KR101267967B1 - 면역 관련 질병을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드를 포함하는 면역조절제, 중증 패혈증 또는 급성 호흡부전 증후군(ARDS)과 같은 면역관련 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 방법, 및 항염증제, 항균제, 또는 면역세포 자가사멸의 저해제에 대한 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

면역 관련 질병을 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR PREVENTING AND TREATING IMMUNE-RELATED DISORDER}

본 발명은 펩타이드를 포함하는 면역조절제, 및 중증 패혈증, 급성 호흡부전 증후군(acute respiratory distress syndrome, (ARDS))과 같은 면역관련 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 방법, 그리고 항염증제, 항균제 또는 면역세포 자가사멸(apoptosis)의 저해제에 관한 펩타이드 용도에 관한 것이다.

FPR은 호중구, 모노사이트, 매크로파지 및 수지상 세포 와 같은 식균세포(phagocytic cell)에서 발견되는 오래된 화학주성물질의 수용체로서 G-단백질과 결합한다. 3종류의 FPR(FPR, FPR-유사 (FPRL)1, 및 FPRL2)와 두 종류 FPR (사람의FPR에 대응되는 FPR1과, 사람의 FPRL1에 대응되는 FPR2)가 사람과 마우스에서 각각 동정되었다. FPR 패밀리 일원의 활성화는 백혈구의 화학주성에 따른 이동을 유도하고, 호중구와 모노사이트에서 수퍼옥사이드 음이온 생성을 통해 살균활성을 유도한다. 식균세포에서 화학주성에 따른 이동을 촉진할 수 있는 합성 펩타이드인 WKYMVm는 FPR 패밀리(마우스에서 FPR1 및 FPR2, 사람에서 FPR, FPRL1 및 FPRL2)의 일원에 시험관내에서 결합하고 수퍼옥사이드 음이온 생성을 통해 모노사이트 및 호중구의 살균활성을 증가시킨다. WKYMVm은 또한 자가사멸을 방지함으로써 모노사이트 생존율을 향상시킨다고 보고되었다(Bae, Y.S., et al., J. Leukoc. Biol. 71:329-338, 2002). 따라서, 이러한 실험은 미생물 감염후 중증 패혈증으로의 진행에서 FPR 작동제(agonist)인 WKYMVm의 치료효과 및 기능적 기작을 연구하며, 이러한 근거는 패혈증-유도 치사율의 주요 원인은 제어되지 않은 세균감염이며, FPR 활성화가 면역세포 및 염증세포의 살균 활성을 증가시킨다는 생각에 근거한 것이다.

최근 연구에 의하면, 패혈증-유도 치사는 초기 패혈증(즉, 처음 6시간)동안에 선천적 면역시스템의 실질적인 손상으로 인해 염증반응을 조절능이 없음이 동반된다. 또한, 패혈증동안에 과도한 림프구의 자가사멸의 결과로 여러 기관 파괴의 임상적 징후가 나타난다. 게다가, 최근 연구에 의하면, 사이토카인의 수준이 패혈증 동안 급격히 변화되며, 특히 TNF- α and IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인 수준이 급격히 증가한다. 이러한 고찰은, 중증 패혈증 또는 패혈증 쇼크에 의한 치사를 효과적으로 방지하기 위해서는 식균세포의 살균활성을 증가시키고, 전염증성 조절자의 생성을 저해하고, 항원-특이적 후천성 면역반응을 연장시키는 약물이 필요하다.

중증 패혈증 또는 패혈증 쇼크를 갖는 많은 환자들은 적극적인 치료에도 불구하고 죽는다. 중증 패혈증을 예방하는 한가지 방법은 엔도톡신의 중화이나, 이러한 치료적 개입의 목표는 역설적이다(Riedemann, N.C., et al., Nat. Med. 9:517-524). 위약 치료 임상시험에서, 엔도톡신에 대한 단클론 항체는 중증 그람-음성 박테리아 패혈증을 앓는 환자의 죽음을 막지 못했다( Cohen, J. Br. Med. Bull. 55:212-225, 1999). 미생물 자극원에 무관하게 염증을 치료하기 위한 또 다른 부속치료법, 예를 들면 직간접적으로 염증 조절자 (혈소판 활성화 인자의 길항근(Dhainaut, J.F., et al., Crit. Care Med. 26:1963-1971, 1998), 재조합 IL-1β 수용체의 길항근(Fisher, C.J. et al., JAMA. 271:1836-1843, 1994), TNF-α 에 대한 유전적으로 제조된 수용성 수용체, 및 TNF-α에 대한 단클론 항체)의 활성을 차단하는 치료법은 중증 패혈증 또는 패혈증 쇼크를 갖는 환자의 죽음을 막지 못했다(Riedemann, N.C., et al., Nat. Med. 9:517-524, 2003).

본 발명은 CLP로 패혈증을 유도한 후에, WKYMVm으로 FPR을 활성화시켜, 식균세포의 직접적 및/또는 IFN-γ-매개 살균활성화 경로, IL-17 생산의 증가(up-regulation)에 의해 부분적으로 조절되는 전염증성 조절자의 생산을 감소시킨(down regulation) 항염증 활성효과, 및 면역세포에서의 항-자가사멸효과와 같은 다중 치료경로를 통해 마우스에서 효과적으로 CLP-유도 치사를 방지하는 것이다. WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 다중경로를 통해 미생물 감염후 중증 패혈증으로의 진행을 효과적으로 방지한다. 따라서, FPR 활성화는 패혈증 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료 표적일 수 있다.

본 발명의 발명자들은 트립토판-리신-티로신-메티오닌-발린-디-메티오닌(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met, WKYMVm)에 의한 포밀펩타이드 수용체(FPR)의 활성화가 죽음으로부터 보호하고, 폐염증을 저해하고, 면역세포 자가사멸을 방지하며, 살균활성을 증가시키는 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 트립토판-리신-티로신-메티오닌-발린-디-메티오닌(WKYMVm)의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 면역조절제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 면역조절제를 함유하는 약학 조성물로서, 급성 호흡부전증(ARDS) 또는 중증 패혈증을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중증 패혈증에 의해 유도되는 비장림프구 또는 흉선세포의 감소를 저해하는, 상기 면역조절제를 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 면역조절제를 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 대상의 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법에서, 면역 반응의 조절은 항염증반응, 항균 반응, 면역세포 자가사멸 저해, 또는 중증 패혈증 또는 ARDS의 예방 또는 치료에 관련된다.

후술할 상세한 설명에서, 본 명세서의 한 부분인 도면을 참조하여 설명하도록 한다. 도면에서, 유사한 부호는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한, 일반적으로 유사한 구성요소를 의미한다. 상세한 설명에서 기술되는 실시예, 도면, 및 청구항은 제한되는 것을 의미하지 않는다. 본 명세서에서 제시된 주제의 범위 또는 정신을 벗어나지 않는 다른 구현예들이 활용될 수 있으며, 다른 변형들이 가능하다.

본 발명의 일예는 서열번호 1로 표시되는 트립토판-리신-티로신-메티오닌-발린-디-메티오닌(WKYMVm)의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 면역조절제를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 일예는 WKYMVm의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는 면역조절제를 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 대상의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.

WKYMVm펩타이드는 마우스에서 포밀 펩타이드 수용체 1(FPR1) 및 포밀 펩타이드 수용체 2(FPR 2), 및 사람에서는 FPR, FPRL1 및 FPRL2에 결합하여 활성화시킴으로써, 대상에서 면역 반응을 조절한다. WKYMVm는 FPR패밀리 수용체에 결합하는 것으로 보고되었기 때문에. 다른 FPR 리간드에 대한 치료효과를 평가하였으나 WKYMVm펩타이드는 치료효과가 없었다(도 1G)

또한, 상기 펩타이드는 인터루킨-1 β(IL-1β), 종양 사멸인자 TNF-α (TNF-α), 또는 인터루킨-6 (IL-6)와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 인터페론-γ (IFN- γ), 인터루킨-2 (IL-2), 또는 인터루킨-12 (IL-12)와 같은 Th1 사이토카인의 발현을 증가시킨다. 상기 펩타이드는 인터루킨-17(IL-17)의 발현을 증가시키고, 전환성장인자- β (TGF- β) 또는 IL-10과 같은 항염증 사이토카인의 발현을 증가시킨다.

WKYMVm 펩타이드는 전염증성 사이토카인의 생산을 감소하도록 조절하고, FPR 활성화는 전염증성 사이토카인 생산의 직접적 저해를 통해 급성 염증을 방지함으로써 치료효과를 나타내기 때문에, WKYMVm는 항염증제로 사용된다.

본 발명에 따르면, 면역 반응의 조절은 또한 면역세포의 자가사멸을 저해하는 것을 포함한다.

WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 복막액으로부터 세균의 제거에 영향을 미치고, 향상된 세균 제거와 관련 있는 H₂O₂ 생산을 향상시킨다. 따라서, WKYMVm 펩타이드는 항균제로 사용된다. CLP로 패혈증을 유도한 후 WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 식균세포의 직접적 및/또는 IFN-γ-매개 살균활성화 경로, IL-17 생산의 증가(up-regulation)에 의해 부분적으로 조절되는 전염증성 조절자의 생산을 감소시킨(down regulation) 항염증 활성효과, 및 면역세포에서의 항-자가사멸효과와 같은 다중 치료경로를 통해 마우스에서 CLP-유도 치사를 효과적으로 방지한다. WKYMVm(서열번호 1)에 의한 FPR 활성화는 다중 경로를 통해 미생물 감염 이후에 중증 패혈증으로 진행되는 것을 효과적으로 방지한다. 따라서, FPR 활성화는 중증 패혈증 및 급성 호흡부전증의 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료 표적일 수 있다. WKYMVm 펩타이드의 항염증제, 항균제, 또는 면역세포 자가사멸의 저해제는, 염증성 사이토카인의 발현감소 및 Th1 사이토카인의 증가에 의한, 중증패혈증의 예방 및 치료효과와 주로 관련된다. 또한, IL-10, 및 TFG- β 및 IL-10 항염증 사이토카인과 같은 항염증 사이토카인의 WKYMVm 펩타이드에 의한 발현증가와 같은 면역 조절 활성은 주로 ARDS 예방 및 치료와 관련된다.

WKYMVm 펩타이드와는 달리, WKYMVm 유사체인 WRYMVm(서열번호 2), WKWMVm(서열번호 3), WKRMVm(서열번호4), WKFMVm(서열번호 5), WHYMVm(서열번호 6), WKYMYm(서열번호 7), WKYMFm(서열번호 8), WKYMWm(서열번호 9), WKYMVV(서열번호 10), 또는 WKEMVm(서열번호 11)는 실험적 패혈증에 대해 치료효과가 없다(도 1h)

바람직하게는, WKYMVm 펩타이드는 사람에서 0.0064 내지 6.4 mg/kg.day, 더욱 바람직하게는 0.064 내지 0.64 mg/kg.day 을 투여할 수 있다. 상기 투여량 범위에서, WKYMVm 펩타이드는 WKYMVm 유사체에 보다 CLP 마우스 모델에서 더욱 월등한 치료효과를 나타낸다.

상기 WKYMVm 펩타이드를 활성성분으로 포함하는 조성물은, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 담체을 포함할 수 있으며, 상기 담체는 상기 예시된 담체에 한정되는 것은 아니다.

상기 활성성분은 다양한 관련 인자를 고려하여 투여량을 결정할 수 있으며, 상기 관련 인자는 치료상태, 환자의 증상 심각성, 다른 약물과의 병용투여(예를 들어, 화학요법제), 나이, 성별, 개개의 환자별 체중, 음식, 투여시간, 선택된 투여경로, 및 조성물의 함량등을 포함한다. 상기 조성물은 1일에 1회 또는 1-3회로 분할투여할 수 있으며, 질병의 종류 및 중증도를 고려하여 투여경로와 투여량를 결정할 수 있지만 바람직하게는 12시간 간격으로 1일 2회 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 입 이외의 경로를 통해 약물을 투여하는 것으로서, 직장, 정맥, 복막내, 근육내, 동맥내, 경피, 경비, 흡입, 눈 및 피하로 투여할 수 있다.

상기 펩타이드를 포함하는 약학 제제는 경구투여 형태, 주사액, 또는 국소제제 등과 같은 어떠한 형태로도 제조될 수 있다. 상기 제제는 바람직하게는 경구 및 주사투여형태 (참용액, 현탁액 또는 에멀젼)로 제조될 수 있으며, 가장 바람직하게는 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수용제제, 알약, 과립 등과 같은 경구 제제일수 있다.

상기 제제를 제조함에 있어서, 상기 펩타이드는 부형제 없이 연질캡슐에 충진되거나, 담체와 혼합 또는 희석된 후에 적절한 제제형태로 제조될 수 있다. 상기 적합한 담체의 예로는 전분, 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.

CLP 패혈증 유도후, WKYMVm에 의한 FPR 활성화는, 식균세포의 직접적 및/또는 IFN-γ-매개 살균활성화 경로, 전염증성 조절자의 생산을 감소시키는 것(down regulation)을 통한 항염증 효과, 및 면역세포에서의 항-자가사멸효과와 같은 다중 치료경로를 통해 마우스에서 CLP-유도 치사를 효과적으로 방지할 수 있다. WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 다중경로를 통해 미생물 감염후 중증 패혈증으로의 진행을 효과적으로 방지할 수 있다. 따라서, FPR 활성화는 패혈증의 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료 표적일 수 있다.

중환자실에서 사망의 주요 원인인 중증 패혈증은 숙주의 면역반응이 침입한 미생물과 싸움에 실패할 때 일어난다. WKYMVm 펩타이드에 의한 포밀 펩타이드 수용체(FPR) 활성화는 맹장 결찰 및 천공(CLP) 패혈증 마우스 모델에서 죽음으로부터 보호하며, 폐염증을 방지하고, 면역세포 자가사멸을 차단하고, 살균활성을 증가시킨다. WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 시험관내(in vitro)에서 마우스의 호중구에 의한 H₂O₂ 생성 및 살균활성을 증가시킨다. FPR 활성화는 또한 CLP 마우스에서 IFN-γ의 생산을 증가시킨다. FPR 활성화의 치료 및 살균효과 (bactericidal effect)는 IFN-γ 결핍 마우스에서 부분적으로 역전되며, 반면 표적 기관 염증이 없다. 이와 대조적으로, FPR 활성화는, CLP 마우스에서 TNF-α 및 IL-1β의 생산을 저해한다. 게다가, FPR 활성화는 그람-음성 박테리아에서 주요한 병원체-관련 분자패턴인 LPS에 유도된 전염증성 조절자의 생산을 저해한다. 마지막으로, FPR 활성화는 CLP-유도 면역세포 자가사멸을 저해하며, 이러한 활성은 CLP-유도 IFN-γ 결핍 마우스에서는 일어나지 않는다. 이러한 실험결과에 의하면, FPR 활성화가 다중경로를 통해 미생물의 감염후 중증 패혈증으로 진행되는 것을 효과적으로 방지함을 제시한다.

패혈증에 동반하는 면역성의 감소조절(down regulation)은 림프구 자가사멸의 진행과 관련된다. 따라서, 패혈증-유도 림프구 자가사멸의 저해는 좋은 치료 표적일 수 있다. WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 우수한 치료 접근법일 수 있다. 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 실험에 의하면, FPR 활성화는 LPS-유도 전염증성 사이토카인의 생산을 저해한다. 이러한 발견은, FPR 활성화가 전염증성 사이토카인 생산의 직접적인 저해를 통해 급성 염증반응을 방지함으로써 그 치료적 효과를 나타낸다는 것을 제시한다. 따라서, WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 패혈증 치료에 있어서 개별 전염증성 조절자를 효과적으로 차단할 수 있다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 WKYMVm 또는 그 유사체는 염증성 사이토카인인 IL-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-6의 발현 감소, Th1 사이토카인인 IFN-γ(interferon-γ), IL-2 및 IL-12의 발현 증가 및 반응성 산소 생성 증가, 패혈증에 의해 유발되는 비장림프구(splenocyte) 또는 흉선세포(thymocyte)의 감소 억제 등의 효과를 나타내므로 패혈증 치료제로 작용할 수 있어 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하다.

본 발명의 더욱 완전한 이해를 돕기 위해, 그리고 이익을 위해, 동반되는 도면과 결부하여 이루어진 하기 설명을 참조하여 설명하도록 한다.
도 1a 내지 도 1f는 동물모델에서 패혈증-유도 치사에 대한 WKYMVm의 보호효과를 나타낸 것이다.
도 1g 내지 1h는 다른 FPR 리간드에 대한 WKYMVm 및 WKYMVm 유사체의 치료효과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 CLP-유도 세균 콜로니 수, 비장림프구 사멸 및 폐염증에 대한 WKYMVm의 효과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3e는 WKYMVm가 H₂O₂ 생성을 통해 시험관내에서 살균활성을 증가시키는 것을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 Th1 및 Th2 마우스 모델에서 불활성 항원에 대한 반응으로서 CLP-유도 비장 림프구 자가사멸(apoptosis) 및 비장림프구 증식에 대한 WKYMVm의 효과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5g는 중증 패혈증에 대한 WKYMVm-유도 보호에 있어서 IL-12 및 IFN-γ의 역할을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6d는 염증성 사이토카인 생성의 변화에 미치는 WKYMVm의 역할을 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7e는 WKYMVm의 항염증 효과가 IL-17매개 경로에 의존적임을 나타내는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 할 것이다.

실시예 1

1-1. CLP 마우스 모델에서 WKYMVm 의 치료효과

이전 논문에 기술한 대로(Yan, J.J., Nat. Med. 10:161-167, 2004), 수컷 WT ICR 마우스 및 IL-12R 2-, IFN-γ -결핍 및 WT C57BL/6 마우스(대한민국, 포항공과대학교Y.C. Sung으로부터 기증받음)를 패혈증 모델동물로 사용하였다. 동물 관련 모든 실험은 동아대학교 동물 관리 및 이용에 관한 임상심의위원회의 가이드라인에 따르며, 이의 승인을 받았다. CLP를 위해서, 마우스를 펜토탈 소디움(복막내주입, 50mg/Kg)으로 마취시키고, 복부 정중선을 약간 절제하여 맹장을 노출시켰다. 상기 맹장을 회맹부 관(ileocecal valve) 아래 부위를 결찰한 후, 맹장에 22 게이지 바늘로 양면에 걸쳐 두 번 구멍을 내고(또는 사이토카인 생산량 측정을 위해 한번) 복부를 봉합하였다. 쉠(Sham) CLP 마우스도 상기 방법과 동일하게 수행하였으나 맹장의 결찰 및 천공을 하지 않았다. 10일간 1일 1회 생존율을 관찰하였다.

실험적 패혈증에 대한 WKYMVm의 치료효과를 조사하기 위해서, 알비노 ICR(암연구센터, Institute of Cancer Research) 마우스에 대해서도 CLP를 수행하고, 생존율을 10일까지 관찰하였다. CLP후 2일째, 마우스의 치사율을 급격히 증가하였다(도 1a). CLP 수술후 2, 14, 26, 및 38시간 경과시에 다양한 농도로WKYMVm를 CLP 마우스에 4회 피하주사하였다.

WKYMVm 치료 효과를 조사하기 위해서, 음성 대조군으로서 다양한 농도의 펩타이드 또는PBS를 CLP 후 2시간부터 시작하여 피하로 주사하였다. PBS 투여군에 비해 4 또는 8 mg/kg WKYMVm 투여군에서 월등히 마우스 생존율이 증가하였다(도 1a). CLP수행후 10시간째 WKYMVm를 투여한 경우, 치료효과는 CLP수행후 2시간째 펩타이드를 투여한 경우와 유사하였다(도 1b). 여러 가지 농도의 WKYMVm를 피하로 4회 CLP 마우스에 CLP 수행후 10, 22, 34 및 48시간째에 투여하였다.

주사빈도면에서, 4 mg/kg WKYMVm 를 CLP 수행후 2시간째 투여하고, 12시간 간격으로 3 또는 4회 추가 투여한 경우에 생존율이 크게 증가하였다 (도 1c). WKYMVm (4mg/kg, 피하주사)을 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5회 CLP 마우스에 주입하였다. 상기 결과로부터, 이후 실험은, 4 mg/kg WKYMVm 를 CLP 수행후 2시간째 투여하고, 12시간 간격으로 3회 추가 투여한 CLP 마우스를 사용하여 수행하였다.

FPR1 및 FPR2의 기능을 평가하기 위해, FPR1 길항제[N-t-butoxycarbonyl-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe (Boc-PLPLP)(서열번호 12)] (La, M., et al., FASEB J. 15:2247-2256) 및 FPR2 길항제 [Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp; WRWWWW (WRW⁴)(서열번호 13)] (Bae, Y.S et al., J. Immunol. 173:607-614.)를CLP 마우스에 WKYMVm 투여 전에 투여하였다. WRW⁴ 를 먼저 투여한 경우 WKYMVm의 치료효과는 완전히 역전되었으며, Boc-PLPLP를 먼저 투여한 경우에는 부분적으로만 역전되었다(도 1d). CLP를 수행하기 2시간 전에 Boc-PLPLP (4 mg/kg), WRW⁴ (4 mg/kg), 또는 Boc-PLPLP (4 mg/kg) + WRW⁴ (4 mg/kg)를 피하로 투여하였다. CLP를 수행한 후에, Boc-PLPLP (4 mg/kg) 또는 WRW⁴ (4 mg/kg)를 WKYMVm 처리 (4 mg/kg, 피하투여)하기 2시간 전에 12시간 간격으로 4회 피하투여하였다.

통계 분석: 생존 데이터를 log-rank 테스트법으로 분석하였다. 모든 다른 데이터는 ANOVA를 사용하여 분석하였다. Bonferroni 테스트를 사용하여 사후비교를 수행하였으며, 통계적 유의성은 P<0.05에서 선험적 설정하였다.

1-2: 대장균(E. coli ) 접종 마우스 모델에서 WKYMVm 의 치료효과

마우스에 대장균(1 × 10⁹ 세포/마우스)을 복막내 투여한 후, 2, 14, 26, 및 38시간에 4회 WKYMVm (4 mg/kg)을 피하주사하였다. 본 실시예는 또한 다른 패혈증 마우스 모델에서 WKYMVm의 치료효과를 평가하였다. PBS를 투여한 대장균 접종 마우스에 비해, 대장균(1 × 10⁹)을 접종하고 접종 후 2시간째부터 시작하여 12시간 간격으로 4회 4 mg/kg WKYMVm를 피하투여한 마우스에서 치사율이 감소하였다(도 1e).

1-3: LPS 를 주사한 마우스 모델에서 WKYMVm 의 치료효과

게다가, WKYMVm은 또한 60 mg/kg LPS를 복막내로 주사한 마우스의 치사율을 감소시켰다(도 1f). 60 mg/kg LPS를 복막내 투여한 후 2, 14, 26 및 38시간째에 PBS 또는 WKYMVm (4 mg/kg)를 피하로 4회 주사하였다. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시하였다. 용매 대조군(a-g)에 비해 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001이고, 샘플크기 n=16-24(a-e) 또는 n=8(f, g) 마우스/그룹이다.

비교예 1

1-1: FPR 리간드에 대한 WKYMVm 의 치료효과

WKYMVm는 FPR 패밀리 수용체에 결합하기 때문에, 다른 FPR 리간드의 치료효과 또한 평가하였다. Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met (WKYMVM)(서열번호 14) (Baek, S.H., et al.,J. Biol. Chem. 271:8170-8175), N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (서열번호 15), 및 MMK-1 펩타이드 (LESIFRSLLFRVM)(서열번호 16) (Klein, C., et al., Nat. Biotechnol. 16:1334-1337)의 치료효과는 WKYMVm 보다 낮았다(도 1g).

또한, 불활성 스크램블 펩타이드인 Val-Trp-Met-Tyr-D-Met-Lys (VWMYmK) (서열번호 17)는 치료효과가 없었다 (도 1G). FPR-패밀리 작용제 (WKYMVm (서열번호 1), WKYMVM(서열번호 14), fMLF(서열번호 15) 및 MMK-1(서열번호 16)) 또는 스크램블 펩타이드 (VWMYmK: 서열번호 17) (각각 4mg/kg)를 CLP 마우스에 CLP수행후 2, 14, 26, 및 38 시간에 4회 피하주사하였다.

1-2. WKYMVm 유사체의 치료효과

WKYMVm(서열번호 1)의 유사체, WRYMVm(서열번호 2), WKWMVm(서열번호 3), WKRMVm(서열번호 4), WKFMVm(서열번호 5), WHYMVm(서열번호 6), WKYMYm(서열번호 7), WKYMFm(서열번호 8), WKYMWm(서열번호 9), WKYMVV(서열번호 10) 및 WKEMVm(서열번호 11)가 실험적 패혈증에 대해서 치료효과가 있는지를 검사하기 위해, 알비노 ICR 마우스에 CLP를 수행하고, 10일까지 생존율을 관찰하였다. CLP 수행후 2일째에, 마우스 치사율을 급격히 증가하였다(도 1h). WKYMVm 또는 WKYMVm의 각 유사체 4 mg/kg을 CLP 수행후 2, 14, 26, 및 38시간째 CLP 마우스에 4회 피하주사하였다(도 1h).

실시예 2

WKYMVm 에 의한 생존 증가는 박테리아 콜로니수 , 비장림프구 사멸 및 폐염증의 감소와 관련됨

2-1. 살균 활성

CLP-유도 치사율이 복막액 내 박테리아 콜로니수와 상당히 관련되었기 때문에, 실험은 WKYMVm에 의한 FPR 활성화가 복막액으로부터 세균의 제거에 영향을 미쳤는지 조사하였다. WKYMVm 투여는 CLP 후 24시간째 복막내 박테리아 콜로니수를 99.8%까지 급격히 감소시켰다(도 2a). WKYMVm(4 mg/kg)을 CLP 마우스에 CLP 후 2 및 14시간째 4회 피하주사하였다. 쉠(Sham), CLP 또는 CLP + WKYMVm 투여 후 24시간째 수집한 복막 세척액을 혈액 한천배지 평판(blood-agar base plates)상에 37 ℃에서 밤새 배양하여 콜로니 형성 유니트(CFUs)의 수를 측정하였다.

2-2. 림프구 자가사멸의 저해

패혈증이 광범위한 림프구 자가사멸을 유도한다는 관측으로부터(Ayala, A., et al., Blood. 87:4261-4275), 실험은 또한 WKYMVm이 비장림프구 사멸을 예방할 수 있는지를 평가하였다. CLP 수행 후 24시간째 비장림프구 사멸은 WKYMVm 투여에 의해 현저히 저해되었다(도 2b). WKYMVm(4mg/kg, 피하투여)가 CLP 후 2 및 14시간째 투여되었고, 비장림프구 수를 ICR 마우스 내 CLP 수행 후 24시간째 측정하였다.

2-3. 항염증 활성

패혈증 후 치사율은 생명 기관 염증과 관련된 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 PBS를 투여한 CLP-유도 마우스 내에 급성 폐염증의 표지인, 습/건(wet/dry, W/D) 중량비가 현저히 증가하였음을 발견했고, 또한 이 표지가 WKYMVm 투여에 의해 완전히 역전되었음을 발견하였다(도 2c). 폐부종의 크기는 종래 기재된 바와 같이 폐의 W/D 중량비를 측정하여 정량화하였다(Liu, D., et al., Inflamm. Res. 54:464-470). 획득한 전체 습윤폐(wet lungs)의 중량을 재고 오븐에 60 ℃에서 48시간 동안 두었다. 이후 건조 중량을 측정하였고 W/D 중량비를 계산하였다.

WKYMVm (4 mg/kg, 피하투여)를 CLP 후 2 및 14시간 후에 투여하였고, ICR 마우스 내 CLP 후 24시간째 폐의 W/D 중량비를 측정하였다. 실험결과는 평균±표준오차(a, b에서 n=16, c에서 n=5)로 표시한다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. PBS 또는 WKYMVm (4 mg/kg, 피하투여)를 CLP 후 2시간 및 14시간 후에 투여하였다. 상기 마우스는 수술 후 24시간째 죽었다.

또한, 조직학적 분석은 CLP-유도 폐염증이 WKYMVm에 의하여 완전히 역전되었음을 나타냈다(도 2d). 상기 폐는 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)(배율, x100)로 염색하였다. 실험결과는 그룹당 8 마리 마우스의 견본이다. 마우스에 CLP 수술을 하고 PBS 또는 WKYMVm를 2시간 후에 4 mg/kg의 양으로 투여하였다. 마우스는 수술 후 24시간째 안락사시켰고, 폐를 고정하고 절단했으며, 형태학적 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.

실시예 3

WKYMVm 은 식균세포내 세균의 제거 및 과산화수소 생산을 향상시킴.

WKYMVm 투여가 시험관내 살균활성을 증가시키는지를 측정하기 위해, 마우스 호중구가 1시간 동안 대장균을 섭취하도록 하고 그 후 20분 동안 0.1 - 1000 nM의 WKYMVm로 자극했다. 이는 투여량에 의존하여 호중구의 살균활성을 두드러지게 향상시켰다(도 3a). 부착된 호중구는 옵소닌화된(opsonized) 대장균 10⁶ 과 1시간 동안 배양했고, 용매(PBS) 또는 WKYMVm(0.1, 1, 10, 100, 및 1000 nM)으로 1시간 동안 자극했다.

FPR1 및 FPR2가 호중구 내 나타났기 때문에(데이터에 나타나지 않음), 이 실험은 WKYMVm-유도 살균활성에 있어서 FPR1-1 및 FPR2-매개된 경로의 역할을 조사했다. WKYMVm 투여 전에 Boc-PLPLP 또는 WRW⁴로 전처리된 호중구는 살균활성을 현저히 저해했다(도 3b). 마우스 호중구를 종래 기재된 히스토페이크(Histopaque)-1077 용액(Sigma)으로 말초혈로부터 분리했다(Bae, Y.S., et al., J. Immunol. 171:6807-6813, 2003). WKYMVm (100 nM)를 첨가하기 30분 전에 Boc-PLPLP (10μM), WRW⁴ (10 μM), 또는 Boc-PLPLP (10μM) + WRW⁴ (10μM)를 첨가했다. 이후 호중구내 생균의 수를 측정했다.

식균세포의 살균효과가 H₂O₂ 생산과 관련되어 있기 대문에(Hampton, M.B., et al., Blood. 92:3007-3017), 마우스 호중구내 H₂O₂ 생성에 대한 WKYMVm의 영향을 측정하였다. WKYMVm은 100 - 1000 nM에서 최대 반응으로 호중구내 H₂O₂ 생산을 향상시켰다(도 3c). 마우스 호중구를 15분 동안 용매(PBS) 또는 WKYMVm(1 - 1000 nM)으로 자극했다. 쉠, CLP-, 또는 CLP + WKYMVm-투여된 마우스로부터 분리한 호중구를 100 nM PMA로 1시간 동안 자극했다. 정상 마우스에서 새롭게 분리한 호중구를 사이토칼라신(cytochalasin) B(5 μM)의 존재하에서 다양한 농도의 WKYMVm으로 10분간 자극했다.

FPR1 및 FPR2의 역할을 조사하기 위해, WKYMVm (100 nM)를 10분간 첨가하기 전에 호중구를 Boc-PLPLP (10 μM), WRW⁴ (10 μM), 또는 용매(DMSO)와 30분 동안 전배양하였다. 상등액 내 H₂O₂는 H₂O₂ 분석 키트(Molecular Probes)로 측정하였다.

게다가, 상기 효과는 Boc-PLPLP 또는 WRW⁴로 전처리하는 것에 의해 부분적으로 역전됐다(도 3d). 그러나, WKYMVm-유도 H₂O₂ 생성은 FPR1+FPR2 길항제로 전처리하는 것에 의해 완전히 역전됐다(도 3d). WKYMVm (100 nM)를 첨가하기 5분 전에 Boc-PLPLP (10μM), WRW⁴ (10 μM), 또는 Boc-PLPLP (10 μM) + WRW⁴ (10 μM)를 첨가했다.

상기 테스트는 CLP-유도 마우스로부터 유래한 호중구가 PMA에 응하여 H₂O₂를 생산하는데 실패하였다는 것을 알아냈다(도 3e). 그러나, WKYMVm가 투여된 CLP-유도 마우스로부터 유래한 호중구내에서는 그것이 투여되지 않은 것에 비해 H₂O₂ 생산이 현저히 향상되었다(도 3e). PBS 또는 WKYMVm (4 mg/kg)을 CLP 후 2시간 및 14시간째 CLP 마우스내 4회 피하주사하였다. CLP 후 24시간째, 복막내 호중구를 분리하였다. 쉠, CLP, 또는 CLP + WKYMVm 마우스로부터 분리한 호중구를 PMA (100 nM)로 30분간 자극했다. 실험 결과는 평균 ± 표준오차(a, b에서 n = 8; c-e에서 n = 16)로 표시한다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

호중구 살균활성은 Yan, J.J., et al., Nat. Med. 10:161-167, 2004.의 방법에 따라 측정했다. 호중구는 60-mm 플라스틱 배양 디쉬(1 × 106 호중구/커버 슬립) 내 13-mm 플라스틱 커버 슬립상에서 1시간 동안 37℃로 배양했다. 부착되지 않은 세포는 PBS로 격리했다. 부착된 호중구는 옵소닌화된 대장균 10⁶과 1시간 동안 배양했다. 탐식되지 않은 대장균을 세척한 후, 몇몇 농도의 WKYMVm 또는 용매와 1시간 동안 배양 전 및 후에 호중구내 생균 수를 측정했다. 사균의 비율은 100 × (1 - WKYMVm 자극 후 CFU 수/ WKYMVm 자극 전 CFU 수)로 계산했다. FPR1 및 FPR2의 역할을 조사하기 위해, WKYMVm (1 μM)를 1시간 동안 첨가하기 전에 호중구를 Boc-PLPLP (10 μM), WRW⁴ (10 μM), 또는 용매(DMSO)와 30분 동안 전배양하였다.

초기 숙주-세균 상호 작용에 따라, 선천적 면역체계의 광범위한 활성화가 이루어지며, 이는 숙주 방어 반응을 조정한다. 식균세포를 포함하는 핵심 방어 기작 중 하나는 반응성 산소(reactive oxygen species) 및 산화질소와 같은 세포내 독성 조절자(toxic mediators)의 합성이다. 실험적 결과는 WKYMVm에 의한 FPR 활성화가, 향상된 세균의 제거와 관련된 H₂O₂ 생산을 향상시켰다는 것을 명백히 보여준다. FPR1 및 FPR2는 WKYMVm에 대한 수용체로 알려진다. FPR1 및 FPR2에 대한 길항제는 호중구내 WKYMVm-유도 H₂O₂ 생산을 현저히 저해했다. 이러한 결과들은 WKYMVm으로 향상된 생존은 식균세포의 살균효과와 관련되며, 이는 FPR1 및 FPR2에 의해 매개된다는 것을 제시한다. 이러한 실험적 결과는 또한 WKYMVm으로 향상된 생존은 완전히 FPR2 경로에 의존하며 FPR1 경로에는 단지 부분적으로만 의존한다는 것을 나타낸다. 따라서, WKYMVm은 식균세포의 직접적인 살균활성에서의 역할 외에 부가적 효과를 가지며, 이는 아마도 FPR2에 의해 매개될 것이다.

실시예 4

WKYMVm 은 CLP -유도 비장림프구 자가사멸을 저해하고 불활성 항원에 반응하여 Th1 세포의 증식을 향상시킴.

4-1. Th1 및 Th2 마우스에서 비장림프구 증식 분석

Th1 및 Th2 마우스 모델(도 4b)을 만들기 위해, 6주령 C57BL/6 WT 마우스를 75 μg의 OVA + 10 μg의 LPS 또는 2 mg의 명반(alum)으로 0 및 7일째에 복막내 2회 면역시켰고 그 후 50 μg의 OVA로 14, 15, 및 16일째에 복막내 면역성 검사를 했다. 분리된 비장림프구를 OVA와 배양 또는 배양하지 않고 세포 증식 분석을 했다. 요약하자면, 비장림프구는 RPMI 1640 배지에서 수확했고 96웰 플렛 버텀 플레이트(96-well flat-bottom plates)에서 37℃로 96시간 동안 배지만으로 또는 5, 50 또는 500 μg의 OVA/ml와 배양했다(2 × 10⁵ 세포/웰). 상기 실시예는 1 μCi [³H]thymidine과 72시간 배양기간 후에 세포의 티미딘(thymidine) 삽입을 측정했다.

CLP-유도 패혈증은 비장림프구 자가사멸을 일으켰다; 그러나, 이러한 작용은 WKYMVm에 의해 매우 효과적으로 저해되었다(도 4a). WKYMVm(4 mg/kg)을 CLP 마우스에 CLP 후 2 및 14시간째 4회 피하주사하였다. 쉠, CLP + PBS 또는 CLP + WKYMVm 투여 후 24시간째에 수집한 비장을 TUNEL 분석(상부) (배율, ×400)에 사용했다. TUNEL-양성 세포를 계수했다(하부). 터널 분석은 표준 조직학적 프로토콜을 사용하여 첫번째로 탈파라핀화된 파라핀 포매(paraffin-embedded) 조직 절편에서 수행하였다. 이후 상기 절편을 4℃에서 2분 동안 트리톤(Triton) X-100으로 투과하고 TdT 효소 및 디곡시제닌(digoxigenin )-dUTP 반응 버퍼(TUNEL) 시약으로 37℃에서 60분간 채웠다. 사멸세포(TUNEL-양성 세포) 비율을 광학 현미경하에서 비장림프구 500개를 계수하여 측정하였다.

종래 문헌은 림프구 자가사멸이 카스파제-3(caspase-3)을 포함하는 몇몇 중요한 카스파제에 의하여 매개된다는 것을 밝혔다(Hotchkiss, R.S., et a., Crit. Care Med. 27:1230-1251, 1999). 이와 유사하게, CLP-유도 패혈증은 카스파제-3의 활성화를 증진시켰음에 반하여, WKYMVm은 매우 효과적으로 그것을 저해했다(도 4b). (a)에 표시된 마우스로부터 유래한 비장은 쪼개진 카스파제-3(cleaved-caspase-3) 항체와 면역조직화학에 사용했다(배율, ×100). 실험결과는 그룹당 8 마리 마우스의 견본이다(a, b). 본 실시예는 표준 조직학적 프로토콜을 사용하여 첫번째로 탈파라핀화된 파라핀 포매 조직 절편에서 면역조직화학을 수행하였다. 쪼개진 카스파제-3에 대한 1차 항체와 배양한 후에(세포 신호(Cell Signaling)), 형광색소와 결합된 2차 항체를 가진 모든 절편들을 염색했다.

WKYMVm은 CLP 후 24시간째 복막액 내 IL-2의 양을 증가시켰다(도 4c). IL-2가 T-세포 증식을 촉진하기 때문에(Benczik, M., et al., Immunol. Invest. 33:109-142), WKYMVm에 의한 FPR 활성화의 Th1 및 Th2 세포 증식에 대한 효과를 불활성 항원을 사용하여 측정하였다.

CLP 후 2, 14, 26 및 38시간 째 WKYMVm (4 mg/kg)을 CLP 마우스 내 4회 피하주사하였다. 분리된 동물 그룹들에 쉠, CLP + PBS, 또는 CLP + WKYMVm를 투여했다. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시하였다(n=8). CLP + PBS에 비해 *P <0.05; **P <0.01였다. C57BL/6 WT 마우스는 비장 내에 Th1 및 Th2 세포들을 만들어내기 위해 각각 LPS 또는 명반에 OVA를 첨가하여 복막내 면역화시켰다(도 4d).

Th1 및 Th2 마우스(도 4d)를 위한 프로토콜을 이하에 기재하였다. OVA + LPS (e) 또는 OVA + 명반(f)으로 면역화된 마우스 내 OVA로 배양 후 72시간째 비장림프구 증식. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시하였고(e, f에서 n=5), *는 OVA+PBS 그룹에 비해 P < 0.05임을 나타내며; **는 다른 그룹들에 비하여 P < 0.05임을 나타낸다. Th1 마우스 모델에서, 비장림프구 증식은 72시간 후에 쉠-투여 마우스에 비해 WKYMVm-투여 마우스에서는 증진되었으나, Boc-PLPLP- 또는 WRW⁴-투여 마우스에서는 저해되었다(도 4e). 이와 대조적으로 Th2 모델에서는, 비장림프구 증식이 72시간 후에 쉠-투여 마우스에 비해 WKYMVm-투여 마우스에서는 저해되었고 길항제-투여 마우스에서는 증진되었다(도 4f)

실시예 5

WKYMVm 의 효과는 IFN -γ-매개 경로에 부분적으로 의존함

본 발명자들은 WKYMVm이 CLP 후 24시간째 복막액내 IL-12의 수준을 증가시켰음을 확인하였다(도 5a). 반면, 복막액내 IFN-γ의 수준은 CLP 후 8 및 24시간째에 증가하였다(도 5b). CLP 후 2, 14, 26, 및 38시간째 CLP 마우스 내로 WKYMVm (4 mg/kg)을 4회 피하주사하였다. 이후, 복막액내에 존재하는 사이토카인을 ELISA (BD Biosciences Pharmingen)로 측정했다.

분리된 동물 그룹들에 쉠, CLP + PBS, 또는 CLP + WKYMVm를 투여했다. a, IL-12; b, IFN- γ;. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시한다(a, b에서 n=8). CLP + PBS에 비해 *P <0.05; **P <0.01였다. 복막 세척액내 CLP-유도 사이토카인을 측정하기 위해, 마우스에 WKYMVm를 CLP 후 2, 14, 26 및 38시간째 투여했다. 복막 세척액을 CLP 후 4시간에서 72시간 사이의 다양한 시간대에서 수집했고, 복막액내 존재하는 사이토카인을 ELISA (BD Biosciences Pharmingen)로 측정했다.

패혈증 이후 WKYMVm-유도 생존에 대한 Th1 사이토카인(IL-12 및 IFN-γ)의 역할을 조사하기 위해, CLP 모델을 IL-12Rβ2- 및 IFN-γ-결핍 마우스(C57BL/6 배경)에 적용시켰다. CLP-유도 치사율은 WKYMVm를 투여한 WT C57BL/6 마우스에서 현저히 감소했으나(도 5c), 그 효과는 IL-12Rβ2- 및 IFN-γ-결핍 마우스에서 부분적으로 역전되었다(도 5c 및 5d). WT C57BL/6 또는 IL-12Rβ2-결핍 마우스에 WKYMVm (4mg/kg) 또는 PBS를 CLP 후 2, 14, 26, 및 38시간째 CLP 마우스에 4회 피하주사하였다. 도 5d에서, WT C57BL/6 또는 IFN-γ-결핍 마우스에 WKYMVm (4mg/kg) 또는 PBS를 CLP 후 2, 14, 26, 및 38시간째 CLP 마우스에 4회 피하주사하였다. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시한다. 용매에 비해 *P <0.05; **P <0.01였다(c, d). n = 그룹당 10-16 마우스(c, d)

본 실험은 WKYMVm-유도 생존이 Th1 사이토카인-매개 경로에 부분적으로 의존하였다는 발견에 기초하여, 살균활성, 표적 기관 염증 및 비장림프구 자가사멸 또한 Th1 사이토카인-의존적인지를 측정하였다. 복막액내 세균 콜로니 수는 WKYMVm를 투여한 CLP-유도 WT 마우스에 비해 WKYMVm를 투여한 CLP-유도 IFN-γ-결핍 마우스에서 더 높았다(도 5e). CLP 후 2 및 14시간째 CLP 마우스에 WKYMVm (4 mg/kg)를 4회 피하주사하였다. CLP 또는 CLP + WKYMVm 투여 후 24시간째 수집한 복막 세척액을 37℃에서 혈액 한천배지 평판상에 밤새 배양하여 CFU의 수를 측정하였다.

이와 대조적으로, W/D 중량비는 PBS를 투여한 CLP-유도 WT, IL-12R 2- 및 IFN-γ-결핍 마우스에서 더 높았으나, 이 효과는 WKYMVm을 투여한 CLP-유도 WT, IL-12Rβ2- 및 IFN-γ-결핍 마우스에서 완전히 역전되었다(도 5f). C57BL/6, IL-12Rβ2-결핍 및 IFN-γ-결핍 마우스내 CLP 후 24시간째 W/D 중량비를 측정하기 위해 폐를 사용했다. 흥미롭게도, IL-12Rβ2-결핍 마우스내 CLP로 유도되고 WKYMVm으로 역전되었음에도 불구하고, CLP-유도 비장림프구 자가사멸은 IFN-γ-결핍 마우스내에서 관측되지 않았다(도 5g). CLP 후 2 및 14시간째 CLP 마우스내로 WKYMVm (4 mg/kg)를 4회 피하주사하였다. sham, CLP 또는 CLP + WKYMVm 투여 후, 24시간째 수집된 비장을 TUNEL 분석(좌측) (배율, ×400)에 사용했다. TUNEL-양성 세포를 계수했다(우측). 실험결과는 평균± 표준오차로 표시한다. *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001. (e-g에서 n = 8).

중증 패혈증 이후에, Th2 사이토카인의 수준이 증가하고 Th1 사이토카인의 수준이 감소하며 이것이 손상된 세포 면역력을 야기할 것이다(Kox, W.J., et al., Intensive Care Med. 26:S124-S128, 2000). 따라서 Th1 사이토카인의 생산을 증가시키기 위해 디자인된 치료는 복막염 이후 중증 패혈증의 치료에 유익할 것이다. 자연살해세포(natural killer cell) 및 대식세포(macrophage)와 같은, 선천성 면역 세포 및 Th1 세포가 IFN-γ를 분비한다(Trinchieri, G. Curr. Opin. Immunol. 9:17-23, 1997). 미생물에 대한 방어를 위한 IFN-γ의 특성은 식균세포 살균 활성의 자극, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자를 통한 항원제시의 자극, 및 백혈구-내피 상호작용의 결합을 포함한다(Dighe, A.S., et al., Immunity. 3:657-666, 1995). 중증 패혈증은 IFN-γ 생산을 낮추는 조절(down-regulate)을 한다(Kox, W.J., Intensive Care Med. 26:S124-S128, 2000). 한 임상연구는 재조합 IFN-γ를 투여한 패혈증 환자가 향상된 임상 경과를 보였음을 입증했다(Kox, W.J., et al., Arch. Intern. Med. 157:389-393, 1997). 실험결과는 패혈증 마우스 모델에서 WKYMVm과 FPR 활성화에 기인한 증가된 IFN-γ 생산을 나타낸다. 게다가, FPR 활성화는 항원을 불활성화시키기 위해 Th1 세포의 증식을 증진시켰으나 Th2 세포 증식을 저해했다. 이와 대조적으로, FPR 활성화의 효과는 IFN-γ 결핍 마우스에서 부분적으로 역전되었다. 생존 효과는 IFN-γ-결핍 마우스내 세균 콜로니 수와 양의 연관을 보였다. 이는 FPR 활성화의 생존 및 살균 효과는 FPR 활성화 이후 IFN-γ 생산에 부분적으로 의존한다는 것을 제시한다.

실시예 6

WKYMVm 의 항염증 효과는 전염증성 사이토카인의 하향 조절(down-regulation )에 직접적으로 연관됨

마우스 호중구(neutrophil) (3 × 10⁶ 세포/0.3 ml)를 24-웰 플레이트내 5% FBS를 함유하고 있는 RPMI 1640 배지에 두고 5% CO₂ 배양기내에서 37℃로 유지하였다. 이후 상기 호중구를 WKYMVm (0.1 및 1 μM)의 존재 또는 부존재하에서, LPS (100 ng/ml)와 각각 3시간 및 6시간 동안 배양하였다.

30분 후에 상기 세포에 LPS (100 ng/ml)를 추가하고, 무세포 상등액(cell-free supernatant)을 수집하고, 원심분리 한 후, 제조사의 방법에 따라 ELISA (BD Biosciences Pharmingen)로 IL-1β 또는 TNF-α를 측정했다.

전염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-γ의 수준은 WKYMVm 투여된 CLP-유도 WT 마우스의 복막액내에서 현저하게 감소했다. WKYMVm (4 mg/kg)을 CLP 후 2, 14, 26, 및 38시간째 CLP 마우스내 4회 피하주사하였다. 분리된 동물 그룹들에 쉠, CLP + PBS, 또는 CLP + WKYMVm를 투여했다. a, IL-1β; b, IFN- α. 실험결과는 평균± 표준오차로 표시한다(n=8). CLP + PBS에 비해 *P <0.05였다(a, b).

이러한 하향 조절이 전염증성 사이토카인 생산에 대한 WKYMVm의 직접적 저해 효과에 의해 야기되었는지를 측정하기 위해, 복막내로 60 mg/kg LPS를 투여한 후 생체 내(in vivo) 전염증성 사이토카인의 생산을 측정하였다. LPS 투여 후 4시간째 IL-1β 및 TNF-α의 플라즈마 수준(plasma level)은 PBS를 투여한 마우스에 비해 4 mg/kg WKYMVm을 투여한 마우스에서 현저하게 감소하였다. LPS 60 mg/kg을 복막내로 주사한 후 2시간째인 마우스내로 WKYMVm (4 mg/kg)를 피하주사하였다; 4시간 후에 플라즈마를 수집하였다. IL-1β 및 TNF-α의 플라즈마 수준을 측정하였다.

또한, 마우스 호중구로부터 LPS-유도 IL-1β 및 TNF-α의 시험관내 방출은 WKYMVm 투여량에 의존하여 저해되었다(도 6d). 마우스 호중구는 30분 동안 PBS 또는 WKYMVm (0.1 및 1 μM)와 전배양하였고 그 후 3시간 동안 PBS 또는 LPS (100 ng/ml)로 자극하였다. IL-1β 및 TNF-α의 수준을 ELISA로 측정하였다(d). 실험결과는 평균± 표준오차로 표시한다(c, d에서 n=16). *P <0.05; ***P <0.001.

패혈증과 동반하는 면역력의 하향 조절은 림프구 자가사멸의 진행과 관련된다; 따라서, 패혈증-유도 림프구 자가사멸의 저해는 좋은 치료 표적이다. 실제로, WKYMVm에 의한 FPR 활성화는 비장내 면역세포의 자가사멸을 저해하였다. 최근 증거는 IFN- γ가 비장내 항원 특이적 Th1 세포에서 자가사멸을 유도한다고 보고한다(Berner, V., et al., Nat. Med. 13:354-360, 2007). 실험적 결과는 또한 비장내 면역세포 자가사멸은 IFN-γ 의존적이라는 것을 나타낸다. 이러한 발견들은 재조합 IFN-γ로 패혈증을 치료하는 것은 IFN-γ의 치료 효과를 떨어뜨리는 부작용을 유발한다는 것과, WKYMVm에 의한 FPR 활성화가 더 우수한 치료적 접근법일지 모른다는 것을 제시한다.

어떠한 환경하에서, 감염에 대한 많은 선천성 면역 반응은 복합적인 기관 부전(중증 패혈증의 임상적 특징)을 초래하는 세포 및 조직 손상을 유발할 수 있다. 조직 식균세포에 의한 미생물 분자의 인지는 감염된 조직으로 혈류를 증가시키고, 국소 혈관(local blood vessel)의 투과성을 향상시키고, 감염부위로 염증성 세포를 모으는 전염증 인자의 생산 또는 방출을 촉발한다. 그 결과는 WKYMVm에 의한 FPR 활성화가 급성 염증에 기인한 생명 기관 장애와 연관된, CLP로 유도된 IL-1β 및 TNF-γ을 포함하는 몇몇 전염증성 사이토카인의 생산을 저해한다는 것을 나타낸다. 또한, 시험관내 및 생체내 실험은 FPR 활성화가 LPS-유도 전염증성 사이토카인 생산을 저해한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견들은 FPR 활성화가 전염증성 사이토카인 생산의 직접적 저해를 통해 급성 염증을 예방하여 치료 효과를 발휘한다는 것을 제시한다. 이는 패혈증 치료에 있어서 WKYMVm에 의한 FPR 활성화가 각각의 전염증성 인자를 막는 것보다 훨씬 우수하다는 것을 나타낸다.

실시예 7

WKYMVm 의 항염증 효과는 IL -17-매개 경로에 의존적임

WKYMVm은 CLP 후 4시간째에 이미 복막액내 IL-17의 수준을 증가시켰다(도 7a). WKYMVm의 투여는 또한 CLP 후 8 및 12시간째부터 IL-10 및 TGF-를 각각 증가시켰다(도 7b 및 7c). FPR 활성화에 의한 향상된 생존 효과에서 IL-17의 역할을 조사하기 위해, CLP 모델을 IL-17 결핍 및 WT 통제 마우스(C57BL/6 배경)에 적용했다. 본 연구는 WKYMVm 투여로 향상된 생존은 IL-17-결핍 마우스에서 부분적으로 역전되었음을 나타냈다(도 7d). FPR 활성화의 항염증 효과에서 IL-17의 역할 측면에서, WT 마우스에서 WKYMVm에 의해 저해된 폐 W/D 중량비는 IL-17 결핍 마우스에서는 관측되지 않았다(도 7e).

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Claims (28)

1. 서열번호 1로 표시되는 트립토판-리신-티로신-메티오닌-발린-디-메티오닌(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met, WKYMVm)의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 포함하는 중증 패혈증 또는 급성 호흡부전 증후군(ARDS)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 마우스에서 포밀펩타이드 수용체 1(FPR 1) 또는 포밀펩타이드 수용체 2(FPR 2)와 결합하여 이들을 활성화시키는 것인 약제학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간에서 FPR, FPRL1 또는 FPRL2와 결합하는 것인 약제학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인터루킨-1β (IL-1β), 종양 사멸인자-α (TNF-α), 또는 인터루킨-6 (IL-6)인 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것인 약제학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인터페론-γ (IFN- γ), 인터루킨-2 (IL-2), 또는 인터루킨-12 (IL-12)인 Th1 사이토카인의 발현을 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인터루킨-10(IL-10)의 발현을 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전환성장인자-β(TGF-β) 또는 인터루킨-10 (IL-10)인 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
   
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10. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 중증 패혈증에 의해 유도되는 비장림프구 또는 흉선세포의 감소를 저해하는 것인 약제학적 조성물.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 중증 패혈증은 염증 반응과 동반되는 것인 약제학적 조성물.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 0.0064 내지 6.4 mg/kg·day의 양으로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드는 0.064 내지 0.64 mg/kg·day의 양으로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
    
14. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여되는 것인 약제학적 조성물.
    
15. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 수용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
    
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