또한 "선행 기술"의 섹션에서 설명된 "제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 의한 염증이 아데노바이러스 초기 유전자인 E2A 유전자의 발현에 의한 것"이라는 종래의 가설을 증명하기 위해, 본 발명자들은 또한 E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터를 구축하였다. 본 발명자들에 의한 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터를 구축하는 방법은 일본 공개특허 공보 제 8-308585호에 개시되어 있기 때문에, 구축 방법의 개요만을 단지 본원에서 설명한다. 먼저, 본 발명자들은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터를 구축하였는데 (도 1, Ax2LD3LCAHGH), 여기에서 P1 파아지의 재조합효소 Cre 의 인지 서열인 loxP 부위를 (Abremski K. 등, J. Biol. Chem. 259: 1509-1514 (1984), 및 Hoess R.H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1026-1029 (1984)) 두 개의 부위 (아데노바이러스 L3 유전자 및 E2A 유전자 (61.5 m.u.) 사이 및 E3 유전자 삭제 부위 (78.0 m.u.))에 삽입하였다. 293 세포를 Ax2LD3LCAHGH 및 재조합효소 Cre 발현 제 1 세대 아데노바이러스 벡터(도 1, AxCANCre)로 동시감염시킴으로써, 두 개의 loxP 부위에 의해 인접한 E2A 유전자 및 L4 유전자가 잘린 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 (도 1, △E2A-CAHGH)를 생성하였다. 이어서, 염화 세슘을 이용한 밀도 구배 초원심분리에 의해, 각각의 바이러스를 바이러스 입자의 비중에 따라 분리하여 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터를 97-98%의 순도로 정제하였다. 상기 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 △E2A-CAHGH 에, 이의 발현 단위를 삽입하여 인간 성장 호르몬 (hGH)을 상기 언급한 CAG 프로모터의 조절하에 리포터 유전자로서 발현시킬 수 있었다. 더욱이, E2A 삭제 아데노바이러스 벡터에 대한 대조 벡터로서, 동일한 발현 단위를 갖는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터를 구축하였다 (도 1, Ax1CAHGH).
이어서, 그렇게 구축된 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터에 대해 E2A 유전자의 삭제 여부를 확인하였다. 그리하여, △E2A-CAHGH 또는 Ax1CAHGH 로 감염된 A549 세포 (인간 폐암 유래의 세포주)에서 E2A 유전자에 의해 코딩된 DBP (단일 가닥 DNA 결합 단백질)의 발현량을 형광 항체법에 의해 비교하고, DBP의 발현이 △E2A-CAHGH 로 감염된 세포에서 명백히 감소함에 의해 E2A 유전자의 삭제를 확인하였다. 더욱이, 후기 유전자에 속하고, 바이러스 입자의 주요 구조 단백질인 L3 유전자에 의해 코딩되는 헥손의 발현량을 유사하게 형광 항체법으로 비교하고, 헥손의 발현이 △E2A-CAHGH 로 감염된 세포에서 명백히 감소한다는 것을 발견하였다. 결과는 "미량으로 발현되는 E2A 유전자가 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (MLP)를 활성화시켜, 주요 후기 단백질이 발현된다"는 종래의 가설이 이 점에서 옳다는 것을 나타냈다.
따라서, E2A 삭제 아데노바이러스 벡터를 주사한 동물의 생체 내 염증 반응 이 감소하는지를 조사하였다. △E2A-CAHGH 또는 Ax1CAHGH 를 마우스의 정맥내로 주사하고, 효소 GPT (글루타믹 피루빅 트랜스아미나아제)를 방출하는 간의 혈청 수준을 염증의 지수로서 측정하였다. 먼저, 각각의 아데노바이러스 벡터의 감염 효율성을 확인하기 위해, 아데노바이러스 벡터의 투여 후 3일째의 혈청 hGH 양을 측정하였다. 아데노바이러스 벡터 투여 군 사이에 혈청 hGH 양에서 현저한 차이가 없었기 때문에, 아데노바이러스 벡터 사이에 동물의 감염 효율성의 차이가 없음을 확인하였다. 따라서, E2A 삭제 아데노바이러스 벡터를 지수로서 혈청 GPT 양을 이용하여 평가하였고, 혈청 GPT 양이 Ax1CAHGH 를 투여한 마우스와 동일하게 △E2A-CAHGH 를 투여한 마우스에서도 증가한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터는 염증 경감 효과가 전혀 없다는 것을 나타낸다. 또한, 일부 마우스에서, 아데노바이러스 벡터의 투여 후, 일정 간격으로 조직 분석을 위해 간 섹션을 제조하였다. Ax1CAHGH 를 투여한 마우스에서, 투여 후 5일 이상에서, 간내로의 T 세포를 포함한 백혈구의 침투와 같은 염증 반응이 있었고, 간세포의 아폽토시스가 관찰되었으며, 유사한 염증 반응이 또한 △E2A-CAHGH 를 투여한 마우스에서 관찰되었다. 그러므로, 또한 양자의 아데노바이러스 벡터를 투여한 마우스 사이에 조직병리학적인 차이가 전혀 없었다.
상기 결과는 E2A 유전자의 삭제가 염증의 경감에 영향이 없다는 것을 나타낸다. 그리하여, E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터와 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 사이의 염증의 유도에서 차이가 없는 이유로서, 하기의 4 가지 가능성을 고려하였다:
1) E2A 유전자이외의 E4 유전자와 같은 아데노바이러스 유전자가 세포 유래의 인자에 의해 직접 활성화되고, 발현된 아데노바이러스 단백질이 그 자체로 세포 매개 면역을 유도하거나, 염증을 야기하는 세포 매개 면역을 유도하는 또 다른 아데노바이러스 단백질의 발현을 유도할 가능성;
2) 리포터 유전자로서 사용한 hGH 단백질이 염증을 야기하는 세포 매개 면역을 유도할 가능성;
3) 벡터내로 삽입된 외래 프로모터 (CAG 프로모터)가 아데노바이러스 프로모터상에서 인핸서로 작용하여 아데노바이러스 단백질을 발현시키고, 이 단백질은 염증을 야기하는 세포 매개 면역을 유도할 가능성;
4) 벡터에 감염된 세포에서 신규로 합성된 단백질 대신에, 세포내로 침투하는 아데노바이러스 입자를 구성하는 단백질 그 자체가 염증을 야기하는 세포 매개 면역을 유도할 가능성.
선택적으로, 세포내로 아데노바이러스 입자의 침투 그 자체는 자극으로서 이용되고, 염증 시토카인 등의 생산을 유도하여, 염증을 야기한다.
그리하여, 상기 1) 내지 4) 중 어느 것이 E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터가 염증 유도를 경감시키지 못하는 가능성있는 원인인지를 명확히 하기 위해, 하기 4 가지 아데노바이러스 벡터를 이용하여 염증의 원인을 조사하였다:
(a) hGH 를 발현하는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Ax1CAHGH: 양성 대조군);
(b) hGH cDNA 없이 CAG 프로모터만 삽입된 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (도 1, AxCAwt: 폴리(A) 서열을 또한 삽입한 것);
(c) 프로모터와 같은 외래 유전자를 삽입하지 않은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (도 1, Ax1wl); 및
(d) UV-불활성화 아데노바이러스 입자 (Ax1CAHGH 를 불활성화시킨 것).
상기 4 가지 벡터를 마우스 정맥내로 주사하고, 혈청 GPT 양을 측정하였다. UV-불활성화 아데노바이러스 입자의 정의 및 제조 방법의 상세한 것은 현존 간행물에 기재되어 있고 (Brinstiel M.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094-6098 (1992), Birnstiel M.L. 등, Virology 205: 254-261 (1994)), 이의 정의는 하기에 간단히 기재된다. UV-불활성화 아데노바이러스 입자는 세포에 대한 감염성을 보유하고, 세포내로 침투할 수 있으나, 불활성화 전에 아데노바이러스의 복제를 허용하는 세포내에서조차 복제할 수 없고, 삽입된 외래 유전자가 발현되지 않는 상태로 불활성화된 아데노바이러스 입자를 의미한다.
상기 결과를 요약하면, UV-불활성화 아데노바이러스 입자로 처리된 마우스 및 외래 유전자가 삽입되지 않는 Axlwl 로 처리된 마우스에서, 혈청 GPT 양은 전혀 증가하지 않았다. 반대로, CAG 프로모터만이 삽입된 AxCAwt 로 처리된 마우스에서는, 혈청 GPT 양은 hGH 를 발현하는 Ax1CAHGH로 처리된 마우스와 유사한 정도로 증가하였다. AxCAwt로 처리된 마우스에서도 염증이 또한 발생하였기 때문에, 2)의 hGH 단백질이 원인일 가능성은 배제되었다. 더욱이, UV-불활성화 아데노바이러스 입자로 처리된 마우스에서 염증이 발생하지 않았기 때문에, 4)의 아데노바이러스 입자가 원인일 가능성은 배제되었다. 더욱이, Axlwl로 처리된 마우스에서도 염증 이 발생하지 않았기 때문에, 1)의 원인이 단독으로 염증을 야기할 가능성은 배제되었다. 그리하여, AxCAwt로 처리된 마우스에서의 염증은 Ax1CAHGH로 처리된 마우스의 것과 유사한 정도로 발생하였고, Axlwl로 처리된 마우스에서 염증이 발생하지 않았고, AxCAwt 와 Axlwl의 구조 사이의 유일한 차이는 CAG 프로모터의 존재 또는 부재이기 때문에, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 의해 야기된 염증의 원인은 3)의 벡터내로 삽입된 CAG 프로모터에 의해 야기된다는 것을 밝혀내었다.
따라서, CAG 프로모터에 의해 발현이 유도되는 아데노바이러스 유전자, 즉 염증에 관련된 아데노바이러스 유전자를 확인하였다. E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 (△E2A-CAHGH) 또는 상기 (a) 내지 (c)의 3 가지 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (AxlCAHGH, AxCAwt, Axlwl)를 A549 세포 (인간 폐암 유래의 세포주) 또는 HepG2 세포 (인간 간암 유래 세포주)에 높은 moi (다중감염도)로 감염시키고, 24 시간 후에 발현된 아데노바이러스 유전자를 노던 블롯팅으로 분석하였다. 발현을 조사한 아데노바이러스 유전자는 하기 8 개의 유전자이다. 초기 유전자: E2A 유전자, E4 유전자; 주요 후기 프로모터 (MLP)의 조절하의 주요 후기 유전자: L1, L2, L3, L5; 지연 초기 유전자: 단백질 IX, IVa2. 목적 아데노바이러스, 즉 CAG 프로모터에 의해 발현이 유도되고, 염증에 관련된 아데노바이러스 유전자의 정의는, CAG 프로모터가 벡터내로 삽입되면, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Ax1CAHGH 및 AxCAwt)로 감염된 세포와 유사한 정도로 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 (△E2A-CAHGH)로 감염된 세포에서 발현되지만, 그의 발현이 CAG 프로모터가 삽입되지 않은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Axlwl)로 감염된 세포에서는 거의 유도되지 않는 유전자이다.
먼저, E2A 유전자의 발현을 조사한 후에, E2A 유전자가 △E2A-CAHGH로 감염된 세포에서는 거의 발현되지 않고, 다른 3 가지 제 1 세대 아데노바이러스 벡터로 감염된 세포에서는 CAG 프로모터의 존재와 무관하게 거의 동일한 정도로 유전자가 발현되는 것으로부터, 본 발명에 사용된 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터에서 E2A 유전자가 완전히 삭제된 것을 확인하였다. 동시에, E2A 유전자의 발현은 CAG 프로모터에 의해 유도되지 않는다는 것을 나타냈다. 또한, 다른 초기 유전자인 E4 유전자는 4 가지의 아데노바이러스 벡터로 감염된 모든 세포에서 거의 동일한 정도로 발현되었고, 이로 인해 또한 E4 유전자의 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되지 않는다는 것을 밝혀내었다.
다음으로, MLP에 의해 조절되는 주요 후기 유전자의 발현을 조사하였다. 주요 후기 유전자 중, L2, L3, 및 L5의 세 유전자의 발현이 HepG2 세포 중에서 △E2A-CAHGH로 감염된 세포 내에서만 감소되었으며, A549 세포에서는 △E2A-CAHGH로 감염된 세포 및 Axlwl로 감염된 세포에서의 발현은 명백히 감소하였다. 따라서, 상기한 단백질 수준뿐 아니라 유전자 수준에서도 "E2A 유전자가 주요 후기 유전자의 발현을 감소시킨다"는 통상의 가설이 확인되었지만, 이들 주요 후기 유전자의 발현이 CAG 프로모터에 의해서는 유도되지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, L1 유전자의 발현은 사용한 세포주에 따라 다양하였다. HepG2 세포에서의 L1 유전자의 발현은 △E2A-CAHGH 감염 세포에서만 감소되었고, CAG 프로모터에 의한 발현 유도는 전혀 관찰되지 않았다. 반면에, A549 세포에서의 L1 유전자의 발현은 Axlwl 감염 세포에서만 감소되었으며, CAG 프로모터에 의한 발현 유도가 관찰되었다.
마지막으로, 각각의 고유 프로모터를 가지는 두 유전자, 즉 IVa2 유전자 및 단백질 IX 유전자의 지연 초기 유전자의 발현을 조사하였다. IVa2 유전자의 발현 패턴은 L1 유전자에 대해 사용한 세포주와 상이하였다. 따라서, HepG2 세포에서, 4개의 아데노바이러스 벡터로 감염된 세포 모두가 거의 동일한 수준으로 IVa2 유전자를 발현하였으며, CAG 프로모터에 의한 발현 유도는 전혀 관찰되지 않았다. 반면, A549 세포에서는, IVa2 유전자의 발현은 Axlwl 감염 세포에서만 감소하며, CAG 프로모터에 의한 발현 유도는 관찰되지 않았다.
반면, 동일한 결과가 양 세포주에 의한 단백질 IX 유전자의 발현에 대해서 얻어졌으며, 단백질 IX 유전자는 △E2A-CAHGH-, AxlCAHGH- 및 AxCAwt 감염 세포에서 거의 동일한 정도로 발현되었지만, Axlwl 감염 세포에서는 거의 나타나지 않았다. 따라서, 단백질 IX 유전자에 대해서는, CAG 프로모터에 의한 발현 유도가 명백히 관찰되었다.
상기 결과로부터, CAG 프로모터에 의해 발현이 명백히 유도되는 아데노바이러스 유전자는 주로 단백질 IX 유전자임을 알 수 있다. 이는, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터가 생체내로 상에서 투여되었을 경우, 단백질 IX 유전자의 발현이 염증의 원인이 됨을 강력하게 나타낸다.
또한, 상기 결과로부터, 단백질 IVa2 유전자 및 L1 유전자의 발현은, 일부 세포에서 CAG 프로모터에 의해 유도됨을 알 수 있다. 단백질 IVa2 유전자는 독립된 프로모터를 소지하고 있으므로, 이는 CAG 프로모터에 의해 직접적으로 활성화 되는 것으로 추측된다. 그러나, L1 유전자는 주요 후기 유전자 중의 하나로서, L3 유전자 및 L5 유전자와 같은 다른 후기 유전자에 대해서도 공통적인 MLP에 의해 조절되어, CAG 프로모터에 의해 L1 유전자의 발현만이 유도될 것으로 기대하는 것은 불가능하다. 그러나, L2 내지 L5 유전자는 감염의 후기부에서만 발현되는 것으로 알려져 있는 반면, L1 유전자는 감염의 초기부에서도 또한 발현되는 것으로 알려져 있어 (Shaw A.R. 등 Cell, 22: 905-916 (1980)), L1 유전자의 발현이 CAG 프로모터에 의해서만 유도되는 이유는 초기 및 후기 단계에서의 유전자 발현 기작의 차이에 기초되는 것으로 생각된다. 또한, 단백질 IX 및 단백질 IVa2 모두는 MLP 활성화 작용을 가지는 것으로 보고되었으므로 (Lutz P. 등, J. Virol. 71: 5102-5109 (1979), Tribouley C. 등 J. Virol. 68: 4450-4457 (1994)), CAG 프로모터가 MLP를 직접적으로 활성화시키기 보다는 MLP는 단백질 IX 또는 단백질 IVa2를 통해 간접적으로 활성화되는 것으로 생각된다. 이들 단백질 IVa2 유전자 및 L1 유전자의 CAG 프로모터에 의한 발현의 정도는, 단백질 IX 유전자의 발현 유도에 비하면 미약하지만, 이들은 단백질 IX과 함께 추가로 작용함으로써 염증을 야기하는 것으로 보여진다.
다음으로, CAG 프로모터의 어느 성분이 단백질 IX 유전자를 포함한 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하는가를 조사하였다. CAG 프로모터는, CMV의 IE 인핸서, 병아리 β-액틴 프로모터, 스플라이스 수용자(acceptor), 및 토끼 β-글로빈의 폴리(A) 서열로 구성된다. 본 발명에 사용된 아데노바이러스 벡터에서, CAG 프로모터는 왼쪽을 향하여 (E1 전사의 역방향) E1 유전자 (1.3 - 9.2 m.u.)의 삭제부위에 삽입되며, 삽입된 CAG 프로모터의 방향은 오른쪽으로 전사되는 단백질 IX 유 전자 (9.7 - 11.2 m.u.) 방향의 반대이다. 따라서, 단백질 IX 유전자의 발현을 유도하는 것은 β-액틴 프로모터가 아니라 CMV의 IE 인핸서인 것으로 보여진다. 따라서, CAG 프로모터에 대한 유일한 공통성분인 IE 인핸서 부분을 포함하는 CMV 프로모터가 삽입된 아데노바이러스 벡터 (AdCMVlacZ)를 사용함으로써, 단백질 IX 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과, AdCMVlacZ 감염 A549 세포에서, 단백질 IX 유전자는, CAG 프로모터만이 삽입된 AxCAwt 감염 세포와 거의 유사한 수준으로 발현된다. 따라서, CMV IE 인핸서 (CMV 인핸서)는 단백질 IX 유전자를 포함하는 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하는 것으로 확인하였다.
이러한 결과의 추가 확인을 위해, CMV 인핸서를 전혀 포함하지 않은 프로모터인 EF-1α프로모터가 삽입된 아데노바이러스 벡터 (AxEFlacZ-L)를 사용하여, 단백질 IX의 발현을 조사하였고, AxEFlacZ-L 감염 세포에서는, 단백질 IX 유전자가 전혀 발현되지 않음을 발견하였다. 또한, 양성 대조군으로서 CAG 프로모터와 lacZ 유전자를 삽입한 아데노바이러스 벡터 (AxCAlacZ-L)를 사용하여, 아데노바이러스 벡터를 정맥내로 투여한 마우스의 혈청 GPT 양을 측정함으로써 AdCMVlacZ 및 AxEFlacZ-L에 의해 유도된 염증 정도를 비교하였다. 그 결과, AdCMVlacZ 처리 마우스 내의 혈청 GPT 양은 AxCAlacZ-L 처리한 마우스의 것과 동일하거나 그 이상으로 증가되지만, AxEFlacZ-L 처리 마우스의 혈청내 GPT 양은 아주 소폭 증가된다. 따라서, CMV 인핸서를 포함하지 않은 EF-1α 프로모터는 단백질 IX의 발현을 유도하지 않으며, 단백질 IX의 발현을 유도하지 않는 아데노바이러스에서는 염증이 발생하지 않음이 확인되었다.
상기 일련의 결과를 종합하면, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 의해 유도되는 염증은 CMV 인핸서에 의한 아데노바이러스 유전자의 발현의 유도에 의한 것이라는 종래에 알려지지않은 새로운 매우 중요한 기작이 본 발명자들에 의해 발견된 것이다.
CMV 프로모터와 같은 CMV 인핸서를 포함하는 프로모터는, 이들의 높은 프로모터 활성 덕분에 현재 임상 연구상의 각종 아데노바이러스 벡터에 사용된다. 이들의 예는 하기를 포함한다: CMV 프로모터 그 자체를 사용하는 벡터: 종양 억제 유전자, p53 발현 아데노바이러스 벡터 (Clayman G.L. 등 J. Clin. Oncol. 16, 2221-2232 (1998)) 및 Swisher S.G. la J. Natl. Cancer Inst. 91: 763-771 (1999)), 인터루킨-2 발현 아데노바이러스 벡터 (Stewart A.K. 등 Gene Ther. 6, 350-363 (1999)), 혈관 내피 성장 인자 VEGF121 발현 아데노바이러스 벡터 (Rosengart T.K. 등, Circulation, 100, 468-474 (1999)); CMV IE 인핸서를 포함하는 하이브리드 프로모터를 사용하는 아데노바이러스 벡터의 예는, 시스틱 파이브로시스 트랜스멤브레인 컨덕턴스 조절 단백질 (CFTR) 발현 아데노바이러스 벡터 (Knowles M.R. 등, N. Eng. J. Med. 333, 823-831 (1995)), 및 Zuckerman J.B. 등, Hum. Gene Ther. 10, 2973-2985 (1999)).
따라서, 외래 프로모터가 염증을 일으키는 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도한다는 본 발명자들에 의한 발견은, CAG 프로모터를 가지는 재조합 아데노바이러스 벡터에만 국한되는 것이 아니라, 현재 임상 연구되는 다른 많은 아데노바이러스 벡터에 적용할 수 있는 공통적인 현상이다. 따라서, 이러한 발견에 기초하여, 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도하지 않도록 변형된 아데노바이러스 벡터는, 투여 이후 감염을 경감시키고, 따라서 치료용 유전자의 지속적 발현을 도모할 것으로 기대되어, 현실적으로 매우 소중한 가치를 가진다.
또한, 외래 유전자가 아데노바이러스 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 본 발명의 발견은, CMV IE 인핸서뿐만 아니라 다른 바이러스 프로모터를 가지는 아데노바이러스 벡터에도 응용 가능하다. 이러한 프로모터의 예는, RSV 프로모터, SV40 초기 유전자 인핸서를 포함하는 프로모터, 또는 SRα 프로모터 등을 포함한다.
이어서, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 예로 하여, 본 발명을 실시하는 방법을 구체적으로 설명한다.
먼저, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 구축 방법을 설명한다. 단백질 IX 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 위치는 참고문헌에 기재된 바와 같다 (Maat J. 등, Gene 10, 27-38 (1980)). 재위치된 단백질 IX 유전자를 제조하는 방법은 특별히 제한 되는 것은 아니며, 단백질 IX 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 코스미드로부터 제한효소 절단에 의해 잘라질 수 있지만 (Miyake S. 등, P.N.A.S. USA 93: 1320-1324 (1996)), 뒤이은 구축의 편의를 위해서는, 증폭을 위해 PCR 방법을 바람직하게는 사용한다. 증폭되는 단백질 IX 유전자의 영역은 코딩 서열 뿐 아니라, 단백질 IX 유전자의 5'-비번역 영역 및 3'-비번역 영역을 바람직하게 포함한다. 5'-비번역 영역은 단백질 IX 유전자의 프로모터 영역을 포함하며, 이들의 예로써 5형 아데노바이러스의 제 3525 이후의 위치의 서열을 바람직하게 포 함하며, 보다 바람직하게는 제 3213 이후의 위치의 서열을 포함한다. 3'-비번역 영역의 범위는, 단백질 IX 유전자의 종결 코돈에 대한 염기 서열을 함유하는 한 특별히 제한되지 않으며, 종결 코돈 바로 직후에 다른 유전자의 폴리(A) 서열을 첨가할 수 있으며, 또는 단백질 IX 유전자의 본래 폴리(A) 서열을 사용할 수 있다. 후자의 예로, 그것은 바람직하게는 폴리아데닐화 시그날 및 폴리(A)가 실제로 첨가되는 부위를 포함하는 제 4070 위치 까지의 염기 서열을 바람직하게는 제 4076 위치 까지의 염기서열을 함유한다. PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열은, 상기에서 언급한 영역 내의 단백질 IX 유전자를 증폭할 수 있는 서열인 한 특별히 제한되지 않으나, 플라스미드내로 증폭 이후의 단백질 IX 유전자를 포함하는 DNA 단편의 클로닝을 촉진하기 위해 적절한 제한 효소의 인식 서열을 바람직하게는 포함한다.
PCR 증폭 단백질 IX 유전자를 포함하는 DNA 단편은 아데노바이러스 게놈 내의 목적 부위내로 바로 삽입될 수 있으나, PCR 반응 동안의 뉴클레오티드 서열의 돌연변이의 부존재를 확인하기 위해서는 증폭된 단편을 적절한 플라스미드 등에 먼저 클로닝하고, 이후 뉴클레오티드 서열의 사용을 위한 준비를 바람직하게는 확인한다. 증폭 단편이 클로닝되는 플라스미드는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예로써는 pUC19 등을 언급할 수 있다.
단백질 IX 유전자가 재위치되는 부위로서, L3 유전자 및 E2A 유전자 사이의 부위, E3 유전자의 삭제 부위 등을 언급할 수 있지만, 보다 바람직한 예로, E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이에 재위치화시키는 방법을 하기에 기재한다. 단백질 IX 유전자가 상기 부위에 재위치화된 아데노바이러스 벡터의 구축 방법으로 서, 한단계로 목적하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해서, 단백질 IX 유전자를 본래의 위치 (9.7 - 11.2 m.u.)로부터 삭제시키고, E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이에 삽입된 구조를 가지는 아데노바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드 또는 코스미드 벡터로 293 세포와 같은 세포주를 형질전환할 수 있다. 그러나, 또 다른 방법으로, 단백질 IX를 본래의 위치에서 유지되며, 또한 단백질 IX 유전자가 E4 유전자의 상류 영역과 3'-말단 ITR 사이에 삽입된 재조합 아데노바이러스를 먼저 구축하고, 다음으로 단백질 IX 유전자를 본래의 위치에서 삭제시키고, 단백질 IX 유전자를 재위치화시킨 아데노바이러스를 구축하는 두단계 방법도 또한 가능하다. 후자의 방법은 많은 단계가 포함되나, 목적하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 확실히 얻을 수 있어 바람직한 방법이며, 상기 두단계로 이루어진 구축방법을 하기에 상술한다. 하기에 기술한 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축방법은, 293 세포 등을 말단 단백질-아데노바이러스 DNA 복합체 (DNA-TPC)의 제한효소 절단에 의해 수득된 DNA 및 아데노바이러스 게놈의 대부분을 포함하는 코스미드 벡터로 형질전환하고, 이어서 목적하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 코스미드 벡터 및 아데노바이러스 DNA-TPC 간의 상동 재조합에 의해 수득할 수 있으며, 이들의 원리 및 방법은 현존 참조 문헌 (Miyake S. 등, P.N.A.S. USA 93, 1320-1324 (1996)), 및 특허 (일본 특허 공보 제 7-298877호) 에 개시되어 있다.
코스미드 벡터 pAx4w는, 5형 아데노바이러스 게놈의 2.6 - 98.0 m.u. (E3 유전자는 삭제됨)과 2형 아데노바이러스의 98.0 - 100 m.u.를 포함하며, E4 유전자 프로모터의 상류 영역과 3'-말단 ITR (99.3 m.u.) 사이에 클로닝 부위로서 제한 효 소 SwaI 부위를 가지는 벡터이다 (Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996), 이 문헌에서는 pAx4w가 pAdex4W로 기재되어 있음). pAx4w의 SwaI 부위에, 상기한 PCR 방법에 의해 제조된 단백질 IX의 유전자를 삽입하여 코스미드 벡터 pAx4pIX를 수득한다. 한편, 재조합 아데노바이러스 벡터 Adex4SRlacZL 은, 5형 아데노바이러스 유래의 복제 결함 아데노바이러스 벡터 (E1A, E1B, E3 유전자는 삭제됨) 로서, 이는 pAx4w와 같이 99.3 m.u.의 동일한 위치에 E.coli lacZ 유전자의 발현단위가 삽입된 것이다. 게놈의 오른쪽 절반을 수회 절단시키는 제한효소 AseI 및 EcoRI을 이용한 절단에 의해, 상기 Adex4SRlacZL로부터 제조된 아데노바이러스 게놈 DNA에서 수득한 DNA-TPC 및 코스미드 벡터 pAx4pIX로, 293 세포를 형질전환시켜, Adex4SRlacZL의 E.coli lacZ 유전자의 발현 단위가 단백질 IX 유전자로 대치된 재조합 아데노바이러스 벡터 Ax4pIX를 제조할 수 있다. Ax4pIX는, 두 위치 (본래의 단백질 IX 유전자 위치, 및 E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이)에 단백질 IX 유전자를 가지는 재조합 아데노바이러스 벡터이다.
이어서, 단백질 IX 유전자의 원위치에서 삭제될 핵산 서열의 범위에 대해 설명한다.
단백질 IX 유전자는 오른쪽 방향으로 전사되는 반면, 단백질 IX 유전자의 3'-비번역 영역은, 왼쪽으로 전사되는 E2B 유전자 및 IVa2 유전자의 3'-비번역 영역과 일부 중첩되어, 따라서 단백질 IX 유전자의 삭제 범위는, IVa2 유전자 및 E2B 유전자의 기능에 영향을 주지 않는 영역이어야만 한다. IVa2 유전자 및 E2B 유전자의 폴리아데닐화 부위는, 일례로 5형 아데노바이러스에서 제 4060 위치의 염기인 것으로 보여지며, 따라서, 삭제 범위는 이들의 더 왼쪽이어야한다. 삭제 범위는, 이러한 조건이 충족되고, 단백질 IX이 발현되지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 일례로, 5형 아데노바이러스에서 PvuII 부위 (Ad5: 452-457) 내지 AlwNI 부위 (Ad5: 4048-4056) 사이의 삭제를 언급할 수 있다. 상기 영역의 염기를 삭제한 아데노바이러스 게놈을 포함하는 벡터는, 코스미드 벡터 pAxcw 로부터 용이하게 구축할 수 있다 (일본 공개 특허 공보 제 8-308585호, 15면, pAdexlcw 는 pAxcw와 동일). pAxcw는, E1 유전자가 삭제된 (△454-3328) 5형 아데노바이러스 게놈의 대부분을 포함하는 코스미드 벡터이며, 출발 물질을 pAxcw로 하여 다단계를 포함하는 구축에 의해, PvuII 부위부터 AlwNI 부위까지가 삭제된 아데노바이러스 게놈을 포함하는 pAx△pIXcw 코스미드 벡터를 수득할 수 있다. pAx△pIXcw는, E1A, E1B 및 단백질 IX 유전자 삭제 벡터로 (△454-4053), 삭제 부위에는 외래 유전자의 클로닝 부위 (ClaI 및 SwaI 부위)가 삽입된다.
게놈의 왼쪽에 다수의 인식 부위를 가지는 제한 효소 EcoT22I로 상기한 아데노바이러스 Ax4pIX로부터 제조된 게놈 DNA를 절단하여 수득된 DNA-TPC와, 상기한 코스미드 벡터 pAx△pIXcw로 293 세포를 형질 전환함으로써, 단백질 IX 유전자가 재위치화된 목적 재조합 아데노바이러스 벡터 AxRpIXcw를 수득할 수 있다. AxRpIXcw 내에 프로모터와 같은 외래 유전자가 삽입되지 않을지라도, 임의의 외래 유전자가 삽입된 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터가, 코스미드 벡터 pAx△pIXcw의 ClaI 부위 또는 SwaI 부위내로 외래 유전자가 삽입된 코스미드 벡터와, AxRpIXcw의 게놈 DNA를 EcoT22I로 절단하여 수득된 DNA-TPC 간의 상동 재조합에 의 해 쉽게 수득할 수 있다. 또한, 임의의 외래 유전자가 삽입된 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터는, 코스미드 벡터 pAx△pIXcw 의 SwaI 부위 또는 Cla I 부위내로 외래 유전자가 삽입된 코스미드 벡터와, Ax4pIX의 게놈 DNA를 EcoT22I로 절단하여 수득한 DNA-TPC 간의 상동 재조합에 의해서도 또한 수득할 수 있다.
상기에서, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 구축방법을 5형 아데노바이러스를 예로 하여 설명하였다. 재위치화된 단백질 IX 유전자는, 동일한 혈청형 아데노바이러스 유래의 유전자만을 사용할 필요가 없으며, 다른 혈청형의 단백질 IX 유전자는 상기 아데노바이러스의 복제 주기에서 단백질이 충분히 기능하는한 사용할 수 있다. 예로써, 5형의 기본 골격에 2형 단백질 IX 유전자가 재위치화된 벡터, 또는 반대로 2형의 기본 골격에 5형의 단백질 IX 유전자가 재위치화된 벡터를 언급할 수 있다.
이어서, 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축방법에 대해 설명한다. 상기 벡터를 구축하기 위해서는, 단백질 IX 발현 세포주가 필요하며, 따라서 상기한 단백질 IX 발현 세포주의 구축 방법을 설명한다. 세포 내로 도입되는 단백질 IX 유전자의 범위는, 단백질 IX의 코딩 영역을 포함하는 한, 특별히 제한되지는 않는다. 단백질 IX의 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편을, 제한 효소 절단에 의해 상기 유전자를 포함하는 플라스미드 등으로부터 잘라낼 수 있고, 또는 PCR 방법에 의해 제조 가능하다. 단백질 IX의 발현을 위한 프로모터는, 특별히 제한되는 것은 아니며, 동물 세포에서 항시적으로 기능하는 프로모터를 사용할 수 있으며, 또한 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 단백질 IX 유전자의 본래의 프로모터도 사용할 수 있다. 단백질 IX를 발현하는 세포주는, 단백질 IX 유전자의 발현 단위를 포함하는 플라스미드로 임의의 세포를 형질 전환시킴으로써 수득할 수 있다. 그러나, 상기 세포주의 구축을 위해 사용되는 세포는, 바람직하게는 아데노바이러스 E1 유전자 발현 세포로 상기 세포는 E1 유전자가 삭제된 제 1 세대 아데노바이러스 벡터를 효과적으로 생산할 수 있다. 이러한 세포의 예는 293 세포를 포함한다. 또한, 벡터 게놈 및 세포 내 게놈 간의 상동성 재조합에 의한 재조합 컴피턴트 아데노바이러스 (RCA)의 생성을 방지하기 위해, E1 유전자를 위해 요구되는 최소의 영역만이 도입된 세포주가, 단백질 IX 발현 세포주의 구축을 위해 바람직하게 사용된다. 또한, 목적하는 세포주는, E1 유전자를 발현하지 않는 세포주로부터 단백질 IX 발현 세포주를 먼저 구축하고, 이어서 상기 세포주를 E1 유전자로 형질전환함으로써 또한 수득된다. 세포의 형질 전환과 목적 세포주의 선택 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 위해 단백질 IX를 충분한 양으로 공급하는 임의의 세포주를 사용할 수 있다.
다음으로, 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축방법을 더욱 구체적으로 설명한다. 단백질 IX 유전자의 삭제 영역은, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터에 대해 기재된 바와 같이, IVa2 유전자 및 E2B 유전자의 기능에 영향을 끼치지 않으며 단백질 IX 의 발현을 허용하지 않는 임의의 영역이면 가능하다. 이들의 예는, 상기한 바와 같은 PvuII 부위 (Ad5: 452-457) 내지 AlwNI 부위 (Ad5: 4048-4056)의 삭제를 포함한다. 상기한 코스미드 벡터 pAx△pIXcw는, 상기한 영역의 아데노바이러스 게놈의 삭제에 대응하는 벡터이다. 상기한 단백질 IX 발현 세 포주를, AxCAwt 또는 Axlwl과 같은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 게놈 DNA를 EcoT22I와 같은 제한효소로 절단하여 수득한 DNA-TPC 및 상기 pAx△pIXcw로 형질전환함으로써, 목적하는 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터를 수득한다. 프로모터와 같은 외래 유전자는 이로써 구축된 상기 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터 Ax△pIXcw내에 삽입되지 않는다. 그러나, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 경우와 유사하게, 임의의 외래 유전자가 삽입된 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터는, Ax△pIXcw의 게놈 DNA를 EcoT22I 등으로 절단하여 수득한 DNA-TPC와, 코스미드 벡터 pAx△pIXcw의 SwaI 부위 또는 ClaI 부위내로 외래 유전자가 삽입된 코스미드 벡터간의 상동성 재조합에 의해 용이하게 수득 가능하다. 선택적으로, 임의의 외래 유전자가 삽입된 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터는, AxCAwt 및 Axlwl과 같은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 게놈 DNA를 EcoT22I로 절단하여 수득한 DNA-TPC와, 코스미드 벡터 pAx△pIXcw의 SwaI 부위 또는 ClaI 부위내로 외래 유전자가 삽입된 코스미드 벡터 간의 상동성 재조합에 의해 또한 수득할 수 있다.
상기에서, 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 단백질 IX 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축방법을 5형 아데노바이러스를 예로 하여 설명하였다. 그러나, 본 발명은 5형 아데노바이러스에 국한되는 것은 아니며, 2형 아데노바이러스를 포함한 다른 혈청형의 아데노바이러스의 골격을 가진 임의의 아데노바이러스 벡터에도 적용할 수 있다.
이어서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물 및 염증이 경감된 유전자 치료법을 설명한다. 상기에서 수득한 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 인간에게 투여할 경우, 염증이 경감된 매우 안전한 벡터이고, 약학 조성물의 활성 성분으로서 다양한 질병의 유전자 치료법에 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 약학 조성물로서 사용하는 경우, 치료할 질병, 표적 기관 등에 따라 적절하게 생체내 또는 생체외 방법을 선택할 수 있다. 본원에서 사용된, 생체내 방법은 유전자 치료용 약학 조성물을 환자의 신체 내로 바로 투여하는 방법이며, 생체외 방법은 환자로부터 특정한 세포를 적출하여 상기 약학 조성물을 상기 세포에 생체외 도입하고, 이어서 상기 세포를 환자의 신체로 돌려놓는 방법이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터에서, 생체내 투여 경로는 특별히 제한되는 것은 아니며, 정맥내, 동맥내, 피하, 피층 또는 근육내로, 간, 폐, 신장, 뇌 등의 대상 기관에 투여 가능하다. 생체내 투여를 위한 투약 형태 또한 특히 제한되는 것은 아니며, 일례로 주사제를 사용하는 경우, 상기 주사제는 표준의 방법에 의해 제조한다. 즉, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 적절한 용매 (PBS와 같은 완충액, 생리 식염수, 무균수 등)에 살균 용해시킨 후, 제조를 위해 무균 용기에 충전할 수 있다. 필요한 경우에는 통상적으로 사용되는 담체를 상기한 약학 제재에 첨가할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터를 생체외 방법으로 사용할 경우, 사용하는 세포가 특히 제한되는 것은 아니며, 환자 유래의 각종 암세포, 림프구와 같은 백혈 구 등과 같은 원하는 용도에 맞는 임의의 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은, 치료할 질병, 환자의 연령 및 체중 등에 따라 적절히 준비한다. 본 발명 재조합 아데노바이러스 벡터를 일반적으로 약 106 내지 1014 (PFU), 바람직하게는 약 108 내지 1012 (PFU)의 일회 투여량으로 투약할 수 있고, 또는 수일간 연속하여 또는 약 1개월에 한번 투약할 수 있다.
현재 임상 연구되고 있는 아데노바이러스 벡터로서는, 상기한 바와 같은 종양 억제 유전자 p53 발현 벡터, 인터루킨-2 발현 벡터, 혈관내피 성장인자 (VEGF) 121 발현 벡터, 시스틱 파이브로시스 트랜스멤브레인 컨덕턴스 조절 단백질 (cystic fibrosis transmambrane conductance regulatory protein, CFTR) 발현 벡터 등이 알려져 있다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스 백터는 종래의 아데노바이러스 벡터의 이용으로 인한 염증이 경감된 벡터로서 종래의 아데노바이러스 벡터 대신 사용될 수 있다.
일례로, 종양 억제 유전자 p53 발현 벡터를 이용한 임상 연구의 방법 등은, 참고 문헌 (Roth J.A. 등, Hum. Gene Ther. 7, 1013-1030, (1996))에 기재되어 있으며, 따라서 상기 방법에 따른 본 발명의 유전자 치료법을 실시할 수 있다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는, 인간 유전자 치료를 위한 약물로서뿐만 아니라, 동물에서의 유전자 전달 벡터로도 사용할 수 있다. 이러한 방법은 생체내 또는 생체외 방법과 같은 인간용 유전자 치료로서 상기한 방법에 따라 실시할 수 있다.
또한, 수많은 기존의 공지 문헌 및 하기의 실시예를 참조할 수 있다. 염증이 경감되는 벡터로서의 본 발명 아데노바이러스 벡터의 특성은, 질병의 동물 모델, 인간 질병의 치료 모델의 생성, 유전자의 기능 분석 등과 같은 다양한 목적에서 염증과 같이 벡터에서 유래되는 부작용에 대해 염려할 필요가 없기 때문에, 동물에 사용 시에 조차도 전통적인 아데노바이러스 벡터와 비교하여 상당한 이점을 갖는다.
본 발명을, 실시예를 참조로하여 하기에서 더욱 상세히 설명하나, 어떤 식으로도 본 발명이 제한되지는 않으며, 당업계 통상의 본 발명의 변형이 가능하다. 실시예에서 파지, 플라스미드, DNA, 각종 효소, E.coli, 배양 세포 등을 다루는 방법은, 달리 언급되지 않는 한, 하기 문헌에 기재된 방법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis 등, 2판, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory)에 의해 실시한다.
본 발명의 실시예에서 사용한 코스미드 벡터 pAxCAwt (Kanegae Y. 등, Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821 (1995) 및 pAxcw (일본 공개 특허 공보 8-30858858호, 15면, pAdexlcw는 pAxcw과 동일)는 아데노바이러스 El 및 E3 유전자 이외의 5형 아데노바이러스 게놈의 대부분을 함유한 벡터이다. 또한, pAxCAwt는 CAG 프로모터가 E1 유전자 삭제 부위에 도입된 것이고 (Niwa H. 등, Gene 108: 193-200 (1991), 및 일본 특허 제 2824434호), 프로모터 및 폴리(A) 서열 사이에 클로닝 부위를 가진다. pAxcw는 E1 유전자 삭제 부위에 ClaI 부위 및 SwaI 부위만이 삽입된 것이다. 이들 코스미드 벡터 및 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합 체에 의한 293 세포 (ATCC CRL-1573)의 형질전환 및 상동 재조합에 의한 재조합 아데노바이러스 벡터 구축의 방법은 (COS/TPC 법), 공지 문헌 (Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996)) 및 특허 (일본 공개 특허 공보 제 7-298877호)) 에 따라 수행된다. 또한, 초원심분리를 이용한 아데노바이러스 벡터의 정제방법 (Kanegae Y. 등., Jpn. J. Med. Sci. Biol. 47: 157-166 (1994))과 293 세포를 이용한 한계 희석에 의한 바이러스 적가의 측정 방법(일본 공개 특허 공보 제 7-298877호)도 또한 다른 지적이 없는 한 공지의 방법에 따라 실시한다.
실시예 1
인간 성장 호르몬 발현 아데노바이러스 벡터의 구축
(1) 인간 성장 호르몬 cDNA의 클로닝
PCR 방법에 의해 인간 성장 호르몬 cDNA를 클로닝하기 위해 하기의 절차를 실시하였다.
파지 DNA를 시판되는 인간 뇌하수체 아데노마 유래의 cDNA 라이브러리 (CLONTECH)로부터 제조하고, 이를 PCR용 주형 DNA로 사용하였다. PCR용 프라이머는 양 말단에 제한 효소 인식부위가 첨가되도록, 즉 5'-말단의 프라이머는 개시 코돈 및 NheI 인식 부위를 포함하도록 하고, 3'-말단 프라이머는 종결 코돈 및 SphI 인식 부위를 포함하도록 고안하였다. 각 프라이머의 서열을 하기에 나타내었다:
5'-말단 프라이머 5-TGGCTAGCTCACCTAGCGGCAATGGCT-3’
NheI Met
(SEQ ID NO: 1)
3'-말단 프라이머 5-CAGGCATGCCACCCGGGCAGCTAGAA-3’
SphI 종결
(SEQ ID NO: 2)
상기한 cDNA-라이브러리 유래의 DNA를 주형으로서 사용하고, 폴리머라제 pfu (Takara Shuzo)를 표준 PCR 반응에 사용하여, hGH cDNA를 포함하는 약 700 bp의 증폭 단편을 수득하였다. Klenow 효소로 증폭된 단편을 블런트-말단화한 후, 이를 플라스미드 pUC19의 HincII 부위에 삽입시켜 플라스미드 pUCHGH (3.4 kb)를 수득하였다. pUCHGH 의 cDNA 부분을 서열분석한 결과, 참고문헌에 게재된 서열(Chen E.Y. 등., Genomics 4: 479-497 (1989))과 동일한 것으로 판명되었다.
(2) 인간 성장 호르몬 발현 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축
pUCHGH을 NheI 및 BglI로 절단한 후, 블런트-말단화시켜 hGH cDNA의 코딩 영역을 포함하는 약 0.7 kb DNA 단편을 수득하였다. cDNA 단편을, 코스미드 벡터 pAxCAwt의 프로모터 및 폴리(A) 서열 사이의 SwaI 부위에 삽입하여, 코스미드 pAx1CAHGH를 수득하였다.
코스미드 pAx1CAHGH 내로 hGH의 발현 단위가 정확하게 혼입된 것을 확인하기 위해, pAx1CAHGH로부터 hGH의 발현 단위를 함유하는 플라스미드를 구축하고, hGH 단백질이 COS7 세포(원숭이 신장-유래의 세포주)에서 일시적으로 발현되도록 하였 다. 따라서, pAx1CAHGH는 NruI로 절단된 이후 셀프라이게이션(self-ligation)되어, 아데노바이러스 DNA의 대부분이 제거된 (좌측 말단에 약 0.4 kb 포함) hGH 발현 플라스미드 Px1CAHGH를 수득하였다. 이후 COS7 세포를 DEAE-덱스트란법에 의해 Px1CAHGH로 형질감염시키고, 2 일 후, 조절된 배지 내의 hGH 농도를 ELISA 법으로 측정하였다 (Picoia™ HGH plate: Sumitomo Pharmaceuticals). 플라스미드가 도입되지 않은 COS7 세포의 조절 배지 내의 hGH 농도는 검출 한계 이하이나, 1 ng/ml 이상의 hGH 가 Px1CAHGH로 형질 전환된 COS7 세포의 조절화된 배지으로부터 검출되었다. 이러한 결과는, 코스미드 pAx1CAHGH 내로 hGH의 발현 단위가 정확하게 삽입된 것을 나타낸다.
마지막으로, 상기한 COS/TPC 방법에 의해, 293 세포를 코스미드 pAx1CAHGH 및 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체로 형질 전환하여, hGH 발현 재조합 아데노바이러스 Ax1CAHGH (도 1, E1 유전자 및 E3 유전자 삭제)를 수득하였다.
실시예 2
hGH를 발현하는 E2A 유전자 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축
(1) E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축용 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축
코스미드 벡터 pAx2LD3LCAwt (일본 공개특허 공보 제 8-308585호의 19 면의 pAdex2LD3LCAwt는 pAx2LD3LCAwt와 동일)는 상기한 코스미드 벡터 pAxCAwt의 유도체이다. pAx2LD3LCAwt는, loxP 부위가 아데노바이러스 L3 유전자 및 E2A 유전자 사이 (61.5 맵 단위) 및 E3 유전자의 삭제 부위 (78.0 맵 단위)에 삽입된 코스미드로 써, loxP 삽입 부위 이외의 뉴클레오티드 서열은 pAxCAwt와 동일하였다.
실시예 1에서 구축된 플라스미드 pUCHGH를 NheI 및 BglI로 절단한 후, 블런트-말단화시켜 hGH cDNA의 코딩 영역을 포함하는 약 0.7 kb의 DNA 단편을 수득하였다. DNA 단편을, 코스미드 벡터 pAx2LD3LCAwt의 프로모터 및 폴리(A) 서열 사이의 SwaI 부위에 삽입하여, 코스미드 pAx2LD3LCAHGH를 수득하였다.
아데노바이러스 벡터 Adex2LD3LCANLacZ (도 1, 일본 공개 특허 공보 제8-308585호, 21 면)는, 코스미드 벡터 pAx2LD3LCAwt와 동일한 위치에 두 개의 loxP 부위가 삽입되고, Escherichia coli의 β-갈락토시다아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터이었다.
Adex2LD3LCANLacZ의 삽입된 유전자가 lacZ 부터 hGH 까지 대체된 재조합 아데노바이러스의 구축을 위해, 하기의 절차를 공지의 방법(일본 공개특허 공보 제 7-298877호)에 따라 실시하였다.
먼저, Adex2LD3LCANLacZ로부터 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 제조하고 이를 EcoT22I로 절단하였다. 293 세포를 DNA-말단 단백질 복합체와 코스미드 pAx2LD3LCAHGH 로 형질감염시켜 hGH 발현 단위와 두 개의 loxP 부위를 갖는 재조합 아데노바이러스 Ax2LD3LCAHGH를 수득하였다 (도 1). 이러한 Ax2LD3LCAHGH는, loxP 삽입 부위 이외의 구조에서는 실시예 1에서 제작된 아데노바이러스 벡터 AxlCAHGH와 동일하며, 발현단위 이외의 구조에 있어서는 아데노바이러스 벡터 Adex2LD3LCANLacZ와 동일하였다.
(2) E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축
두 개의 loxP 부위에 의해 인접한 E2A 유전자 및 L4 유전자가 재조합효소 Cre의 작용에 의해 아데노바이러스 벡터 Ax2LD3LCAHGH로부터 삭제된 재조합 아데노바이러스 벡터 (E2A 삭제 아데노바이러스 벡터)를 구축하기 위해 하기 방법을 실시하였다.
먼저, 아데노바이러스 벡터 Ax2LD3LCAHGH 및 재조합효소 Cre 발현 아데노바이러스 벡터 AxCANCre (도 1, Kanegae Y. 등., Nucleic Acids Res.23: 3816-3821 (1995))를 초원심분리법 (상기)으로 정제하고, 각 바이러스의 적가를 293 세포를 이용한 한계 희석법 (상기)에 의해 측정하였다.
이후, 콜라겐 코팅된 225 ㎠ 배양 플라스크 내에 거의 군집한 293 세포에, 3.0 ×107 PFU/㎖ 의 Ax2LD3LCAHGH (moi 2) 및 1.5 x107 PFU/㎖ 의 AxCANCre (moi 1)를 함유한 4 ㎖의 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 5% FCS 함유: DMEM)를 첨가하여, 두 바이러스 모두를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 감염시켰다. 감염 이후, 5% FCS를 함유한 21㎖의 DMEM 배지를 첨가하고, 37℃에서 5% CO2의 존재하에 배양하였다. 이틀 후, 플라스크 바닥에 부착된 세포를 세포 스크래퍼로 긁어, 조절화된 배지를 함유한 세포 현탁액을 50 ㎖ 원심분리 튜브에 넣고, 4℃에서 5 분 동안 2500 rpm (1130 x g) 으로 원심분리하고, 상청액을 제거한 다음, 세포 부분을 -80℃에서 동결 보관하였다.
(3) E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 정제
hGH를 발현하며 E2A가 삭제된 목적 아데노바이러스 벡터 (△E2A-CAHGH: 28.1 kb)는 상기의 Ax2LD3LCAHGH 및 AxCANCre으로 동시 감염시킨 293 세포에서 생산될지라도, Ax2LD3LCAHGH (34.4 kb) 및 AxCANCre (34.7 kb)도 또한 존재하여, 따라서 이들 세 가지 바이러스는 혼합물로 존재한다 (괄호 내의 숫자는 각 바이러스의 게놈 크기를 나타냄). 따라서, 바이러스의 비중 차이에 따라 △E2A-CAHGH를 분리하기 위해서는, 하기의 세슘 클로라이드 (CsCl) 밀도 구배 초원심분리를 실시하여 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터를 정제하였다. 정제에 사용되는 CsCl 용액은, 모두 50 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)에서 제조되며, 원심분리 및 초원심분리는 4℃에서 실시하였다.
1) -80℃에서 동결 저장되었던 △E2A-CAHGH를 함유한 293 세포의 세포 분획을 녹여, 8 개의 225 ㎠ 배양 플라스크에서 세포당 25 ㎖의 50 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)에 현탁시켰다. 이후, 세포 현탁액을 200 ㎖ 초음파 파쇄 컵에 넣고 폐쇄형의 초음파 파쇄기 (Cosmo Bio, model UCD-200T)로 초음파 파쇄하였다 (200 W, 3 분 (30초 ×6회) 4℃). 세포 균질화물을 30㎖ 원심분리기 튜브로 옮기고, 10분간 10,000 rpm (11,850 x g) 로 원심 분리하였다. 원심분리 이후의 상청액에 대해 3 단계 초원심분리하였다.
2) 세포 균질물 내의 아데노바이러스를 농축하기 위해, 비중 1.43의 8 ㎖의 CsC1 용액을 Beckmann swing rotor SW28용 초원심분리 튜브에 옮기고, 상기 1)에서 준비한 상청액 약 25㎖를 첨가한 다음, 약 1.5시간 동안 23,000 rpm (95,400 x g)으로 초원심분리하였다. 원심 분리 이후, 수상과 CsCl 상의 경계면 부근에서 아데노바이러스를 함유하는 밴드를 회수하였다 (튜브당 약 2.5㎖). 그리고, 회수한 바 이러스 용액과 동량인 포화 CsCl 용액을 첨가하였다.
3) Beckmann swing rotor SW41용 초원심분리기 튜브에, 하기 용액으로 바닥부터 순차적으로 쌓아 올렸다. 상기 2)에서 제조한 바이러스 용액 (약 5㎖)/1.32 비중의 CsCl 용액 (4.5㎖)/1.25 비중의 CsCl 용액 (2.5 ㎖). 이를 세 시간 동안 35,000 rpm (210,000 x g)에서 초원심분리한다. 이러한 초원심분리에 의해 1.25 및 1.32 비중의 CsCl 용액의 경계면 부근에서 단백질이 폭넓은 밴드를 형성하었고, 바이러스는 1.32 비중의 CsCl 용액의 중심 부근에서 좁은 밴드를 형성하였고, 바이러스 밴드를 회수하고 (튜브 당 약 1.5㎖), 회수된 바이러스 용액과 동량으로 1.36 비중의 CsCl 용액을 그것에 첨가하였다.
4) SW41 초원심분리 튜브에, 약 2㎖의 3)에서 제조한 바이러스 용액과 비중 1.34의 CsCl 용액 10㎖를 첨가하고, 잘 혼합하여 약 19 시간 동안 30,000 rpm (154,000 x g)으로 초원심분리하였다. 이러한 초원심분리에 의해, 각 바이러스의 비중차에 따라 바이러스 밴드가 각각 분리되었다. Ax2LD3LCAHGH (34.4 kb) 및 AxCANCre (34.7 kb) 가 거의 같은 게놈 크기를 가지므로, 이들의 비중 또한 거의 유사하여 초원심분리 이후의 바이러스 밴드가 중첩되는데, 반면 △E2A-CAHGH (28.1 kb)는 이들 바이러스에 비해 그 비중이 작으므로, 초원심분리에 의해 밴드가 튜브의 상부에 형성되었다. △E2A-CAHGH 밴드의 회수를 위해 주사 바늘로 초원심분리 튜브의 측면에 구멍을 내었다.
5) 마지막으로, 바이러스 용액으로부터 CsCl을 제거하기 위해, 회수한 바이러스 용액을 10% 글리세롤을 함유한 PBS(-)에 대해 투석하여, △E2A-CAHGH의 정제 된 생성물을 최종적으로 수득하였다. 분액 후, 투석 후의 바이러스는 -80℃에서 동결 저장하였다.
(4) E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 순도 및 감염성 적가 측정
1) 감염성 적가 측정
E2A 삭제 아데노바이러스는 293 세포 내에서 복제되지 않으므로, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (E1 유전자 삭제)와는 달리, 이들의 적가는 지수로써 293 세포 내의 복제를 이용하는 표준 방법에 의해 측정되지 못한다. 따라서, 지수로써의, 리포터 유전자, hGH의 생성물의 양, 적가가 알려진 hGH 발현 제 1 세대 아데노바이러스 벡터에 의한 생성된 hGH의 양 및 △E2A-CAHGH의 양을, △E2A-CAHGH와의 상대적 적가 (감염성 적가)를 측정하기 위해 비교하였다.
시험할 아데노바이러스 벡터를 2% FCS를 함유한 DMEM 배지으로 순차 희석하고, 이들을 50㎕씩 96웰 미세적가 플레이트에 배양된 A549 세포 (인간 폐암 유래 세포주)에 첨가하여, 1 시간 동안 37℃에서 감염시켰다. 바이러스 용액을 제거하고, 세포를 배지로 1 회 세척하고, 2% FCS를 함유한 DMEM 배지 100㎕를 여기에 첨가하고, 2 일간 배양하였다. 배양 종결후, 조절된 배지 내의 hGH 양을 ELISA 방법으로 측정하였다 (Picoia™ HGH plate: Sumitomo Pharmaceuticals).
먼저, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 Ax1CAHGH를 이용하여 예비시험을 행하여, 첨가한 바이러스의 양과 생성된 hGH의 양이 바이러스 감염동안의 0.01 - 1의 영역에서 상호 연관되는 것을 알아내었으며, 이는 생성된 hGH의 양이 첨가한 바이러스의 양을 반영함을 확증한다.
따라서, 대조군 적가로써 적가가 알려진 Ax1CAHGH (로트(Lot) B, 적가 3.0 ×1010 PFU/㎖)를 이용하여, △E2A-CAHGH (로트 3)의 감염성 적가를 측정하였다. 각 바이러스에 대한 감염 동안의 희석 비율은 30,000, 90,000, 및 270,000 배이며, 2 일 후 생성 된 hGH의 양을 비교하였다. 모든 희석비에서, 생성된 hGH의 양은 △E2A-CAHGH (로트 3) 보다 Ax1CAHGH (로트 B)에서 평균 약 1.1 배 정도 높았다. 따라서, △E2A-CAHGH (로트 3) 의 적가는 3.0 ×1010 PFU/㎖ ×1/1.1 = 2.7 ×1010 PFU/㎖ (당량)로 계산하였다.
상기 수치에 기초하여 △E2A-CAHGH (로트 3)의 총 수율을 계산하면, 48 개의 225㎠ 플라스크로부터의 293 세포는 4.7 ×1010 PFU (당량)의 바이러스를 생산하였다. 또한, 정제된 바이러스에 대해 260nm에서 흡광도 측정하면, 입자 대 △E2A-CAHGH의 플라크 형성 단위 (PFU)의 비율은 63이었다.
△E2A-CAHGH의 다른 로트에 대해서도 유사한 측정을 행하였으며, 20 개의 225㎠ 플라스크의 293 세포에 대한 △E2A-CAHGH (로트 2)의 총수율은 1.9 ×1010 PFU (당량)이며, 입자의 플라크 형성 단위 (PFU)에 대한 비율은 47인 것이 발견되었다.
2) 순도 측정
E2A 삭제 아데노바이러스 벡터가 초원심분리에 의해 정제되기는 하지만, 정제 과정 중 제거되지 못한 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Ax2LD3LCAHGH 및 AxCANCre)의 오염이 약간 존재하였다, 이들 오염원 제 1 세대 아데노바이러스 벡터는 293 세포 내에서 복제될 수 있으므로, 293 세포를 이용한 표준법 (한계 희석)으로 측정된 적가는 오염원 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 양을 반영하였다. 따라서, △E2A-CAHGH (로트 3)의 순도 측정을 위해, 293 세포를 이용하여 한계 희석법에 의해 적가를 측정하였다. △E2A-CAHGH (로트 3) 의 적가는 7.8 ×108 PFU/㎖, Ax1CAHGH (로트 B) 의 적가는 4.4 ×1010 PFU/㎖ 이며, 그 비율은 1.8%였다. 상기 1)의 결과에서 Ax1CAHGH (로트 B) 의 감염성 적가가 △E2A-CAHGH (로트 3)의 적가의 1.1 배이므로, 이들 수치를 보정한 결과, △E2A-CAHGH (로트 3)의 순도는 (1 - 0.018 x 1.1) ×100 ≒ 98%로 계산되었다.
또한, 유사한 측정으로부터 다른 로트의 △E2A-CAHGH (로트 2) 순도는 97%이었다.
(5) E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 단백질의 감소된 발현 확인
E2A 삭제 아데노바이러스 벡터로 감염된 세포에 대해, 아데노바이러스 입자의 주요 구조 단백질인 E2A 유전자 및 헥손에 의해 코딩되는 DBP (단일가닥 DNA 결합 단백질) 의 발현이 감소되는지의 여부를 측정하기 위해 형광항체법을 사용하였다.
콜라겐 코팅된 8웰 배양 슬라이드 (Becton Dickinson, #40630) 내에서 배양된 군집된 A549 세포에, 5% FCS 함유 DMEM 배지 내에서 100 또는 10 moi로 희석된 △E2A-CAHGH 또는 Ax1CAHGH를 함유하는 100 μl의 바이러스 용액을 첨가하여, 37℃에서 1 시간μ 감염시켰다. 감염 후, 바이러스 용액을 제거하고, 5% FCS를 함유하는 0.3 ㎖의 DMEM 배지를 첨가하고, 2 일간 배양하였다. 2 일 후, 조절된 배지를 제거하고, PBS(-)로 세포를 세척하고, 0.4 ㎖의 2% 파라포름알데하이드/PBS(-)를 첨가하였다. 10 분간 세포를 상온에서 고정하고, PBS(-)로 2회 세척하였다. 또한, 1 ㎎/㎖의 사포닌으로 막 투과 처리 (30분간 실온에서) 후, 세포에 대해 DBP 또는 헥손을 측정하였다.
DBP의 측정을 위해, 슬라이드 유리를 10% 정상 염소 혈청으로 차단한 후, 토끼 항-DBP 펩타이드 (RPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKR: DBP의 22-46 위치의 아미노산 잔기에 해당) 항체 및 FITC 표지화된 염소 항-토끼 항체 (JACKSON, #111-096-003)를 순차적으로 반응시키고, DAPI (4',6-디아미노-2-페닐-인돌)용액으로 핵 염색을 실시하여, 에피-조명(epi-illumination) 형광 현미경 (Olympus BX-50)으로 관찰하였다.
헥손 검출을 위해서는, 슬라이드 유리를 10% 정상 토끼 혈청으로 차단한 후, 염소 항-헥손 항체 (CHEMICON, AB-1056)및 FITC 표지화된 토끼 항-염소 항체(Vector Laboratories, Fl- 5000)를 순차적으로 반응시키고, DAPI로 핵 염색을 실시하여, 에피-조명 형광 현미경으로 관찰하였다.
△E2A-CAHGH-감염 세포에서, DBP 및 헥손 양자 모두의 발현량은 뚜렷이 감소하였으며, 100 moi의 △E2A-CAHGH로 감염된 세포에서는 DBP- 및 헥손-양성 세포의 비율은 10 moi의 Ax1CAHGH로 감염된 세포의 비율과 거의 동일하였다. 따라서, △ E2A-CAHGH에서는 아데노바이러스 유전자의 발현이 감소한다는 본래 기대했던 바를 확인하였다.
실시예 3
E2A 삭제 아데노바이러스 벡터의 염증 유도 효과 조사
아데노바이러스 E2A 유전자의 삭제가 염증 유도 효과의 감소를 도모하는지의 여부를 측정하기 위해, hGH 발현 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 (△E2A-CAHGH) 또는 hGH 발현 제 1 세대 아데노바이러스 벡터(Ax1CAHGH)를 마우스에 주사하고, 양 아데노바이러스 벡터에서의 감염 유도 효과를 혈청 GPT (glutamic pyruvic transaminase) 수준을 지수로 하여 비교하였다. 방법과 결과를 하기에 나타내었다.
(1) 방법
사용한 마우스는 C57BL/6 마우스 (7주령, 암컷)이었다. 사용한 아데노바이러스 벡터는 △E2A-CAHGH (로트 3) 또는 Ax1CAHGH (로트 C)이었다. 아데노바이러스 벡터의 투여량은 1 ×109 PFU, 3 ×108 PFU, 또는 1 ×108 PFU (그룹당 5 마리)였으며, 식염수에 희석된 아데노바이러스 벡터를 꼬리 정맥을 통해 마우스 당 0.2㎖ 투여한다. 아데노바이러스 벡터 투여 3 일 전, 및 투여후 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 및 63 일째에, 에테르 마취 하에 헤파린화 헤마트크릿 튜브를 사용하여 동물의 오르비탈 정맥(orbital vein)으로부터 부분채혈하였다. 혈액을 10,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 혈청을 분리한 후, 사용 시까지 -20℃ 에 저장하였다. GPT의 혈청 수준을 트랜스아미나제 CII-Test Wako (Wako Pure Chemicals)를 이용하여 POP-TOOS 법으로 측정하였다.
(2) 결과
C57BL/6 마우스에 아데노바이러스 벡터를 투여한 후 일정 간격마다 측정한 GPT의 평균 혈청치를 도 2에 나타내었다. 각 처리 군에서의 벡터 투여 효율을 확인하기 위해, hGH의 혈청 수준을 아데노바이러스 벡터 투여 후 3 일 및 5 일째에 또한 측정하였다. 아데노바이러스 벡터의 동일한 투여량으로 처리된 군에서는, Ax1CAHGH 처리군 및 △E2A-CAHGH 처리군 간에 혈청 hGH 수준의 뚜렷한 차이가 없었고, 이는 두 벡터가 동일한 효율로 투여되었음을 확증한다.
다음, 혈청 GPT 양을 측정한다. △E2A-CAHGH-처리 마우스에서는 아데노바이러스 벡터의 투여량이 증가함에 따라 혈청 GPT 수준도 증가하였고, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터로 처리한 마우스와는 차이가 없었다. 이러한 결과는, 아데노바이러스 E2A 유전자의 삭제가 염증 유도 효과의 경감을 가져오지 않음을 나타낸다.
실시예 4
UV-불활성화 아데노바이러스 입자의 제조
마우스로 아데노바이러스 벡터의 투여시에 일어나는 염증이 아데노바이러스 벡터 자체에 의해 유도되는지 여부를 확인 하기 위해, UV-불활성화 아데노바이러스 입자를 하기 절차에 의해 제조하였다.
실시예 2-(2) 에 기재된 방법으로 정제된 hGH 발현 아데노바이러스 벡터 Ax1CAHGH (3.0 ×1010 PFU/㎖, 1.4 ×1012 입자/㎖) 1.8 ㎖ 에, 33 ㎎/㎖ 의 8-메톡시프소랄렌 (8-MOP) 18 ㎕ 를 첨가한 후 (8-MOP 의 최종 농도는 330 ㎍/㎖ 임), 이어서 이들을 0.6 ㎖ 씩 35 mm 직경의 조직 배양 페트리 디쉬 (Sumitomo Bakelite Cat. No. MS-10350) 로 분액하였다. 이어서, 페트리 디쉬를 얼음 상에 놓고, 365 nm 의 파장을 갖는 UV 램프 (8 와트, 5 개의 램프) 가 장착된 UV 가교결합기 (StratalinkerTM UV Crosslinker 1800 모델, STRATAGENE) 의 UV 램프의 5 cm 아래에 덮개를 덮은채 두었다. 매 10 분 마다 디쉬의 위치를 바꾸면서 UV 를 1 시간 동안 조사하였다 (약 1.8 kW 의 UV 강도). UV 조사 후, 바이러스 용액을 디쉬로부터 회수하고 10% 글리세롤 함유 PBS (-) 에 대해 하룻밤동안 투석하여, 8-MOP 를 제거하였다. 마지막으로, 1.1 ×1012 입자/㎖ 의 입자 농도를 갖는 바이러스 용액 약 1.7 ㎖ 을 회수하여, -80℃ 에서 동결 보관하였다.
상기 처리로 아데노바이러스 벡터가 불활성화되었음은 생성된 hGH 양의 측정 및 적가 측정의 2 가지 방법으로 확인되었다. 생성된 hGH 양의 측정은, 아데노바이러스 벡터 감염 1 일 후 hGH 농도를 측정한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-(4) 에 기재된 방법으로 수행되었다. UV-불활성화 전에 1 ×105 입자/㎖ 의 아데노바이러스 벡터 Ax1CAHGH 로 감염된 세포에서 생성된 hGH 의 양은 약 0.2 ng/㎖ 이었고, 1 ×1010 입자/㎖ 로 감염된 세포에서 생성된 양은 약 28 ㎍/㎖ 이었다. 반면, 상 기 불활성화 아데노바이러스 벡터에 대해서, 생성된 hGH 의 양은 1 ×1010 입자/㎖ 로 감염된 경우에도 0.4 ng/㎖ 이었다. 따라서, 생성된 hGH 양의 계산으로부터, 불활성화에 의해 아데노바이러스 벡터의 감염성이 1/105 로 감소됨이 확인되었다. 293 세포를 이용하는 표준 방법으로 적가 결정도 수행되었다. 불활성화 전의 바이러스 적가는 약 3 ×1010 PFU/㎖ 이었지만, 불활성화 후의 적가는 2 ×103 PFU/㎖ 미만이었고, 따라서 바이러스의 적가는 1/107 이하로 감소되었다.
상기 결과로, 본 발명의 UV 조사가 처리된 바이러스 (UV-불활성화 아데노바이러스 입자) 가 완전히 불활성화되었음이 확인되었다.
실시예 5
제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 투여 후의 염증의 원인에 대한 조사
실시예 3 에서, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Ax1CAHGH) 로 처리된 마우스와 비교하여, E2A 삭제 아데노바이러스 벡터가 마우스에 투여되는 경우에도 처리된 마우스의 혈청 GPT 수준은 감소되지 않음이 나타났다. 상기 결과의 해석으로서, 하기 4 가지 가능성이 고려되었다: 1) E2A 유전자의 발현이 염증과 관련되지 않을 가능성; 2) 리포터로서 사용된 hGH 단백질이 세포 매개 면역을 위한 항원으로서 작용하여 염증을 유도할 가능성; 3) 발현이 외래 프로모터 (CAG 프로모터) 에 의해 유도되는 바이러스 유전자 산물이 세포 매개 면역을 위한 항원으로서 작용할 가능성, 및 4) 감염된 동물에서 새로 합성되는 바이러스 단백질이 아니라 바이러스 감염 도중 세포 내로 도입된 바이러스 입자 구성 단백질이 세포 매개 면역을 위한 항원으로서 작용할 가능성.
따라서, 상이한 구조를 갖는 아데노바이러스를 마우스에 투여하여, 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 투여 후의 염증의 원인을, 혈청 GPT 수준을 지수로서 측정하여 조사하였다. 사용된 아데노바이러스 벡터, 실험 방법 및 결과를 하기에 나타내었다.
(1) 아데노바이러스 벡터
사용된 아데노바이러스 벡터를 하기에 나타낸다. 이들 모두는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터이다.
- hGH 발현 아데노바이러스 벡터: Ax1CAHGH
- hGH cDNA 없이 CAG 프로모터만이 삽입된 아데노바이러스 벡터: AxCAwt (도 1: 폴리(A) 서열도 삽입됨) (Kanegae Y. 등, Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821 (1995))
- 프로모터와 같은 외래 유전자가 삽입되지 않은 아데노바이러스 벡터 (제한 효소 SwaI 부위만 삽입됨): Axlwl (도 1, Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996), 상기 참고문헌에 Adexlw 로 기재됨)
- Ax1CAHGH 상에 UV 조사하여 불활성화된 바이러스: UV-불활성화 입자 (실시예 4 참조).
(2) 방법
본 방법은 대부분 실시예 3 에 나타낸 것과 동일하다. 상이한 점은 아래에 기재된 것만이다.
벡터 투여량은 1 ×109 PFU, 3 ×108 PFU, 1 ×108 PFU, 또는 3 ×107 PFU 였다 (군 당 5 마리 동물). UV-불활성화 아데노바이러스 입자의 투여량은 PFU 단위로 측정될 수 없으므로, 이들은 입자 수의 측면에서 동일한 양을 투여하였다.
투여 3 일 전, 및 투여후 3, 5, 7, 10 (또는 11), 14, 21 및 28 일째에 채혈하였다.
(3) 결과
실험을 2 회로 나누어 수행하였다. 제 1 회 수행에서, Ax1CAHGH 및 AxCAwt 를 비교하였다 (도 3, 상부 칼럼). 제 2 회 수행에서, Ax1CAHGH, Axlwl 및 UV-불활성화 아데노바이러스 입자를 비교하였다 (도 3, 하부 칼럼). 2 회의 수행에서, 벡터 희석에 사용된 식염수만이 투여된 군이 음성 대조군으로서 설정되었다. 도 3 에서, 식염수 처리군에 대한 데이타는 제 1 회 수행으로부터의 것이지만, 제 2 회 수행에서도 유사한 결과가 수득되었다.
CAG 프로모터의 조절하에 hGH 를 발현하는 아데노바이러스 벡터 (Ax1CAHGH) 로 처리된 군 및 CAG 프로모터만을 갖는 아데노바이러스 벡터 (AxCAwt) 로 처리된 군간에는, 혈청 GPT 수준의 증가 정도에 있어서 거의 차이가 없었다. 따라서, 이는 리포터 유전자인 hGH 의 발현이 염증과 관련되지 않음을 나타낸다. 반면, 외래 유전자가 삽입되지 않은 아데노바이러스 벡터 (Axlwl) 로 처리된 군 및 UV-불활성화 아데노바이러스 입자로 처리된 군에서는 혈청 GPT 수준이 증가되지 않았다. AxCAwt 및 Axlwl 간의 구조 차이는 CAG 프로모터 및 폴리(A) 서열의 유무 뿐이므로, 혈청 GPT 양의 증가 원인, 즉 염증의 원인은 CAG 프로모터인 것으로 나타났다.
실시예 6
발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되는 아데노바이러스 유전자의 동정
제 1 세대 아데노바이러스 벡터에서, 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되어 염증을 일으키는 아데노바이러스 유전자를 동정하기 위해, 하기에 나타낸 다양한 아데노바이러스 벡터를 제 1 세대 아데노바이러스 벡터가 복제될 수 없는 세포주 (A549 세포 또는 HepG2 세포) 에 감염시키고, 발현된 아데노바이러스 유전자를 노던 블롯팅으로 분석하였다. 상기 연구에 사용된 아데노바이러스 벡터는 CAG 프로모터를 갖는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Ax1CAHGH, AxCAwt), 외래 프로모터가 없는 제 1 세대 아데노바이러스 벡터 (Axlwl), 및 CAG 프로모터를 갖는 E2A 삭제 아데노바이러스 벡터 (△E2A-CAHGH) 였다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 목적 아데노바이러스 유전자, 즉 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되는 유전자는 3 가지의 벡터 (Ax1CAHGH, AxCAwt, △E2A-CAHGH) 로 감염된 세포에서 동일한 정도로 발현되지만 Axlwl 감염 세포에서는 거의 발현되지 않는다. 방법 및 결과를 하기에 나타낸다.
(1) 방법
25 ㎠ 배양 플라스크에서 거의 군집한 (약 5 ×106 세포) A549 세포 (인간 폐암 유래 세포주) 또는 HepG2 세포 (인간 간암 유래 세포주) 를 5% FCS 함유 DMEM 배지 중에 희석된 각각의 아데노바이러스 벡터 0.3 ㎖ 로 1 시간 동안 감염시켰다 (moi 100). 감염 후, 바이러스 용액을 제거하고, 5% FCS 함유 DMEM 배지 5 ㎖ 을 첨가하여 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 조건화된 배지를 제거하고 세포를 PBS(-) 로 2 회 세척한 후, ISOGEN (Nippongene) 을 이용하여 RNA 를 지시 매뉴얼에 따라 각각의 바이러스 감염 세포로부터 제조하였다.
코스미드 벡터 pAxcw (상동) 를 주형으로 PCR 에 의해 증폭된 DNA 를 BcaBESTTM Labeling Kit (Takara Shuzo) 를 사용하여 [α-32P] dCTP 로 표지하여, 노던 블롯팅을 위해 사용되는 프로브를 수득하였다. PCR 에 사용된 프라이머의 서열을 하기에 나타낸다 (괄호 안의 수치는 5형 아데노바이러스의 염기번호 및 서열번호를 나타낸다):
L1: 5'-프라이머 5'-ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3' (12,818-12,842/서열 3)
3'-프라이머 5'-CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3' (13,440-13,416/서열 4)
L2: 5'-프라이머 5'-AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3' (15,098-15,122/서열 5)
3'-프라이머 5'-ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3' (15,834-15,810/서열 6)
L3: 5'-프라이머 5'-GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3' (21,735-21,759/서열 7)
* 3'-프라이머 5'-CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3' (22,305-22,281/서열 8)
L5: 5'-프라이머 5'-GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3' (31,484-31,508/서열 9)
3'-프라이머 5'-GCCAAACAGCCTTTAACAGCCAAAA-3' (32,378-32,354/서열 10)
pIX: 5'-프라이머 5'-ATGAGCACCAACTCGTTTGATG-3' (3,609-3,630/서열 11)
3'-프라이머 5'-TGTTTTAAACCGCATTGGGAGGGGA-3' (4,035-4,011/서열 12)
Iva2: 5'-프라이머 5'-AAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGA-3' (4,554-4,577/서열 13)
3'-프라이머 5'-TGTGGGACCGCCTGGAACTGCTTG-3' (5,181-5,158/서열 14)
E4: 5'-프라이머 5'-GGCAGTGGTCTCCTCAGCGA-3' (33,301-33,320/서열 15)
3'-프라이머 5'-TGAGGAAGTGTATGCACGTG-3' (33,800-33,781/서열 16)
E2A: 5'-프라이머 5'-TGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTA-3' (22,769-22,798/서열 17)
3'-프라이머 5'-GTATGCGGACGCAAGAGGAAGAGGAAGAGC-3' (23,584-23,555/서열 18)
각각의 RNA 5 ㎍ 을 1% 아가로오스 겔 상에서 전기영동한 후, 모세관 전달 방법에 의해 나일론 필터 (Hybond-N+, Amersham) 상에 블롯팅하고, 이어서 UV 가교결합시켰다. 필터를 0.02% 메틸렌 블루 용액으로 염색하여 28S 및 18S RNA 의 위치를 확인한 후, 완충액 A (0.5M Na2HPO4 (pH 7.2) 7% SDS/1mM EDTA) 50 ㎖ 을 첨가하고 65℃ 에서 2 시간 동안 예비혼성화시켰다. 이어서, 32P-표지된 프로브 12.5 ng 을 함유하는 완충액 A 50 ㎖ 를 필터에 첨가한 후, 65℃ 에서 하룻밤동안 혼성화시켰다. 또한, 완충액 B (40 mM Na2HPO4 (pH 7.2)/1% SDS) 200 ㎖ 를 여기에 첨가한 후 필터를 65℃ 에서 2 회 세척하고, 자가방사선촬영하였다.
(3) 결과
노던 블롯팅의 결과를 도 4A 내지 C 에 나타내며, 결과의 요약을 표 1 에 나타내었다. A549 세포에서, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (major late promoter, MLP) 에 의해 조절되는 주요 후기 유전자 (major late gene), 예를 들어 헥손을 포함하는 L3 유전자의 발현이 AxCAwt 감염 세포와 비교하여 Axlwl 감염 세포에서 뚜렷이 감소되었고, 유사하게 △E2A-CAHGH 감염 세포에서 감소되었다 (도 4A). 또한, HepG2 세포에서, L3 유전자의 발현은 △E2A-CAHGH 감염 세포에서만 감소되었다. 데이타를 나타내지는 않았지만, 다른 주요 후기 유전자, 예컨대 L2 유전자 및 L5 유전자에 대한 결과도 L3 유전자에 대한 것과 유사했으며, CAG 프로모터에 의한 발현 유도는 이들 후기 유전자에서 나타나지 않았다.
E2A 유전자의 발현이 △E2A-CAHGH 감염 세포에서 자연적으로 감소되었지만, E2A 유전자 발현은 Axlwl 감염 세포 및 AxCAwt 감염 세포 간에 차이가 없었고, E2A 유전자는 2 가지 바이러스 감염 세포 모두에서 비슷한 수준으로 발현되었다. E4 유전자의 발현에 대해서는 모든 벡터 감염 세포에서 차이가 없었고, E4 유전자는 모든 바이러스 감염 세포에서 비슷한 수준으로 발현되었다 (데이타를 나타내지는 않았음). 따라서, E2A 유전자의 발현 또는 E4 유전자의 발현이 둘 다 CAG 프로모터에 의해 유도되지 않음이 나타났다.
HepG2 세포에서, MLP 에 의해 조절되지 않는 지연 초기 유전자인 IVa2 유전자의 발현은 Axlwl 감염 세포 및 AxCAwt 감염 세포 간에 차이가 없었고, 두 세포 모두에서 유사한 수준으로 발현되었다. 반면, A549 세포에서, IVa2 유전자의 발현은 Axlwl 감염 세포에서만 감소되었다 (도 4B).
또한, MLP 에 의해 조절되는 후기 유전자중 하나인 L1 유전자의 발현은 IVa2 유전자와 유사했고, 그 결과는 HepG2 세포 및 A549 세포에서 상이했다 (표 1 참조).
반면, IVa2 유전자와 같이 MLP 에 의해 조절되지 않는 지연 초기 유전자인 단백질 IX 유전자 (본원에서는 pIX 유전자로 불림) 의 발현은 A549 세포 및 HepG2 세포에 대해 유사한 결과를 나타내었다. 따라서, pIX 유전자의 발현은 △E2A-CAHGH 감염 세포에서는 감소되지 않았고, Axlwl 감염 세포에서만 발현이 뚜렷이 감소되었다 (도 4C).
상기 결과로부터, A549 세포 및 HepG2 세포 둘 다에서 혈청 GPT 수준의 변화와 유사한 발현 패턴을 나타내는, 즉 발현이 AxCAwt-, Ax1CAHGH-, 및 △E2A-CAHGH-감염 세포에서 거의 동일하고, Axlwl-감염 세포에서만 감소되는 유전자는 pIX 유전자였다. 이는, 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되고 염증을 일으키는 유전자가 pIX 유전자임을 시사하였다.
Figure 112008068558824-pat00001
실시예 7
CMV 프로모터에 의한 pIX 유전자 발현의 유도 확인
pIX 유전자의 발현이 CAG 프로모터에서와 유사한 방식으로 CMV 프로모터에 의해 유도되는지의 여부를 조사하였다. CMV 프로모터가 삽입된 재조합 아데노바이러스로서, CMV 프로모터 및 E.coli lacZ 유전자가 5형 아데노바이러스의 E1 유전자 삭제 부위의 우측 방향으로 삽입된 재조합 아데노바이러스 AdCMVlacZ (Osada S. 등, Kidney Int. 55: 1234-1240 (1999)) 를 사용하였다. CAG 프로모터가 삽입된 대조군 바이러스로서, 실시예 6 에 나타낸 AxCAwt 를 사용하였다.
A549 세포를 실시예 6 에 기재된 바와 유사한 방식으로 AdCMVlacZ 또는 AxCAwt 로 감염시키고, 24 시간 후 RNA 를 회수하였다. 그러나, 감염 moi 는 AdCMVlacZ 가 moi 6 또는 moi 2 였고, AxCAwt 가 moi 300 또는 moi 100 이었다. 실시예 6 에 나타낸 pIX 프로브를 사용하여 노던 블롯팅을 수행하였다.
결과를 도 5 에 나타내었다. moi 6 의 AdCMVlacZ 로 감염된 세포에서, pIX 유전자는 moi 100 에서 AxCAwt 로 감염된 세포 이상의 수준으로 발현되었다. 2 가지 바이러스의 감염시 moi 가 상이하고, 프로모터의 삽입 방향이 상이하며, 프로모터로부터 pIX 유전자까지의 거리가 상이하므로, CAG 프로모터 및 CMV 프로모터에 의한 pIX 유전자 발현의 유도 강도의 정도는 비교될 수 없다. 그러나, CMV 프로모터가 삽입된 AdCMVlacZ 감염 세포에서, pIX 유전자가 더 낮은 moi 로 발현되므로, pIX 유전자의 발현이 CMV 프로모터에 의해서도 유도될 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 8
SRα프로모터 및 EF-1α프로모터에 의한 pIX 유전자 발현 유도의 존재 또는 부존재에 대한 조사
pIX 유전자의 발현이 CMV 프로모터를 포함하지 않는 외래 프로모터에 의해 유도되는지 여부를 조사하였다. 연구에 사용된 프로모터는 SRα프로모터 (Takebe Y. 등, Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)) 및 EF-1α프로모터 (Kim D.W. 등, Gene 91:217-223 (1990)) 였고, 각각의 프로모터 및 E. coli lacZ 유전자가 좌측 방향으로 삽입된 아데노바이러스 벡터 (AxSRlacZ-L 및 AxEFlacZ-L) 를 사용하였다. 양성 대조군으로서, CAG 프로모터만이 삽입된 아데노바이러스 벡터 AxCAwt (실시예 5 참조) 및 CAG 프로모터 및 E. coli lacZ 유전자가 좌측 방향으로 삽입된 아데노바이러스 벡터 (AxCAlacZ-L) 를 사용하였다. AxSRlacZ-L, AxEFlacZ-L 및 AxCAlacZ-L 의 구축 방법은 Saito 등 (일본 공개특허 공보 제 7-298877 호) 에 의해 개시되어 있으며, 여기에서 Adex1SRlacZ-L 은 AxSRlacZ-L 과 동일하고, Adex1EFlacZ-L 은 AxEFlacZ-L 과, 및 Adex1CAlacZ-L 은 AxCAlacZ-L 과 각각 동일하다. 음성 대조군으로는, 외래 프로모터가 삽입되지 않은 아데노바이러스 벡터 Axlwl (실시예 5 참조) 을 사용하였다. 또한, 실시예 7 에서 사용된 CMV 프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터 (AdCMVlacZ) 를 다시 조사하였다.
A549 세포를 상기 6 가지의 아데노바이러스 벡터 (AxSRlacZ-L, AxEFlacZ-L, AxCAlacZ-L, AdCMVlacZ, AxCAwt, Axlwl) 를 이용하여 30 또는 100 moi 로 감염시키고, 24 시간 후 RNA 를 회수하여 pIX 프로브를 이용해 노던 블롯팅하였다 (자세한 방법은 실시예 6 참조).
결과는 도 6 에 나타내었다. CMV 프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터 (AdCMVlacZ) 로 감염된 세포에서, pIX 유전자가 실제로 발현되었고, 이들의 발현량은 양성 대조군으로서 사용된 CAG 프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터 (AxCAlacZ-L 및 AxCAwt) 로 감염된 세포의 발현량과 동일하거나 그보다 높았다.
반면, EF-1α프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터 (AxEFlacZ-L) 로 감염된 세포에서는 pIX 유전자의 발현이 전혀 관찰되지 않았다. SRα프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터 (AxSRlacZ-L) 로 감염된 세포에서는 pIX 유전자의 발현이 관찰되었다.
상기 결과는, 외래 프로모터에 의한 pIX 유전자의 발현이 프로모터의 특이성에 관련되며, pIX 유전자의 발현을 전혀 유도하지 않는 EF-1α와 같은 외래 프로모터가 존재함을 나타낸다. 또한, CAG 프로모터 및 CMV 프로모터의 공통 부분이 단지 CMV IE 인핸서뿐이므로, pIX 유전자의 발현을 유도하는 것은 주로 CMV IE 인핸서라는 것을 나타낸다.
실시예 9
상이한 프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터의 염증 유도능에 대한 조사
외래 프로모터에 의한 pIX 유전자 발현의 유도가 동물에게 아데노바이러스 벡터를 투여시에 일어나는 염증과 관련된다는 것을 증명하기 위해, 실시예 8 에서 사용된 아데노바이러스 벡터 중에서 4 가지 벡터 (AxEFlacZ-L, AxCAlacZ-L, AdCMVlacZ 및 Axlwl) 를 C57BL/6 마우스에 투여하고, 지수로서의 혈청 GPT 양으로 염증 정도를 비교하였다.
1 ×109 PFU (AdCMVlacZ 제외), 3 ×108 PFU, 및 1 ×108 PFU 로 꼬리 정맥을 통해 아데노바이러스를 투여하여 (군 당 5 마리 동물), 투여 3 일 전, 및 투여후 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 및 35 일째의 채혈하고 GPT 수준을 측정하였다. 각 방법의 상세한 내용은 실시예 3 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
결과를 도 7 에 나타내었다. CMV 프로모터를 갖는 AdCMVlacZ 로 처리된 마우스에서, 혈청 GPT 양은 CAG 프로모터를 갖는 AxCAlacZ-L 로 처리된 마우스에서 보다 상승되었고, 염증 정도는 실시예 8 에 나타낸 pIX 유전자의 발현량과 관련되어 있다. 반면, EF-1α프로모터를 갖는 AxEFlacZ-L 로 처리된 마우스에서는 외래 프로모터가 없는 Axlwl 로 처리된 마우스에서와 동일한 수준으로 혈청 GPT 양이 거의 증가하지 않았다.
상기 결과는, pIX 유전자의 발현이 생체 내 투여 후의 염증과 직접 관련되고, 즉 pIX 유전자의 발현을 유도하지 않는 프로모터를 갖는 아데노바이러스 벡터가 염증을 유도하지 않는다는 것과, 외래 프로모터에 의한 pIX 유전자의 발현 유도가 염증의 원인이라는 것을 나타낸다.
실시예 10
항-pIX 항체의 제조 및 단백질 IX 의 검출
(1) 단백질 IX (pIX) 유전자의 클로닝
PCR 방법에 의해 인간 5형 아데노바이러스 (Ad5) 의 pIX 유전자를 코딩하는 영역을 클로닝하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 상기 코스미드 벡터 pAxcw 를 주형으로, 하기 서열의 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행하였다. Ad5 의 제 3585 - 3605 위치의 뉴클레오티드 서열 및 EcoRI 인식 부위가 포함되도록 5'-프라이머를 고안하였고, Ad5 의 제 4034 - 4015 위치의 염기 서열 및 XhoI 인식 부위가 포함되도록 3'-프라이머를 고안하였다.
5'-말단 프라이머
5'-TAGAATTCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCC-3' (SEQ ID No: 19)
EcoRI
3'-말단 프라이머
5'-TACTCGAGGTTTTAAACCGCATTGGGAG-3' (SEQ ID No. 20)
XhoI End
Pfx DNA 폴리머라아제 (GIBCO BRL) 를 이용해 PCR 반응을 수행하여, pIX 유전자의 코딩 영역을 포함하는 470 bp 의 DNA 단편을 증폭하였다. 시판되는 플라스미드 벡터 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 은 CMV 프로모터의 하류에 다중 클로닝 부위를 갖는다. 따라서, PCR 로 증폭된 470 bp 의 DNA 단편을 EcoRI 및 XhoI 로 함께 절단한 후, pcDNA3.1(+) 의 다중 클로닝 부위 내의 EcoRI 부위 및 XhoI 부위 사이에 삽입하여 pIX 를 발현하는 플라스미드 pCMV-IX (5.9 kb) 를 수득하였다. 상기 pCMV-IX 의 pIX 유전자 코딩 영역을 포함하는 부분을 서열분석하여, 그 서열이 기존 서열 (GenBank: 접근 번호 M73260) 과 동일함을 확인하였다.
(2) pIX-융합 단백질의 제조
항-pIX 항체를 수득하기 위한 항원으로서, pIX 및 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST) 의 융합 단백질을 제조하였다.
1) pIX-융합 단백질의 발현 플라스미드 구축
플라스미드 pCMV-IX 를 EcoRI 및 XhoI 으로 함께 절단하여, pIX 유전자를 포함하는 470 kb 의 DNA 단편을 수득하였다. E. coli 에서 GST-융합 단백질을 발현하도록 구축된 시판되는 플라스미드 벡터 pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia Biotech) 는 GST 의 C-말단에 다중 클로닝 부위를 갖는다. 따라서, pCMV-IX 로부터 수득된 470 bp 의 DNA 단편을 pGEX-5X-1 의 다중 클로닝 부위 중 EcoRI 부위 및 XhoI 부위 사이에 삽입하여 GST-pIX 발현 플라스미드 pGST-IX (5.4 kb) 를 수득하였다.
2) pIX-융합 단백질의 제조
E. coli 균주 JM109 를 플라스미드 pGST-IX 로 형질전환시켰다. 형질전환체에 의해 발현되는 GST-pIX 는 불용성이므로, GST-pIX 를 봉입체 중의 단백질 정제 방법에 따라 정제하였다. 먼저, LB 배지 40 ㎖ 중의 형질전환된 E. coli 를 37℃ 에서 하룻밤 동안 배양한 후, LB 배지 800 ㎖ 을 첨가하고, 1 시간 더 배양하였다. IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 를 첨가하고 (최종 농도 0.2 mM 로) 6 시간 동안 배양한 후, 세포를 채취하였다. 세포를 PBS 로 세척한 다음, 라이소자임 (1 ㎎/㎖) 을 함유하는 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0)/1 mM EDTA/100 mM NaCl) 20 ㎖ 중에 현탁하고, 실온에서 20 분 동안 배양한 후, 10% 나트륨 디옥시콜레이트를 함유하는 용해 완충액 1 ㎖ 을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이어서, 용해액에 1 M MgCl2 용액 100 ㎕, 1 M MnCl2 용액 100 ㎕ 및 DNase I 용액 (70 U/㎕) 20 ㎕ 을 첨가하고 37℃ 에서 15 분 동안 배양한 후, 15 분 동안 원심분리하였다 (11,850 ×g). 원심분리 후, 상청액을 버리고, 침전물을 0.5% Triton X-100/10 mM EDTA 를 함유하는 용해 완충액 20 ㎖ 로 2 회 세척한 후, 침전물을 PBS 1㎖ 중에 현탁하였다. 용액에 동량의 6M 요소를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한 후, 15 분 동안 원심분리하였다 (11,850 ×g). 원심분리 후, 상청액을 버리고, 침전물을 PBS 2 ㎖ 중에 현탁하였다. 용액에 8M 구아니딘 히드로클로라이드 6 ㎖ 을 첨가하고 (최종 농도 6M) 15 분 동안 원심분리한 후 (11,850 ×g), 상청액을 회수하였다. 상청액을 정제 GST-pIX 로 이용하여, 항-pIX 항체를 제조하였다.
(3) 항-pIX 항체의 제조
6M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 정제 GST-pIX 로 토끼 (Japanese White) 를 면역시켰다.
면역 및 채혈은 Asahi Techno Glass Corporation 에 의뢰하였다. 항원 (GST-pIX) 0.2 - 0.4 ㎎ 을 2 마리 토끼에게 매 2 주마다 5 회 면역시켰다. 4 차 면역 1 주일 후에 부분 채혈하여 GST-pIX 에 대한 항체의 적가가 충분히 상승하였는지를 ELISA 방법으로 확인한 후, 5 차 면역 1 주일 후에 전체 채혈하여 항혈청 (#1 및 #2) 을 수득하였다.
*이어서, 상기 항혈청을 웨스턴 블롯팅으로 pIX 와 반응하는 것을 확인하였다. pIX 를 포함하는 양성 대조군으로서, 하기 2 개 샘플을 사용하였다. 하나는 A549 세포를 E3 유전자만 삭제된 5형 아데노바이러스 야생형 균주 (Ad5-dlX: Saito I. 등, J. Virol. 54: 711 - 719 (1985)) 에서 유도된 바이러스를 이용하여 moi 10 으로 감염시킨 후 약 1 일 후에 회수된 세포이고, 다른 하나는 정제 아데노바이러스 입자이다. 음성 대조군으로서, 아데노바이러스로 감염되지 않은 A549 세포를 사용하였다.
각각의 샘플을 환원 조건 하에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 한 후, 니트로셀룰로스막 (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) 으로 블롯팅하였다. 막을 1000배 희석된 항혈청 또는 면역전 혈청을 첨가한 5% 탈지유로 차단하고, 4℃ 에서 하룻밤 동안 배양하였다. 막을 세척한 후, 퍼옥시다아제-공액 F(ab')2 단편 당나귀 항-토끼 Ig 항체 (Amersham Pharmacia Biotech, Cat. NA9340) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 또한, 막을 세척한 후, 화학발광 검출 시약 (ECL Plus 검출 시약, Amersham Pharmacia Biotech) 을 첨가하고, 막을 X-선 필름에 노출시켰다.
2 개 항혈청 가운데, 항혈청 #1 의 결과를 예로서 도 8 에 나타낸다. 면역 후의 항혈청이 사용된 경우, Ad5-dIX-감염 세포 및 정제 바이러스 입자가 적용된 레인에서는 pIX 의 분자량에 상응하는 약 14 kDa 의 밴드가 뚜렷이 검출되었고, 바이러스에 감염되지 않은 A549 세포가 적용된 레인에서는 상기 밴드가 검출되지 않았다. 또한, 면역전 혈청이 사용되는 경우, 상기 14 kDa 의 밴드는 모든 레인에서 전혀 검출되지 않았다. 데이타는 나타내지는 않았만, #2의 항혈청에서도 유사한 결과가 수득되었다. 상기 결과는, 상기 항혈청으로 검출되는 14 kDa 밴드가 pIX 에서 유래됨을 확인시킨다. 따라서, 상기 항혈청을 하기 실험에서 항-pIX 항체로서 사용하였다.
(4) 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도되는 pIX 의 검출
실시예 6 - 8 은, pIX RNA 의 발현이 CAG 프로모터에 의해 유도됨을 노던 블롯팅에 의해 보여준다. 따라서, pIX 의 발현이 또한 RNA 수준 뿐만 아니라 단백질 수준에서도 유도되는지를 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다.
A549 세포를 CAG 프로모터만이 삽입된 아데노바이러스 벡터 AxCAwt (실시예 5 참조) 또는 외래 프로모터가 삽입되지 않은 아데노바이러스 벡터 Axlwl (실시예 5 참조) 를 moi 100 으로 감염시키고, 1 일 후에 세포를 회수하였다. 양성 대조군으로서, Ad5-dIX 를 moi 10 으로 감염시키고 1 일 후에 회수된 A549 세포를 사용하였다. 상기 (3) 에 기재된 것과 유사한 방법으로, 웨스턴 블롯팅을 수행하여 항-pIX 항체 (#1) 로 pIX 를 검출하였다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 14 kDa pIX 를 Ad5-dIX-감염 세포에서와 같이 AxCAwt-감염 세포에서 검출하였다. 반면, 상기 14 kDa의 밴드는 Axlwl-감염 세포에서는 전혀 관찰되지 않았다. 이는 pIX 의 발현이 CAG 프로모터에 의해 단백질 수준에서도 유도됨을 확인시킨다.
실시예 11
pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 구축
pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터를 하기 (1) 내지 (3) 의 절차에 의해 구축하였다:
(1) E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단의 ITR 사이에 삽입된 pIX 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ax4pIX) 의 구축
인간 5형 아데노바이러스 (Ad5) 의 전장 pIX 유전자를 포함하는 영역을 클로닝하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. E1 유전자 및 E3 유전자를 제외한 5형 아데노바이러스 게놈의 대부분을 포함하는 코스미드 벡터 pAxcw (상기) 를 주형으로, 하기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 제한 효소 인식 부위를 각 프라이머에 첨가하였다.
5'-말단 프라이머
5'-CCTGAATTC GTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTA-3'
EcoRI RsaI
(SEQ ID NO: 21) (Ad5: 3513-3536)
3'-말단 프라이머
5'-CCTGGATCC GTAC ATTAATTGCTTGATCCAAATCCAAACAG-3'
BamHI RsaI AseI
(SEQ ID NO: 22) (Ad5: 4076-4054)
PCR 증폭된 pIX 유전자를 포함하는 약 0.6 kb 의 DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI 으로 함께 절단한 후, 이를 시판되는 플라스미드 pUC19 의 다중 클로닝 부위 내 EcoRI 부위 및 BamHI 부위 사이에 삽입하여, 플라스미드 pUCfpIX (3.3kb) 를 수득하였다. 상기 pUCfpIX 의 pIX 유전자를 포함하는 삽입 부분을 서열분석하여, 그 서열이 기존 서열 (GenBank: 접근 번호 M73260) 과 동일함을 확인하였다.
이어서, pIX 유전자가 E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이에 삽입된 코스미드 벡터를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 코스미드 벡터 pAx4w 는 5형 아데노바이러스의 게놈 중 2.6 - 98.0 m.u. (E3 유전자 삭제) 및 2형 아데노바이러스의 게놈 중 98.0 - 100 m.u. 를 포함하고, E4 유전자 프로모터의 상류 부위 및 3'-말단 ITR (99.3 m.u.) 사이에 제한 효소 SwaI 부위, 클로닝 부위를 갖는 벡터이다 (Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320 - 1324 (1996), 상기 참고문헌에서 pAx4w 는 pAdex4w 로 기재됨). 플라스미드 pUCfpIX 를 RsaI 로 절단하여, pIX 유전자를 포함하는 약 0.6 kb 의 DNA 단편을 수득하였다. 상기 0.6 kb 의 DNA 단편을 코스미드 벡터 pAx4w 의 SwaI 부위에 삽입하여, 코스미드 pAx4pIXL 및 pAx4pIXR 을 수득하였다. pAx4pIXL 에서는 pIX 유전자를 좌측 방향으로 삽입하였고, pAx4pIXR 에서는 pIX 유전자를 우측 방향으로 삽입하였다.
마지막으로, pIX 유전자가 E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이에 삽입된 재조합 아데노바이러스를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 재조합 아데노바이러스 벡터 Adex4SRlacZL (Miyake S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324 (1996) 및 도 10 참조) 은 5형 아데노바이러스 (E1A 유전자 및 E3 유전자 삭제) 으로부터 유도되고, E. coli lacZ 유전자의 발현 단위가 pAx4w 에서와 동일한 위치인 상기 99.3 m.u. 위치에서 좌측 방향으로 삽입된 복제-결함 아데노바이러스 벡터이다. Adex4SRlacZL 로부터, 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체 (DNA-TPC) 를 제조한 후, 상기 DNA-TPC 를 제한 효소 AseI 및 EcoRI 으로 함께 절단하였다. Adex4SRlacZL 의 게놈 DNA 에는 lacZ 유전자의 발현 단위를 포함하는 게놈의 우측 절반에 여러개의 AseI 부위 및 EcoRI 부위가 있으므로, Adex4SRlacZL 의 DNA-TPC 를 상기 두 효소로 절단하면 게놈의 우측 절반이 절단된 DNA-TPC 가 얻어진다. 293 세포를 상기 제한효소로 절단된 DNA-TPC 및 코스미드 pAx4pIXL 또는 pAx4pIXR 로 형질전환시켰다. 생성된 재조합 아데노바이러스의 게놈 DNA 를 제한 효소 BspEI 및 PmlI 로 절단하여 목적 바이러스 클론이 동정되고, Adex4SRlacZL 의 E. coli lacZ 유전자의 발현 단위가 pIX 유전자로 교체된 재조합 아데노바이러스 Ax4pIXL 또는 Ax4pIXR (도 10) 이 수득되었다. Ax4pIXL 및 Ax4pIXR 은 두 부위 (pIX 유전자의 본래의 위치 (9.7 - 11.2 m.u.), 및 E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이) 에 pIX 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스이다. Ax4pIXL 및 Ax4pIXR 의 구조 차이는 E4 유전자 및 ITR 사이의 pIX 유전자의 삽입 방향뿐이며, Ax4pIXL 은 pIX 유전자가 좌측 방향으로 삽입된 재조합 아데노바이러스이고, Ax4pIXR 은 pIX 유전자가 우측 방향으로 삽입된 재조합 아데노바이러스이다.
(2) E1A, E1B, 및 pIX 유전자가 삭제된 아데노바이러스 벡터의 게놈을 갖는 코스미드 벡터 (pAx△pIXcw) 의 구축
pIX 유전자를 포함하는 5형 아데노바이러스 게놈의 좌측 말단의 17% 를 포함하는 플라스미드를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 상기 언급된 코스미드 벡터 pAx4w (도 11) 는 E1 유전자 (△454-3328) 및 E3 유전자 (△28592-30470) 이외의 5형 아데노바이러스 게놈의 대부분을 포함하는 벡터이다. pAxcw 를 HindIII 및 EcoRV 로 절단한 후, Klenow 효소로 블런트-말단화한 뒤 셀프라이게이션시켜, 플라스미드 pAx17cw (6.5 kb: 도 11) 를 수득하였다. pAx17cw 는 E1 유전자를 제외한 5형 아데노바이러스의 좌측 말단의 약 17% (1-453, 3329-6241) 를 포함하는 플라스미드이다.
pAx17cw 로부터 pIX 유전자가 삭제된 플라스미드를 구축하기 위해, 하기 3 가지의 DNA 단편 (a) 내지 (c) 를 제조하였다:
(a) pAx17cw 를 SwaI 및 XhoI 으로 절단하여 수득되는, pIX 유전자를 포함하지 않는 약 4.0 kb 의 DNA 단편,
(b) pAx17cw 를 AlwNI 및 XhoI 으로 절단하여 수득되는, 5형 아데노바이러스 게놈의 제 4054 - 5788 위치에 상응하는 약 1.7 kb 의 DNA 단편,
(c) 하기 서열을 갖는 합성 DNA 의 5'-말단을 인산화시킨 후 어닐링시켜 수득되는, SwaI-절단 단편-ClaI 인식 부위-SalI 인식 부위-NruI 인식 부위-AlwNI-절단 단편의 서열을 갖도록 고안된 이중가닥 DNA 단편:
Figure 112008068558824-pat00002
상기 3 가지의 단편 (a), (b) 및 (c) 를 결찰하여, E1A, E1B 및 pIX 유전자가 삭제된 (△454-4053) 플라스미드 pAx17△pIXcw (5.8 kb: 도 11) 를 수득하였다.
이어서, 코스미드 벡터 pAxcw 의 BamHI 부위 및 BstZ17I 부위 사이의 서열이 플라스미드 pAx17△pIXcw 의 BamHI 부위 및 BstZ17I 부위 사이의 서열로 교체된 코스미드 벡터를 구축하기 위해, 하기 3 가지의 DNA 단편 (d) 내지 (f) 를 제조하였다:
(d) pAx17△pIXcw 를 BamHI 및 BstZ17I 로 절단하여 수득되는, SwaI 인식 부위를 포함하는 약 2.2 kb 의 DNA 단편,
(e) pAxcw 를 BamHI 및 Csp45I 로 절단하여 수득되는, 아데노바이러스 게놈 DNA 를 포함하지 않는 약 10 kb 의 DNA 단편,
(f) pAxcw 를 Csp45I 및 BstZ17I 로 절단하여 수득되는, 아데노바이러스 게놈 DNA 를 포함하는 약 30 kb 의 DNA 단편.
상기 3 가지의 단편 (d), (e) 및 (f) 를 결찰하여, E1A, E1B 및 pIX 유전자가 삭제된 아데노바이러스 게놈을 갖는 코스미드 벡터 pAx△pIXcw (41.8 kb: 도 11) 를 수득하였다.
마지막으로, 인간 성장 호르몬 (hGH) 의 발현 단위가 코스미드 벡터 pA△pIXcw 의 E1A, E1B 및 pIX 유전자 삭제 부위에 삽입된 코스미드 벡터를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다:
hGH cDNA 가 CAG 프로모터의 하류에 결찰된 hGH 발현 단위를 갖는 코스미드 pAx1CAHGH (실시예 1) 를 제한 효소 PmeI 로 절단하여, hGH 발현 단위를 포함하는 약 3.0 kb 의 DNA 단편을 수득하였다. 상기 DNA 단편을 코스미드 벡터 pA△pIXcw 의 SwaI 부위에 삽입하여, 코스미드 pA△pIXCAHGH (44.8 kb: 도 11) 를 수득하였다.
(3) 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터의 구축
(1) 에 기재된 재조합 아데노바이러스 Ax4pIXL 또는 Ax4pIXR, 및 (2) 에 기재된 코스미드 벡터 pAx△pIXCAHGH 간의 상동 재조합에 의해 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. Ax4pIXL 및 Ax4pIXR 로부터, 아데노바이러스 DNA-TPC 를 제조한 후, 각각의 DNA-TPC 를 제한 효소 EcoT22I 로 절단하였다. Ax4pIXL 및 Ax4pIXR 의 게놈 DNA 의 좌측 절반에는 여러 EcoT22I 부위가 있으므로, EcoT22I 로의 절단은 게놈의 좌측 절반이 절단된 DNA-TPC 를 만든다. 293 세포를 EcoT22I-절단된 Ax4pIXR 의 DNA-TPC 및 코스미드 pAx△pIXCAHGH 로 형질전환시켰다. 생성된 재조합 아데노바이러스의 게놈 DNA 를 제한 효소 (XhoI, NruI, BspEI 등) 로 절단함으로써, 목적 바이러스 클론을 동정하였다. 그 결과, pIX 유전자가 pIX 유전자의 본래 위치 (9.7 - 11.2 m.u.) 에 존재하지 않고, pIX 유전자가 E4 유전자의 상류 영역 및 3'-말단 ITR 사이에 재위치된 pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터 (AxRpIXRCAHGH, 도 10) 를 수득할 수 있다. 유사하게, pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터 (AxRpIXLCAHGH, 도 10) 는 EcoT22I-절단된 Ax4pIXL 의 DNA-TPC 및 코스미드 pAx△pIXCAHGH 로 293 세포를 형질전환시켜 수득할 수 있다. AxRpIXRCAHGH 및 AxRpIXLCAHGH 간의 구조 차이는 단지 pIX 유전자의 삽입 방향만이며, AxRpIXRCAHGH 는 pIX 유전자가 우측 방향으로 삽입된 재조합 아데노바이러스이고, AxRpIXLCAHGH 는 pIX 유전자가 좌측 방향으로 삽입된 재조합 아데노바이러스이다.
실시예 12
pIX 발현 세포주의 구축
pIX 삭제 아데노바이러스의 생산에 사용하기 위해, 293 세포를 형질전환시켜 pIX 발현 세포주를 구축하였다.
실시예 10-(1) 에서 구축된 pIX 발현 플라스미드 pCMV-IX 를 이용하여, 293 세포를 리포펙션 방법 (FuGENETM 6 형질감염 시약: Roche Diagnostics Corp.) 으로 형질전환시켰다. 네오마이신-내성 유전자가 pCMV-IX 내에 삽입되었으므로, 배지를 형질전환 3 일 후에 600㎍/㎖ 의 G418 술페이트 (Geneticin: GIBCO BRL) 를 함유하는 것으로 교체한 후, 형질전환된 세포를 13 일간 더 배양한 후 세포를 클로닝하였다. G418-내성 세포주 중의 임의의 10 개 클론에 대해, pIX 유전자의 발현을 노던 블롯팅으로 검사하였다. 그 결과, pIX 유전자가 4 개 클론 (#2, #5, #6, #10) 에서 발현되고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 4 개 클론에 대해 pIX 유전자 발현의 안정성을 검사하기 위해, 상기 4 개 클론을 30 계대로 2차배양하고, 그 도중에 매 5 계대마다 RNA 를 얻어내어 pIX 유전자의 발현을 노던 블롯팅으로 확인하였다 (도 12). 그 결과, 클론마다 pIX 유전자의 발현량은 상이하지만, pIX 유전자가 4 개의 모든 클론에서 30 계대 이상 안정하게 발현될 수 있음을 확인하였다.
또한, 25 계대의 세포를 이용하여, pIX 의 발현을 실시예 10-(3) 에 기재된 웨스턴 블롯팅을 이용해서 단백질 수준에서도 확인하였다. 상기 실험 및 도 12 의 실험에서, 외래 프로모터가 삽입되지 않은 아데노바이러스 벡터 Axlwl 로 감염된 293 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 아데노바이러스 E1A 또는 E1B 유전자를 발현하지 않는 A549 세포와 같은 세포가 Axlwl 로 감염된 경우에도, pIX 는 RNA 수준에서 (도 4, 도 6), 또는 단백질 수준에서 (도 9) 거의 발현되지 않는다. 그러나, E1A 및 E1B 유전자를 발현하는 293 세포가 Axlwl 로 감염되는 경우, 이들은 E1-유전자 삭제 제 1 세대 아데노바이러스 벡터의 통상적 복제 주기에 해당하며, 충분한 량의 pIX 를 발현한다. 도 13 에 나타내듯이, Axlwl 감염된 293 세포에 의해 발현되는 pIX 양보다 약간 더 적었지만, 4 개의 모든 클론은 단백질 수준에서도 pIX 를 발현하였음이 확인되었다.
상기 결과는 pIX 를 항시적으로 그리고 안정하게 발현하는 pIX 발현 세포주로서 4 개 클론 (#2, #5, #6, #10) 이 수득되었음을 뚜렷이 나타낸다.
실시예 13
pIX 삭제 아데노바이러스 벡터의 구축
실시예 5 에서 사용되는 아데노바이러스 벡터 AxCAwt 및 pIX 삭제 코스미드 벡터 pAx△pIXCAHGH 간의 상동 재조합에 의해 pIX 삭제 아데노바이러스 벡터를 구축하기 위해, 하기 절차를 수행하였다.
AxCAwt 로부터 아데노바이러스 DNA-TPC 를 제조한 후, EcoT22I 로 절단하였다. 실시예 12 에 기재된 pIX 발현 세포주 또는 293 세포를 상기 DNA-TPC 및 코스미드 벡터 pAx△pIXCAHGH 로 형질전환시켰다. 생성된 재조합 아데노바이러스의 게놈 DNA 를 제한 효소 (ClaI, NruI, SalI 등) 로 절단하여, 목적 바이러스 클론을 동정하고, pIX 삭제 아데노바이러스 벡터 Ax△pIXCAHGH (도 10) 를 수득할 수 있다. Ax△pIXCAHGH 는 E1A, E1B 및 pIX 유전자가 삭제되고 (△454-4053), E3 유전자가 또한 삭제된 (△28592-30470) 5형 아데노바이러스에서 유래된 재조합 아데노바이러스이다.
pIX 삭제 아데노바이러스 벡터가 pIX 발현 세포주의 형질전환에 의해 수득되는 경우, pIX 발현 세포주는 대규모의 바이러스 계대 및 제조에 사용된다. 반면, pIX 삭제 아데노바이러스 벡터가 293 세포의 형질전환에 의해 수득되는 경우, pIX 발현 세포주는 대규모의 바이러스 제조에 사용된다.
이어서, pIX 삭제 아데노바이러스 벡터를 정제하고, 바이러스 입자 중 정상량의 pIX 단백질의 존재가 항-pIX 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 확인된 바이러스 입자를 제조한다.
실시예 14
pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 pIX 삭제 아데노바이러스 벡터의 투여에 의한 염증의 여부에 대한 조사
pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 pIX 삭제 아데노바이러스 벡터에 대해 염증이 경감되었는지를 확인하기 위해, 생체 내 실험을 실시예 3 및 5 에 기재된 바와 같이 염증의 지수로서 혈청 GPT 양을 측정하여 수행하였다. 시험된 아데노바이러스는 하기와 같다:
- hGH 발현 pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터: AxRpIXRCAHGH, AxRpIXLCAHGH (실시예 11)
- hGH 발현 pIX 삭제 아데노바이러스 벡터: Ax△pIXCAHGH (실시예 13)
- hGH 발현 제 1 세대 아데노바이러스 벡터: Ax1CAHGH (실시예 5)
- 외래 유전자가 삽입되지 않은 제 1 세대 아데노바이러스 벡터: Axlwl (실시예 5)
마우스 계통 및 아데노바이러스 벡터의 투여량을 포함하는 실험 방법은 실시예 3 에 기재된 방법에 따라 수행된다.
그 결과, Ax1CAHGH-투여 마우스에서는 혈청 GPT 양이 실시예 3 및 5 에서와 같이 상당히 증가되었다. 그러나, AxRpIXRCAHGH-, AxRpIXLCAHGH- 및 Ax△pIXCAHGH-투여 마우스에서는 혈청 GPT 양이 Axlwl-투여 마우스에서와 같이 전혀 증가하지 않는다. 상기 결과는 pIX-재위치화 아데노바이러스 벡터 및 pIX 삭제 아데노바이러스 벡터가 생체 내에 투여되는 경우에도 거의 염증을 일으키지 않음을 나타낸다.
도 1은 본 실험에 사용된 아데노바이러스의 구조를 나타내는 모식도이다. 도면에서, CAG는 CAG 프로모터를 나태내고, pA는 폴리(A) 서열을 나타내며, 이들 위의 화살표는 전사 방향을 나타낸다. Ad5 게놈은 인간 5형 아데노바이러스 게놈을 나타내고, lacZ는 Escherichia Coli의 lacZ 유전자를 나타내며, Cre는 재조합효소 Cre 유전자를 나타내고, hGH는 인간 성장 호르몬의 cDNA를 나타낸다.
도 2는 꼬리 정맥을 통해 아데노바이러스 벡터 Ax1CAHGH 또는 △E2A-CAHGH를 를 주입한 C57BL/6 마우스의 혈청 GPT 양의 일변화에 대한 평균값 (각 군당 5마리 마우스)을 나타내는 그래프이다. 도면에서,
Figure 112008068558824-pat00003
는 1 ×109 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00004
는 3 ×108 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00005
는 1 ×108 PFU로, 아데노바이러스 벡터를 주입한 군이다.
본 실험은 각 군당 5 마리의 마우스에 대해서 수행하였다. Ax1CAHGH 1 ×109 PFU 투여군 및 △E2A-CAHGH 1 ×108 PFU 투여군 각각에서, 한마리 마우스에서의 혈청 hGH의 양은 나머지 마우스 4마리보다 명백히 낮았다 (10분의 1 이하, 데이터를 나타내지는 않았음). 따라서, 이들 두 군에서, 각각의 마우스의 값은 평균값의 계산에서 생략하였고, 각 군당 4마리의 평균 GPT 값을 나타내었다.
도 3은 꼬리 정맥을 통해 다른 구조를 갖는 아데노바이러스 벡터 또는 UV-불활성화 아데노바이러스 입자를 주입한 C57BL/6 마우스의 혈청 GPT 양의 일변화에 대한 평균값 (각 군당 5마리 마우스)을 나타내는 그래프이다. 도면에서,
Figure 112008068558824-pat00006
는 1 ×109 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00007
는 3 ×108 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00008
는 1 ×108 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00009
는 3 ×107 PFU로, 벡터를 주입한 군이다. 식염수는 생리적 식염수를 주입한 군을 타내내며, UV-불활성화는 UV-불활성화 아데노바이러스 입자를 주입한 군을 나타낸다.
도 4는 노던(Northern) 블롯팅의 결과를 나타낸 사진이다. A549 세포 또는 HepG2 세포를 100의 moi (다중감염도)로 하기 나타낸 각각의 아데노바이러스 벡터에 감염시키고, 24시간 후 세포로부터 RNA를 얻어내었다. 5㎍의 각각의 RNA를 전기영동한 후, (A) L3 RNA, (B) IVa2 RNA 및 (C) pIX RNA를 노던 블롯팅에 의해 검출되었다. 겔 상의 기호는 다음을 나타낸다. 모크: 거짓 감염 (mock infection), lwl: Axlwl, CAwt: AxCAwt, HGH: Ax1CAHGH, △E2A: △E2A-CAHGH. 겔 우측의 화살표 및 숫자는 목적 밴드의 위치 및 크기를 나타낸다.
우측 표지된 Ad5에 대한 3개의 레인은 양성 대조군이다. E3 유전자만을 삭제시킨 5형 아데노바이러스 야생형 (Ad5-dlX: Saito I. 등, J. Virol. 54: 711-719 (1985)) 유래의 바이러스로 HepG2 세포를 10의 moi로 감염시키고, 24시간 후에 RNA를 얻어내었고, 도면에 나타낸 RNA의 양에 대해 전기영동을 수행하였다.
도 5는 단백질 IX (pIX) 유전자의 노던 블롯팅의 결과를 나타낸 사진이다. A549 세포를 AxCAwt 또는 AdCMVlacZ로 도면에 나타나 있는 moi로 감염시키고, 24시간 후에 세포로부터 RNA를 얻어내었다. dlemf 각각으로부터의 5㎍의 RNA에 대해 전기영동을 수행한 다음, pIX RNA를 노던 블롯팅에 의해 검출하였다. 도면에서의 약자는 다음을 나타낸다. 모크: 거짓 감염, CAG: AxCAwt, CMV: AdCMVlacZ.
우측표지된 Ad5에 대한 3개의 레인은 양성 대조군이다. A549 세포는 Ad5-dlX (도 4 참조)를 이용하여 10의 moi로 감염시키고, 24시간 후 RNA를 얻어내었고 도면에 나타낸 RNA 양에 대해 전기영동을 수행하였다.
도 6은 pIX 유전자의 노던 블롯팅의 결과를 나타낸 사진이다. A549 세포를 도면에 나타난 각각의 아데노바이러스 벡터로 30 또는 100의 moi로 감염시키고 24시간 후 세포로부터 RNA를 얻어내었다. 이들 각각으로부터의 5㎍의 RNA에 대해 노던 블롯팅을 수행하고, pIX RNA를 검출하였다.
도 7은 다른 프로모터를 갖는 아데노바이러스가 주입된 C57BL/6 마우스에서 혈청 GPT 양의 하루 변화량에 대한 평균값을 나타내는 그래프이다 (각 군당 5마리 마우스). 도면에서,
Figure 112008068558824-pat00010
는 1 ×109 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00011
는 3 ×108 PFU로,
Figure 112008068558824-pat00012
는 1 ×108 PFU로 벡터를 주입한 군이다.
도 8은 pIX-융합 단백질 (GST-pIX)에 대해서 배양한 항혈청을 사용하여 수행한 웨스턴 블롯팅의 결과이다. A549 세포를 Ad5-dIX (도 4 참조)로, 10의 moi로 감염시키고, 세포를 약 하루 후에 채취한 다음, SDS 샘플 완충액에 용해하였다. 세포 용해물 또는 정제 바이러스 입자 (7.5 ×107 PFU)에 대해, 환원 조건하에, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행한 다음, 항-pIX 항혈청 #1 (항-pIX) 또는 면역전 혈청 (면역전)을 사용하여 웨스턴 블롯팅함으로써, pIX를 검출하였다. 도면 내의 약자는 다음을 나타낸다. 모크: 감염시키지 않은 세포, Ad5: Ad5-dIX 감염된 세포, 비리온: 정제된 바이러스 입자. 도면의 우측의 숫자값 은 분자량 마커의 분자량을 의미한다. 분자량 마커로서, 사전 염색된 분자량 마커 (GIBCO BRL, Cat. No. 10748-010)를 사용하였고, 사용된 분자량은 염색되지 않은 분자량 마커 (New England Biolabs, Cat. No. P7702S)의 이동성으로부터 보정되었다. 괄호내의 숫자값은 염색되지 않은 분자량 마커를 이용하여 보정되지 않은 값이다.
도 9는 pIX의 웨스턴 블롯팅 결과를 보여주는 사진이다. A549 세포를 AxCAwt (moi 100), Awlwl(moi 100) 또는 Ad5-dIX (moi 10)로 감염시키고, 세포를 약 하루 후에 채취하고, SDS 샘플 완충액에 용해하였다. SDS-PAGE 후에, 웨스턴 블롯팅을 수행하여, pIX를 검출하였다. 도면 내의 약자는 다음을 나타낸다. Ad5: Ad5-dIX 감염된 세포, CAwt: AxCAwt 감염된 세포, lwl: Awlwl 감염된 세포, 모크: 감염되지 않은 세포. 도면 우측면의 숫자값은 분자량 (도 8 참조)을 의미한다.
도 10은 단백질 IX-재위치화 아데노바이러스 벡터, pIX 삭제 아데노바이러스 벡터 등의 구조를 나타내는 모식도이다. 도면에서, lacZ는 E.Coli lacZ 유전자의 발현 단위를 나타내며, pIX는 단백질 IX 유전자를 나타내고, psi는 패키징 시그널을 나타내며, CAG는 CAG 프로모터를 나타내고, hGH는 인간 성장 호르몬 cDNA를 나타내며, pA는 폴리(A) 서열을 나타낸다. 화살표는 각 유전자의 전사 방향을 나타낸다.
도 11은 코스미드 벡터 pAx△pIXcw 및 pAx△pIXCAHGH의 구축방법을 나타내는 모식도이다. 도면에서, 펼쳐진 상자 (open box)는 인간 5형 아데노바이러스 게놈을 나타내고, 얇은 선 부분은 E.Coli 유래의 DNA 서열을 나타낸다. 제한 효소 상 의 숫자값은 인간 5형 아데노바이러스에서 각 제한 효소의 인식부위의 뉴클레오티드 번호를 나타내고, APR은 암피실린 내성 유전자를 나타내며, ori는 E.coli의 복제 원점을 나타내고, COS는 λ파지의 COS 부위를 나타낸다.
도 12는 pIX 발현 세포주의 단백질 IX 유전자의 노던 블롯팅 결과를 나타내는 사진이다. pIX 발현 세포주의 4개의 클론 (#2, #5, #6, #10)이 30회 계대 (passage) (각각 5회 계대)로 서브클로닝하고, RNA를 세포주로부터 얻은 다음, 노던 블롯팅을 수행하였다. 도면에서, P1, P5, P10, P15, P20, P25 및 P30은 계대 횟수를 나타낸다. 좌측면 상의 3개의 레인은 음성 대조군 및 양성 대조군이다. 모크는 그 바이러스에 있지 않은 293 세포로부터 얻어된 RNA를 나타내며, 8hr 및 24hr은 Axlwl로 293 세포를 10의 moi로 감염시킨 후 8시간 (8hr) 및 24시간 (23hr) 째에 얻어진 RNA를 나타낸다.
도 13은 pIX 발현 세포주의 pIX의 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 사진이다. pIX 발현 세포주의 4 개의 클론 (#2, #5, #6, #10)을 25회 계대로 2차배양한 다음, SDS 샘플 완충액에 용해하였다. SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯팅을 수행하여 pIX를 검출하였다. 우측면상의 3개의 레인은 음성 대조군 및 양성 대조군을 나타낸다 (상세하게는, 도 12 참조). 분자량 마커로서, 염색되지 않은 분자량 마커 (New England Biolabs, Cat. No. P7702S)가 사용되었다.

Claims (13)

  1. 하기 (14), (15) 및 (17)의 특성을 갖고, 생체내 투여동안 염증이 경감되거나 또는 유도되지 않는 재조합 아데노바이러스 벡터:
    (14) 상기 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자가 결실되어 있음;
    (15) 아데노바이러스 게놈의 E1A 및 E1B 유전자의 결실 부위에, 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자의 발현을 유도하지 않는 외래 프로모터인 EF-1α 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 도입되어 있고, 또한, 상기 외래 프로모터인 EF-1α 프로모터를 함유하는 외래 유전자가 좌측 방향으로 삽입되어 있고, 단백질 IX 유전자 발현이 유도되지 않음으로써 당해 재조합 아데노바이러스 벡터의 생체내 투여시의 염증이 경감되거나 또는 유도되지 않음; 및
    (17) 상기 아데노바이러스 게놈의 단백질 IX 유전자가 본래 위치에서 유지됨.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터를 활성성분으로서 포함하고, 생체내 투여동안에 염증을 경감하거나 유발하지 않는 약학 조성물.
  9. 생체내 투여동안 염증을 경감하거나 유발하지 않는 약학 조성물의 제조를 위한, 제 1 항에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터의 사용방법.
  10. 생체내 투여동안 염증을 경감하거나 유발하지 않는 유전자 치료용 약학조성물의 제조를 위한, 제 1 항에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터의 사용방법.
  11. 제 1 항에 기재된 재조합 아데노 바이러스 벡터를, 인간을 제외한 동물 개체에 유전자 도입하기 위한 벡터로서 사용하는 방법.
  12. 제 1 항에 기재된 재조합 아데노 바이러스 벡터를 사용하여, 염증을 경감시키거나 혹은 유도하지 않고, 인간을 제외한 질환 모델 동물을 제조하는 방법.
  13. 제 1 항에 기재된 재조합 아데노 바이러스 벡터를 사용하여, 외래 유전자의 기능을 해석하는 방법.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4744771B2 (ja) * 2000-05-26 2011-08-10 大日本住友製薬株式会社 副作用を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター
JP4237449B2 (ja) * 2002-06-05 2009-03-11 国立医薬品食品衛生研究所長 アデノウィルスベクター
KR100808269B1 (ko) 2006-07-18 2008-02-29 연세대학교 산학협력단 Ｃａｇ 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 셔틀벡터
KR101667094B1 (ko) * 2010-08-16 2016-10-17 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 항암 아데노바이러스
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
CN104388398A (zh) * 2014-11-19 2015-03-04 中国人民解放军第二军医大学 一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒及其应用
WO2017147269A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
EP3390428B1 (en) 2016-02-23 2019-09-25 Salk Institute for Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
JP7216668B2 (ja) * 2017-05-26 2023-02-01 エピセントアールエックス，インコーポレイテッド 導入遺伝子を保持する組換えアデノウイルス
AU2019251356B2 (en) 2018-04-09 2025-06-12 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions with enhanced replication properties
CN108424934A (zh) * 2018-04-16 2018-08-21 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种慢病毒cag-cmv双启动子改造载体构建及应用
US20210355506A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Lysogene Compositions and methods for treating gm1 gangliosidosis and other disorders
CA3200833A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Synplogen Co., Ltd. Production of virus vector plasmid in bacillus subtilis
JP7329296B2 (ja) 2020-11-04 2023-08-18 株式会社シンプロジェン 統合型プラスミド
AU2023265204A1 (en) 2022-05-02 2024-12-19 Synplogen Co., Ltd. Virus-derived construct plasmid library and construction of same
JPWO2023214579A1 (ko) 2022-05-02 2023-11-09
EP4624584A1 (en) 2022-12-27 2025-10-01 Synplogen Co., Ltd. Helper gene control

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534015A (en) * 1992-02-18 1996-07-09 Angeion Corporation Method and apparatus for generating biphasic waveforms in an implantable defibrillator
US5591209A (en) * 1994-05-19 1997-01-07 Angeion Corporation Implantable defibrillator system for generating an active biphasic waveform
DE4301783C1 (de) * 1993-01-23 1994-02-03 Lohmann Therapie Syst Lts Transdermales therapeutisches System mit Galanthamin als wirksamem Bestandteil
US6080569A (en) * 1993-06-24 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Adenovirus vectors generated from helper viruses and helper-dependent vectors
US20070259429A9 (en) * 1993-10-25 2007-11-08 Canji,Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
TW442569B (en) * 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
US20010006629A1 (en) * 1993-10-25 2001-07-05 Richard J. Gregory Recombinant adenoviral vector and methods of use
SK283703B6 (sk) * 1993-10-25 2003-12-02 Canji, Inc. Rekombinantný adenovírusový vektor a jeho použitie
US6210939B1 (en) * 1993-10-25 2001-04-03 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
JP3557276B2 (ja) 1994-03-07 2004-08-25 株式会社林原生物化学研究所 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体
US5731172A (en) * 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
JP4159620B2 (ja) * 1994-03-09 2008-10-01 大日本住友製薬株式会社 組換えアデノウイルスの製造方法
US5851806A (en) * 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
JP3770333B2 (ja) * 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
ES2300105T3 (es) * 1995-03-24 2008-06-01 Genzyme Corporation Vectores adenoviricos para terapia genica.
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5801030A (en) 1995-09-01 1998-09-01 Genvec, Inc. Methods and vectors for site-specific recombination
AU5253998A (en) * 1996-11-13 1998-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement
JPH10146191A (ja) * 1996-11-15 1998-06-02 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ウィルソン病治療用の組換えアデノウイルスベクター
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
DK1071806T3 (da) * 1998-04-24 2004-07-19 Univ Florida Rekombinant adeno-associeret virus-vektor, der koder for alpha-1-antitrypsin i genterapi
WO1999057296A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Genzyme Corporation Partially deleted adenoviral vectors
US6328958B1 (en) * 1998-08-28 2001-12-11 Duke University Deleted adenovirus vectors and methods of making and administering the same
US6365394B1 (en) * 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
JP4744771B2 (ja) * 2000-05-26 2011-08-10 大日本住友製薬株式会社 副作用を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene Ther. Vol.7(7):556-567 (2000.04. *
Gene Ther. Vol.7(7):556-567 (2000.04.*
J Immunol. Vol.164(6):3402-3412 (2000.03.15.) *
J Immunol. Vol.164(6):3402-3412 (2000.03.15.)*
J Virol. Vol.69(11):6627-6633. (1995.11.) *

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