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KR101318713B1 - 세포내 미토콘드리아를 지표로 이용하는 심근 세포의 선별방법 - Google Patents

세포내 미토콘드리아를 지표로 이용하는 심근 세포의 선별방법 Download PDF

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KR101318713B1
KR101318713B1 KR1020077004065A KR20077004065A KR101318713B1 KR 101318713 B1 KR101318713 B1 KR 101318713B1 KR 1020077004065 A KR1020077004065 A KR 1020077004065A KR 20077004065 A KR20077004065 A KR 20077004065A KR 101318713 B1 KR101318713 B1 KR 101318713B1
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cardiomyocytes
mitochondrial
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후미유키 하토리
게이이치 후쿠다
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각고호우징 게이오기주크
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 전체 심장 구성 세포군이나 줄기세포 유래의 분화 세포군으로부터 유전자의 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은 상술한 심근 세포의 여러 성질을 토대로 미토콘드리아 특이적 표시제를 사용함으로써 게놈의 변형없이 심근 세포를 선별하는 획기적인 방법을 확립하였다. 즉, 본 발명자들은 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 농화하는 방법, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 제조하는 방법, 및 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 심근 세포 비율을 평가하는 방법을 제공한다.
심근 세포, 선별, 미토콘드리아, 함유량, 막 전위

Description

세포내 미토콘드리아를 지표로 이용하는 심근 세포의 선별 방법{METHOD OF SELECTING MYOCARDIAL CELLS BY USING INTRACELLULAR MITOCHONDRIA AS INDICATION}
본 발명은 전체 심장 구성 세포군 또는 줄기세포로부터 유래된 세포군에서 심근 세포를 선별하는 방법 및 그 방법을 이용하는 방법에 관한 것이다.
성체의 심근 세포는 증식 활성이 상실되어, 중증의 심근경색, 심근증 등의 질환에서는 심장 이식에 의지할 수 밖에 없다. 그러나, 현재 심장 공여자가 부족한 문제점이 해결되지 않아, 심장 이식 이외의 치료 방법을 개발하는 것이 급선무이다. 이에 대하여, 심근 세포를 체외에서 제조하여 심근 세포 보충을 충당하는 방법이 심장 이식에 의지할 수밖에 없는 환자를 구제할 수 있는 가장 유망한 방법으로 예상되고 있다.
심근 세포의 제조 방법으로, 배아 줄기세포를 분화시켜 이용하는 방법 및 생체내에 존재하는 것으로 추정되는 줄기세포(성체 줄기세포)를 취하여 분화를 유도하는 방법 등이 검토되고 있다. 그러나, 심근 세포 이외의 세포를 부산물로 생산하거나, 미분화된 세포를 잔존시키는 줄기세포의 특성으로 인해, 지금까지 분화 및 유도를 수행한 세포 집단을 그대로 치료에 이용할 수 없는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 인간에게 실용가능하도록 하기 위해서는, 분화 및 유도를 수행한 세포 집 단으로부터 심근 세포를 선별하는 과정이 필수적이다.
현재, 심근 세포를 정제하는 방법은 미리 줄기세포의 게놈에 임의의 마커 유전자를 도입하는 방법 이외에는 유효한 방법이 보고되어 있지 않은 실정이다(FASEB J. 2000; 14: 2540-2548). 그러나, 게놈 변형은 윤리적으로 문제가 되며, 악성 세포화율의 변화 등, 예측하기 어려운 중대한 위험을 수반하기 때문에, 인간에게 실용화하는데에는 상당한 문제가 있다.
심장의 산소 소비량은 주요 조직에 비해 높으며, 심장의 미토콘드리아 함유량이 비교적 높은 것으로 알려져 있다(Am J Physiol 1985; 248: R415-421). 또한, 심근 세포가 세포 분화 및 성숙하게 되면, 분열능이 현저히 소실되는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 전술한 바와 같은 심근 세포의 성질을 응용하여 심근 세포를 선별하고자 하는 시도는 종래 기술 분야에서는 전혀 알려져 있지 않다. 또한, 미토콘드리아의 막 전위에 착안하여 심근 세포의 미토콘드리아 막 전위와 다른 세포의 미토콘드리아 막 전위를 직접 비교 및 검토한 예도 없으며, 미토콘드리아의 막 전위를 지표로 심근 세포의 선별을 검토한 예도 보고되어 있지 않다.
비특허문헌 1: FASEB J. 2000; 14: 2540-2548
비특허문헌 2: Am J Physiol 1985; 248: R415-421
본 발명자들은 종래에는 심근 세포를 선별하는 것과 직접적으로 연관짓지 않았던 심근 세포의 여러가지 성질을 이용하여, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물이나 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물로부터, 유전자의 변형없이, 심근 세포를 선별하는 방법을 개발하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 심근 세포가 다른 모든 세포에 비해 상대적으로 미토콘드리아의 함유량이 높은 성질, 및 심근 세포의 미토콘드리아가 다른 모든 세포의 미토콘드리아에 비해 상대적으로 막 전위가 높다는 성질을 토대로, 상기 과제를 성공적으로 해결하였으며, 미토콘드리아에 특이적인 표시제(indicator)를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하고, 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 미토콘드리아 막 전위를 측정함으로써, 심근 세포의 유전자 변형없이, 심근 세포를 선별하는 획기적인 방법을 확립하였다.
구체적으로, 본 발명은 제1 구현예로 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이도 심근 세포를 선별하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 방법의 제1 구현예로서,
심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터, 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량을 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법;
심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터, 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법;
또는
심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터, 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및 막 전위를 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법;을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 해당 구현예는, 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 단계 및 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 측정하는 단계를 특징으로 한다.
여기서, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물인 것을 특징으로 한다.
또한, 근육 세포로 분화가능한 세포는 줄기세포, 전구세포 및 난세포(egg cell)로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 해당 구현예는 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 단계 이후와, 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 전에, 미토콘드리아 표시제의 비존재하에서 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 해당 구현예에 사용되는 미토콘드리아 표시제는 A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 및 T3168로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, M7512, T3168, T668 또는 R302가 더 바람직하다.
본 발명의 제2 구현예는 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 농화(enrichment)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(1) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및
(2) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제2 구현예에서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 심근 세포로 분화가능한 세포는 줄기세포, 전구세포 및 난세포로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제2 구현예에 있어서, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 구현예에 사용되는 미토콘드리아 표시제는 A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 및 T3168로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, M7512, T3168, T668 또는 R302인 것이 바람직하다.
본 발명의 제3 구현예는 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(1) 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 심근 세포를 분화 및 유도하고, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 제조하는 단계;
(2) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및
(3) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로 심근 세포를 선별하는 단계;를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 제3 구현예에 있어서, 심근 세포로 분화가능한 세포는, 줄기세포, 전구세포 및 난세포로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (2) 단계와 (3) 단계 사이에 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 구현예에 사용되는 미토콘드리아 표시제는 A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 및 T3168로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, M7512, T3168, T668 또는 R302인 것이 바람직하다.
본 발명의 제4 구현예는 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 심근 세포 비율을 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(1) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및
(2) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 비심근 세포에 대한 심근 세포의 비율을 계측하는 단계;를 포함하는 것을 특징한다.
본 발명에 따른 방법의 제4 구현예에서 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포 유래의 분화 세포 혼합물인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 심근 세포로 분화가능한 세포는 줄기세포, 전구세포 및 난세포로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 해당 구현예에 사용되는 미토콘드리아 표시제는 A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 및 T3168로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, M7512, T3168, T668 또는 R302인 것이 바람직하다.
이상으로, 본 발명은, 일 예로, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 선별하는 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위는 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지함으로써, 측정할 수 있다.
여기서, "심근 세포를 포함하는 세포 혼합물"은 심근 세포와 그 이외의 세포로 이루어진 모든 세포 혼합물을 의미한다. 예를 들면, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물을 들 수 있다. 상기 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 동종 또는 이종의 심장 조직으로부터 각종 효소 처리한 결과로 얻어지는, 심근 세포, 내피 세포, 간질 세포(stromal cell), 평활근 세포 등의 세포로 이루어지는 혼합물을 의미한다. 또한, 상기 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물은 심근 세포로 분화가능한 세포(예, 배아 줄기세포나 성체 줄기세포 등의 줄기세포, 전구세포, 및 수정란 세포나 체세포 클론 등의 난세포)를, 상기 세포로부터 심근 세포를 분화시키는 조건하에서 배양하여 얻어지는, 심근 세포, 비심근 세포, 미분화 세포, 신경 세포, 상피 세포 등의 세포로 이루어지는 혼합물을 의미한다. 또한, ES 세포로부터 심근 세포를 분화 및 유도한 경우도 포함된다.
세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위는 미토콘드리아 표시제를 사용하여 세포내의 미토콘드리아를 표지함으로써, 정량화할 수 있다. 그러나, 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위를 반영하는 미토콘드리아 표시제 유래 신호의 절대치는, 해석 대상인 심근 세포의 성숙 정도, 표지 시약의 종류, 노출 시간 등의 노출 조건에 따라 변경된다. 이로 인해, 본 발명의 주된 특징은 미토콘드리아 표시제 유래 신호량의 절대치가 아닌 심근 세포와 비심근 세포 간의 미토콘드리아 표시제 유래 신호량의 상대적인 관계이다. 아울러, 본 발명에서는 상대적으로 높은 형광 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 선별할 수 있다. 실제로 사용할 예정인 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 시료를 이용하여 예비 실험을 수행하여, 목적에 부합되는 심근 세포 집단의 규정 조건(즉, 미토콘드리아 함유량 및/또는 미토콘드리아 막 전위 정도와 심근 세포와의 관계)을 적정화한다. 구체적으로, 예비 실험에서는 미토콘드리아 함유량 및/또는 미토콘드리아 막 전위를 지표로서, 선별해야 하는 세포의 미토콘드리아 표시제 유래 신호량의 범위를 구분하여, 상대적으로 높은 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위를 나타내는 세포를 회수하도록 설정한다.
본 발명에서, "미토콘드리아 표시제"는 살아있는 세포의 미토콘드리아를 특이적으로 표지하여 그 존재량을 측정할 수 있는 물질, 살아있는 세포의 미토콘드리아를 특이적으로 표지하여 미토콘드리아 막 전위를 측정할 수 있는 물질, 또는 살아있는 세포 중의 미토콘드리아를 특이적으로 표지하여 그 존재량과 미토콘드리아 막 전위 모두를 측정할 수 있는 물질이면, 어떠한 물질이라도 가능하다. 예를 들면, (1) 형광을 가지며, 미토콘드리아의 구조 물질(예, 단백질, 지질, 당쇄, 핵산 또는 이들의 대사 산물 등)과 결합하는 물질, (2) 형광을 가지며, 미토콘드리아의 막 전위에 의해 미토콘드리아로 선택적으로 도입가능한 물질, (3) 미토콘드리아 구조 물질의 작용에 의해 형광을 발광하는 물질로 변환되는 물질, 또는 (4) 미토콘드리아 구조 물질의 작용에 의해 미토콘드리아 외부로 확산할 수 없는 물질 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 미토콘드리아 표시제의 구체적인 예로 A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, S7563, T639, T668, T669 또는 T3168 등(화합물 제품번호: 모두 Molecular Probe사에서 구입가능)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는, M7514, M7510, M7511, M7512, M7513, M22425, M22426, T668, R302, 또는 T3168이며, 가장 바람직하게는 T668, R302, M7514 또는 T3168이나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기에 예시한 본 발명에 사용할 수 있는 미토콘드리아 표시제는 하기 구조를 가지고 있다:
[화합물 1]
A1372의 구조
분자식: C26H38BrN3
분자량: 472.51
CAS 번호: 75168-11-5
명칭: 아크리디늄, 3,6-비스(디메틸아미노)-10-노닐-, 브로마이드
Figure 112007015349610-pct00001
[화합물 2]
D273의 구조
분자식: C29H37IN2O2
분자량: 572.53
CAS 번호: 53213-82-4
명칭: 벤조옥사졸리움, 3-헥실-2-(3-(3-헥실-2(3H)-벤조옥사졸릴리덴)-1-프로페닐, 요오드화물
Figure 112007015349610-pct00002
[화합물 3]
D288의 구조
분자식: C16H19IN2
분자량: 366.24
CAS 번호: 959-81-9
명칭: 피리디늄, 4-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)에테닐)-1-메틸, 요오드화물
Figure 112007015349610-pct00003
[화합물 4]
D308의 구조
분자식: C16H19IN2
분자량: 366.24
CAS 번호: 2156-29-8
명칭: 피리디늄, 2-(2-(4-(디메틸아미노)페닐)에테닐)-1-메틸, 요오드화물
Figure 112007015349610-pct00004
[화합물 5]
D378의 구조
분자식: C31H41N2O2I
분자량: 600.58
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00005
[화합물 6]
D426의 구조
분자식: C17H21IN2
분자량: 380.27
CAS 번호: 3785-01-1
명칭: 피리디늄, 2-(2-(4-디메틸아미노)페닐)에테닐)-1-에틸, 요오드화물
Figure 112007015349610-pct00006
[화합물 7]
D632의 구조
분자식: C21H18N2O3
분자량: 346.38
CAS 번호: 109244-58-8
명칭: 벤조익산, 2-(3,6-디아미노-9H-크산텐-9-일)-, 메틸 에스테르
Figure 112007015349610-pct00007
[화합물 8]
D633의 구조
분자식: C28H32N2O3
분자량: 444.57
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00008
[화합물 9]
D22421의 구조
분자식: C27H21IN2O2
분자량: 532.38
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00009
[화합물 10]
D23806의 구조(성분 A: 디하이드로로다민 123)
분자식: C21H18N2O3
분자량: 346.38
CAS 번호: 109244-58-8
명칭: 벤조익산, 2-(3,6-디아미노-9H-크산텐-9-일)-, 메틸 에스테르
Figure 112007015349610-pct00010
[화합물 11]
L6868의 구조
분자식: C28H22N4O6
분자량: 510.50
CAS 번호: 22103-92-0
명칭: 9,9'-비아크리디늄, 10,10'-디메틸-
Figure 112007015349610-pct00011
[화합물 12]
M7502의 구조
분자식: C34H30Cl3N3O
분자량: 602.99
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00012
[화합물 13]
M7510의 구조
분자식: C24H24Cl2N2O
분자량: 427.37
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00013
[화합물 14]
M7511의 구조
분자식: C24H25ClN2O
분자량: 392.93
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00014
[화합물 15]
M7512의 구조
분자식: C32H32Cl2N2O
분자량: 531.52
CAS 번호: 167095-09-2
명칭: 1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-18-윰, 9-[4-(클로로메틸)페닐]-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 염화물
Figure 112007015349610-pct00015
[화합물 16]
M7513의 구조
분자식: C32H33ClN2O
분자량: 497.08
CAS 번호: 167095-08-1
명칭: 1H,5H,9H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6, 7-i'j']디퀴놀리진, 9-[4-(클로로메틸)페닐]-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-
Figure 112007015349610-pct00016
[화합물 17]
M7514의 구조
분자식: C34H28Cl5N3O
분자량: 671.88
CAS 번호: 201860-17-5
명칭: 벤조옥사졸륨, 2-[3-[5,6-디클로로-1,3-비스[[4-(클로로메틸)페닐]메틸]-1,3-디하이드로-2H-벤즈이미다졸-2-일리덴]-1-프로페닐]-3-메틸-, 염화물
Figure 112007015349610-pct00017
[화합물 18]
M22422의 구조
분자식: C35H33ClF6N2O
분자량: 647.10
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00018
[화합물 19]
M22423의 구조
분자식: C26H26ClN3O5
분자량: 495.96
CAS 번호: 137993-41-0
명칭: 1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-18-윰, 9-시아노-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 과염소산염(perchlorate)
Figure 112007015349610-pct00019
[화합물 20]
M22425의 구조
분자식: C39H36Cl5N3
분자량: 724.00
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00020
[화합물 21]
M22426의 구조
분자식: C34H36Cl2N2
분자량: 543.58
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00021
[화합물 22]
R302의 구조
분자식: C21H17ClN2O3
분자량: 380.83
CAS 번호: 62669-70-9
명칭: 크산틸륨, 3,6-디아미노-9-(2-(메톡시카르보닐) 페닐, 염화물
Figure 112007015349610-pct00022
[화합물 23]
R634의 구조
분자식: C28H31ClN2O3
분자량: 479.02
CAS 번호: 989-38-8
명칭: 크산틸륨, 9-(2-(에톡시카르보닐)페닐)-3,6-비스(에틸아미노)-2,7-디메틸, 염화물
Figure 112007015349610-pct00023
[화합물 24]
R648의 구조
분자식: C34H43ClN2O7
분자량: 627.18
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00024
[화합물 25]
R14060의 구조
분자식: C23H19F5N2O
분자량: 434.41
CAS 번호: N/A
명칭: N/A
Figure 112007015349610-pct00025
[화합물 26]
R22420의 구조
분자식: C21H17ClN2O3
분자량: 380.83
CAS 번호: 62669-70-9
명칭: 크산틸륨, 3,6-디아미노-9-(2-(메톡시카르보닐)페닐, 염화물
Figure 112007015349610-pct00026
[화합물 27]
T639의 구조
분자식: C23H23N2OCl
분자량: 378.90
CAS 번호: 6837-70-3
명칭: 크산틸륨, 3,6-비스(디메틸아미노)-9-페닐, 염화물
Figure 112007015349610-pct00027
[화합물 28]
T668의 구조
분자식: C25H25ClN2O7
분자량: 500.93
CAS 번호: 115532-50-8
명칭: 크산틸륨, 3,6-비스(디메틸아미노)-9-(2-(메톡시카르보닐)페닐)-, 과염소산염
Figure 112007015349610-pct00028
[화합물 29]
T669의 구조
분자식: C26H27ClN2O7
분자량: 514.96
CAS 번호: 115532-52-0
명칭: 크산틸륨, 3,6-비스(디메틸아미노)-9-[2-(에톡시카르보닐)페닐]-, 과염소산염
Figure 112007015349610-pct00029
[화합물 30]
T3168의 구조
분자식: C25H27Cl4IN4
분자량: 652.23
CAS 번호: 47729-63-5
명칭: 1H-벤즈이미다졸륨, 5,6-디클로로-2-[3-(5,6-디클로로-1,3-디에틸-1,3-디하이드로-2H-벤즈이미다졸-2-일리덴)-1-프로페닐]-1,3-디에틸-, 요오드화물, (E)-
Figure 112007015349610-pct00030
또한, 미토콘드리아 표시제로, S7563, S7567 및 S7585(화합물 제품 번호: Molecular Probe사에서 구입가능)도 사용할 수 있다.
미토콘드리아 표시제는 각각의 물질에 특유한 여기 파장을 가지며, 특유한 파장의 형광을 발광하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, M7514는 490 nm의 여기 파장에 의해 받아 516 nm의 형광을 발광하고, 또한, T3168은 535 nm의 여기 파장을 받아 590 nm의 형광을 발광하는 것으로 알려져 있다.
전술한 바와 같이, 심근 세포는 다른 세포에 비해 세포내 미토콘드리아 함유량이 높으며, 또한 미토콘드리아의 막 전위가 높아, 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하면, 심근 세포는 다른 세포에 비하여 강한 형광 강도를 나타낸다. 본 발명에서는, 먼저, 표지한 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 각 세포 미토콘드리아 함유량 및/또는 미토콘드리아 막 전위를 측정한다. 다음으로, 보다 강한 표지 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정하여, 측정한 미토콘드리아 함유량 및/또는 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 상대적으로 미토콘드리아 고함유 세포 집단, 상대적으로 높은 막 전위를 가지는 미토콘드리아를 포함하는 세포 집단, 또는 상대적으로 미토콘드리아 고함유 세포이면서 동시에 상대적으로 높은 막 전위를 가지는 미토콘드리아 함유 세포 집단인, 심근 세포를 분리한다.
예컨대, 상술한 형광 발광성의 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 경우, 세포 분리기(cell sorter)를 사용하여 심근 세포(미토콘드리아 함유량이 상대적으로 높고, 또한 상대적으로 높은 막 전위를 가지는 미토콘드리아를 포함하기 때문에, 상대적으로 보다 강한 형광 강도를 나타냄)를, 심근 세포 이외의 세포(미토콘드리아 함유량이 상대적으로 낮거나, 또는 상대적으로 낮은 막 전위를 가지는 미토콘드리아를 포함하기 때문에, 미토콘드리아 표시제에 의한 표지를 토대로한 형광 강도도 상대적으로 약함)와 구별함으로써, 그 결과 심근 세포를 살아있는 상태에서 심근 세포의 유전자 변형없이, 선별할 수 있다. 본 발명에 사용하는 세포 분리기는 형광 표지된 세포를 살아있는 상태로 분리할 수 있는 임의의 모든 것일 수 있으며, 구체적인 장치의 예로는 형광 세포 분리기(Fluorescent Activated Cell Sorter; FACS(등록상표))(BD, Frank lin Lakes, NJ USA)를 사용할 수 있지만, 그 이외의 장치(Beckman사, Coulter사, Cytomation사 등)를 사용할 수도 있다.
심근 세포의 선별은 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제에 의해 표지한 직후에 수행할 수도 있다. 그러나, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 보다 확실하게 심근 세포를 선별하고자 하는 경우에는, 미토콘드리아 표시제로 표지한 후 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 다시 배양한 다음, 심근 세포를 선택할 수도 있다. 미토콘드리아 표시제로 표지한 후 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 다시 배양하면, 세포 분열로 인해 세포 하나에 포함되는 미토콘드리아 표시제의 함유량은 감소하게 된다. 따라서, 증식 세포는 배양 시간이 길어질수록, 세포내 미토콘드리아 표시제 함유량이 감소하여 형광 강도가 저하되게 된다. 반면, 심근 세포는 분열 능력이 상실 또는 상당히 저하된 상태이므로, 배양 시간이 길어지더라도 세포 하나 당 미토콘드리아 표시제의 함유량은 다른 세포의 감소 수준으로 감소되지 않아, 상대적으로는 강한 형광 강도를 유지할 수 있다. 따라서, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지한 후, 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 또한 일정 기간, 구체적으로는 수 일간, 배양하면, 심근 세포와 그 이외의 세포 간의 표지 강도 차이가 증폭되어, 보다 확실하게 심근 세포를 선별할 수 있다.
또한, 본 발명은 제2 구현예로, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 농화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (1) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및 (2) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로, 심근 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 구현예에서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물 중 어느 하나이다. 상기 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물이므로 그대로 심장 이식하면, 비심근 세포의 존재로 인해, 수여체의 심장에 심각한 부작용이 발생될 위험성이 있다. 그러므로, 수여체에게 보다 안전하고 확실하게 심근 세포를 이식하기 위해, 이식 전에 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 심근 세포 비율을 가능한 높게, 즉 농화시키는 것이 바람직하다. 또한, 심근 세포로 분화가능한 세포의 예로 줄기세포, 전구세포 또는 난세포를 사용할 수 있다.
상기 방법에서 심근 세포를 보다 확실하게 농화하기 위하여, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 수행할 수 있다. 이 단계에 의해 다른 세포의 형광 강도는 낮아지고 심근 세포의 형광 강도는 상대적으로 높아져, 보다 확실하게 심근 세포를 농화시킬 수 있다.
이러한 구현예에서, 미토콘드리아 표시제로 상기와 같이, A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 또는 T3168을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 미토콘드리아 표시제로 M7512, T3168, T668 또는 R302을 사용한다.
또한, 본 발명은 제3 구현예로 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (1) 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 심근 세포를 분화 및 유도하여, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 제조하는 단계; (2) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및 (3) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로 심근 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 구현예에서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물 중 어느 하나이다. 상기 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물이므로, 이를 그대로 심장 이식하면 비심근 세포의 존재로 인해, 수여체의 심장에 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 위험성이 있다. 그러므로, 수여체에게 보다 안전하고 확실하게 심근 세포를 이식하기 위하여, 이식 시에, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물에서 심근 세포의 비율을 가능한 높게 준비한 제조물을 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 심근 세포로 분화가능한 세포는 예컨대 줄기세포, 전구세포 또는 난세포를 사용할 수 있다.
상기 방법에서, 보다 확실하게 심근 세포를 제조하기 위하여, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에, 미토콘드리아 표시제의 비존재하에 표지한 세포를 배양하는 단계을 더 수행할 수도 있다.
상기 구현예에서, 미토콘드리아 표시제는, 상기와 같이, A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 또는 T3168을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 미토콘드리아 표시제로 M7512, T3168, T668 또는 R302을 사용한다.
심근 세포를 분화 및 유도하는 방법으로서, 보다 미분화되고 다양한 분화능을 가진 다능성 줄기세포(pluripotent stem cells)로부터 분화 및 유도하는 방법이, 이미 본 발명이 속하는 기술 분야에서 여러가지 개발되어 있다. 상기 다능성 줄기세포는 시험관내 배양에 의해 미분화된 상태를 유지하면서 거의 영속적 또는 장기적인 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적정 조건하에서 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화되는 능력을 가진 세포로 정의된다. 현재, 다능성 줄기세포로는 초기 배아로부터 분리되는 배아 줄기세포(embryonic stem cells: ES 세포), 태아기의 원시 생식 세포로부터 분리되는 배아 생식 세포(embryonic germ cells: EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리되는 다능성 성체 전구세포(multipotent adult progenitor cells: MAPC)의 3종이 가장 잘 알려져 있다.
다능성 줄기세포 중의 배아 줄기세포로부터 심근 세포를 분화 및 유도하는 방법은, 예컨대, 부유 응집 배양법, 행잉 드롭 배양법(hanging drop culture), 피더 세포와의 공배양법, 선회 배양법(rotation culature), 연질 한천 배양법, 마이크로 캐리어 배양법 등을 들 수 있다.
부유 응집 배양법은 단일 세포 상태(효소 소화 등을 실시하여 세포 간의 접착이 없이 각각의 세포가 액체중에 분산된 상태)의 배아 줄기세포를 배지에 수백 세포/mL의 세포 밀도가 되도록 현탁하는 단계, 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 등의 분화 억제 인자의 부재하에 부유 응집 배양을 수행하는 단계, ES 세포끼리 접착 및 응집하여, 배아체(embryoid body: EB)라 하는 초기 배아와 유사한 구조체가 형성되는 단계로, 상기 EB를 부유 상태 또는 접착 상태로 배양함으로써, 자율 박동성을 가진 심근 세포로 분화 및 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 행잉 드롭 배양법은 배양 접시 뚜껑에 20 ㎕의 배양액으로 이루어지는 액적(droplet)을 제조하는 단계, 이 액적에 수백 개의 세포를 포함시키고, 상기 배양 접시 뚜껑을 배양 접시에 덮고 정치하는 단계, 세포가 액적의 바닥면, 즉 액적의 끝 부분에서 세포 덩어리를 형성하는 단계로, 상기 세포 덩어리를 자율 박동성을 갖는 심근 세포로 분화 및 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 피더 세포와의 공배양법을 이용하는 경우, 간엽계 세포의 성질을 갖는 세포, 바람직하게는 ST2 세포, OP9 세포, PA6 세포 등의 골수 스트로마 세포형(marrow stromal cell-like)의 형질을 갖은 세포를 고밀도 배양, 마이토마이신C 처리 또는 방사선 조사 등의 방법에 의해 피더화하고, 그 위에 배지에 단일 세포 상태의 ES 세포를 접종한 후 배양함으로써, 자율 박동성을 갖는 심근 세포로 분화 및 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 제4 구현예는 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물내 심근 세포 비율을 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (1) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및 (2) 세포의 상대적인 미토콘드리아 함유량을 토대로, 비심근 세포에 대한 심근 세포의 비율을 계측하는 단계 및/또는 세포의 상대적인 미토콘드리아 막 전위를 토대로 심근 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법도 제공한다.
상기 구현예에서, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물 중 어느 하나이다. 상기 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 심근 세포와 비심근 세포와의 혼합물이며, 그대로 심장 이식을 수행하면, 비심근 세포의 존재에 의해 수여체의 심장에 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 위험성이 있다. 그러므로, 수여자에게 보다 안전하고 확실하게 심근 세포를 이식하기 위하여, 이식 전에 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물내 심근 세포의 비율을 가능한 높게, 즉 농화시키는 것이 바람직하다. 또한, 상기 심근 세포로 분화가능한 세포로는 예를 들면, 줄기세포, 전구세포 또는 난세포를 사용할 수 있다.
상기 구현예에서도, 미토콘드리아 표시제로는, 상기와 같이, A1372, D273, D288, D308, D378, D426, D632, D633, D22421, D23806, L6868, M7502, M7510, M7511, M7512, M7513, M7514, M22422, M22423, M22425, M22426, R302, R634, R648, R14060, R22420, T639, T668, T669 또는 T3168을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 미토콘드리아 표시제로 M7512, T3168, T668 또는 R302을 사용한다.
심근 세포의 이식과 관련된 분야에서는 심근 세포를 분화 및 유도하는 방법이 수개 공지되어 있으며, 또한 장래에 심근 세포를 분화 및 유도하는 방법이 다수 개발될 것이 예상된다. 그러나, 상술한 바와 같이, 심장 이식 세포에 비심근 세포가 혼재되어 있으면, 심장 이식시에 수여체의 심장에 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 위험성이 존재한다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 심장에 이식 예정인 심근 세포 제조물의 심근 세포의 비율을 이식 전에 평가함으로써, 이식에 사용할 수 있는 심근 세포 제조물의 확실성을 사전에 평가할 수 있다.
해당 기술 분야의 심근 세포 정제 방법으로는, 예컨대, 유세포 측정기나 자석비드, 패닝법(panning method) 등의 항원-항체 반응에 준한 방법(Monoclonal Antibodies: principle sand practice, Third Edition(Acad. Press, 1993); Antibody Engineering: A Practical Approach(IRL Pressat Oxford University Press, 1996); 모세포가 되는 ES 세포 등의 다능성 줄기세포의 유전자에 미리 인위적인 수식을 가하여 약제 내성 또는 이소성 단백질의 발현능을 부여함으로써, 심근 세포로서의 형질을 가진 세포를 수득하는 방법; 및 정제도는 낮지만 다른 방법과 조합하여 이용하는 것이 용이한 자당, 퍼콜(Percoll) 등의 담체를 이용한 밀도 구배원심에 의한 세포 분획법(Circ Res. 2002 20; 91: 501-508)) 등이, 구체적인 예로서 알려져 있다.
본 발명의 방법에 의해, 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포를 선별할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, 심근 세포의 유전자 변형없이, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물중의 심근 세포를 농화할 수 있으며, 그리고 심근 세포의 유전자 변형없이 심근 세포를 제조할 수 있다. 또한, 다양한 방법으로 제조된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 심근 세포 비율을 평가 가능하다.
본 발명에 기재한 상기 방법에 따라, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 심근 세포 비율을 향상시킬 수 있으며, 수여체의 심장에 이식하였을 때에 비심근 세포의 존재로 의해 발생될 수 있는 각종 부작용을 낮출 수 있다.
(1) 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물의 제조
먼저, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물 또는 줄기세포 유래 세포 혼합물로서 수득한다.
전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 우선 중절 태아 또는 신생아의 심장으로부터 심실을 분리하고, 이를 가위로 섬세하게 분리한 후, 콜라게나제 등의 효소 처리함으로써 세포간 결합을 제거하여 세포를 분산시킴으로써, 준비할 수 있다.
줄기세포 유래 세포 혼합물은 배아 줄기세포나 성체 줄기세포 등의 줄기세포를 행잉 드롭 배양법(Bader A, et al., Differentiation, 200168: p.31-43)에 의해 심근 세포를 분화 및 유도시킴으로써, 준비할 수 있다. 줄기세포 유래 세포 혼합물을 사용할 경우에는, 분화 및 유도한 세포 혼합물에 심근 세포의 분화 및 성숙도를 높이는 처리(예, all-trans 레티노인산의 첨가)를 수행하는 것이 바람직하다.
(2) 세포를 미토콘드리아 표시제로 표지
본 발명에서는 바람직한 미토콘드리아 표시제로서 형광 발광성의 M7512, T3168, T668 또는 R302(모두 Molecular Probe)을 사용한다. 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물, 또는 줄기세포 유래 세포 혼합물은 M7512, T3168, T668 또는 R302을 배양액에 첨가하여 배양함으로써, 세포를 표지한다.
세포를 미토콘드리아 표시제로 표지한 후, 수 일간 배양함으로써, 심근 세포의 표지 신호량과 다른 세포의 표지 신호량의 차이를 더욱 증폭시킬 수 있다.
(3) 심근 세포의 선별
M7512, T3168, T668 또는 R302로 표지한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물, 또는 줄기세포 유래 세포 혼합물은, 세포 분리기를 사용하여 각 세포내 미토콘드리아 함유량을 측정하고, 상대적으로 높은 미토콘드리아 함유량을 가지는 세포 집단을 심근 세포로 분리한다. 여기서, 세포 분리기로 형광 세포 분리기(Fluorescent Activated Cell Sorter; FACS(등록상표))(BD, Franklin Lakes, NJ USA)를 사용하는 것이 바람직하다.
(4) 심근 세포의 확인
상술한 방법에 따라, 표지 강도가 강한 세포를 분리하여 배양한다. 그 후, 심근 세포를 다른 세포와 식별할 수 있는 다른 방법을 사용하여 선택한 후, 심근 세포의 함유량 및 포함율을 산출하여, 본 발명의 효과를 확인한다. 본 발명에서는 심근 세포를 다른 세포와 식별할 수 있는 다른 방법으로, 심근 세포 특이적 마커(예, 미오신 중쇄(heavy chain)/경쇄(light chain)나 근육원섬유마디(Sarcomer) α-액티닌, 트로포닌I, ANP, GATA-4, Nkx 2.5, MEF-2c)에 대한 항체를 이용한 검출 방법을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 이들 중에서 항-근육원섬유마디 α-액티닌 항체(anti-Sarcomeric α-Actrinin Antibody)에 의한 표지 방법을 사용한다.
도 1은 갓 태어난 랫의 심장에서 추출한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제 M7512로 표지한 표지 사진이다.
도 2는 마우스 배아 줄기세포 유래의 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제 M7512로 표지한 표지 사진이다.
도 3은 갓 태어난 랫의 심장에서 추출한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제 M7512로 표지하고, 각 세포의 형광량으로 각각 검출한 세 포 집단의 분포를 나타낸다.
도 4는 마우스 배아 줄기세포 유래의 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제 M7512로 표지하고, 각 세포의 형광량으로 각각 검출한 세포 집단의 분포를 나타낸다.
도 5는 도 3에 나타낸 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 심근 세포 마커에 대한 항체, 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체로 표지한 사진이다.
도 6은 도 4에 나타낸 심근 세포로 분화가능한 세포로부터 유래된 세포 혼합물을 심근 세포 마커에 대한 항체, 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체로 표지한 사진이다.
도 7은 갓 태어난 랫의 심장에서 추출한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제 T3168로 표지하고, 각 세포의 형광량을 각각 검출한 분포 해석과 세포 분리한 집단을 심근 세포 마커에 대한 항체, 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체로 표지한 사진이다.
도 8a는 갓 태어난 랫의 전체 심장 세포를 T668로 표지하고, 형광량을 각각에 검출하여 분포를 분석한 결과, 세포 분리한 집단에 대한 분석 결과, 및 각 세포군의 심근 세포 마커에 대한 항체, 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체 표지 사진이다. 도 8a는 갓 태어난 랫 태아 심장 유래의 세포 집단이 T668 형광 강도에 따라 3개의 세포 집단으로 분리됨을 나타낸다.
도 8b는 68의 형광 신호가 가장 강한 세포군의 대부분은 모든 세포가 심근 세포이며, 중형광 세포 집단의 대부분은 심근 세포가 아님을 나타낸 도면이다.
도 8c는 R302에서도 T668과 동일하게 세포를 얻을 수 있음을 나타낸 도면이다.
도 9는 미토콘드리아 표시제 T668를 사용한 랫 태아의 전체 심장 구성 세포의 세포 집단 분석 및 분리 세포의 액티닌에 대한 면역 염색을 나타낸다. 도 9a는 수태 13일된 랫 태아 심장 유래의 세포 집단이 T668 형광 강도에 따라 3종의 세포 집단으로 분리됨을 나타낸 도면이다.
도 9b는 T668의 형광 신호가 가장 강했던 세포군 대부분이 심근 세포이며, 중형광 세포 집단의 대부분이 심근 세포가 아님을 나타낸 도면이다.
도 10은 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 태아 전체 세포의 염색과 심근 세포의 정제를 나타낸다. 도 10a는 수태 9일된 랫 태아 유래의 세포 집단은 형광 강도에 따른 세포 집단 분류에서 주로 1종의 세포 집단으로 관측됨을 나타낸 도면이다.
도 10b는 심근 세포 마커인 액티닌으로 면역 염색을 수행한 결과, T668으로 표지된 세포의 95% 이상이 심근 세포인 것으로 확인됨을 나타낸 도면이다.
도 11은 미토콘드리아 표시제 T668를 이용한 생후 8일부터 수태 11일까지의 랫 전체 심장 구성 세포의 염색 사진과 세포 집단 분석 결과이다.
도 12는 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 마우스 배아 줄기세포 유래의 다양한 종류의 세포군의 염색 사진과 분리한 세포 집단의 액티닌 면역 염색 결과이다.
본 발명은 이하의 실시예를 들어 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 예시에 불과하며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 갓 태어난 랫의 심장에서 추출한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제로 표지
본 실시예는 본 발명에 따른 방법이 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물에서 심근 세포를 검출하기 위해 사용가능한지 여부를 확인하였다.
생후 1-3일 된 랫을 에테르로 마취하고, 경추 탈구에 의해 죽인 후, 심장을 적출하였다. 심실을 분리하여, 혈청 무첨가 D-MEM(High-glucose) 배지(Invitrogen) 중, 0.025%(w/v)의 콜라게나제(Warthington Biomedical Corporation) 존재하에서 분리한 심실을 소화시킴으로써, 세포를 분산시켜, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 수득하였다.
배양액을 소태아 혈청(JRH Bioscience)을 최종 농도 10%로 첨가한 D-MEM(High-glucose) 배지(Invitrogen)로 치환하였다. 이와 같이하여 제조한 배양 세포는 미토콘드리아 표시제 M7512(Molecular Probe)을 최종 농도 100nM로 첨가한 배양액에서 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 후, 배지로 4번 세정한 후, 다시 37℃에서 24시간 배양하였다.
이와 같이하여 표지한 세포를 형광현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 1에 나타낸다.
도 1에서, 심근 세포에서 M7512에 의한 형광이 명료하게 관찰되어, 심근 세포가 다량의 미토콘드리아를 세포내에 포함하고 있는 것으로 나타났지만, 틀에 둘 러 싸여진 비심근 세포에서는 소량의 미토콘드리아만 포함되어 있는 것으로 관찰되었다.
실시예 2: 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포 혼합물에 대한 미토콘드리아 표시제 표지
본 실시예는, 본 발명의 방법이 줄기세포 유래 세포 혼합물에서 심근 세포를 검출하기 위하여 사용 가능한지 여부를 확인하기 위하여 수행하였다.
미분화 마우스 배아 줄기세포는 행잉 드롭 배양법(Bader A, et al., Differentiation ,2001 68: p.31-43)을 사용하여, 심근 세포의 분화 및 유도를 실시하였다. 구체적으로는, 배양 접시 뚜껑에 20㎕의 배양액으로 이루어지는 액적을 만들고, 이 액적에 수백 개의 세포를 포함시킨 후, 상기 배양 접시 뚜껑을 배양 접시에 덮어 정치함으로써, 세포는 액적의 바닥면, 즉 액적의 끝 부분에 세포 덩어리를 형성하여 심근 세포를 분화 및 유도시키는 방법이다. 심근 세포의 분화 및 유도시, 배양액으로서 소태아 혈청(EQUITECH-BIO)을 최종 농도 10%로 혼합한 α-MEM 배지(SIGMA)를 사용하였다.
분화 및 유도 후 14일째에, 배양 용기내에서 자율 박동성의 세포를 포함하는 세포 덩어리가 생성된 것을 확인하였고, 또한 심근 세포의 분화 및 성숙도를 높이기 위하여, 모두 트랜스인 레티노인산을 최종 농도 10-8M로 배양액에 첨가하였다.
분화 및 유도 21일째에 자율 박동성의 세포를 포함하는 세포 덩어리를 분산시켜, 각각의 세포로 분산되었다. 이와 같이 제조한 세포 혼합물을 실시예 1과 동 일한 조건으로 M7512로 표지하고, M7512를 제거한 후 접착 배양을 5일간 계속 실시하였으며, 배양 조건 하에서 형성된 자율 박동성의 세포를 포함하는 세포 덩어리를 형광현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 2에 나타낸다.
도 2는 세포 덩어리의 1회 박동주기(즉, 이완기1-수축기-이완기2) 동안의 세포 덩어리의 위상차 사진(상단) 및 형광 사진(하단)이다. 그 결과, 모든 자율 박동성의 심근 세포는 다른 세포에 비해 M7512로 강하게 표지되어 있음을 알수 있었다. 즉, 자율 박동성의 세포 덩어리에서는 M7512에 의한 형광이 명료하게 관찰되지만, 자율 박동성의 세포 덩어리 주변에 존재하는 세포에서는 M7512에 의한 형광이 거의 관찰되지 않았다.
실시예 3: 미토콘드리아 표시제로 표지한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물의 세포 분포 분석
본 실시예는 실시예 1의 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물에 심근 세포가 어느 정도 존재하는지를 명확하게 하기 위해 수행하였다.
먼저, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 실시예 1에 기재한 방법으로 제조하고, M7512로 표지하였다. 상기 표지된 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 FACS(등록상표)(BD, Frank lin Lakes, NJ USA)에 의한 세포 집단의 존재 분포 분석에 사용하였다. 결과는 도 3에 나타낸다.
도 3에서, 가로축의 FSC-A는 세포의 크기를 나타내는 지표이다. 도시한 바와 같이, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물은 상대적으로 형광 강도가 강한 P5 영역에 존재하는 세포와 상대적으로 형광 강도가 약한 P6 영역으로 나눌 수 있다. 본 실시예에서는 P5 영역에 존재하는 세포를 심근 세포로 분리하고, P6 영역에 존재하는 세포를 심근 세포 이외의 세포로 분리하여 배양하였다.
실시예 4: 미토콘드리아 표시제로 표지한 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포 혼합물의 세포 분포 분석
본 실시예는, 실시예 2의 마우스 배아 줄기세포로부터 유래된 세포 혼합물중에 심근 세포가 어느 정도 존재하는지를 밝히는 것을 목적으로 수행하였다.
먼저, 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물을 실시예 2에 기재한 방법으로 제조하고, M7512으로 표지하였다. 표지된 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물은 FACS(등록상표)(BD, Franklin Lakes, NJ USA)으로 세포 집단의 존재 분포를 분석하였다. 결과는 도 4에 나타낸다.
도 4에서, 가로축의 FSC-A는 세포의 크기를 나타내는 지표이다. 도시한 바와 같이, 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물은 상대적으로 형광 강도가 강한 P2 영역에 존재하는 세포와, 상대적으로 형광 강도가 약한 그 이외의 영역에 존재하는 세포로 나눌 수 있다. 본 실시예에서는, P2영역에 존재하는 세포를 심근 세포로 분리하여 배양하였다.
실시예 5: 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물에서 선별한 세포의 심근 세포 마커로 표지
본 실시예는, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물에 존재하는 심근 세포가 실시예 3의 방법에 의해 어느 정도 농화되었는지를 명확하게 하기 위해 실시하였다.
실시예 3의 방법에서 분리한 P5 영역 및 P6 영역에 속하는 세포 집단은 배양액으로 소태아 혈청(EQUITECH-BIO)이 최종 농도 10%로 혼합된 α-MEM 배지(SIGMA)에서 12시간 배양하고, 파라포름알데히드로 고정하였다.
이어서, 고정한 세포는 심근 세포 마커인 마우스 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체(SIGMA)로 표지하고, 녹색형광 물질로 표지한 염소 항-마우스 항체(Molecular Probes)를 사용하여, 세포에 결합된 마우스 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체를 가시화하였다. 결과는 도 5에 나타낸다. 도 5에서 상단은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물의 결과이고, 중단은 실시예 3으로 P5 영역에서 분리한 세포의 결과이고, 하단은 실시예 3으로 P6 영역에서 분리한 세포의 결과이다.
그 결과, 본 발명의 방법으로 선별하기 전의 세포 혼합물에는 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체에 의해 인식되는 심근 세포와 그 이외의 세포가 혼재되어 있었으며, 전체 세포중에 심근 세포의 비율은 30% 이었다. 이에 비해, P5 영역에서 수득한 세포는 99% 이상이 심근 세포인 것이 나타났다. 또한, P6 영역에서 수득한 세포에도 심근 세포가 일부 잔존하였지만, 본 발명의 방법으로 선별하기 전과 동등한 심근 세포 비율에 불과하였다.
따라서, 본 발명의 방법으로 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물로부터 고순도로 심근 세포를 선별 및 농화할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 6: 마우스 배아 줄기 세포 유래 세포 혼합물로부터 선택한 세포의, 심근 세포 마커에 의한 표지
본 실시예는, 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물에 존재하는 심근 세포 가 실시예 4의 방법에 의해 어느 정도 농화되었는지를 확인하기 위한 목적으로 실시하였다.
실시예 4의 방법으로 분리한 P2 영역에 속하는 세포 집단 및 그 이외의 영역에 속하는 세포 집단은, 배양액으로 소태아 혈청(EQUITECH-BIO)이 최종 농도 10%로 혼합된 α-MEM 배지(SIGMA)에서 12시간 배양한 후, 파라포름알데히드로 고정하였다.
이어서, 고정한 세포는 심근 세포 마커인 마우스 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체(SIGMA)을 사용하여 표지하고, 녹색형광 물질로 표지된 염소 항 마우스 항체(Molecular Probes)를 사용하여, 세포에 결합한 마우스 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체를 가시화하였다. 결과는 도 6에 나타낸다. 도 6에서, 상단은 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물의 결과이고, 하단은 실시예 4의 P2 영역으로 수득한 세포의 결과이다.
그 결과, 본 발명의 방법으로 선별하기 전의 세포 혼합물에는 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체에 의해 인식되는 심근 세포와 그 이외의 세포가 혼재하고 있었으며, 전체 세포에서 심근 세포의 비율은 10% 이었다. 이에 비해, M7512로 표지하였을때 형광 강도가 강했던 P2 영역에서 수득한 세포는 80% 이상이 심근 세포인 것이 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 마우스 배아 줄기세포 유래 세포 혼합물로부터 심근 세포를 고순도로 선별 및 농화할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 7: 미토콘드리아 표시제 T3168에 의한 표지
본 실시예는, 미토콘드리아 표시제 T3168에 의해 표지 결과가 M7512의 결과와 동일하지를 확인하기 위하여 수행하였다.
미토콘드리아 표시제로 T3168(Molecular Probe)을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로, 미토콘드리아 표시제로 표지된 갓 태어난 랫의 심장으로부터 추출한 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물을 제조하였다.
이와 같이 하여 제조한 표지된 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물에 대하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 FACS로 세포 분포를 분석하고, 상대적으로 강한 형광 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 선택하여 수득하였다. 이와 같이하여 얻어진 세포를 실시예 5과 동일한 방법으로 배양한 후, 파라포름알데히드로 고정하고, 마우스 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체(SIGMA)로 표지하였다. 결과는 도 7에 나타낸다.
그 결과, 본 발명의 방법으로 선별하기 전의 세포 혼합물에는 항-근육원섬유마디α-액티닌 항체에 의해 인식되는 심근 세포와 그 이외의 세포가 혼재되어 있었으며, 전체 세포에서 심근 세포의 비율은 30% 이었다. 이에 비해, 상대적으로 강한 형광 강도를 나타내는 세포는 95% 이상이 심근 세포인 것이 나타났다.
이로써, 본 발명의 방법을 사용하여 미토콘드리아 표시제로 T3168을 사용한 경우에도, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물로부터 고순도로 심근 세포를 선별 및 농화할 수 있음이 확인되었다.
실시예 8: 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 갓 태어난 랫의 전체 심장 구성 세포의 염색 및 심근 세포의 정제
갓 태어난 랫 태아 심장을 0.025%(w/v) 콜라게나제(SIGMA)와 트립신(GIBCO)으로 처리하고, 세포 집단을 회수하였다. 세포가 분산된 배양액을, 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 T668(Molecular Probe)에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS 분석하였다. 그 결과, T668 형광 강도에 따라 3종의 세포 집단이 분리되었다(도 8a). 형광 신호가 가장 강한 고형광 세포 집단과 중형광 강도 세포 집단을 각각 분리하여 배양하였다.
이어서, 배양 세포에 대하여 액티닌에 대한 면역 염색을 수행하여, 심근 세포를 동정하였다(도 8b). 그 결과, T668 형광 신호가 가장 강했던 세포군 대부분은 모든 세포가 심근 세포이었으며, 중형광 세포 집단의 대부분이 심근 세포가 아닌 것이 확인되었다. 마찬가지로, R302(Molecular Probe)로도 분석하였고, 동일한 결과를 얻었다(도 8c).
실시예 9: 미토콘드리아 표시제 T668 및 M7514에 의한 갓 태어난 랫의 전체 심장 구성 세포의 염색 및 단위 미토콘드리아 당 막 전위 비교 분석
실시예 8과 동일한 재료 및 방법을 이용하여 세포 집단을 수득하였다. 그리고, 심근 세포의 미토콘드리아를 특이적으로 염색하는 막 전위 비의존적인 미토콘드리아 표시제 M7514(Molecular Probe)과, 심근 세포의 미토콘드리아를 특이적으로 염색하는 막 전위 의존적인 미토콘드리아 표시제 T668로 염색하였다. 즉시 FACS 분석하였다. T668에 의한 형광과 M7514에 의한 형광은 파장이 상이하므로, 각각 검출 가능하다. T668 형광을 지표로서 3종의 세포 집단을 검출하였다. 실시예 8에 나타낸 바와 같이, 가장 높은 형광을 나타내는 고형광 세포 집단은 심근 세포군 이며, 중형광 세포 집단은 비심근 세포인 것으로 밝혀졌다.
다음으로, T668 유래의 형광 강도를 M7514 유래의 형광 강도로 나눈 비율을 기준으로 각각의 세포군을 분류하였다. T668의 신호에 기초하여 심근 세포로 동정된 세포군은 M7514에 대한 T668의 형광 강도비로 예컨대 150%을 채택할 경우, 150% 이상의 세포가 전체의 90% 이었던 것에 비해, T668에서의 신호에 기초하여 비심근 세포로 동정된 세포에서는 M7514에 대한 T668 형광 강도비 150% 이상은 전체의 13%에 불과하였다. 이러한 차이는 심근 세포는 비심근 세포에 비해 미토콘드리아의 함유량뿐만 아니라, 미토콘드리아당 막 전위도 높음을 의미한다.
실시예 10: 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 랫 태아 전체 심장 구성 세포의 염색 및 심근 세포의 정제
수태 13일된 랫 태아의 심장을 콜라게나제와 트립신으로 처리하여, 세포 집단을 회수하였다. 세포가 분산된 배양액은 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 T668에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS로 분석하였다. T668 형광 강도에 따라 3종의 세포 집단으로 분리되었다(도 9a). 형광 신호가 가장 강한 고형광 세포 집단과 중형광 세포 집단을 각각 분리하여 배양하였다.
배양 세포는 액티닌에 대한 면역염색하여, 심근 세포를 동정하였다. 그 결과, T668 형광 신호가 가장 강했던 세포군의 대부분이 모든 세포가 심근 세포이며, 중형광 세포 집단의 대부분은 심근 세포가 아닌 것으로 밝혀졌다(도 9b).
실시예 11: 미토콘드리아 표시제 T668과 M7512에 의한 태아 전체 심장 염색 및 심근 세포의 정제
수태 9일된 랫 태아를 콜라게나제와 트립신으로 처리하여, 세포 집단을 회수하였다. 세포가 분산된 배양액은, 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 T668에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS로 분석하였다. 형광 강도에 따른 세포 집단에서 주로 1종의 세포 집단이 관찰되어, 발생 후기의 전체 심장 샘플을 사용한 분석에서 심근 세포로 검출이 예측되는 고형광 강도 영역에서는 명확한 세포 집단이 발견되지 않았다(도 10a). 그러나, 주세포 집단에 비해 고형광을 나타내는 세포가 일부 비율로 존재하였기에, 이를 고형광 세포 집단으로 분리 회수하였다.
상기 세포를 배양하고, 심근 세포 마커인 액티닌으로 면역 염색한 결과, T668을 이용하여 회수한 세포의 95% 이상이 심근 세포인 것이 밝혀졌다(도 10b). 수태 9일째 태아(초기 배아)에서는 심근 세포도 매우 미숙한 상태이므로, 미토콘드리아의 양적 변화가 충분히 발생되지 않았음을 고려할 수 있다. 이 결과는, 이러한 시기에도 미토콘드리아의 막 전위를 지표로 이용함으로써, 심근 세포를 효율적으로 선택할 수 있음을 의미한다.
실시예 12: 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 수태 11일부터 생후 8일까지의 랫 전체 심장 구성 세포 염색 및 FACS 분석
수태 11일부터 생후 8일까지의 랫 심장을 콜라게나제와 트립신으로 처리하여, 세포 집단을 회수하였다. 세포가 분산된 배양액은 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 T668에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS로 분석하였다. T668 형광 강도에 따라 세포 집단이 분리되었다. 가장 형광 강도가 강한 고형광 심근 세포 집단은 발생 진행에 따라 양적으로 증가되었고, 세포군이 명확하게 분리되었다(도 11). 그 결과는, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 심근 세포의 성숙도를 추측가능함을 나타낸다.
실시예 13: 미토콘드리아 표시제 T668에 의한 마우스 배아 줄기 세포 유래 다종 세포군의 염색 및 심근 세포의 정제
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, ES 세포를 심근 세포를 포함하는 세포군으로 분화시켰다. 다양한 종류의 세포 덩어리를 콜라게나제와 트립신으로 처리하고, 뿔뿔이 흩어진 세포를 회수하였다. 세포가 분산된 배양액은 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 T668에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS로 분석하였다. 형광 강도에 의한 세포 집단에서는 주로 1종의 세포 집단이 관측되어, 발생 후기의 전체 심장 샘플을 사용한 분석에서 심근 세포로서 검출될 것으로 예측되는 고형광 강도 영역에서는 명확한 세포 집단이 발견되지 않았다(도 12). 그러나, 주세포 집단에 비해 고형광을 나타내는 세포가 존재하기에, 이를 고형광 세포 집단으로 분리 및 회수하였다.
이 세포를 대량 배양하고, 심근 세포 마커인 액티닌으로 면역염색한 결과, 98% 이상이 심근 세포인 것으로 밝혀졌다. 반대로, 주세포 집단을 회수하여, 배양 및 면역염색한 결과, 대부분이 심근 세포가 아니었다.
실시예 14: 미토콘드리아 표시제 S7563에 의한 갓 태어난 랫 전체 심장 구성 세포의 염색 및 심근 세포의 정제
갓 태어난 랫 태아의 심장을 콜라게나제와 트립신으로 처리하여, 세포 집단 을 회수하였다. 세포가 분산된 배양액은 최종 농도 1μM의 미토콘드리아 표시제 S7563에 37℃에서 15분간 노출시키고, 3번 세정한 다음, 바로 FACS 분석하였고, 그 결과 S7563 형광 강도에 따라 3종의 세포 집단이 분리되었다. 형광 신호가 가장 강한 세포 집단을 분리하여 배양하였다.
배양 세포를 액티닌으로 면역염색하여, 심근 세포를 동정하였다. 그 결과, S7563 형광 신호가 가장 강했던 고형광 세포 집단의 대부분은 모든 세포가 심근 세포이었으며, 중형광 세포 집단의 대부분은 심근 세포가 아닌 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 방법에 따라, 심근 세포의 유전자 변형없이, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포를 선별할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, 심근 세포의 유전자 변형없이, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물내 심근 세포를 농화할 수 있으며 심근 세포의 유전자 변형없이도 심근 세포를 제조할 수 있다. 또한, 다양한 방법으로 제조된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물내 심근 세포의 비율을 평가할 수 있다.
본 발명에 기재된 이들 방법에 의해, 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물내 심근 세포의 비율을 향상시킬 수 있으며, 수여체의 심장에 이식하였을 때의 비심근 세포의 존재로 인해 발생될 수 있는 여러가지 부작용을 낮출 수 있다.

Claims (45)

  1. 미토콘드리아 표시제를 사용하여 생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 단계; 및 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 심근 세포를 선별하는 단계를 포함하는,
    생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포 유전자의 변형 없이 심근 세포를 선별하는 시험관 내(in vitro) 심근 세포의 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 심근 세포는, 심근 세포 유전자의 변형 없이, 각 세포의 미토콘드리아 함유량을 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 선별되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 심근 세포는, 심근 세포 유전자의 변형 없이, 각 세포의 미토콘드리아 막 전위를 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 선별되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 심근 세포는, 심근 세포 유전자의 변형 없이, 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위를 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 선별되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은, 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물인 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 단계와, 상기 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여 심근 세포를 선별하는 단계 사이에, 미토콘드리아 표시제의 비존재 하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법:
    A1372:
    Figure 112013032778432-pct00047
    ,
    D273:
    Figure 112013032778432-pct00048
    ,
    D288:
    Figure 112013032778432-pct00049
    ,
    D308:
    Figure 112013032778432-pct00050
    ,
    D378:
    Figure 112013032778432-pct00051
    ,
    D426:
    Figure 112013032778432-pct00052
    ,
    D632:
    Figure 112013032778432-pct00053
    ,
    D633:
    Figure 112013032778432-pct00054
    ,
    D22421:
    Figure 112013032778432-pct00055
    ,
    D23806:
    Figure 112013032778432-pct00056
    ,
    L6868:
    Figure 112013032778432-pct00057
    ,
    M7502:
    Figure 112013032778432-pct00058
    ,
    M7510:
    Figure 112013032778432-pct00059
    ,
    M7511:
    Figure 112013032778432-pct00060
    ,
    M7512:
    Figure 112013032778432-pct00061
    ,
    M7513:
    Figure 112013032778432-pct00062
    ,
    M7514:
    Figure 112013032778432-pct00063
    ,
    M22422:
    Figure 112013032778432-pct00064
    ,
    M22423:
    Figure 112013032778432-pct00065
    ,
    M22425:
    Figure 112013032778432-pct00066
    ,
    M22426
    Figure 112013032778432-pct00067
    ,
    R302:
    Figure 112013032778432-pct00068
    ,
    R634:
    Figure 112013032778432-pct00069
    ,
    R648:
    Figure 112013032778432-pct00070
    ,
    R14060:
    Figure 112013032778432-pct00071
    ,
    R22420:
    Figure 112013032778432-pct00072
    ,
    T639:
    Figure 112013032778432-pct00073
    ,
    T668:
    Figure 112013032778432-pct00074
    ,
    T669:
    Figure 112013032778432-pct00075
    , 및
    T3168:
    Figure 112013032778432-pct00076
    .
  10. 제9항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  11. (1) 생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제로 표지하는 단계; 및
    (2) 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 심근 세포를 선별하는 단계를 포함하는,
    생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물로부터 심근 세포 유전자의 변형 없이 심근 세포를 농화(enrichment)하는 시험관 내(in vitro) 심근 세포의 농화 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물인 시험관 내 심근 세포의 농화 방법.
  13. 삭제
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 (1) 단계와 (2) 단계 사이에, 미토콘드리아 표시제의 비존재 하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 시험관 내 심근 세포의 농화 방법.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 농화 방법:
    A1372:
    Figure 112013032778432-pct00077
    ,
    D273:
    Figure 112013032778432-pct00078
    ,
    D288:
    Figure 112013032778432-pct00079
    ,
    D308:
    Figure 112013032778432-pct00080
    ,
    D378:
    Figure 112013032778432-pct00081
    ,
    D426:
    Figure 112013032778432-pct00082
    ,
    D632:
    Figure 112013032778432-pct00083
    ,
    D633:
    Figure 112013032778432-pct00084
    ,
    D22421:
    Figure 112013032778432-pct00085
    ,
    D23806:
    Figure 112013032778432-pct00086
    ,
    L6868:
    Figure 112013032778432-pct00087
    ,
    M7502:
    Figure 112013032778432-pct00088
    ,
    M7510:
    Figure 112013032778432-pct00089
    ,
    M7511:
    Figure 112013032778432-pct00090
    ,
    M7512:
    Figure 112013032778432-pct00091
    ,
    M7513:
    Figure 112013032778432-pct00092
    ,
    M7514:
    Figure 112013032778432-pct00093
    ,
    M22422:
    Figure 112013032778432-pct00094
    ,
    M22423:
    Figure 112013032778432-pct00095
    ,
    M22425:
    Figure 112013032778432-pct00096
    ,
    M22426
    Figure 112013032778432-pct00097
    ,
    R302:
    Figure 112013032778432-pct00098
    ,
    R634:
    Figure 112013032778432-pct00099
    ,
    R648:
    Figure 112013032778432-pct00100
    ,
    R14060:
    Figure 112013032778432-pct00101
    ,
    R22420:
    Figure 112013032778432-pct00102
    ,
    T639:
    Figure 112013032778432-pct00103
    ,
    T668:
    Figure 112013032778432-pct00104
    ,
    T669:
    Figure 112013032778432-pct00105
    , 및
    T3168:
    Figure 112013032778432-pct00106
    .
  16. 제15항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포의 농화 방법.
  17. (1) 생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 제조하는 단계;
    (2) 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및
    (3) 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 심근 세포를 선별하는 단계를 포함하는,
    심근 세포 유전자의 변형 없이 심근 세포를 제조하는, 시험관 내(in vitro) 심근 세포의 제조 방법.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서, 상기 (2) 단계와 (3) 단계 사이에, 미토콘드리아 표시제의 비존재 하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 시험관 내 심근 세포의 제조 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 제조 방법:
    A1372:
    Figure 112013032778432-pct00107
    ,
    D273:
    Figure 112013032778432-pct00108
    ,
    D288:
    Figure 112013032778432-pct00109
    ,
    D308:
    Figure 112013032778432-pct00110
    ,
    D378:
    Figure 112013032778432-pct00111
    ,
    D426:
    Figure 112013032778432-pct00112
    ,
    D632:
    Figure 112013032778432-pct00113
    ,
    D633:
    Figure 112013032778432-pct00114
    ,
    D22421:
    Figure 112013032778432-pct00115
    ,
    D23806:
    Figure 112013032778432-pct00116
    ,
    L6868:
    Figure 112013032778432-pct00117
    ,
    M7502:
    Figure 112013032778432-pct00118
    ,
    M7510:
    Figure 112013032778432-pct00119
    ,
    M7511:
    Figure 112013032778432-pct00120
    ,
    M7512:
    Figure 112013032778432-pct00121
    ,
    M7513:
    Figure 112013032778432-pct00122
    ,
    M7514:
    Figure 112013032778432-pct00123
    ,
    M22422:
    Figure 112013032778432-pct00124
    ,
    M22423:
    Figure 112013032778432-pct00125
    ,
    M22425:
    Figure 112013032778432-pct00126
    ,
    M22426
    Figure 112013032778432-pct00127
    ,
    R302:
    Figure 112013032778432-pct00128
    ,
    R634:
    Figure 112013032778432-pct00129
    ,
    R648:
    Figure 112013032778432-pct00130
    ,
    R14060:
    Figure 112013032778432-pct00131
    ,
    R22420:
    Figure 112013032778432-pct00132
    ,
    T639:
    Figure 112013032778432-pct00133
    ,
    T668:
    Figure 112013032778432-pct00134
    ,
    T669:
    Figure 112013032778432-pct00135
    , 및
    T3168:
    Figure 112013032778432-pct00136
    .
  21. 제20항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포의 제조 방법.
  22. (1) 생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 미토콘드리아 표시제를 사용하여 표지하는 단계; 및
    (2) 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여, 보다 강한 지시 강도를 나타내는 세포를 심근 세포로 규정함으로써, 비심근 세포에 대한 심근 세포의 비율을 계측하는 단계를 포함하는,
    생체로부터 이미 채취해 조제된, 또는 생체 외에서 조제된 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물 중 심근 세포의 비율을 평가하는, 시험관 내(in vitro) 심근 세포 비율 평가 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물은 전체 심장을 구성하는 세포 혼합물인 시험관 내 심근 세포 비율 평가 방법.
  24. 삭제
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포 비율 평가 방법:
    A1372:
    Figure 112013032778432-pct00137
    ,
    D273:
    Figure 112013032778432-pct00138
    ,
    D288:
    Figure 112013032778432-pct00139
    ,
    D308:
    Figure 112013032778432-pct00140
    ,
    D378:
    Figure 112013032778432-pct00141
    ,
    D426:
    Figure 112013032778432-pct00142
    ,
    D632:
    Figure 112013032778432-pct00143
    ,
    D633:
    Figure 112013032778432-pct00144
    ,
    D22421:
    Figure 112013032778432-pct00145
    ,
    D23806:
    Figure 112013032778432-pct00146
    ,
    L6868:
    Figure 112013032778432-pct00147
    ,
    M7502:
    Figure 112013032778432-pct00148
    ,
    M7510:
    Figure 112013032778432-pct00149
    ,
    M7511:
    Figure 112013032778432-pct00150
    ,
    M7512:
    Figure 112013032778432-pct00151
    ,
    M7513:
    Figure 112013032778432-pct00152
    ,
    M7514:
    Figure 112013032778432-pct00153
    ,
    M22422:
    Figure 112013032778432-pct00154
    ,
    M22423:
    Figure 112013032778432-pct00155
    ,
    M22425:
    Figure 112013032778432-pct00156
    ,
    M22426
    Figure 112013032778432-pct00157
    ,
    R302:
    Figure 112013032778432-pct00158
    ,
    R634:
    Figure 112013032778432-pct00159
    ,
    R648:
    Figure 112013032778432-pct00160
    ,
    R14060:
    Figure 112013032778432-pct00161
    ,
    R22420:
    Figure 112013032778432-pct00162
    ,
    T639:
    Figure 112013032778432-pct00163
    ,
    T668:
    Figure 112013032778432-pct00164
    ,
    T669:
    Figure 112013032778432-pct00165
    , 및
    T3168:
    Figure 112013032778432-pct00166
    .
  26. 제25항에 있어서, 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포 비율 평가 방법.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제6항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제를 사용하여 심근 세포를 포함하는 세포 혼합물을 표지하는 단계와, 상기 각 세포의 미토콘드리아 함유량 및 미토콘드리아 막 전위 중 하나 이상을 측정하여 심근 세포를 선별하는 단계 사이에, 미토콘드리아 표시제의 비존재 하에 표지한 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제6항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법:
    A1372:
    Figure 112011067083022-pct00167
    ,
    D273:
    Figure 112011067083022-pct00168
    ,
    D288:
    Figure 112011067083022-pct00169
    ,
    D308:
    Figure 112011067083022-pct00170
    ,
    D378:
    Figure 112011067083022-pct00171
    ,
    D426:
    Figure 112011067083022-pct00172
    ,
    D632:
    Figure 112011067083022-pct00173
    ,
    D633:
    Figure 112011067083022-pct00174
    ,
    D22421:
    Figure 112011067083022-pct00175
    ,
    D23806:
    Figure 112011067083022-pct00176
    ,
    L6868:
    Figure 112011067083022-pct00177
    ,
    M7502:
    Figure 112011067083022-pct00178
    ,
    M7510:
    Figure 112011067083022-pct00179
    ,
    M7511:
    Figure 112011067083022-pct00180
    ,
    M7512:
    Figure 112011067083022-pct00181
    ,
    M7513:
    Figure 112011067083022-pct00182
    ,
    M7514:
    Figure 112011067083022-pct00183
    ,
    M22422:
    Figure 112011067083022-pct00184
    ,
    M22423:
    Figure 112011067083022-pct00185
    ,
    M22425:
    Figure 112011067083022-pct00186
    ,
    M22426
    Figure 112011067083022-pct00187
    ,
    R302:
    Figure 112011067083022-pct00188
    ,
    R634:
    Figure 112011067083022-pct00189
    ,
    R648:
    Figure 112011067083022-pct00190
    ,
    R14060:
    Figure 112011067083022-pct00191
    ,
    R22420:
    Figure 112011067083022-pct00192
    ,
    T639:
    Figure 112011067083022-pct00193
    ,
    T668:
    Figure 112011067083022-pct00194
    ,
    T669:
    Figure 112011067083022-pct00195
    , 및
    T3168:
    Figure 112011067083022-pct00196
    .
  34. 삭제
  35. 제8항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법:
    A1372:
    Figure 112011067083022-pct00227
    ,
    D273:
    Figure 112011067083022-pct00228
    ,
    D288:
    Figure 112011067083022-pct00229
    ,
    D308:
    Figure 112011067083022-pct00230
    ,
    D378:
    Figure 112011067083022-pct00231
    ,
    D426:
    Figure 112011067083022-pct00232
    ,
    D632:
    Figure 112011067083022-pct00233
    ,
    D633:
    Figure 112011067083022-pct00234
    ,
    D22421:
    Figure 112011067083022-pct00235
    ,
    D23806:
    Figure 112011067083022-pct00236
    ,
    L6868:
    Figure 112011067083022-pct00237
    ,
    M7502:
    Figure 112011067083022-pct00238
    ,
    M7510:
    Figure 112011067083022-pct00239
    ,
    M7511:
    Figure 112011067083022-pct00240
    ,
    M7512:
    Figure 112011067083022-pct00241
    ,
    M7513:
    Figure 112011067083022-pct00242
    ,
    M7514:
    Figure 112011067083022-pct00243
    ,
    M22422:
    Figure 112011067083022-pct00244
    ,
    M22423:
    Figure 112011067083022-pct00245
    ,
    M22425:
    Figure 112011067083022-pct00246
    ,
    M22426
    Figure 112011067083022-pct00247
    ,
    R302:
    Figure 112011067083022-pct00248
    ,
    R634:
    Figure 112011067083022-pct00249
    ,
    R648:
    Figure 112011067083022-pct00250
    ,
    R14060:
    Figure 112011067083022-pct00251
    ,
    R22420:
    Figure 112011067083022-pct00252
    ,
    T639:
    Figure 112011067083022-pct00253
    ,
    T668:
    Figure 112011067083022-pct00254
    ,
    T669:
    Figure 112011067083022-pct00255
    , 및
    T3168:
    Figure 112011067083022-pct00256
    .
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 제29항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 선별 방법:
    A1372:
    Figure 112011067083022-pct00317
    ,
    D273:
    Figure 112011067083022-pct00318
    ,
    D288:
    Figure 112011067083022-pct00319
    ,
    D308:
    Figure 112011067083022-pct00320
    ,
    D378:
    Figure 112011067083022-pct00321
    ,
    D426:
    Figure 112011067083022-pct00322
    ,
    D632:
    Figure 112011067083022-pct00323
    ,
    D633:
    Figure 112011067083022-pct00324
    ,
    D22421:
    Figure 112011067083022-pct00325
    ,
    D23806:
    Figure 112011067083022-pct00326
    ,
    L6868:
    Figure 112011067083022-pct00327
    ,
    M7502:
    Figure 112011067083022-pct00328
    ,
    M7510:
    Figure 112011067083022-pct00329
    ,
    M7511:
    Figure 112011067083022-pct00330
    ,
    M7512:
    Figure 112011067083022-pct00331
    ,
    M7513:
    Figure 112011067083022-pct00332
    ,
    M7514:
    Figure 112011067083022-pct00333
    ,
    M22422:
    Figure 112011067083022-pct00334
    ,
    M22423:
    Figure 112011067083022-pct00335
    ,
    M22425:
    Figure 112011067083022-pct00336
    ,
    M22426
    Figure 112011067083022-pct00337
    ,
    R302:
    Figure 112011067083022-pct00338
    ,
    R634:
    Figure 112011067083022-pct00339
    ,
    R648:
    Figure 112011067083022-pct00340
    ,
    R14060:
    Figure 112011067083022-pct00341
    ,
    R22420:
    Figure 112011067083022-pct00342
    ,
    T639:
    Figure 112011067083022-pct00343
    ,
    T668:
    Figure 112011067083022-pct00344
    ,
    T669:
    Figure 112011067083022-pct00345
    , 및
    T3168:
    Figure 112011067083022-pct00346
    .
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 제14항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 농화 방법:
    A1372:
    Figure 112011067083022-pct00437
    ,
    D273:
    Figure 112011067083022-pct00438
    ,
    D288:
    Figure 112011067083022-pct00439
    ,
    D308:
    Figure 112011067083022-pct00440
    ,
    D378:
    Figure 112011067083022-pct00441
    ,
    D426:
    Figure 112011067083022-pct00442
    ,
    D632:
    Figure 112011067083022-pct00443
    ,
    D633:
    Figure 112011067083022-pct00444
    ,
    D22421:
    Figure 112011067083022-pct00445
    ,
    D23806:
    Figure 112011067083022-pct00446
    ,
    L6868:
    Figure 112011067083022-pct00447
    ,
    M7502:
    Figure 112011067083022-pct00448
    ,
    M7510:
    Figure 112011067083022-pct00449
    ,
    M7511:
    Figure 112011067083022-pct00450
    ,
    M7512:
    Figure 112011067083022-pct00451
    ,
    M7513:
    Figure 112011067083022-pct00452
    ,
    M7514:
    Figure 112011067083022-pct00453
    ,
    M22422:
    Figure 112011067083022-pct00454
    ,
    M22423:
    Figure 112011067083022-pct00455
    ,
    M22425:
    Figure 112011067083022-pct00456
    ,
    M22426
    Figure 112011067083022-pct00457
    ,
    R302:
    Figure 112011067083022-pct00458
    ,
    R634:
    Figure 112011067083022-pct00459
    ,
    R648:
    Figure 112011067083022-pct00460
    ,
    R14060:
    Figure 112011067083022-pct00461
    ,
    R22420:
    Figure 112011067083022-pct00462
    ,
    T639:
    Figure 112011067083022-pct00463
    ,
    T668:
    Figure 112011067083022-pct00464
    ,
    T669:
    Figure 112011067083022-pct00465
    , 및
    T3168:
    Figure 112011067083022-pct00466
    .
  43. 제42항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포의 농화 방법.
  44. 제19항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 하기 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시험관 내 심근 세포의 제조 방법:
    A1372:
    Figure 112011067083022-pct00467
    ,
    D273:
    Figure 112011067083022-pct00468
    ,
    D288:
    Figure 112011067083022-pct00469
    ,
    D308:
    Figure 112011067083022-pct00470
    ,
    D378:
    Figure 112011067083022-pct00471
    ,
    D426:
    Figure 112011067083022-pct00472
    ,
    D632:
    Figure 112011067083022-pct00473
    ,
    D633:
    Figure 112011067083022-pct00474
    ,
    D22421:
    Figure 112011067083022-pct00475
    ,
    D23806:
    Figure 112011067083022-pct00476
    ,
    L6868:
    Figure 112011067083022-pct00477
    ,
    M7502:
    Figure 112011067083022-pct00478
    ,
    M7510:
    Figure 112011067083022-pct00479
    ,
    M7511:
    Figure 112011067083022-pct00480
    ,
    M7512:
    Figure 112011067083022-pct00481
    ,
    M7513:
    Figure 112011067083022-pct00482
    ,
    M7514:
    Figure 112011067083022-pct00483
    ,
    M22422:
    Figure 112011067083022-pct00484
    ,
    M22423:
    Figure 112011067083022-pct00485
    ,
    M22425:
    Figure 112011067083022-pct00486
    ,
    M22426
    Figure 112011067083022-pct00487
    ,
    R302:
    Figure 112011067083022-pct00488
    ,
    R634:
    Figure 112011067083022-pct00489
    ,
    R648:
    Figure 112011067083022-pct00490
    ,
    R14060:
    Figure 112011067083022-pct00491
    ,
    R22420:
    Figure 112011067083022-pct00492
    ,
    T639:
    Figure 112011067083022-pct00493
    ,
    T668:
    Figure 112011067083022-pct00494
    ,
    T669:
    Figure 112011067083022-pct00495
    , 및
    T3168:
    Figure 112011067083022-pct00496
    .
  45. 제44항에 있어서, 상기 미토콘드리아 표시제는 상기 M7512, T3168, T668 또는 R302인 시험관 내 심근 세포의 제조 방법.
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