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KR101417146B1 - 이소프레노이드의 생산 방법 - Google Patents

이소프레노이드의 생산 방법 Download PDF

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KR101417146B1
KR101417146B1 KR1020087029580A KR20087029580A KR101417146B1 KR 101417146 B1 KR101417146 B1 KR 101417146B1 KR 1020087029580 A KR1020087029580 A KR 1020087029580A KR 20087029580 A KR20087029580 A KR 20087029580A KR 101417146 B1 KR101417146 B1 KR 101417146B1
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 생합성 경로를 통하여 이소프레노이드를 확실하게 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이와 같은 방법을 수행하기 위한 핵산, 효소, 발현 벡터 및 유전자 변형 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 유전자 변형된 숙주 세포로부터 이소프레노이드를 고 생산성으로 생산하는 발효 방법을 제공한다.

Description

이소프레노이드의 생산 방법{PRODUCTION OF ISOPRENOIDS}
상호 참고 문헌
본 출원은, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 가명세서 특허 출원 제60/808,989호(2006년 5월 26일 출원) 및 동 제60/870,592호(2006년 12월 18일 출원)의 우선권의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 이소프레노이드의 생산에 관한 것이다.
이소프레노이드는 자연 환경에 있어서 도처에 존재하는 물질이다. 이소프레노이드는 40,000개 이상의 생산물들로 이루어진 다양한 군을 포함하는데, 이것들 중 다수는 살아있는 유기체에서 중요한 역할을 한다. 이소프레노이드는 세포의 유동성, 전자 이동 및 기타 대사 작용을 유지하는데 사용된다. 다수의 천연 이소프레노이드 및 합성 이소프레노이드는 약품, 화장품, 향수, 색소 및 발색제, 살진균제, 방부제, 기능성 식품(nutraceutical) 및 정밀 화학 중간 물질로서 유용하다.
이소프레노이드 생산물로서는 불규칙적인 단위로 이루어진 이소프레노이드와 폴리테르펜도 있지만, 통상적으로는, 5 탄소 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)의 반복 단위로 이루어져 있다. 천연의 상태에서, 이소프레노이드는 이의 전구체인 IPP와 이성체인 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)의 연속적인 축합 반응에 의해 합성된다. 상기 전구체에 대한 경로로서는 2가지가 알려져 있다. 식물을 제외한 진핵 생물은 일반적으로, 아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)를 IPP로 전환시키기 위해 메발로네이트-의존(MEV) 경로를 이용하는데, 이때, 상기 IPP는 추후 DMAPP로 이성체화된다. 일부 예외도 있지만, 원핵 생물은 통상적으로, IPP 및 DMAPP를 생산하기 위해 메발로네이트-독립 경로 또는 데옥시자일룰로스-5-포스페이트(DXP) 경로만을 이용한다. 식물은 MEV 경로와 DXP 경로 둘 다를 이용한다. 문헌[Rohmer외 다수 (1993) Biochem. J. 295:517-524; Lange외 다수 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(24):13172-13177; Rohdich외 다수 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1158-1163]을 참조하시오.
통상적으로, 이소프레노이드는 천연 공급원 예를 들어, 식물, 미생물 및 동물로부터 추출하여 제조되어 왔다. 그러나, 추출에는 다수의 심각한 한계점이 있기 때문에, 그로 인한 수율은 보통 매우 낮다. 첫째, 대부분의 이소프레노이드는 천연의 환경 하에서는 소량만이 축적된다. 둘때, 공급 유기체는 일반적으로 원하는 이소프레노이드를 상업적으로 유용한 양만큼 생산하는데 필요한 대규모 배양 공정에 적합하지 않다. 셋째, 이소프레노이드 추출을 위해서는 임의의 독성 용매가 필요하고, 이 용매의 취급과 처리 과정에 특별히 주의해야 하므로, 이소프레노이드를 상업적으로 생산해 내는데 어려움이 따른다.
MEV 및 DXP 대사 경로를 밝힘으로써, 이소프레노이드를 생합성 방법에 의해 생산할 수 있게 되었다. 예를 들어, 미생물을 조작하여, 이소프레노이드 즉, 아모 르파-4,11-디엔을 생산하기 위한 메발로네이트 경로 중의 일부 또는 전체를 과진행시킨 바 있다[미국 특허 제7,172,886호 및 동 제7,192,751호). 뿐만 아니라, 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트의 풀(pool)에 균형을 맞추거나, 또는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성 효소(dxs) 및 IPP 이성화 효소(idi)의 발현 수준을 증가시키는데에도 많은 노력들이 집중되었다. 문헌[Farmer외 다수 (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61; Kajiwara외 다수 (1997) Biochem. J. 324:421-426; 및 Kim외 다수 (2001) Biotechnol. Bioeng. 72:408-415]을 참조하시오.
그러나, 다수의 상업적 분야에서 요망되는 다량의 이소프레노이드 생성물이 생산되었음에도 불구하고, 현재의 기술로써 생산할 수 있는 이소프레노이드보다 더욱 많은 양의 이소프레노이드를 생산하는 발현 시스템과 발효법의 필요성이 대두되고 있다. 이소프레노이드 생성에 대한 미생물 대사 과정의 방향을 최적으로 전환할 때에는, 도입된 생합성 경로를 적당히 조작하여, 이소프레노이드를 효율적으로 생산하도록 탄소를 집약하고, 또한 오랜 시간에 걸쳐 대사 중간 물질의 독성 수준이 증가하는 것을 막아야 한다. 본 발명은 이와 같은 요망 사항을 충족시키고, 또한 이와 관련한 이점도 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 하나 이상의 이종 조절 인자 또는 발효 조건의 (단독 또는 합동) 제어 하에 있는, 이소펜테닐 피로포스페이트 경로 효소를 사용하여 이소프레노이드를 안정적으로 생산하는 방법과 이를 위한 조성물을 제공한다. 적당한 이소프레노 이드의 비 제한적인 예로서는, 헤미테르펜(하나의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 이소프렌; 모노테르펜(2개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 미르신; 세스퀴테르펜(3개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 아모르파-4,11-디엔; 디테르펜(4개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 탁사디엔; 트리테르펜(6개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 스쿠알렌; 테트라테르펜(8개의 이소프레노이드로부터 유래) 예를 들어, β-카로텐; 및 폴리테르펜(8개 이상의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 폴리이소프렌을 포함한다.
하나의 측면에서, 이소프레노이드를 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 생산하는 효소 경로를 포함하는 다수의 숙주 세포를 생산하는 단계[여기서, 상기 경로 효소는 모두 하나 이상의 이종 전사 조절 인자의 제어 하에 있음]; 및 (b) 숙주 세포에 대해 최대 비 생장률(maximum specific growth rate)을 제공하는 조건에 비하여 차선인(suboptimal) 조건 하에 배지 중에서 이 숙주 세포를 배양하는 단계. 몇몇 구체예에서, 경로는 메발로네이트 경로이다. 다른 구체예에서, 경로는 DXP 경로이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 이종 전사 조절 서열은 유도성이다. 다른 구체예에서, 경로 효소는 하나의 전사 조절 인자의 제어 하에 있다. 다른 구체예에서, 경로 효소는 다수의 이종 전사 조절 인자의 제어 하에 있다.
몇몇 구체예에서, 경로는 내인성 메발로네이트 경로를 가지는 원핵 생물로부터 유래하는 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 내인성 메발로네이트 경로를 가지는 대표적인 원핵 생물로서는 엔테로코커 스(Enterococcus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 그리고 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 원핵 생물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구체예에서, 메발로네이트 경로 효소는, 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소, HMG-CoA 환원 효소 및 메발로네이트 키나제로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 이종 핵산 서열은 제II군 HMG-CoA 환원 효소를 암호화한다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 배지 중에서 배양되는데, 이때, 영양소 및/또는 온도 수준은, 숙주 세포를 최대 비 생장률에 이르게 하는 수준 이하로 유지한다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 배지 중에서 배양되는데, 여기서, 탄소 공급원의 수준은 최대 비 생장률의 약 90%, 75%, 50%, 25%, 10% 미만, 또는 90∼10% 정도에 이르게 하도록 유지된다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 배지 중에서 배양되는데, 여기서, 질소 공급원의 수준은 최대 비 생장률의 약 90%, 75%, 50%, 25%, 10% 미만, 또는 90∼10% 정도에 이르게 하도록 유지된다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 배지 중에서 배양되는데, 여기서 온도의 수준은 최대 비 생장률의 약 90%, 75%, 50%, 25%, 10% 미만, 또는 90∼10% 정도에 이르게 하도록 유지된다. 다른 구체예에서, 배지의 온도는 최대 비 생장률에 이르게 하는 온도보다 약 2℃, 4℃, 5℃, 6℃, 8℃, 10℃, 15℃, 또는 20℃ 이상 낮은 온도로 유지된다.
또 다른 구체예에서, 이소프레노이드 또는 이소프레노이드 전구체를 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (i) (a) 발효 배지의 온도를, 숙주 세포의 최대 비 생장률을 위해 제공되는 온도보다 낮은 온도로 유지하고, (b) 발효 배지가, 숙주 세포의 최대 비 생장률을 위해 제공되는 탄소 공급원의 양보다 적은 양의 탄소 공급원을 포함하며/포함하거나, (c) 발효 배지가, 숙주 세포의 최대 비 생장률을 위해 제공되는 질소 공급원의 양보다 적은 양의 질소 공급원을 포함하는 조건 하에서, 이소 프레노이드를 생산하는 유전자 변형된 숙주 세포 다수와 발효 배지를 포함하는 발효 반응을 수행하는 단계; 및 (iii) 상기 (a)∼(c)에 제시된 하나 이상의 조건 하에서 생산된 이소프레노이드를 회수하는 단계. 하나의 측면에서, 이소프레노이드는 상기 (a)∼(c)에 제시된 조건 중 2개 이상의 조건 하에서 생산된다. 다른 측면에서, 상기 이소프레노이드는 상기 (a)∼(c)에 제시된 모든 조건 하에서 생산된다.
참고 문헌에 관한 인용 현황
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허 출원들은, 이러한 공보 및 특허 출원들이 참고용으로 인용된 것으로서 구체적이고 개별적으로 명시된 바와 동일한 정도로, 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 이소펜테닐 피로포스페이트("IPP")의 생산을 위한 메발로네이트("MEV") 경로를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 이소펜테닐 피로포스페이트("IPP") 및 디메틸알릴 피로포스페이트("DMAPP")의 생산을 위한 1-데옥시-D-자일룰로스-5-디포스페이트("DXP") 경로를 개략적으로 나타낸 것이다. Dxs는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성 효소를; Dxr은 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제(reductoisomerase)(IspC라고도 알려져 있음)를; IspD는 4-디포스포시티딜-2C-메 틸-D-에리트리톨 합성 효소를; IspE는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소를; IspF는 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-사이클로디포스페이트 합성 효소를; IspG는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 합성 효소(IspG)를; 그리고 IspH는 이소펜테닐/디메틸알릴 디포스페이트 합성 효소를 나타낸다.
도 2는 이소펜테닐 피로포스페이트("IPP") 및 디메틸알릴 피로포스페이트("DMAPP")가, 게라닐 피로포스페이트("GPP"), 파네실 피로포스페이트("FPP"), 그리고 게라닐게라닐 피로포스페이트("GGPP")로 전환되는 과정과, 다양한 이소프레노이드의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 발현 플라스미드 pMBIS-gpps의 맵을 나타내는 것이다.
도 4는 발현 플라스미드 pAM408의 맵을 나타내는 것이다.
도 5는 발현 플라스미드 pAM424의 맵을 나타내는 것이다.
도 6은 발현 플라스미드 pTrc99A-ADS, pTrc99A-FSA, pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-TS, pTrc99A-CS, pTrc99A-SS 및 pAM373의 맵을 나타내는 것이다.
도 7a∼7c는 플라스미드 pAM489-pAM498과 pAM328의 구조를 도식적으로 나타내는 것이다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 절단형 HMG-CoA 환원 효소(tHMGR)의 비 활성 및 안정성에 비하여, 엔테로코커스 패컬리스(Enterococcus faecalis) HMGR-CoA 환원 효소(HMGR)의 비 활성 및 안정성이 더욱 크다는 것을 나타내는 것이다.
도 9는 리터 당 건조 세포 중량("DCW")과 OD600 사이의 관계를 나타내는 것이다.
도 10a 및 10b는 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR 및 HMGS 유전자를 보유하는 숙주 균주의 부피 및 아모르파-4,11-디엔의 비 생산성에 비하여, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) HMGR 및 HMGS 유전자를 보유하는 숙주 균주의 부피 및 아모르파-4,11-디엔의 비 생산성이 더욱 높다는 것을 나타내는 것이다.
도 11a 및 11b는, 온도를 낮추었을 때, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 숙주 균주의 아모르파-4,11-디엔 생산성에 미치는 영향력을 나타내는 것이다.
도 12a∼12d는, 글루코스 수준을 낮추었을 때, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주의 아모르파-4,11-디엔 생산성에 미치는 영향력을 나타내는 것이다.
도 13a 및 13b는, 온도와 글루코스 수준을 낮추었을 때, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주의 아모르파-4,11-디엔 생산성에 미치는 영향력을 나타내는 것이다.
도 14a∼14e 및 도 15a∼15e는, 온도와 글루코스 및 질소 수준을 모두 낮추었을 때, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주의 아모르파-4,11-디엔 생산성에 미치는 영향력을 나타내는 것이다.
도 16은 에스케리치아 콜라이 숙주 균주에 의한 DXP 경로를 통하여, 아모르파-4,11-디엔을 생산하는 과정을 나타내는 것이다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에 의하여 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이하와 같은 의미들을 가지는 것으로 정의될 다수의 용어들을 참고하기로 한다.
"임의의" 또는 "임의로"라는 용어는, 후술하는 특징 또는 구조가 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다는 것, 또는 후술하는 현상이나 환경이 발생 또는 조성되거나 발생 또는 조성되지 않을 수 있다는 것, 그리고 구체적인 특징이나 구조가 존재하는 경우와, 이와 같은 특징 또는 구조가 부재하는 경우, 또는 현상이나 환경이 발생 및 조성되는 경우, 그리고 현상이나 환경이 발생 또는 조성되지 않는 경우를 포함하는 의미이다.
본원에 사용된 "대사 경로"란 용어는, 이화 경로 또는 동화 경로를 의미하는 것이다. 동화 경로는, 소형의 분자들로부터 대형의 분자를 구성하는 과정으로서 에너지를 필요로 하는 과정이다. 이화 경로는, 대형 분자들을 분해하는 과정으로서, 종종 에너지를 방출하는 과정이다.
본원에 사용된 "메발로네이트 경로" 또는 "MEV 경로"란 용어는, 아세틸-CoA를 IPP로 전환하는 생합성 경로를 의미한다. 상기 MEV 경로는 도 1a에 개략적으로 도시되어 있다.
본원에 사용된 "데옥시자일룰로스 5-포스페이트 경로" 또는 "DXP 경로"란 용어는, 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트를 IPP 및 DMAPP로 전환하는 경로를 의미하는 것이다. 상기 DXP 경로는 도 1b에 개략적으로 도시되어 있다.
본원에 사용된 "피로포스페이트"란 용어는, "디포스페이트"와 호환되어 사용된다.
"발현 벡터" 또는 "벡터"란 용어는, 숙주 세포에 형질 도입되거나, 이 숙주 세포를 형질 전환 또는 감염하여, 이 숙주 세포가, 상기 세포가 원래 생산하는 단백질 이외의 핵산 및/또는 단백질을 생산하도록 만들거나, 또는 상기 세포 내에서는 진행되지 않던 방식으로 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 만드는 핵산을 의미한다.
"내인성"이란 용어는, 어떤 물질 또는 과정이, 예를 들어, 비-재조합 숙주 세포 내에서 원래 생산 또는 진행되는 경우를 의미한다.
"이소펜테닐 피로포스페이트를 생산하는 효소적 경로"란 용어는, 이소펜테닐 피로포스페이트를 생산할 수 있는 임의의 경로로서 예를 들어, 메발로네이트 경로 또는 DXP 경로를 의미하는 것이다.
"핵산"이란 용어는, 임의의 길이를 가지는 중합체 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드)를 의미한다. 그러므로, 상기 용어로서는, 당일 사슬, 이중 사슬 또는 다중 사슬 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학 또는 생화학 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"오페론"이란 용어는, 각각 유전자 생산물 예를 들어, RNA 또는 단백질을 암호화하는 2개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로서, 이것의 발현은 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 연계적으로 조절되는 서열들을 의미한다.
"유전자 생산물"이란 용어는, DNA에 의해 암호화된 RNA(또는 RNA에 의해 암호화된 DNA), 또는 RNA나 DNA에 의해 암호화되는 단백질을 의미하는 것으로서, 여기서, 유전자는 통상적으로, 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 뿐만 아니라, 인트론 및 기타 비-암호화 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
"단백질"이란 용어는, 임의의 길이를 가지는 아미노산 중합체를 의미하는 것으로서, 암호화 및 비 암호화된 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형 또는 유도체화된 아미노산, 그리고 변형된 펩티드 주쇄를 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "이종 핵산"이란 용어는, 다음과 같은 특징 중 하나 이상을 가지는 핵산을 의미한다: (a) 핵산이 소정의 숙주 세포에 대하여 외래임(즉, 천연의 환경하에 숙주 세포 내에서 발견되지 않음); (b) 핵산이 천연의 환경 하에 소정의 숙주 세포 내에서는 발견되는(즉, 소정의 숙주 세포에 대해 "내인성"인) 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 뉴클레오티드 서열은 상기 세포 내에서 인위적 양(예를 들어, 천연의 환경 하에서 발견될 것으로 예상되는 양보다 많은 양 또는 이보다 많은 양)으로 생산됨; (c) 핵산 서열이 내인성 뉴클레오티드 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 이 뉴클레오티드 서열은 (동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는) 동일한 단백질을 암호화하고, 상기 세포 내에서 인위적 양(예를 들어, 천연의 환경 하에서 발견될 것으로 예상되는 양보다 많은 양 또는 천연의 환경 하에서 발견되는 양보다 많은 양)으로 생산됨; 또는 (d) 핵산이 천연의 환경에서 각자 동일한 관계를 갖는 것으로 발견되지 않는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포함함(예를 들어, 상기 핵산이 재조합체임).
"트랜스유전자(transgene)"란, 숙주 세포에 외부에서 도입된 유전자를 의미한다. 이는 내인성 또는 외인성, 또는 이종 핵산을 포함할 수 있다.
"재조합 숙주"(또는 "유전적으로 변형된 숙주 세포" 또는 "유전적으로 변형된 숙주 미생물")란 용어는, 본 발명의 이종 핵산을 포함하는 숙주 세포를 의미한다.
"외인성 핵산"이란 용어는, 외부로부터 숙주 세포에 도입되는 것으로서, 천연의 환경 하에서는 보통 소정의 숙주 세포 내에서 발견되지 않으며/않거나 생산되지 않는 핵산을 의미한다.
"조절 요소"란 용어는, 전사 및 번역 제어 서열 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결 인자, 단백질 분해 신호 등을 의미하는 것으로서, 숙주 세포 내에서 암호화 서열을 발현시키고/발현시키거나, 이 암호화 서열의 발현을 조절하며/조절하거나, 암호화된 폴리펩티드를 생산하는 전사 및 번역 제어 서열을 의미한다.
"형질 전환"이라는 용어는, 신규의 핵산을 도입한 후 세포 내에서 유도되는 영구적 또는 일시적인 유전적 변화를 의미하는 것이다. 유전적 변화("변형")은, 신규의 DNA를 숙주 세포 게놈에 통합하거나, 또는 신규의 DNA를 에피좀 요소로서 일시적 또는 안정적으로 유지시킴으로써, 이루어질 수 있다. 진핵 생물 세포 내에서, 영구적인 유전적 변화는 일반적으로 세포의 게놈에 DNA를 도입함으로써 이루어진다. 원핵 생물 세포 내에서, 영구적인 유전적 변화는 염색체에 도입될 수 있거나, 또는 잉여 염색체가 재조합 숙주 세포 내에서 유지될 수 있도록 도와주는 하나 이상의 선별 마커를 함유할 수 있는 잉여 염색체 요소(extrachromosomal element) 예를 들어, 플라스미드 및 발현 벡터를 통하여 도입될 수 있다.
"작동 가능하도록 결합된"이란 용어는, 전술한 구성 요소들이 의도로 하는 방식으로 작용할 수 있도록 만들어 주는 관계로 병렬되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 뉴클레오티드 서열을 전사 또는 발현시키면, 이 프로모터는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 것이다.
"숙주 세포" 및 "숙주 미생물"이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되는 용어로서, 이종 핵산이 삽입될 수 있거나 또는 삽입된 임의의 고세균, 박테리아 또는 살아있는 진핵 생물 세포를 의미한다. 상기 용어는 또한, 천연의 환경 하에서 발생하거나, 우연히 발생하거나 또는 계획적으로 발생하는 돌연 변이로 인하여, 기원 부모에 대한 게놈 DNA 상보체 또는 총 DNA 상보체, 또는 형태가 반드시 완전 동일할 수 없는, 기원 세포의 자손을 의미하기도 한다.
핵산과 관련하여 사용된 "합성의"란 용어는, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 구성 블록(building block)을 어닐링하여, 추후 효소에 의해 전체 유전자로 조립되는 유전자 분절을 형성하는 경우를 의미한다. "화학적 수단"을 통한 핵산의 합성이란, 구성 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되는 것을 의미한다.
핵산, 세포 또는 유기체에 적용되는 "천연의"란 용어는, 핵산, 세포 또는 유기체가 천연에서 발견되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 천연의 환경 하에서 공급원으로부터 분리될 수 있고, 실험실 내에서 인간에 의해 고의적으로 변형되지 않으며, 비-병원성(비-질병 유발성) 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연의 것이다.
핵산, 효소, 세포 또는 유기체에 적용되는 "천연 생성된"이란 용어는, 핵산, 효소, 세포 또는 유기체가 천연의 환경 하에서 발견되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 천연의 환경 하에서 공급원으로부터 분리될 수 있고, 실험실 내에서 인간에 의해 고의적으로 변형되지 않으며, 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 생성된 것이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 효소에 적용되는 "생물학적 활성 단편"이란 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드 또는 효소의 기능성 부분(들)을 의미하는 것이다. 기능상 균등체는 변이 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 여기서 이 변이 아미노산 서열은 핵산 서열과 이로 인하여 암호화된 단백질 내에서 천연 발생 및 생성되는 것으로 알려져 있는, 코돈의 축퇴성과 기능상 균등체로 인하여 생성될 수 있다. 기능상 균등 단백질 또는 펩티드는, 재조합 DNA 기술을 수행함으로써 대안적으로 구성될 수도 있는데, 여기서, 단백질 구조상의 변이는, 변이될 아미노산의 특성을 바탕으로 하여 조작될 수 있다.
"이소프레노이드", "이소프레노이드 화합물", "이소프레노이드 생성물", "테르펜", "테르펜 화합물", "테르페노이드" 및 "테르페노이드 화합물"은 본원에서 호환되어 사용된다. 상기 용어들은 IPP로부터 유래할 수 있는 화합물을 의미한다.
단수 형태임을 나타내는 "하나", "하나의" 및 "상기"란 용어는, 명세서의 내용 중 명백히 언급되어 있지 않은 한, 복수형도 포함하는 의미이다. 그러므로, 예를 들어, "하나의 발현 벡터"는, 발현 벡터 하나 뿐만 아니라, 다수의 발현 벡터도 포함하며, "상기 숙주 세포"라는 용어는, 하나 이상의 숙주 세포를 포함하기도 한다. 또한, 청구항들은 임의의 요소를 배제하는 것으로 초안이 작성될 수 있음에도 주의하여야 할 것이다. 그러므로, 이와 같은 설명은, 청구항의 요소들을 언급하거나, 또는 "네거티브" 제한(negative limitation)을 적용하는 것과 관련하여, "유일한" 및 "오로지" 등과 같이 독점적임을 나타내는 용어를 사용하는 것에 대한 선례로서 사용하고자 한다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명은, 특정 서열, 발현 벡터, 효소, 숙주 미생물, 또는 경로에 한정되는 것은 아니므로, 본 발명이 속하는 당 업자가 본원에 교시되어 있는 바에 비추어 이해할 수 있는 것과 같이 다양할 수 있다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것이지, 본 발명을 한정하고자 사용된 것은 아니다.
숙주 세포
본 발명을 실시함에 있어서는 임의의 적당한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 숙주 세포는 유전적으로 변형된 숙주 미생물로서, 핵산 분자가 삽입, 결실 또는 변형되어(즉, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 전좌에 의해 돌연 변이되어), 원하는 이소프레노이드 화합물 또는 이소프레노이드 유도체를 생산하거나, 또는 원하는 이소프레노이드 화합물 또는 이소프레노이드 유도체의 수율을 증가시키는 미생물이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 액체 생장 배지 중에서 생육할 수 있는 세포이다. 이와는 반대로, "대조군 세포"는, 비교를 위한 실험에 사용되는 대안적인 개체 또는 시료로서, 통상적으로, 해당 숙주 세포에 대한 변형(들)을 포함하지 않는 모 세포이다.
적당한 숙주 세포의 예로서는 임의의 고세균, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 세포를 포함한다. 고세균 세포의 예로서는 다음과 같은 속에 속하는 고세균의 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 애어로피륨(Aeropyrum), 아카에글로버스(Archaeglobus), 할로박테리움(Halobacterium), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 피로코커스(Pyrococcus), 설포로버스(Sulfolobus) 및 서모플라스마(Thermoplasma). 고세균 균주의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아에로피륨 페르닉스(Aeropyrum pernix), 아카에오글로버스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 서모오토트로피큠(Methanobacterium thermoautotrophicum), 피로코커스 어비시(Pyrococcus abyssi), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 서모플라스마 액시도필륨(Thermoplasma acidophilum) 및 서모플라스마 볼캐늄(Thermoplasma volcanium).
원핵 생물 세포의 예로서는 다음과 같은 속에 속하는 원핵 생물의 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 아나바에나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아스로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 크로마티움(Chromatium), 클로스트리듐(Clostridium), 코린박테리움(Corynebacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 에스케리치아(Escherichia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 메소리조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 포르미디움(Phormidium), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도박터(Rhodobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴륨(Rhodospirillum), 로도코커스(Rhodococcus), 살모넬라(Salmonella), 세네데스뮨(Scenedesmun), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), 스타플로코커스(Staphlococcus), 스트렙토마이세스(Strepromyces), 시네코커스(Synnecoccus) 및 자이모모나스(Zymomonas).
원핵 생물 박테리아 균주의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리크페이시네스(Bacillus amyloliquefacines), 브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 이마리오필륨(Brevibacterium immariophilm), 클로스트리듐 베이게린키(Clostridium beigerinckii), 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 슈도모나스 푸디카(Pseudomonas pudica), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도스피릴륨 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 쉬겔라 다이센테리아에(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등.
일반적으로, 만일 박테리아 숙주 세포가 사용되면, 비-병원성 균주인 것이 바람직하다. 비-병원성 균주의 예로서는 다음과 같은 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 슈도모나스 푸디타(Pseudomonas pudita), 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rodobacter capsulatus) 및 로도스피릴륨 루브럼(Rhodospirillum rubrum) 등.
진핵 생물 세포의 예로서는 진균 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 진균 세포의 예로서는 다음과 같은 속에 속하는 균주의 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 크라이소스포리움(Chrysosporium), 크라이오토코커스(Cryotococcus), 푸사리움(Fusarium), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 네오타이포디움(Neotyphodium), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 트리코더마(Trichoderma) 및 잔토필로마이세스(Xanthophyllomyces)(구 파피아(Phaffia)).
진핵 생물 균주의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus oryzae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 크라이소스포륨 럭노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 그래미네아륨(Fusarium graminearum), 푸사리움 베네나튬(Fusarium venenatum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 피치아 앵거스타(Pichia angusta), 피치아 핀랜디카(Pichia finlandica), 피치아 코다마에(Pichia kodamae), 피치아 멤브라내페이션스(Pichia membranaefaciens), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 오퓬티아에(Pichia opuntiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 피즈페리(Pichia pijperi), 피치아 쿼큠(Pichia quercuum), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 서모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 스트렙토마이세스 앰보페이션스(Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 아우레오페이션스(Streptomyces aureofaciens), 스트렙토마이세스 아우레우스(Streptomyces aureus), 사카로마이세스 베이야누스(Saccaromyces bayanus), 사카로마이세스 불라르디(Saccaromyces boulardi), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 스트렙토마이세스 펀지시디쿠스(Streptomyces fungicidicus), 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스(Streptomyces griseochromogenes), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리보그리세우스(Streptomyces olivogriseus), 스트렙토마이세스 라메우스(Streptomyces rameus), 스트렙토마이세스 테너시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 비나세우스(Streptomyces vinaceus), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 및 잔토필로마이세스 덴드로루스(Xanthophyllomyces dendrorhous)(구 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma)).
일반적으로, 만일 진핵 생물 세포가 사용되면, 비-병원성 균주인 것이 바람직하다. 비-병원성 균주의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 푸사리움 그래미네아륨, 푸사리움 베네나튬, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 불라르디 및 사카로마이세스 세레비지아에.
뿐만 아니라, 임의의 균주는 미국 식품 의약국에 GRAS 즉, 일반적으로 안전하다고 간주되는 균주(Generally Regarded As Safe)로서 지정된 것이다. 이러한 균주로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 바실러스 서브틸리스, 락토바실러스 액시도필러스, 락토바실러스 헬베티쿠스 및 사카로마이세스 세레비지아에.
IPP 경로
본 발명의 숙주 세포는 IPP 및 이의 이성체인 DMAPP를 합성하기 위하여, MEV 경로, DXP 경로, 또는 이 경로 둘 다를 진행하거나 또는 이 경로들을 이용한다. 일반적으로, 식물을 제외한 진핵 생물은, 배타적으로 아세틸-CoA를 IPP(이는 추후 DMAPP로 전환됨)로 전환시키는 MEV 이소프레노이드 경로를 이용한다. 예외도 있지만, 원핵 생물은 분기점(branch point)을 통하여 각각 IPP와 DMAPP를 생산하는, 메발로네이트-독립 경로 또는 DXP 경로를 이용한다. 일반적으로, 식물은 IPP를 합성하기 위해 MEV 경로 및 DXP 경로를 이용한다.
MEV 경로
MEV 경로를 도 1a에 개략적으로 도시하였다. 일반적으로, 상기 경로는 6개의 단계로 이루어져 있다.
첫번째 단계에서, 아세틸-조효소 A의 2개의 분자는 효소에 의하여 화합되어, 아세토아세틸-CoA를 형성한다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 아세틸-CoA 티올라제(아세틸-CoA 아세틸 전이 효소라고도 알려짐)가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는, 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(이하, "유전자 은행 등록 번호; 서열이 유래된 유기체명"의 순으로 기재함): (NC_000913 영역: 2324131..2325315; 에스케리치아 콜라이), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비지아에).
MEV 경로의 두 번째 단계에서, 아세토아세틸-CoA는 아세틸-CoA의 다른 분자와 효소에 의하여 축합되어, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA(HMG-CoA)를 형성한다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, HMG-CoA 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (NC_OO1145. 상보체 19061..20536; 사카로마이세스 세레비지아에), (X96617; 사카로마이세스 세레비지아에), (X83882; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라(Kitasatospora griseola)), (BT007302; 호모 사피엔스(Homo sapiens)), 및 (NC_002758, 위치 태그 SAV2546, 유전자 번호 1122571; 스타필로코커스 아우레우스).
세 번째 단계에서, HMG-CoA는 효소에 의하여 메발로네이트로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, HMG-CoA 환원 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (NM_206548; 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster)), (NC 002758, 위치 태그 SAV2545, 유전자 번호 1122570; 스타필로코커스 아우레우스), (NM_204485; 갤러스 갤러스(Gallus gallus)), (AB015627; 스트렙토마이세스 종 KO 3988), (AF542543; 니코티아나 아테뉴아타(Nicotiana attenuata)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라), (AX 128213, 절단형 HMGR을 암호화하는 서열 제공; 사카로마이세스 세레비지아에) 및 (NC_001145: 상보체(115734..118898; 사카로마이에스 세레비지아에).
네번째 단계에서, 메발로네이트는 효소에 의하여 인산화되어 메발로네이트 5-포스페이트를 형성한다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 메발로네이트 키나제가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (L77688; 아라비돕시스 탈리아나) 및 (X55875; 사카로마이세스 세레비지아에).
다섯번 째 단계에서, 제2의 포스페이트 기는 효소에 의해 메발로네이트 5-포스페이트에 부가되며, 그 결과, 메발로네이트 5-피로포스페이트가 형성된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 공지된 효소로서는 예를 들어, 포스포메발로네이트 키나제가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF429385; 헤베아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis), (NM_006556; 호모 사피엔스) 및 (NC_OO1145. 상보체 712315..713670; 사카로마이세스 세레비지아에).
여섯번째 단계에서, 메발로네이트 5-피로포스페이트는 효소에 의해 IPP로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 메발로네이트 피로포스페이트 탈 탄산 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (X97557; 사카로마이세스 세레비지아에), (AF290095; 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)) 및 (U49260; 호모 사피엔스).
만일 IPP가 DMAPP로 전환되면, 이후 일곱번째 단계가 진행되어야 한다. 이러한 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, IPP 이성화 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (NC_000913, 3031087..3031635; 에스케리치아 콜라이) 및 (AF082326; 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)). 만일 DMAPP로의 전환이 필요하다면, IPP 이성화 효소의 발현 수준을 증가시켜야 하고, 따라서, IPP → DMAPP로의 전환은 전체 경로 중 속도-제한 단계(rate-limiting step)가 되지 않는다.
DXP 경로
DXP 경로를 도 1b에 개략적으로 도시하였다. 일반적으로, DXP 경로는 7개의 단계로 이루어져 있다. 첫 번째 단계에서, 피루베이트는 D-글리세르알데히드 3-포스페이트로 축합되며, 그 결과, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트가 형성된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF035440; 에스케리치아 콜라이), (NC_002947, 위치 태그 PP0527; 슈도모나스 푸티다 KT2440), (CP000026, 위치 태그 SPA2301; 살모넬라 엔테리카 파라타이피(Salmonella enterica Paratyphi) ATCC 9150), (NC_007493, 위치 태그 RSP_0254; 로도박터 스패로이데스 2.4.1), (NC_005296, 위치 태그 RPA0952; 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris, CGA009), (NC_004556, 위치 태그 PD1293; 자일렐라 파스티디오사 테메큘랄(Xylella fastidiosa Temeculal)) 및 (NC_003076, 위치 태그 AT5G11380; 아라비돕시스 탈리아나).
두번째 단계에서, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트는 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AB013300; 에스케리치아 콜라이), (AF148852; 아라비돕시스 탈리아나), (NC_002947, 위치 태그 PP1597; 슈도모나스 푸티다 KT2440), (AL939124, 위치 태그 SCO5694; 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)), (NC_007493, 위치 태그 RSP_2709; 로도박터 스패로이데스 2.4.1) 및 (NC_007492, 위치 태그 Pfl_1107; 슈도모나스 플루오레센스 PfO-1).
세번째 단계에서, 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF230736; 에스케리치아 콜라이), (NC_007493, 위치 태그 RSP_2835; 로도박터 스패로이데스 2.4.1), (NC_003071, 위치 태그 AT2G02500; 아라비돕시스 탈리아나) 및 (NC_002947, 위치 태그 PP1614; 슈도모나스 푸티다 KT2440).
네번째 단계에서, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨은 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 키나제가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF216300; 에스케리치아 콜라이) 및 (NC_007493, 위치 태그 RSP_1779; 로도박터 스패로이데스 2.4.1).
다섯번째 단계에서, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트는 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AF230738; 에스케리치아 콜라이), (NC_007493, 위치 태그 RSP_6071; 로도박터 스패로이데스 2.4.1) 및 (NC_002947, 위치 태그 PP1618; 슈도모나스 푸티다 KT2440).
여섯번째 단계에서, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AY033515, 에스케리치아 콜라이), (NC_002947, 위치 태그 PP0853; 슈도모나스 푸티다 KT2440) 및 (NC_007493, 위치 태그 RSP_2982; 로도박터 스패로이데스 2.4.1).
일곱번째 단계에서, 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트는 IPP 또는 이의 이성체인 DMAPP로 전환된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 이소펜틸/디메틸알릴 디포스페이트 합성 효소가 있다. 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AY062212; 에스케리치아 콜라이) 및 (NC_002947, 위치 태그 PP0606; 슈도모나스 푸티다 KT2440).
몇몇 구체예에서는, 숙주 세포 자체의 대사 경로와 본 발명에 의해 제공되는 IPP의 생산과 관련된 경로들 사이의 "혼선(cross talk)"(또는 간섭(interference))을 최소화하거나 아예 없앤다. 예를 들어, 숙주 미생물이 IPP 합성시 DXP 경로에만 의존할 때, 상기 혼선은 최소화되거나 또는 완전히 없어지며, 부가의 IPP를 제공하기 위해 MEV 경로가 도입된다. 이와 같은 숙주 유기체는 MEV 경로 효소의 발현을 변경시키거나, 또는 MEV 경로와 관련된 중간 물질을 가공하도록 조작되지는 않는다. DXP 경로에만 의존하거나 주로 이 경로에 의존하는 유기체로서는 예를 들어, 에스케리치아 콜라이를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 숙주 세포는 MEV 경로만을 통하거나, 아니면 DXP 경로를 함께 이용하여 IPP를 생산한다. 다른 구체예에서, 숙주의 DXP 경로는 기능상 작동할 수 없으므로, 숙주 세포는 외부에서 도입된 MEV 경로를 통하여서만 IPP를 생산한다. DXP 경로는, 유전자 발현을 불능하도록 만들거나 또는 DXP 경로 효소 중 하나 이상의 기능을 불활성화시킴으로써, 기능상 작동할 수 없게 될 수 있다.
C 5 화합물
본 발명의 C5 화합물은 일반적으로, IPP 또는 DMAPP로부터 유래한다. 이와 같은 화합물들은 하나의 이소프렌 단위(IPP 또는 DMAPP)로부터 유래하므로, 헤미테르펜으로도 알려져 있다.
이소프렌
다음과 같은 구조를 가지는 이소프렌은 다수의 식물에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00001
이소프렌은 이소프렌 합성 효소에 의하여 IPP로부터 생산된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AB198190; 파퓰러스 알바(Populus alba)) 및 (AJ294819; 파퓰러스 알바 엑스 파퓰러스 트레뮬라(Populus alba x Polulus tremula)).
C 10 화합물
본 발명의 C10 화합물은 일반적으로, IPP와 DMAPP의 축합에 의해 생산되는 게라닐 피로포스페이트(GPP)로부터 유래한다.이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 게라닐 피로포스페이트 합성 효소가 있다. 이와 같은 C10 화합물은 또한 2개의 이소프렌 단위로부터 유래하기 때문에, 모노테르펜이라고도 알려져 있다.
도 2는 IPP와 DMAPP가 어떻게 GPP를 생산할 수 있는지를 개략적으로 보여주는 것으로서, 이때, 상기 GPP는 모노테르펜으로 추가 가공될 수 있다.
게라닐 피로포스페이트 합성 효소에 대한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF513111; 에이비스 그랜디스(Abies grandis)), (AF513112; 에이비스 그랜디스), (AF513113; 에이비스 그랜디스), (AY534686; 안티리늄 메이저스(Antirrhinum majus)), (AY534687; 안티리늄 메이저스), (Y17376; 아라비돕시스 탈리아나), (AE016877, 위치 AP11092; 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); ATCC 14579), (AJ243739; 사이트러스 시넨시스(Citrus sinensis)), (AY534745; 클라키아 브루어리(Clarkia breweri)), (AY953508; 입스 피니(Ips pini)), (DQ286930; 라이코페르시콘 에스큘렌툼(Lycopersicon esculentum)), (AF182828; 멘타 엑스 피페리타(Mentha x piperita)), (AF182827; 멘타 엑스 피페리타), (MPI249453; 멘타 엑스 피페리타), (PZE431697, 위치 CAD24425; 파라코커스 제악산티니페이션스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)), (AY866498; 피크로리자 쿠루아(Picrorhiza kurrooa)), (AY351862; 비티스 비니페라(Vitis vinifera)) 및 (AF203881, 위치 AAF12843; 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)).
이후, GPP는 다수의 C10 화합물로 전환된다. C10 화합물의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
카렌
다음과 같은 구조를 가지는 카렌은 다수의 나무 특히, 소나무의 송진에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00002
카렌은 카렌 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF461460, 영역 43..1926; 피세아 에이비스(Picea abies)) 및 (AF527416, 영역: 78..1871; 살비아 스테노필라(Salvia stenophylla)).
게라니올
다음과 같은 구조를 가지는 게라니올(로드놀이라고도 알려짐)은 장미 오일 및 팔마로사 오일(palmarosa oil)의 주 성분이다:
Figure 112008083397046-pct00003
이것은 제라늄, 레몬 및 시트로넬라에서 생성되기도 한다. 게라니올은 게라니올 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AJ457070; 시나모뮴 테누이필룸(Cinnamomum tenuipilum)), (AY362553; 오시뮴 바실리쿰(Ocimum basilicum)), (DQ234300; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens) 균주 1864), (DQ234299; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora) 균주 1861), (DQ234298; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora) 균주 4935) 및 (DQ088667; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora)).
리날룰
다음과 같은 구조를 가지는 리날룰은 다수의 꽃과 향신 식물 예를 들어, 고수풀 종자에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00004
리날룰은 리날룰 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF497485; 아라비돕시스 탈리아나), (AC002294, 위치 AAB71482; 아라비돕시스 탈리아나), (AY059757; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_104793; 아라비돕시스 탈리아나), (AF154124; 아르테미시아 아누아(Artemisia annua)), (AF067603; 클라키아 브루어리), (AF067602; 클라키아 콘시나(Clarkia concinna)), (AF067601; 클라키아 브루어리), (U58314; 클라키아 브루어리), (AY840091; 라이코페르시콘 에스큘렌툼), (DQ263741; 라밴듈라 앵구스티폴리아(Lavandula angustifolia)), (AY083653; 멘타 시트라테(Mentha citrtae)); (AY693647; 오시뮴 바실리쿰), (XM_463918; 오라이자 사티바(Oryza sativa)), (AP004078, 위치 BAD07605; 오라이자 사티바), (XM_463918, 위치 XP_463918; 오라이자 사티바), (AY917193; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora)), (AF271259; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens)), (AY473623; 피세아 에이비스), (DQ195274; 피세아 시첸시스(Picea sitchensis)) 및 (AF444798; 페릴라 프루테센스 바. 크리스파 컬티바(Perilla citriodora var. frutescens cultivar No. 79).
리모넨
다음과 같은 구조를 가지는 리모넨은 감귤류와 페퍼민트의 외피에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00005
리모넨은 리모넨 합성 효소에 의하여 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (+)-리모넨 합성 효소(AF514287, 영역: 47..1867; 사이트러스 리몬(Citrus limon)) 및 (AY055214, 영역: 48..1889; 아가스타쉬 루고사(Agastache rugosa)) 및 (-)-리모넨 합성 효소(DQ195275, 영역: 1..1905; 피세아 시첸시스), (AF006193, 영역: 73..1986; 에이비스 그랜디스) 및 (MHC4SLSP, 영역: 29..1828; 멘타 스피카타(Mentha spicata)).
미르신
다음과 같은 구조를 가지는 미르신은 다수의 식물 예를 들어, 월계수, 버베나(verbena) 및 미르시아(myrcia)에서 추출되는 에센셜 오일(오일의 명칭은 그것이 추출된 식물의 명칭과 같음)에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00006
미르신은 미르신 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (U87908; 에이비스 그랜디스), (AY195609; 안티리늄 메이저스), (AY195608; 안티리늄 메이저스), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS1O), (NM_113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (AF271259; 페릴라 프루테센스), (AY473626; 피세아 에이비스), (AF369919; 피세아 에이비스) 및 (AJ304839; 쿼쿠스 일렉스(Quercus ilex)).
오시멘
각각 다음과 같은 구조를 가지는 α-오시멘 및 β-오시멘은 다수의 식물과 과일 예를 들어, 오시뮴 바실리쿰에서 발견되며, 오시멘 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다:
Figure 112008083397046-pct00007
및
Figure 112008083397046-pct00008
적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AY195607; 안티리늄 메이저스), (AY195609;안티리늄 메이저스), (AY195608; 안티리늄 메이저스), (AK221024; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_ 113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_117775; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_001036574; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS1O), (AB110642; 사이트러스 언슈(Citrus unshiu) CitMTSL4) 및 (AY575970; 로터스 코르니큘라터스 바. 자포니쿠스(Lotus corniculatus var. japonicus)).
α-피넨
다음과 같은 구조를 가지는 α-피넨은 소나무와 유칼립투스에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00009
적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (+)α-피넨 합성 효소(AF543530, 영역: 1..1887, 파이너스 타에다(Pinus taeda)), (-)α-피넨 합성 효소(AF543527, 영역: 32..1921, 파이너스 타에다) 및 (+)/(-)α-피넨 합성 효소(AGU87909, 영역: 6111892, 에이비스 그랜디스).
β-피넨
다음과 같은 구조를 가지는 β-피넨은 소나무, 로즈마리, 파슬리, 딜, 바질 및 장미에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00010
β-피넨은 β-피넨 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (-)β-피넨 합성 효소(AF276072, 영역: 1..1749, 아르테미시아 아누아) 및 (AF514288, 영역: 26..1834, 사이트러스 리몬).
사비넨
다음과 같은 구조를 가지는 사비넨은 후추, 당근 종자, 샐비어 및 차 나무에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00011
사비넨은 사비넨 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AF051901, 영역: 26..1798, 살비아 오피시날리스(Salvia officinalis).
γ-테르피넨
다음과 같은 구조를 가지는 γ-테르피넨은 감귤류로부터 유래하는 에센셜 오일의 구성 성분이다:
Figure 112008083397046-pct00012
생화학적으로, γ-테르피넨은 γ-테르피넨 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AF514286, 영역: 30..1832, 사이트러스 리몬 유래) 및 (AB110640, 영역: 1..1803, 사이트러스 언슈 유래).
테르피놀렌
다음과 같은 구조를 가지는 테르피놀렌은 까막 까치밥 나무(black currant), 사이프러스, 구아바, 여지(lychee), 파파야, 소나무 및 차나무에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00013
테르피놀렌은 테르피놀렌 합성 효소에 의해 GPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AY906866, 영역: 10..1887, 슈도츄가 멘지에시(Pseudotsuga menziesii) 유래.
C 15 화합물
본 발명의 C15 화합물은 일반적으로 파네실 피로포스페이트(FPP)로부터 유래하는 것으로서, 이 FPP는 IPP 2 분자와 DMAPP 1 분자의 축합에 의해 생산된다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 파네실 피로포스페이트 합성 효소가 있다. 이와 같은 C15 화합물은 3개의 이소프렌 단위로부터 유래하므로, 세스퀴테르펜이라고도 알려져 있다.
도 2는 IPP와 DMAPP가 어떻게 화합하여 FPP로 생성되는지를 개략적으로 나타낸 것으로서, 이때, 이 FPP는 세스퀴테르펜으로 추가 가공된다.
파네실 피로포스페이트 합성 효소에 대한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (ATU80605; 아라비돕시스 탈리아나), (ATHFPS2R; 아라비돕시스 탈리아나), (AAU36376; 아르테미시아 아누아), (AF461050; 보스 타우러스(Bos taurus)), (D00694; 에스케리치아 콜라이 K-12), (AE009951; 위치 AAL95523; 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)의 아종 뉴클레아툼, ATCC 25586), (GFFPPSGEN; 지베렐라 후지쿠로이(Gibberella fujikuroi)), (CP000009, 위치 AAW60034; 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 621H), (AF019892; 헬리안투스 어누스(Hellianthus annuus), (HUMFAPS; 호모 사피엔스), (KLPFPSQCR; 클루이베로마이세스 락티스), (LAU15777; 루피너스 알버스(Lupinus albus)), (LAU20771; 루피너스 알버스), (AF309508; 머스 머스큘러스(Mus musculus)), (NCFPPSGEN; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), (PAFPS1; 파르테늄 아르겐타튬(Parthenium argentatum)), (PAFPS2; 파르테늄 아르겐타튬), (RATFAPS; 레이투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)), (YSCFPP; 사카로마이세스 세레비지아에), (D89104; 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), (CP000003; 위치 AAT87386; 스트렙토코커스 파이로제네스(Streptococcus pyogenes)), (CP000017, 위치 AAZ51849; 스트렙토코커스 파이로제네스), (NC_008022, 위치 YP_598856; 스트렙토코커스 파이로제네스 MGAS10270), (NC_008023, 위치 YP_600845; 스트렙토코커스 파이로제네스 MGAS2096), (NC_008024, 위치 YP_602832; 스트렙토코커스 파이로제네스 MGAS10750) 및 (MZEFPS, 제아 메이스(Zea mays)).
대안적으로, FPP는 IPP를 GPP에 부가하여 생성될 수도 있다. 이 반응을 수행할 수 있는 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (AE000657, 위치 AAC06913; 에이쿼펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) VF5), (NM_202836; 아라비돕시스 탈리아나), (D84432, 위치 BAA12575; 바실러스 서브틸리스), (U12678, 위치 AAC28894; 브래디리조비움 자포니큠(Bradyrhizobium japonicum) USDA 110), (BACFDPS; 제오바실러스 스테아로서모필러스(Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, 위치 NP_873754; 해모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi) 35000HP), (L42023, 위치AAC23087; 해모필러스 인플루엔자 Rd KW20), (J05262; 호모 사피엔스), (YP_395294; 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 아종 사케이 23K), (NC_005823, 위치 YP_000273; 렙토스피라 인터로간스 세로바 코펜하게니(Leptospira interrogans serovar Copenhageni) str. 피오크루즈(Fiocruz) L1-130), (AB003187; 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)), (NC_002946, 위치 YP_208768; 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) FA 1090), (U00090, 위치 AAB91752; 리조비움 종 NGR234), (J05091; 사카로마이세스 세레비지아에), (CP000031, 위치 AAV93568; 살리시박터 포메로이(Salicibacter pomeroyi) DSS-3), (AE008481, 위치 AAK99890; 스트렙토코커스 뉴모니아에 R6) 및 (NC_004556, 위치 NP 779706; 자일렐라 파스티디오사 테메큘라 1(Xylella fastidiosa Temecula 1)).
이후 FPP는 다수의 C15 화합물로 전환된다. C15 화합물의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
아모르파디엔
다음과 같은 구조를 가지는 아모르파디엔은 아르테미시아 아누아에 의해 생산되는 아르테미시닌의 전구체이다:
Figure 112008083397046-pct00014
아모르파디엔은 아모르파디엔 합성 효소에 의해 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 미국 특허 제7,192,751호의 서열 번호 37이 있다.
α-파네센
다음과 같은 구조를 가지는 α-파네센은 다수의 생물학적 공급원 예를 들어, 개미의 뒤푸(Dufour) 선과, 사과 외피 및 배 껍질에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00015
α-파네센은 α-파네센 합성 효소에 의해 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: DQ309034, 파이러스 커뮤니스 컬티바 당쥬(Pyrus communis cultivar d'Anjou)(배; 유전자명 AFS1) 유래 및 AY182241, 말루스 도메스티카(Malus domestica)(사과; 유전자 AFS1)[Pechouus외 다수, Planta 219(1):84-94 (2004)].
β-파네센
다음과 같은 구조를 가지는 β-파네센은 다수의 생물학적 공급원 예를 들어, 진딧물과, 예를 들어, 페퍼민트에서 추출한 에센셜 오일에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00016
몇몇 식물 예를 들어, 감자(wild potato)에서, β-파네센은 천연의 해충 기피제로서 합성된다. β-파네센은 β-파네센 합성 효소에 의해 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 유전자 은행 등록 번호 AF024615(멘타 엑스 피페리타 유래(페퍼민트; 유전자 Tspa11)) 및 AY835398(아르테미시아 아누아 유래)[Picaud외 다수, Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005)].
파네솔
다음과 같은 구조를 가지는 파네솔은 다수의 생물학적 공급원 예를 들어, 곤충과 시트로넬라, 네롤리, 시클라멘, 레몬 그라스, 월하향 및 장미에서 추출되는 에센셜 오일에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00017
파네솔은 하이드록실라제 예를 들어, 파네솔 합성 효소에 의해 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 유전자 은행 등록 번호 AF529266(제아 메이스 유래) 및 YDR481C(사카로마이세스 세레비지아에 유래(유전자 Pho8)[Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006)].
네롤리돌
다음과 같은 구조를 가지는 네롤리돌은 페루비올이라고도 알려져 있는데, 이는 다수의 생물학적 공급원 예를 들어, 에센셜 오일 예를 들어, 네롤리, 생강, 자스민, 라벤더, 차 나무 및 레몬 그래스에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00018
네롤리돌은 하이드록실라제 예를 들어, 네롤리돌 합성 효소에 의하여 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AF529266(제아 메이스 유래)(옥수수; 유전자 tps1).
패출롤
다음과 같은 구조를 가지는 패출롤은 패출리 알콜이라고도 알려져 있는 것으로서, 포고스테몬 패출리(Pogostemon patchouli)의 에센셜 오일의 구성 성분이다:
Figure 112008083397046-pct00019
패출리올은 패출리올 합성 효소에 의하여 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AY508730(영역: 1..1659; 포고스테몬 캐블린(Pogostemon cablin) 유래).
발렌센
다음과 같은 구조를 가지는 발렌센은 오렌지향과 오렌지맛을 내는 주요 화학 성분중의 하나로서, 오렌지 외피에서 발견된다:
Figure 112008083397046-pct00020
발렌센은 누트카톤 합성 효소에 의하여 FPP로부터 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: AF441124(영역: 1..1647; 사이트러스 시넨시스 유래) 및 AY917195(영역: 1..1653; 페릴라 프루테센스 유래).
C 20 화합물
본 발명의 C20 화합물은 일반적으로, IPP 3 분자와 DMAPP 한 분자의 축합에 의해 생성되는 게라닐게라니올 피로포스페이트(GGPP)로부터 유래한다. 이 단계를 촉매하는 것으로 알려진 효소로서는 예를 들어, 게라닐게라닐 피로포스페이트 합성 효소가 있다. 이와 같은 C20 화합물은 4개의 이소프렌 단위로부터 유래하기 때문에, 디테르펜이라고도 알려져 있다.
도 2는 IPP와 DMAPP가 어떻게 화합하여 GGPP를 생성하는지를 개력적으로 나타내는 것으로서, 이때, 상기 GGPP는 디테르펜으로 추가 가공될 수 있거나, 또는 카로테노이드를 생성하도록 추가로 가공될 수도 있다.
게라닐게라닐 피로포스페이트 합성 효소에 대한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (ATHGERPYRS; 아라비돕시스 탈리아나), (BT005328; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_119845; 아라비돕시스 탈리아나), (NZ_AAJM01000380, 위치 ZP_00743052; 바실러스 투린지엔시스 세로바 이스라엘렌시스(Bacillus thuringiensis serovar israelensis), ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; 카타란터스 로세우스(Catharanthus roseus)), (NZ_AABF02000074, 위치 ZP_001144509; 푸소박테리움 뉴클레아튬 아종 빈센티(vincentii), ATCC 49256), (GFGGPPSGN, 지베렐라 후지쿠로이), (AY371321; 징코 빌로바(Ginkgo biloba), (AB055496; 헤베아 브라실리엔시스), (AB017971; 호모 사피엔스), (MCI276129; 뮤코 시르시넬로이데스 에프. 루시타니쿠스(Mucor circinelloides f. lusitanicus)), (AB016044; 머스 머스큘러스), (AABX01000298, 위치 NCU01427; 뉴로스포라 크라사), (NCU20940; 뉴로스포라 크라사), (NZ_AAKL01000008, 위치 ZP_00943566; 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; 레이투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)), (SCU31632; 사카로마이세스 세레비지아에), (AB016095; 시네코코커스 엘롱가테스(Synechococcus elongates)), (SAGGPS; 시나피스 알바(Sinapis alba)), (SSOGDS; 설폴로버스 액시도캘더리우스(Sulfolobus acidocaldarius)), (NC_007759, 위치 YP 461832; 신트로퍼스 액시디트로피쿠스(Syntrophus aciditrophicus) SB) 및 (NC_006840, 위치 YP_204095; 비브리오 피셰리(Vibrio fischeri) ES114).
대안적으로, GGPP는 또한 IPP를 FPP에 부가함으로써 생산될 수도 있다. 이 반응을 수행할 수 있는 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (NM_112315; 아라비돕시스 탈리아나), (ERWCRTE; 판토에아 어글로머란스(Pantoea agglomerans)), (D90087, 위치 BAA14124; 판토에아 애너네이티스(Pantoea ananatis)), (X52291, 위치 CAA36538; 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)), (AF195122, 위치 AAF24294; 로도박터 스패로이데스) 및 (NC_004350, 위치 NP_721015; 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) UA159).
이후, GGPP는 다수의 C20 이소프레노이드로 전환된다. C20 화합물의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
게라닐게라니올
다음과 같은 구조를 가지는 게라닐 게라니올은 세드렐라 투나(Cedrela toona)로부터 유래하는 우드 오일(wood oil)과 아마인유의 구성 성분이다:
Figure 112008083397046-pct00021
게라닐게라니올은 예를 들어, 발현 구조물에 GGPP 합성 효소에 대한 유전자를 부가한 후, 포스파타제 유전자를 부가함으로써 생성될 수 있다.
아비에타디엔
아비에타디엔은 다음과 같은 이성체들을 포함하며, 나무 예를 들어, 에이비스 그랜디스에서 발견되는 물질이다:
Figure 112008083397046-pct00022
,
Figure 112008083397046-pct00023
및
Figure 112008083397046-pct00024
.
아비에타디엔은 아비에타디엔 합성 효소에 의하여 생성된다. 적당한 뉴클레오티드 서열의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: (U50768; 에이비스 그랜디스) 및 (AY473621; 피세아 에이비스).
C 20+ 화합물
C20+ 화합물도 본 발명의 범위내에 포함된다. 이와 같은 화합물의 예로서는, 세스터테르펜(5개의 이소프렌 단위로 생성된 C25 화합물), 트리테르펜(6개의 이소프렌 단위로 생성된 C30 화합물) 및 테트라테르펜(8개의 이소프렌 단위로 생성된 C40 화합물)을 포함한다. 이와 같은 화합물들은 본원에 개시된 방법과 유사한 방법을 사용하고, 또한 적당한 합성 효소(들)에 대한 뉴클레오티드 서열들을 치환 또는 부가함으로써 생성된다.
조작 경로
본 발명은 숙주 세포 내에서 이소프레노이드를 높은 수준으로 생산하기 위하여, 조작된 MEV 경로 및/또는 DXP 경로를 이용한다. 이와 같은 경로는 통상적으로, 이 경로들 중 하나 이상에 관여하는 효소들을 암호화하는 이종 서열들을 발현시킴으로써, DNA 재조합 기술을 통하여 조작된다.
본 발명의 뉴클레오티드 핵산은 하나 또는 여러 개의 벡터에 의하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 하나의 발현 벡터는 전체 MEV 또는 DXP 경로 효소를 암호화하는 이종 서열 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 하나 또는 여러 개의 벡터를 선택하는 것은 이종 서열의 크기와 벡터의 수용 능력에 따라서 달라질 수 있는데, 이러한 과정은 상기 벡터가 선택된 숙주 세포 내에서 발현될 때 생산할 수 있는 소정의 이소프레노이드의 전체 수율에 따라서 크게 영향을 받을 것이다. 상기 벡터는 에피좀의 형태로서 복제 가능한 상태에 있을 수 있거나, 아니면 숙주 세포 게놈의 구성 부분으로서 복제될 수 있다. 통상적으로, 숙주 세포를 지속적으로 증식시키는 경우에는 후자의 형태로 복제되는 것이 바람직하다.
임의의 숙주 세포에서, MEV 또는 DXP 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 이종 서열은 하나 이상의 오페론에 의해 제어될 수 있다. 몇몇 경우, 2개 또는 3개의 오페론 시스템은 하나의 오페론 시스템보다 이소프레노이드를 더욱 높은 수율로 제공한다.
원하는 경우, 본 발명의 핵산 서열은 숙주 세포 내에서 이와 같은 서열을 더욱 높은 수준으로 발현하기 위해, 선택된 숙주 세포의 코돈 선호도를 반영하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 몇몇 구체예에서 효모 코돈 선호도에 따라서 변형될 것이다. 문헌[Bennetzen and Hall (1982) J Biol Chem 257(6) 3026-3031]을 참조하시오. 다른 비 제한적인 예로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 다른 구체예에서 이.콜라이 코돈 선호도에 따라서 변형될 것이다. 예를 들어, 문헌[Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res 10(22) 7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol Evol 13(6) 864-872]을 참조하시오. 뿐만 아니라, 문헌[ Nakamura외 다수 (2000) Nucleic Acids Res 28(1) 292]도 참조하시오. 다수의 유기체에 대한 코돈 선호도 표를 입수할 수 있는데, 이 표는 본 발명의 서열을 디자인하는데 참고 기준으로서 사용될 수 있다. 소정의 숙주 미생물의 코돈 중 가장 많이 사용되는 코돈을 사용하면, 일반적으로 번역 가능성이 증가하게 되므로, 원하는 서열의 발현 수준도 증가하게 된다.
다수의 통상적인 재조합 기술과 합성 방법에 의하여 본 발명의 핵산을 제조할 수 있다. 간단하게 말하면, 본 발명의 핵산 즉, 게놈 DNA 단편, cDNA 및 RNA가 제조될 수 있는데, 이들 핵산은 모두 세포로부터 직접 추출되거나 또는 다양한 증폭 방법 예를 들어, PCR 및 rt-PCR에 의해서 재조합 방식으로 생산될 수 있다.
핵산의 직접 화학 합성법은 통상적으로 3'-블로킹된 뉴클레오티드 단량체 및 5'-블로킹된 뉴클레오티드 단량체를, 연장되고 있는 뉴클레오티드 중합체 사슬의 5' 말단 하이드록실기에 연속적으로 부가하는 과정을 포함하는데, 여기서, 각각의 부가 과정은 부가된 단량체의 3'-위치 상에서 연장되고 있는 사슬의 5' 말단 하이드록실기를 친핵 공격하여 수행되며, 이때, 상기 부가된 단량체는 통상적으로 인 유도체 예를 들어, 포스포트리에스테르 및 포스포라미다이트 등이다. 이와 같은 방법은 당 업자에게 알려져 있으며, 이에 관하여는 관련 문헌 및 논문에 개시되어 있다[예를 들어, Matteuci외 다수 (1980) Tet Lett 521 719, 미국 특허 제4,500,707호(Caruthers외 다수) 및 미국 특허 제5,436,327호 및 동 제5,700,637호(Southern외 다수)].
숙주 미생물 내 핵산의 전사 수준은 다양한 방법으로 증가될 수 있다. 예를 들어, 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 복사체 수를 증가시킴으로써[예를 들어, 이 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 복사체를 다수 개 사용하거나, 또는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 부가 복사체를 예를 들어, recA-매개 재조합법에 의해 숙주 미생물 게놈에 도입하거나, "자살(suicide)" 벡터를 사용하거나, 람다 파지 재조합 효소를 사용하는 재조합법에 의하고/의하거나, 트랜스포존 또는 이동 가능한 요소를 삽입함으로써], 전사 수준을 증가시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 오페론의 폴리시스트론 mRNA상에 있는 암호화 부위의 순서를 바꾸거나, 오페론을 자체의 제어 요소를 가지는 개별 유전자로 나누거나, 또는 (예를 들어, 에스케리치아 콜라이 숙주 미생물 내에서, 변형 락토스-유도성 프로모터 대신에 공통 아라비노스- 또는 락토스-유도 프로모터 예를 들어, pBluescript 및 pBBR1MCS 플라스미드 내에서 발견되는 프로모터를 사용하여) 효소 암호화 부위와 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터(전사 개시 서열 또는 전사 제어 서열)의 강도를 증가시키거나, 또는 유도성 프로모터를 사용하고 화학 물질을 생장 배지에 첨가함으로써 유도성 프로모터를 유도시켜, 전사 수준을 증가시킬 수 있다. 숙주 미생물 내 뉴클레오티드 서열의 번역 수준은, 다양한 방법 예를 들어, mRNA의 안정성을 증가시키거나, 리보좀 결합 위치의 서열을 변형시키거나, 리보좀 결합 위치와 효소 암호화 서열의 개시 코돈 사이의 거리나 서열을 변형시키거나, 효소 암호화 부위의 개시 코돈의 5' 쪽의 "상류"에 위치하거나 이에 인접하는 전체 시스트론간 부위를 변형시키거나, 헤어핀 서열 및 특정 서열을 사용하여 mRNA 전사체의 3' 말단을 안정화하거나, 효소의 코돈 선호도를 변경하거나, 효소의 생합성에 사용되는 희귀 코돈 tRNA의 발현 수준을 변경시키거나/변경시키고, 예를 들어, 효소의 암호화 서열을 돌연 변이시켜 이 효소의 안정성을 증가시킴으로써, 증가할 수 있다. 선호되는 코돈과 희귀 코돈 tRNA의 결정은, 숙주 미생물로부터 유래하는 유전자의 서열 분석을 바탕으로 할 수 있다.
MEV, DXP 또는 프레닐전이효소의 숙주 내 활성은, 다양한 방법 예를 들어, 안정성이 증가된 변형 효소를 숙주 세포 내에서 발현시키는 방법, 효소 활성을 억제하는 도메인이 결여된 변형 효소를 발현시키는 방법, 기질에 대한 Kcat가 보다 높거나 Km이 보다 낮은 변형 효소를 발현시키는 방법, 또는 경로에 관여하는 다른 분자에 의한 피드-백(feed-back) 또는 피드-포워드(feed-forward) 조절에 의해 영향받지 않는 변형 효소를 발현시키는 방법을 통하여 변경될 수 있다. 이와 같은 변이 효소는 또한, 이하에 기술한 바와 같이, 보다 광범위한 특이성을 가지는 효소를 무작위로 돌연 변이시킴으로써 분리될 수도 있으며, 이러한 변이 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 또는 숙주 미생물의 게놈에 통합된 재조합 유전자로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 벡터는 암호화된 효소의 복사체 수를 원하는 수준으로 생산하도록 구성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 벡터는 HMG-CoA 환원 효소, 메발로네이트 키나제 또는 이 효소 둘 다를, 10개 이상, 10∼20개, 20∼50개, 50∼100개, 또는 100개 이상의 복사체만큼 생산한다. 플라스미드의 복사체 수가 적으면, 일반적으로, 세포 당 약 20개 미만의 플라스미드 복사체를 생산하게 되고; 플라스미드의 복사체 수가 중간 정도이면, 일반적으로, 세포 당 약 20∼약 50개의 플라스미드 복사체, 또는 세포 당 약 20∼약 80개의 플라스미드 복사체를 생산하게 되며; 플라스미드의 복사체 수가 많으면, 일반적으로, 세포 당 약 80∼약 200개 또는 그 이상의 플라스미드 복사체를 생산하게 된다.
에스케리치아 콜라이에 적당한, 적은 복사체 수의 발현 벡터로서는, pACYC184, pBeloBac11, pBR332, pBAD33, pBBR1MCS 및 이의 유도체, pSC1O1, 슈퍼코스(SuperCos; 코스미드) 및 pWE15(코스미드)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 에스케리치아 콜라이에 적당한, 중간 정도의 복사체 수의 발현 벡터로서는, pTrc99A, pBAD24 및 ColE1 복제 기원을 함유하는 벡터 및 이의 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 에스케리치아 콜라이에 적당한, 많은 복사체 수의 발현 벡터로서는, pUC, pBluescript, pGEM 및 pTZ 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효모에 적당한, 적은 복사체 수의(동원체성의(centromeric)) 발현 벡터로서는, pRS415 및 pRS416을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[Sikorski & Hieter (1989) Genetics 122.19-27]. 효모에 적당한, 많은 복사체 수의 2 마이크론 발현 벡터로서는, pRS425 및 pRS426을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[Christainson외 다수 (1992) Gene 110:119-122]. 대안적인 2 마이크론 발현 벡터로서는 2 마이크론 벡터의 비-선택성 변이체[Bruschi & Ludwig (1988) Curr. Genet 15:83-90], 또는 발현 카세트를 보유하는 비 변형 2 마이크론 플라스미드(예를 들어, 미국 특허 출원 제20050084972호) 또는 결함 선별 마커를 보유하는 2 마이크론 플라스미드 예를 들어, LEU2d[Erhanrt외 다수 (1983) J. Bacteriol 156 (2): 625-635] 또는 URA3d[Okkels (1996) Annals of the New York Academy of Sciences 782(1):202-207]를 포함한다.
조절 요소로서는 예를 들어, 프로모터와 작동 인자를 포함하는데, 이들 프로모터와 작동 인자는, 이소프레노이드의 전체적인 생산 수율을 결정하는데에 있어서 중요한 역할을 하는 하나 이상의 유전자의 발현량을 증가시킴으로써, MEV 또는 DXP 경로의 대사 흐름(metabolic flux)이 증가하도록 조작될 수 있다. 프로모터는 RNA 중합 효소에 의하여 핵산 서열의 전사를 개시 및 제어하는 뉴클레오티드 서열이다. 작동 인자는 원하는 핵산 서열의 전사를 제어하는 역할을 하는 프로모터에 인접한 뉴클레오티드 서열이다. 상기 작동 인자는 특이적 억제 인자 단백질이 결합할 수 있는 단백질-결합 도메인을 포함한다. 적당한 억제 인자 단백질이 존재하지 않으면, 프로모터를 통하여 전사가 개시된다. 적당한 억제 인자 단백질이 존재하면, 억제 인자 단백질은 작동 인자에 결합하고, 이로써, 프로모터에서 전사가 진행되는 것을 억제하게 된다. 프로모터와 작동 인자는 또한 전사 조절 인자라고도 칭하여 진다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 발현 벡터에 사용된 프로모터는 유도성이다. 다른 구체예에서, 발현 벡터에 사용되는 프로모터는 구성적이다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 기타 하나 이상의 핵산 서열은 구성적 프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있다.
원핵 생물 숙주 세포에 사용하기 적당한 프로모터에 관한 비 제한적인 예로서는, 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터, 혼성체 프로모터 예를 들어, lac/tac 혼성체 프로모터, tac/trc 혼성체 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 등, araBAD 프로모터; 생체 내 조절되는 프로모터 예를 들어, ssaG 프로모터 또는 관련 프로모터[예를 들어, 미국 특허 공보 20040131637 참조), pagC 프로모터[Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1):86-93; Alpuche-Aranda외 다수 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 89(21):10079-83], nirB 프로모터[Harborne외 다수 (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813] 등[예를 들어, Dunstan외 다수 (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie외 다수 (2004) Vaccine 22:3243-3255; 및 Chatfield외 다수 (1992) Biotechnol. 10:888-892 참조]; 시그마 70 프로모터 예를 들어, 공통 시그마 70 프로모터[예를 들어, 유전자 은행 등록 번호 AX798980, AX798961 및 AX798183]; 정상 상태(stationary phase) 프로모터 예를 들어, dps 프로모터, spv 프로모터 등, 병원성 유전자 섬(pathogenicity island) SPI-2 유래 프로모터[예를 들어, WO96/17951]; actA 프로모터[예를 들어, Shetron-Rama외 다수 (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096]; rpsM 프로모터[예를 들어, Valdivia and Falkow (1996) Mol. Microbiol 22:367 378]; tet 프로모터[예를 들어, Hillen외 다수 (1989) In Saenger W. and Heinemann U. (eds) Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162]; SP6 프로모터[예를 들어, Melton외 다수 (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056] 등을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 각각의 경로에 관여하는 기타 효소에 비하여, 이소프레노이드의 전체 수율에 지대한 영향을 미치는 이종 MEV 또는 DXP 효소의 전체 활성은, 강력한 프로모터로부터 효소를 발현시킴으로써 증가한다. 에스케리치아 콜라이에 적당한 강력 프로모터로서는 Trc, Tac, T5, T7 및 P람다를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구체예에서, 숙주 내 하나 이상의 MEV 경로 효소의 전체 활성은, 많은 복사체 수의 플라스미드상에 존재하는 강력 프로모터로부터 효소를 발현시킴으로써 증가된다. 에스케리치아 콜라이에서 활성을 증가시키는 방법에 관한 적당한 예로서는, Trc, Tac, T5, T7 및 P람다 프로모터와, pBAD24, pBAD18, pGEM, pBluescrrpt, pUC 및 pTZ 벡터를 함께 사용하는 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
진핵 생물 숙주 세포 내에서 사용하기 적당한 프로모터에 관한 비 제한적인 예로서는, CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 또는 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 유래 LTR, 그리고 마우스의 메탈로티오닌-I 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
원핵 생물 숙주 세포에 사용하기 적당한 구성적 프로모터의 비 제한적인 예로서는 시그마 70 프로모터(예를 들어, 공통 시그마 70 프로모터)를 포함한다. 박테리아 숙주 세포에 사용하기 적당한 유도성 프로모터의 비 제한적인 예로서는 박테리오파지 λ의 pL; Plac; Ptrp; Ptac(Ptrp-lac 혼성 프로모터); 이소프로필-베타-D44 티오갈락토피라노시드(IPTG)-유도성 프로모터 예를 들어, lacZ 프로모터; 테트라사이클린 유도성 프로모터; 아라비노스 유도성 프로모터 예를 들어, PBAD(예를 들어, Guzman외 다수 (1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130 참조); 자일로스-유도성 프로모터 예를 들어, Pxyl(예를 들어, Kim외 다수 (1996) Gene 181:71-76 참조); GAL1 프로모터; 트립토판 프로모터; lac 프로모터; 알콜-유도성 프로모터 예를 들어, 메탄올-유도성 프로모터, 에탄올-유도성 프로모터; 라피노스-유도성 프로모터; 열-유도성 프로모터 예를 들어, 열 유도성 람다 PL 프로모터; 감열성 억제 인자의 제어를 받는 프로모터(예를 들어, CI857-억제 람다계 발현 벡터(예를 들어, Hoffmann외 다수 (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34 참조) 등을 포함한다.
효모 숙주 세포에 사용하기 적당한 구성적 프로모터의 비 제한적인 예로서는 ADH1, ADH2, PGK 또는 LEU2를 포함한다. 효모 숙주 세포에 사용하기 적당한 유도성 프로모터의 비 제한적인 예로서는 발산형 갈락토스-유도성 프로모터 예를 들어, GAL1 또는 GAL10 프로모터[West외 다수(1984) Mol. Cell. Biol. 4(11):2467-2478] 또는 CUP1 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원하는 경우, 본 발명의 벡터는 천연의 이.콜라이 Lac 프로모터보다 더욱 강력한 프로모터를 포함한다.
박테리아 숙주 세포에 사용하는 작동 인자의 비 제한적인 예로서는 락토스 프로모터 작동 인자(락토스와 접촉시 LacI 억제 인자 단백질이 그 형태를 바꾸어, 상기 LacI 억제 인자 단백질이 작동 인자에 결합하지 못하도록 막는 것), 트립토판 프로모터 작동 인자(트립토판과 복합체 형성시, TrpR 억제 인자 단백질이 작동 인자와 결합할 때의 형태를 갖고; 트립토판이 존재하지 않을 때에는, 상기 TrpR 억제 인자 단백질이 상기 작동 인자와 결합하지 않는 형태를 가지는 것), 그리고 tac 프로모터 작동 인자[예를 들어, deBoer외 다수 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 참조]를 포함한다.
발현 벡터 내 유전자들은 통상적으로, 임의의 암호화된 mRNA 유전자 생산물의 번역(즉, 합성)을 유도하는 리보좀 결합 위치를 암호화할 것이다. 에스케리치아 콜라이 내에서 사용되는 적당한 리보좀 결합 위치에 관하여는 문헌[Shine외 다수 (1975) Nature 254:34, 및 Steitz, Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, N. Y.]을 참조하시오. 암호화 서열의 뉴클레오티드 서열 5'-AAAACA-3' 상류를 암호화하는 리보좀 결합 위치를 삽입하면, 효모 숙주 미생물 내 번역을 효율적으로 촉진한다[Looman외 다수 (1993) Nuc. Ac. Res. 21:4268-4271; Yun et. al. (1996) Mol. Microbiol. 19:1225-1239].
발현 벡터 내에 사용될 수 있는 기타 조절 요소로서는 전사 인핸서 요소와 전사 종결 인자를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Bitter외 다수 (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544]을 참조하시오.
발현 벡터는 특정 유형의 숙주 미생물에서만 사용하기 적당하며, 다른 미생물에서는 적당하지 않다. 그러나, 당 업자는 통상의 실험을 통하여, 어느 특정 발현 벡터가 소정의 숙주 미생물에 적당한지를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 숙주 유기체에 도입될 수 있으며, 이후 상기 벡터 내에 포함된 임의의 유전자의 자생력과 발현 여부에 대해 모니터링된다.
발현 벡터는 또한, 발현시 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포를 선별 또는 동정하는데 유용한 하나 이상의 표현형적 특징을 부여하는, 하나 이상의 선별 마커 유전자도 함유할 수 있다. 진핵 생물 세포에 적당한 선별 마커에 관한 비 제한적인 예로서는, 디하이드로폴레이트 환원 효소 및 네오마이신 내성을 포함한다. 원핵 생물 세포용으로 적당한 선별 마커에 관한 비 제한적인 예로서는, 테트라사이클린, 암피실린, 클로람페니콜, 카르베니실린 및 카나마이신 내성을 포함한다.
이소프레노이드를 산업적 규모로 생산하기 위해서, 발효 배지에 항생제를 첨가해야 하는 선별 마커를 사용하는 것은 비실용적일 수 있거나, 비용이 너무 많이 들 수 있다. 그러므로, 본 발명의 몇몇 구체예에서는, 플라스미드(발현 벡터)를 유지시킬 수 있는 선별 마커를 부여하는 항생제 내성을 이용할 필요가 없는 숙주 세포를 사용한다. 본 발명의 이와 같은 구체예에서, 발현 벡터는 항생제 선별이 행하여 지지 않을 때에도 플라스미드를 보유하게 하는 플라스미드 유지 시스템 예를 들어, 60kb IncP(RK2) 플라스미드를, 임의로는 RK2 플라스미드 복제 및/또는 분리 시스템과 함께 함유한다[예를 들어, Sia외 다수 (1995) J. Bacteriol. 177:2789-97; Pansegrau외 다수 (1994) J. Mol. Biol. 239:623-63 참조]. 이러한 목적으로 사용하기에 적당한 플라스미드 유지 시스템은, 안정한 독소 및 불안정한 항독소를 암호화하는 RK2의 parDE 오페론에 의해 암호화된다. 항독소는 직접적인 단백질-단백질 상호 작용에 의해 독소의 치사 작용을 억제할 수 있다. parDE 오페론을 수용하는 발현 벡터를 상실한 세포는 불안정한 항독소가 급속하게 제거되며, 그 결과 안정한 독소가 생성되어, 결국에는 세포를 사멸에 이르게 한다. 상기 RK2 플라스미드 복제 시스템은 DNA 복제 단백질을 암호화하는 trfA 유전자에 의해 암호화된다. 상기 RK2 플라스미드 분리 시스템은, DNA 복제에 의해 생성될 수 있는 플라스미드 다량체를 분해하는 작용을 하는 단백질을 암호화하는 parCBA 오페론에 의해 암호화된다.
본 발명의 벡터는 다수의 확립된 기술에 의해 안정적으로 또는 일시적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법으로서는 염화칼슘 처리법을 포함하는데, 이 방법에서는 발현 벡터가 칼슘 침전물을 통하여 도입된다. 다른 염 예를 들어, 인산칼슘도 다음과 같은 유사한 방법에 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 전기 천공법(즉, 핵산에 대한 세포의 투과성을 증가시키기 위하여 전류를 흐르게 하는 방법)이 사용될 수 있다. 기타 형질 전환법으로서는 미세 주입법, DEAE 덱스트란 매개 형질 전환법과, 아세트산리튬의 존재 하에 열 충격을 주는 방법을 포함한다. 숙주 미생물을 형질 감염시키는데에 지질 복합체, 리포좀 및 덴드리머(dendrimer)도 사용될 수 있다.
형질 전환시, 대상 벡터가 도입된 숙주 세포를 동정하기 위하여, 다수의 방법들이 실시될 수 있다. 한 가지 대표적인 선별법은, 각각의 세포들을 계대 배양하여 각각의 콜로니를 형성시킨 다음, 원하는 유전자 생산물을 발현하는지 여부에 대해 테스트하는 과정을 포함한다. 다른 방법은, 발현 벡터 내에 포함된 선별 마커 유전자를 발현시켜, 주어진 표현형적 특징을 바탕으로 하여 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 과정을 포함한다. 당 업자는 이와 같은 방법 또는 기타 당 업계에 통용되고 있는 방법을 이용하여, 유전자 변형된 숙주 세포를 동정할 수 있다.
본 발명의 다양한 경로 서열(pathway sequence)이 숙주 세포에 도입되었는지 여부는 여러 가지 방법들 예를 들어, PCR, 서던 블럿 혼성화 또는 노던 블럿 혼성화에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 결과로 생성된 숙주 세포로부터 생산될 수 있으며, 목적으로 하는 특이 서열은 목적 서열에 특이적인 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 증폭된 생성물을 사용하여 아가로스 겔 전기 영동법, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 또는 모세관 전기 영동법을 실시한 다음, 브롬화에티듐 또는 SYBR 그린 용액 등으로 염색을 하거나, 또는 UV 검출법을 수행하여, DNA를 검출한다. 대안적으로, 목적 서열에 특이적인 핵산 프로브가 혼성화 반응에 사용될 수 있다. 특이적인 유전자 서열의 발현 여부는, 역전사 커플링된 PCR, 노던 블럿 혼성화를 통하여 상응하는 mRNA를 검출하거나, 또는 암호화된 유전자 생성물과 반응성인 항체를 사용하는 면역 검정법에 의해 확인될 수 있다. 대표적인 면역 검정법의 예로서는 ELISA, 방사성 면역 검정법 및 샌드위치 면역 검정법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소정의 경로 효소의 효소 활성은 당 업계에 공지된 다수의 방법을 통하여 확인할 수 있다. 일반적으로, 효소의 활성은 연구중인 생성물의 형성 여부나, 효소 반응에 관한 기질의 전환 여부를 통하여 확인할 수 있다. 이러한 반응은 시험관 내 또는 생체 내 진행될 수 있다. 예를 들어, 세포 내 HMG-CoA 환원 효소 및 HMG-CoA 합성 효소의 상대적 활성은 세포 내 HMG-CoA의 정상 상태 수준에 의해 측정될 수 있다. HMG-CoA는 트리콜로로아세트산(TCA)에 의해 추출될 수 있으며, 이 추출된 물질을 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석법에 의해 분석할 수 있다. 메발로네이트 키나제의 활성은 메발로네이트 5-포스페이트의 형성에 의해 입증될 수 있다. 메발로네이트 키나제와 HMG-CoA 환원 효소의 상대적 활성은, 기체 크로마토그래피/질량 분광 분석법에 의해 측정될 수 있는 메발로네이트의 정상 상태 수준을 통하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 WO 05033287를 참조하시오.
본원에 개시된 하나 이상의 대사 경로를 통한 이소프레노이드의 수율은, 생산 단계에서 얻어진 중간 물질이 이소프레노이드 생성물로 형성되도록 전환하는 반응을 억제함으로써 증가될 수 있다. 비 생산 반응은 하나 이상의 비 생산 반응에 관여하는 효소의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 억제될 수 있다. 이와 같은 반응으로서는, 지방산 생합성, 알라닌 생합성, 아스파르테이트 초경로(superpathway), 글루코스 신생 합성, 헴(heme) 생합성 및/또는 글루타메이트 생합성을, 이소프레노이드의 전체 생산 수율에 영향을 미치는 수준으로 유도하는 TCA 회로의 부반응을 포함한다. 뿐만 아니라, 포스포트랜스아세틸라제의 작용을 통하여, 아세틸-CoA를 아세테이트로 전환시키는 과정은 비 생산성 부반응의 다른 예이다. 그러므로, 원하는 경우, 이소프레노이드 생산 수율을 증가시키지 위해, 포스포트랜스아세틸라제를 암호화하는 pta 유전자를 "녹-아웃(knock-out)" 또는 "녹-다운(knock-down)"시킬 수도 있다. 목적으로 하는 특이적 이소프레노이드에 따라서, 당 업자는 부가 비 생산 단계들을 표적화하는 방법을 취할 수 있다. 예를 들어, 카로티노이드를 이소프레노이드로서 선택한 경우, 당 업자는 gdhA, aceE, fdhF, yjiD, hnr 또는 yjfP, ackA, appY, aspC, clp, clpP, clpXP, crcB, csdA, cyaA, evgS, fdhA, fdhD, feoB, fumA, glnE, glxR, gntK, hycI, lipB, lysU, modA, moeA, nadA, nuoC, nuoK, pflB, pitA, pst, pstC, pta, p-yjiD, sohA, stpA, yagR, yaiD, ybaS, ycfZ, ydeN, yebB, yedN, yfcC, ygiP, yibD, yjfP, yjhH 또는 yliE 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 또는 임의의 기타 유전자(단독 또는 조합체)를 "녹-아웃" 또는 "녹-다운"시킬 수 있으며, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 제20060121558호에 개시된 바와 같이, 카로티노이드가 고수율로 생산되는 것을 막을 수 있다.
목적 유전자를 녹-아웃 또는 녹-다운시키는데에 다수의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 수준은 결실, 돌연 변이 및/또는 유전자 재배열에 의해 감소될 수 있다. 또한, 안티센스 RNA, siRNA, miRNA, 리보자임, 3중 사슬 DNA, 그리고 전사 및/또는 번역 억제 인자를 이용할 수도 있다. 뿐만 아니라, 트랜스포손(transposon)을 사용하여, 예를 들어, 이 트랜스포손을 프로모터와 암호화 부위 사이에 삽입하거나, 또는 상기 트랜스포손을 2개의 인접한 유전자 사이에 삽입하여, 하나의 유전자 또는 두 개의 유전자를 불활성화시킴으로써, 유전자 발현을 억제할 수도 있다.
이소프레노이드 화합물의 고 수율
본 발명은 하나 이상의 이종 조절 인자의 제어 하에 있는 이소펜테닐 피로포스페이트 경로 효소 또는 발효 조건을 사용하여(하나만 사용하거나 또는 둘 다 사용), 이소프레노이드를 안정적으로 생산하는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다.
하나의 측면에서, 이소프레노이드를 생산하는 방법은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 생산하기 위한 효소 경로를 포함하는 다수의 숙주 세포를 생산하는 단계[여기서, 경로 효소는 모두 하나 이상의 이종 전사 조절 인자의 제어 하에 있음]; 및 (b) 숙주 세포의 비 생장률을 최대로 이르게 하는 조건에 비하여 차선인 조건 하에서, 배지 중 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 경로는 메발로네이트 경로이다. 다른 구체예에서, 상기 경로는 DXP 경로이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 이종 전사 조절 서열은 유도성이다. 다른 구체예에서, 상기 경로 효소 하나의 전사 조절 인자의 제어 하에 있다. 다른 구체예에서, 상기 경로 효소는 다수의 이종 전사 조절 인자의 제어 하에 있다.
몇몇 구체예에서, 상기 경로는 내인성 메발로네이트 경로를 가지는 원핵 생물로부터 유래하는, 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 적당한 원핵 생물의 비 제한적인 예로서는 다음과 같은 속에 속하는 것들을 포함한다: 악티노플라네스(Actinoplanes); 아카에오글로버스(Archaeoglobus);비델로비브리오(Bdellovibrio); 보렐리아(Borrelia); 클로로플렉서스(Chloroflexus); 엔테로코커스(Enterococcus); 락토바실러스(Lactobacillus); 리스테리아(Listeria), 오세아노바실러스(Oceanobacillus); 파라코커스(Paracoccus); 슈도모나스(Pseudomonas); 스타필로코커스(Staphylococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 서모플라스마(Thermoplasma); 및 비브리오(Vibrio). 구체적인 균주에 관한 비 제한적인 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 아카에오글로버스 펄기두스(Archaeoglobus fulgidus); 비델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus); 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi); 클로로플렉서스 오란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus); 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis); 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii); 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum); 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua); 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes); 오세아노바실러스 아이헤이옌시스(Oceanobacillus iheyensis), 파라코커스 제아잔티니패이시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens); 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii); 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis); 스타필로코커스 해모라이티쿠스(Staphylococcus haemolyticus); 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae); 스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스(Streptomyces griseolosporeus); 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans); 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae); 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes); 서모플라스마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum); 서모플라스마 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae); 비브리오 파라해모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 벌니피쿠스(Vibrio vulnificus).
다른 구체예에서, 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열은 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소, HMG-CoA 환원 효소 및 메발로네이트 키나제 암호화 서열로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열은 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소, HMG-CoA 환원 효소 및 메발로네이트 키나제 암호화 서열로부터 선택되며, 엔테로코커스 속 또는 슈도모나스 속 또는 스타필로코커스 속에 속하는 원핵 생물로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열은 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소, HMG-CoA 환원 효소 및 메발로네이트 키나제 암호화 서열로부터 선택되며, 엔테로코커스 패칼리스 또는 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래한다.
다른 구체예에서, 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열로서는 제II군 HMG-CoA 환원 효소의 암호화 서열이 있다. HMG-CoA 환원 효소는 일반적으로 2개의 군으로 분류되는데, 이 군들은 서열 상동성 및/또는 효소 특성을 바탕으로 하여 구별할 수 있다[예를 들어, Hedl,외 다수, J. Bacteriology, 1927-1932, 2004, 및 Bochar,외 다수, Molec. Genet. Metab, 66, 122-127, 1999 참조].
제II군 HMG-CoA 환원 효소는 부분적으로, 이 효소의 스타틴 예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴에 대한 감수성이 낮은 것을 특징으로 할 수 있으며, 몇몇 구체예에서, 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 스타틴 억제 상수가 약 1 마이크로몰 이상, 약 10 마이크로몰 이상 또는 약 100 마이크로몰 이상이다. 다른 구체예에서, 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 로바스타틴에 대한 억제 상수가, 제I군 HMG-CoA 환원 효소의 로바스타틴에 대한 억제 상수보다, 약 10, 100, 1000 또는 10,000 이상의 팩터(factor)만큼 크다. 다른 구체예에서, 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 로바스타틴에 대한 억제 상수가, 호모 사피엔스로부터 분리된 제I군 HMG-CoA 환원 효소의 로바스타틴에 대한 억제 상수보다, 약 10, 100, 1000 또는 10,000 이상의 팩터만큼 크다. 다른 구체예에서, 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 원핵 생물로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 고세균 박테리아로부터 유래한다.
원형인 제II군 HMG-CoA 환원 효소는 슈도모나스 메발로니로부터 유래한다. 피.메발로니 HMG-CoA 환원 효소의 아미노산 서열에 비하여, 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성을 가지는 변형 제II군 HMG-CoA 환원 효소도 본 발명에 포함된다. 에이치.사피엔스 HMG-CoA 환원 효소와의 동일성이 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 이하인 변이체도 본 발명에 포함된다. 아미노산 서열의 동일성은 문헌[Bochar외 다수, Molec.Genet.Metab.,66,122-127,1999]에 개시된 방법에 의하여 측정될 수 있다.
비 제한적인 제II군 HMG-CoA 환원 효소로서는 다음과 같은 균주들로부터 유래하는 HMG-CoA 환원 효소를 포함한다: 아카에오글로버스 펄기두스(NC_000917); 비델로비브리오 박테리오보러스(BX842650); 보렐리아 버그도르페리(AE001169); 클로로플렉서스 아우랜티아쿠스(AJ299212); 엔테로코커스 패칼리스(AAO81155); 엔테로코커스 파에시움(AF290094); 락토바실러스 존스니(AE017204); 락토바실러스 플랜타룸; 락토코커스 락티스(AE006387); 리스테리아 이노쿠아(CAC96053); 리스테리아 모노사이토제네스(AE017324); 오세아노바실러스 아이헤이옌시스(NC_000917), 파라코커스 제아잔티니패이시엔스(AJ431696); 슈도모나스 메발로니(M24015); 스타필로코커스 아우레우스(AF290086); 스타필로코커스 에피더미스(AF290090); 스타필로코커스 해모라이티쿠스(AF290088); 스트렙토코커스 아갈락티아에(CAD47046); 스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스(AB037907); 스트렙토코커스 뮤탄스(AAN58647); 스트렙토코커스 뉴모니아에(AF290098); 스트렙토코커스 파이로제네스(AF290096); 서모플라스마 액시도필럼(CAC11548); 서모플라스마 볼카니움(AL935253); 비브리오 콜레라에(AAF96622); 비브리오 파라해모라이티쿠스(BAC62311); 및 비브리오 벌니피쿠스(AAO07090).
본원에 개시된 발효법은 숙주 세포의 비 생장률을 조정하는 것과 관련된 것이다. 종종 매개 변수 μ로 표시되는 비 생장률은, 단위 시간 당 생물량 단위에 대한 세포의 생장률을 의미한다. 비 생장률의 단위는 시간의 역수(1/t)이다. 배양 배지 중 세포에 대한 최대 비 생장률은 생장률에 대한 기질 농도의 효과와 관련되어 있다. 일반적으로, 세포는 기질 수준이 낮은 수준으로 존재할 때에는 천천히 생장할 것이며, 배지 중 기질의 수준이 증가하면, 세포 생장률도 증가할 것이다. 그러나, 세포 생장률은 무한정 증가하는 것은 아니며, 기질의 수준이 높을 때 즉, 기질의 양이 소정의 수준이 될 때, 세포 생장률의 증가 수준도 아주 작아진다. 그러므로, 생장률은 궁극적으로 한계점에 도달하게 되는데, 이 한계점을 종종 최대 비 생장률이라고도 부른다. 배양액 중 생장률 사이의 관계에 관한 이론적인 취급법에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있으며, 이를 모노드 등식(Monod equation)이라고 부른다. 예를 들어, 문헌[Pir, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Wiley, NY, 1975, pages 4-10]을 참조하시오. 이와 같은 이론적인 취급법에 있어서, 최대 비 생장률은 기질의 수준이 무한정이 될 때까지는 도달하지 않는 점근적 한계점(asymptotic limit)이다. 그러나, 실제로, 최대 비 생장률은, 연구중인 조건(예를 들어, 기질 수준이나 온도)이 가장 이른 초기 생장률을 나타낼 때 얻어지는 것으로 볼 수 있다. 예를 들어, 유기식 반응기에 있어서는, 영양소가 과량으로 공급되는 초기의 조건이 최대 생장률을 나타내기 위한 조건으로 취급된다. 예를 들어, 문헌[Lee외 다수 (1996) Trends Biotechnol. 14: 98-105 및 Korz외 다수 (1995) J Biotechnology 39:59-65]을 참조하시오. 기질이 첨가되어, 최대 비 생장률을 유지하는 조건을 또한, 비 제한 생장(unlimited growth)이라고 부르기도 한다. 뿐만 아니라, 모노드 등식은 더욱 많은 기질이 첨가될 때에 얻어지는 최대 비 생장률에 대해 설명하는 것이라고 하기 보다는, 다수의 기질들에 대한 최대 비 생장률에 점근적으로 접근하는, 기질에 대한 이론적인 비율 특성에 대하여 설명하고 있는 것인데, 여기서, 최대 비율 즉, 최대 비 생장률에 도달한 다음에 생장률이 다시 감소하게 된 후 기질의 수준이 증가하면, 생장률은 감소되는 것을 확인할 수 있다.
최대 비 생장률은 또한 온도와 기질과 관련하여 적용될 수도 있다. 일반적으로, 유기체는 저온에서 서서히 생장할 것이고, 또한 온도가 임의의 지점(즉, 생장률이 하강하게 되는 지점 이후의 지점) 이하까지 상승하면 더욱 빨리 생장하게 될 것이다. 생장률이 최대 수준으로 도달하게 될 온도가 있을 것인데, 이때의 온도가 최대 생장률에 도달하게 되는 온도이다. 이소프레노이드의 생산량은 온도를, 최대 비 생장률을 유지시키는 온도 이하로 낮춤으로써 증가될 수 있음을 알 수 있었다.
최대 비 생장률은 또한 발효에 기질보다는 기타 첨가물을 사용하는 경우에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 영양소, 비타민 그리고 무기질의 경우, 이와 같은 성분들의 양이 적으면, 상기 비율은 낮을 수 있으며, 이 비율은 이와 같은 성분들의 농도가 증가함에 따라서 높아질 것이고, 몇몇 경우, 상기 성분들의 농도가 클수록 상기 비율은 감소할 것이다. 성분들의 농도가 상기 비율을 가장 높게 만드는 경우 최대 비 생장률이 얻어진다.
배지 중 세포의 최대 비 생장률은 종종, 최종 생성물 또는 중간 물질에 의한 억제, 세포 구축(cell crowding) 또는 기타 생장률을 낮추는 요인들에 의해 억제되기 이전인, 발효 초기 단계에 결정된다. 예를 들어, 최대 생장률은 종종 생장 단계 중 정지기, 감퇴기 또는 정상기보다는 지수기에 있을 때 결정된다. 최대 비 생장률에 관한 개념은 또한, 적당한 변수들을 고려함으로써, 발효의 후반부에 적용될 수도 있다.
그러므로, 몇몇 구체예에서, 숙주 세포는 최대 비 생장률의 약 90% 미만으로 생장하는 조건 하에서 배양된다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 최대 비 생장률의 약 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만, 또는 그보다 더 낮은 수준으로 생장하는 조건 하에서 배양된다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 배지 온도 약 2℃, 4℃, 5℃, 6℃, 8℃, 10℃, 15℃ 또는 20℃ 이상이되, 최대 비 생장률에 이르게 하는 온도 이하의 온도에서 배양된다. 상기 온도를 낮춤으로써 생장을 줄일 수 있는데, 즉, 온도를 낮추어, 배지 중 독성 부산물이 생성되는 것과, 대사열이 발생하는 것을 감소시킬 수 있다. 배양 온도를 낮춤으로써, 세포 밀도를 높일 수 있는 세포 내 산소 요구량도 감소시킬 수 있다.
숙주 세포의 최대 비 생장률에 도달할 수 있는 온도는 선택된 숙주 세포의 유형에따라서 달라질 것이다. 이는 일정한 시간 동안 다양한 온도 하에서 숙주 세포를 생장시켜, 관련 생장 곡선을 구하여 확인할 수 있다. 최대 비 생장률을 유지시키는 온도는, 각각의 생장 곡선 기울기들을 비교함으로써 측정될 수 있다. 이.콜라이의 경우, 최대 비 생장률에 이르게 하는 온도는 약 37℃이다. 그러므로, 만일 이.콜라이가 발효에 의하여 이소프레노이드를 생산하는데 사용된다면, 발효 온도는 37℃ 이하이다. 만일 에스.세레비지아에가 사용되면, 최대 비 생장률에 이르게 하는 온도는 약 30℃이다. 그러므로, 만일 발효에 의하여 이소프레노이드를 생산하는데 사용되는 에스.세레비지아에가 숙주 세포라면, 발효 온도는 30℃ 이하이다. 통상적으로, 목표 온도는, 숙주 세포의 최대 비 생장률에 이르게 할 수 있는 온도보다 약 2℃, 4℃, 5℃, 6℃, 8℃, 10℃, 15℃ 및 20℃ 낮다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 발효 배지 중에서 배양되는데, 이 배지는 탄소 공급원을 최대 비 생장률에 이르게 하는 양보다 적은 양으로 포함한다. 임의의 구체예에서, 숙주 세포는, 탄소 공급원이 최대 비 생장률을 원래의 약 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1% 미만으로 이르게 하는 수준, 또는 그보다 더 낮은 수준으로 유지되는 배지 중에서 배양된다. 미생물에 의하여 분해 가능한 임의의 탄소-함유 공급원이 사용될 수 있다. 비 제한적인 예로서는 탄수화물 예를 들어, 단당류, 올리고당류 및 다당류, 유기산 예를 들어, 아세트산, 프로피온산; 그리고 알콜 예를 들어, 에탄올 및 프로판올, 그리고 폴리올 예를 들어, 글리세롤을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 탄소 공급원은 주로 단당류 또는 올리고당류를 포함한다. 다른 구체예에서, 탄소 공급원은 본질적으로, 단당류와 이당류로 이루어져 있다. 또 다른 구체예에서, 탄소 공급원은 본질적으로 셀룰로스를 포함하지 않는다.
단당류는 탄수화물에 대한 구성 단위로서 사용되는 간단한 당이다. 단당류는 탄소 원자(C) 주쇄에 따라서 다음과 같이 분류된다: 탄소 원자를 3개 보유하는 트리오스, 탄소 원자를 4개 보유하는 테트로스, 탄소 원자를 5개 보유하는 펜토스, 탄소 원자를 6개 보유하는 헥소스, 그리고 탄소 원자를 7개 보유하는 헵토스. 탄소 원자는 수소 원자(-H), 하이드록실기(-OH) 및 카보닐기(-C=O)에 결합하는데, 이것들의 조합 상태, 배열 순서 및 형태에 따라서 다수의 입체 이성체가 존재할 수 있다. 펜토스는 목재에서 발견되는 자일로스; 구과 식물의 고무에서 발견되는 아라비노스; RNA와 몇몇 비타민의 구성 성분인 리보스, 그리고 DNA의 구성 성분인 데옥시리보스를 포함한다. 대표적인 헥소스로서는 글루코스, 갈락토스 및 프럭토스를 포함한다. 단당류들은 서로 결합하면서, 다른 기와도 결합하여, 다양한 이당류와 올리고당류를 형성한다. 올리고당은 소수의(통상적으로는 3∼10개의) 간단한 당을 함유하는 당 중합체이다. 일반적으로, 상기 간단한 당은 단백질이나 지질 부분에 존재하는 혼화성 아미노산 측쇄에 O-결합 또는 N-결합된 상태로 발견된다. 본 발명의 발효 반응에 사용되기에 바람직한 올리고당으로서는 이당류 예를 들어, 수크로스 또는 삼당류 예를 들어, 라피노스가 있다.
궁극적인 탄소 공급원으로서, 셀룰로스, 글리칸, 전분 또는 기타 다당류를 포함하는 것이 바람직한 경우, 상기 다당류는 처음에, 화학적 수단이나 효소에 의한 방법에 의해, 단당류 및 올리고당류로 전환될 수 있다. 예를 들어, 셀룰로스는 효소 셀룰라제에 의해 글루코스로 전환될 수 있다. 그러므로, 만일 바이오매스(예를 들어, 카놀라, 알팔파, 쌀, 호밀, 사탕 수수, 해바라기, 밀, 대두, 담배, 감자, 땅콩, 면, 고구마, 카사바, 커피, 코코넛, 감귤 나무, 코코아, 차, 과일 예를 들어, 바나나, 무화과, 파인애플, 구아바, 망고, 귀리, 보리, 식물, 연목단 또는 구과 식물) 중에서 발견되는 다당류 예를 들어, 셀룰로스가 궁극적인 탄소 공급원으로서 사용되면, 그것은 셀룰라제에 의해 분해되어, 본 발명의 발효 방법과 관련하여 사용되는, 더욱 간단한 당으로 생성될 수 있다. 임의의 구체예에서, 다당류가 분해된 다음에, 단당류 및/또는 올리고당류는 탄소 공급원의 약 50 중량% 이상(이는 발효의 시작 단계에서 측정된 수치임)을 구성한다. 다른 구체예에서, 단당류 및/또는 올리고당류는 탄소 공급원의 약 80 중량% 이상 또는 90 중량% 이상(이는 발효의 시작 단계에서 측정된 수치임)을 구성하므로, 발효 배지는 본질적으로 셀룰로스를 포함하지 않는다.
다른 구체예에서, 발효 배지 중에서 배양된 숙주 세포는 질소 공급원을, 최대 비 생장률에 이르게 하는 양보다 더욱 적은 양으로 포함한다. 어떠한 구체적인 이론에 국한되지 않을 때, 세포가 이용할 수 있는 구성 성분 예를 들어, 질소의 수준을 바꾸면 세포 내 다양한 화학적 경로를 통한 상대적 유입량도 변할 수 있음을 알 수 있다. 본 발명자들은, 미생물이 이용할 수 있는 질소의 수준을 제한하면, 미생물에 의해 생산되는 이소프레노이드 예를 들어, 아모르파디엔의 양이 증가된다는 사실을 알아냈다. 본 발명의 질소의 수준의 예로서는, 최대 비 생장률을 원래의 약 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 그 이하의 수준에 이르도록 유지시키는 양을 포함한다.
여러 단계에서 질소를 제한할 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 발효의 초기 단계에 암모니아 형태의 질소가 제공되면 초기 생장을 유지시킬 수 있지만, 이후에는 발효 반응에 질소를 첨가하지 않거나, 또는 발효 반응의 pH를 7로 유지시키는데 필요한 암모니아 수준을 유지하는데 사용되는 질소(암모니아 용액 형태의 질소)를 첨가하지 않게 된다. 다량의 발효액에 있어서, 질소의 수준은 최대 비 생장률을 유지시키는 양에 못미치는 수준으로 유지된다. 상기 양은 예를 들어, 최대 비 생장률을 원래의 약 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이상, 또는 이보다 낮은 수준으로 유지시키도록 하는 양일 수 있다. 본 발명의 발효 반응에 있어서, 초기에 생장을 유지시킬 초기 질소 수준은 10 mM 이상(발효 배지 중 측정)일 수 있었으며, 이후 질소 수준은 발효 배지 중 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 10 mM 또는 4 mM 이하로 유지된다.
적당한 발효 반응 혼합물 중에 사용될 수 있는 동화 가능한 질소 공급원으로서는 간단한 질소 공급원, 유기 질소 공급원 및 복합 질소 공급원을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 질소 공급원으로서는 무수 암모니아, 무기산 또는 유기산의 암모늄 염 예를 들어, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄, 기타 질소-함유 화합물과, 동물, 식물 및/또는 미생물 기원의 물질들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아미노산 예를 들어, 루신, 이소루신 또는 발린, 또는 이의 혼합물은 또한 질소 공급원으로서 사용될 수도 있다.
기질의 수준을, 최대 비 생장률에 이르게 하는 수준 이하로 유지하기 위해서, 발효 반응에 기질을 제공하는 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 그 예로서는, 회분식 방법 즉, 발효에 이용되는 모든 기질을 발효 반응의 초기 단계에 첨가하는 방법; 연속 공급식 방법; 그리고 다양한 속도의 공급 방법을 포함하며, 여기서, 배지 중 세포의 농도를 증가시키기 위하여 발효가 진행될 때, 기질의 양도 증가하게 된다. 종종, 이와 같은 3가지 방법이 병행되기도 한다. 예를 들어, 처음에 발효 반응에 임의의 양만큼의 기질이 존재하도록 만들어, 미생물이 이 기질의 초기량을 소모하게 한 다음, 상기 기질을 다시 연속적으로 첨가하거나, 또는 초기량만큼의 기질이 사용되게 한 후에 기질을 수시로 첨가하는 것이 일반적이다. 발효 배지 중 세포에 초기량만큼의 기질을 제공하는 것이 본 발명의 하나의 측면인데, 이때, 상기 기질은 비교적 높은 수준으로 존재하여, 숙주 세포가 초기 기질을 모두 소모할 수 있도록 만들 수 있으며, 이후 상기 숙주 세포에 기질을, 최대 생장률을 유지시킬 양에 비하여 차선인 수준으로, 연속적 또는 수시로 공급하게 된다. 세포들은 지수적 비율로 생장할 수 있으므로, 기질의 양을, 숙주 세포에서의 양에 비하여 일정하게 유지시키기 위해, 공급 속도를 지수적 비율로 다양하게 하는 것이 유리할 수 있다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 기질의 양은 지수적으로 늘릴 수 있되, 최대 비 생장률에 이르게 하는 기질의 수준보다는 낮은 수준으로 늘릴 수 있다.
몇몇 구체예에서는, 발효 반응에 최대 비 생장율을 나타낼 탄소 공급량에 비하여 적은 양으로 탄소 공급원을 첨가하게 된다. 특별한 이론에 국한되지 않을 때, 세포가 이용할 수 있는 영양소의 수준을 바꾸면, 세포 내 다양한 화학적 경로를 통한 상대적 유입량도 바뀔 것이다. 예를 들어, 몇몇 효소들은 유도성으로서, 임의의 영양소가 존재할 때에만 활성을 가질 것이다. 탄소 공급원이 미생물에 공급될 때의 속도를 늦추면, 발효시 생산되는 이소프레노이드의 양을 증가시킬 수 있다. 실제로, 탄소 공급원은 처음에, 초기 탄소 공급원이 실질적으로 고갈될 때까지 숙주 세포의 초기 생장을 유지하는데 충분한 양만큼 공급될 수 있으며, 이후, 탄소 공급원은 지수적 속도로 첨가되되, 숙주 세포의 최대 비 생장률을 유지시키는 속도 이하의 속도로 첨가된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 탄소 공급원은 최대 비 생장률을 원래의 약 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 그 이하로 유지시키도록 하는 양만큼 첨가된다.
다른 구체예에서, 발효 반응시 탄소 공급원은 처음에, 최대 비 생장률(무제한 생장)로 생장하거나 또는 이와 근사한 정도로 생장하기에 충분한 양만큼 볼루스 투여되고, 이후 나머지 발효 반응에서는 이 공급원의 공급 속도를, 최대 비 생장률을 유지하는데 필요한 수준 이하의 수준으로 줄인다. 몇몇 경우에서, 탄소 공급원의 공급 속도가 감소되는 지점은 예정된 공급 속도로 공급되는 지점이다. 임의의 구체예에서, 미생물에는 탄소 공급원을 공급 속도 약 15 g/ℓ/hr로, 미생물을 지수적으로 생장시키는데 충분한 만큼 제공하고, 이후에는, 공급 속도를 5.7 g/ℓ/hr로 줄여서, 이후의 발효 반응에서 공급 속도를 이 수준으로 일정하게 유지시킨다.
임의의 구체예에서, 이종 메발로네이트 또는 DXP 경로 효소 중 하나 이상은 유도성이며, 이 경로들 중 하나 이상은 탄소 공급원의 공급 속도가 최대 비 생장률에 이르게 하는데 필요한 수준 이하로 감소된 이후에 유도된다. 예를 들어, 조작된 미생물이 유도성 프로모터인 경우, 발효 반응은, 처음에 탄소 공급원을 지수적 생장을 이루게 하는 수준이되, 최대 비 생장률을 유지하게 하는 수준에는 못미치도록 하는 수준으로 첨가한 다음, 이후의 발효 반응에서는 탄소 공급원의 공급 속도를 이보다 낮은 수준으로 감소시켜, 탄소 공급원의 공급 속도가 감소한 이후에 유도 물질을 첨가한다. 몇몇 구체예에서, 미생물은 탄소 공급원의 공급이 감소하기 시작할 때, 이소프로필티오-베타-D-갈락토시드(IPTG)로 유도된다.
다른 구체예에서, 발효 반응은 세포 생장률을 감소시키는 독성 물질이 축적되는 것을 막아주는 방식으로 수행된다. 예를 들어, 배지에 글루코스가 너무 많이 첨가되면, 독성 생성물 예를 들어, 아세테이트가 유기체 내에 축적될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kortz외 다수 (1995) J Biotechnol 39:59-65]을 참조하시오. 그러므로, 탄소 공급원을 높은 수준 즉, 최대 생장률(무한 생장)을 유지하는 양 또는 이와 유사한 양으로 제공함으로써, 세포의 초기 생장률을 더욱 증가시킬 수 있으나, 이와 같은 생장은 독성 물질이 축적됨으로 인하여 지연된다. 독성 생성물이 축적되지 않는 수준 이하로 탄소 공급원이 첨가되는 수준을 임계 수준(critical level) 또는 억제 최소 수준(inhibitory threshold)라 부른다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 발효 반응은, 탄소 공급원의 수준이 독성 물질이 축적되는 임계 수준 이하로 유지되도록 진행된다. 당 업자는 기질의 임계 농도가 사용된 균주 및 배지에 따라서 달라질 것이라는 것을 알 것이다.
유효 발효 반응 혼합물은 기타 화합물 예를 들어, 무기 염, 비타민, 미량 금속(trace metal) 또는 생장 촉진 물질을 포함할 수 있다. 이와 같은 기타 화합물은 또한 유효 반응 혼합물 중 탄소, 질소 또는 무기 공급원 내에 존재할 수 있거나, 아니면 반응 혼합물에 특별히 첨가될 수도 있다. 본 발명의 하나의 구체예는, 숙주 세포의 최대 생장률을 유지시키는 수준에 비하여 차선인 수준으로 이와 같은 화합물을 제공하여, 이소프레노이드의 생산 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
발효 반응 혼합물은 또한 적당한 포스페이트 공급원도 포함할 수 있다. 이와 같은 포스페이트 공급원으로서는 무기 포스페이트 공급원 및 유기 포스페이트 공급원을 포함한다. 포스페이트 공급원의 비 제한적인 예로서는 포스페이트 염 예를 들어, 1가 염기 또는 2가 염기 인산나트륨 및 인산칼륨, 인산암모늄, 폴리포스페이트 및 이것들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 발효 반응 혼합물은 또한 마그네슘 공급원도 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 마그네슘은 생리적으로 허용 가능한 염 예를 들어, 황산마그네슘 7수화물의 형태로 존재하나, 기타 마그네슘 공급원이 마그네슘 양을 유사하게 만들 농도만큼 사용될 수도 있다. 또한, 몇몇 경우, 발효 반응 혼합물 중 마그네슘 공급원이 발효시 소모되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 인 공급원은 최대 비 생장률을 유지시키도록 하는 양에 비하여, 차선인 양으로 제공된다.
발효 반응 혼합물은 또한 생물학적으로 허용 가능한 킬레이트화제 예를 들어, 구연산 삼나트륨의 2수화물 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함할 수도 있다. 발효 반응 혼합물은 또한 초기에 발효 반응 혼합물의 pH를 원하는 수준으로 유지시키기 위하여 생물학적으로 허용 가능한 산이나 염기를 포함할 수도 있다. 생물학적으로 허용 가능한 염으로서는 염화수소산, 황산, 질산, 인산 및 이것들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적으로 허용 가능한 염기로서는 수산화암모늄, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이것들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발효 반응 혼합물은 또한 생물학적으로 허용 가능한 칼슘 공급원 예를 들어, 염화칼슘을 포함할 수도 있다. 발효 반응 혼합물은 또한 염화나트륨을 포함할 수도 있다. 발효 반응 혼합물은 또한 미량의 금속을 포함할 수도 있다. 이와 같은 미량 금속은 발효 반응 혼합물에, 편의를 위하여 나머지 발효 반응 혼합물로부터 별도로 생산될 수 있는 스톡 용액(stock solution)으로서 첨가될 수 있다. 적당한 미량 금속 용액은 셀렌산나트륨; 황산 제1철, 7수화물; 황산 구리, 5수화물; 황산아연, 7수화물; 몰리브덴산 나트륨, 2수화물; 염화코발트; 셀레늄 또는 크롬 용액; 6수화물; 및 황산망간 1수화물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 염화수소산은 용액 중 미량 금속 염을 유지시키기 위해서 스톡 용액에 첨가될 수 있다.
만일 경로의 중간 물질 또는 이와 같은 경로의 중간 물질로 전환될 수 있는 화합물이 발효 배지에 첨가되면, 상기 중간 물질 또는 화합물은 통상적으로 과량으로 존재한다.
발효는 혐기 조건(산소 결핍 조건) 또는 호기 조건(산소화 조건) 하에서 수행될 수 있다. 호기 조건 하에서, 미생물은 당을 최종 산물 예를 들어, CO2 및 H2O로 분해할 수 있다. 혐기 조건 하에서, 숙주 세포는 CO2와 에탄올을 생산하기 위해 대안적인 경로를 이용한다. 발효는 또한 호기 대사 및 혐기 대사간 구별이 되지 않는 생장 배지 상에서 미생물을 다량으로 생장시키는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이소프레노이드를 생산하기 위해서는 호기 발효를 수행한다.
본 발명의 발효는 회분식, 유가식 또는 연속적 방법으로 수행될 수 있다. 회분식 방법은 통상적으로, 폐쇄된 공정으로서, 원료 전부가 발효 초기에 첨가되는 공정이다. 유가식 공정은 통상적으로 폐쇄된 공정으로서, 탄소 공급원 및/또는 기타 기질이 공정 전반에 걸쳐서 그 양을 늘리면서 첨가되는 공정이다. 유가식 공정은 배지와 미생물의 생장을 보다 잘 제어할 수 있다. 연속 공정은 배지를 연속적으로 첨가함과 동시에 생성물을 분리해내는 개방 시스템이다. 이와 같은 유형의 공정들의 중간 형태인 공정도 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 유가식 공정으로 발효를 개시한 후, 유기층 예를 들어, 도데칸을 발효 배지와 접촉시키면서, 발효 공정을 진행시키는 방법도 있다. 통상적으로, 유기 배지 중 용해도가 수성 발효 배지 중 용해도보다 큰 이소프레노이드가 발효 배지로부터 유기층으로 추출된다. 이소프레노이드가 포화점 이상으로 생산되어, 배지와 분별 가능한 층을 형성하는 경우, 명확하게 구분된 상의 층을 배수하거나 또는 흡출하여 간단하게 분리할 수 있다. 매질 및 발효 공정으로부터 생성물이 분리되기 때문에, 이러한 공정은 유가식 공정의 특징과 연속 공정의 특징을 모두 가진다고 할 수 있다. 유가식 공정 및 연속 공정은 발효 과정 중 발효 성분을 조절하면서 첨가할 수 있다. 유가식 공정, 연속 공정 또는 이러한 공정을 병행하는 공정은 일반적으로 본 발명을 실시하는데 바람직하다. 이와 같은 공정들로 말미암아, 시간에 관한 함수인, 공급물 및 기타 발효 성분의 첨가 속도를 더욱 잘 제어할 수 있다. 발효 중 생성물을 분리하면 유리할 수 있는데, 특히, 축적된 생성물이 생산 경로를 억제하는 경우에 유리할 수 있다.
발효액 1 리터당 미생물의 양 또는 미생물의 밀도는, 소정 부피의 발효 배지로부터 분리된 미생물의 중량을 측정함으로써 측정될 수 있다. 일반적인 척도는 발효 배지 1 리터당 세포의 건조 중량이다. 발효가 진행되는 동안에 발효 상태를 관찰하는데 사용될 수 있는 다른 방법으로서는, 배지의 광학 밀도를 측정하는 방법이 있다. 일반적인 방법은, 파장 600 ㎚에서의 광학 밀도(즉, OD600 또는 OD)를 측정하는 방법이 있다. OD는 특정 배지 중에 존재하는 특정 유형의 유기체의 밀도와 상관성이 있을 수 있으나, OD와 부피당 미생물의 양 사이의 구체적인 관계는 일반적으로 모든 유형의 배지 중에 존재하는 모든 유형의 유기체에 적용되는 것은 아니다. 교정 곡선은 일정 범위의 세포 밀도에 대한 건조 세포 중량 및 OD를 측정함으로써 작성될 수 있다. 몇몇 경우, 이와 같은 상관 관계는 동일하거나 유사한 배지 중 동일하거나 유사한 미생물의 상이한 발효에 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 방법을 제공한다: (i) (a) 발효 배지의 온도를, 숙주 세포를 최대 비 생장률에 이르게 하는 온도보다 낮은 온도로 유지하고, (b) 발효 배지가, 숙주 세포를 최대 비 생장률에 이르게 하는데 필요한 탄소 공급원의 양보다 적은 양의 탄소 공급원을 포함하며/포함하거나, (c) 발효 배지가, 숙주 세포를 최대 비 생장률에 이르게 하는데 필요한 질소 공급원의 양보다 적은 양의 질소 공급원을 포함하는 조건 하에서, 이소 프레노이드를 생산하는, 유전자 변형된 숙주 세포 다수와 발효 배지를 포함하는 발효 반응을 수행하는 단계; 및 (iii) 상기 (a)∼(c)에 제시된 하나 이상의 조건 하에서 생산된 이소프레노이드를 회수하는 단계. 하나의 구체예에서, 발효 반응은 상기 (a)의 조건 하에서 진행된다. 다른 구체예에서, 발효 반응은 상기 (a) 및 (b)의 조건 하에서 진행된다. 또 다른 구체예에서, 발효 반응은 상기 (a)∼(c)의 조건, 또는 이 조건들을 임의로 조합한 조건 하에서 진행된다.
본원에 개시된 방법을 이용하여, 숙주 세포는 발효 반응 혼합물 1리터당 이소프레노이드 약 10 g 이상(10 g/ℓ)을 생산한다. 기타 구체예에서, 약 15 g/ℓ 이상, 약 20 g/ℓ 이상, 25 g/ℓ 이상의 이소프레노이드, 또는 약 30 g/ℓ 이상의 이소프레노이드가 생산된다.
다른 구체예에서, 숙주 세포는 건조 숙주 세포 1 g 당 이소프레노이드 약 50 밀리그램(건조 세포 중량 1 그램당 50 밀리그램) 이상을 생산한다. 다른 구체예에서, 건조 세포 중량 1 그램당 약 100 밀리그램 이상, 건조 세포 중량 1 그램당 약 150 밀리그램 이상, 건조 세포 중량 1 그램당 약 200 밀리그램 이상, 건조 세포 중량 1 그램당 약 250 밀리그램 이상, 건조 세포 중량 1 그램당 약 500 밀리그램 이상, 건조 세포 중량 1 그램당 약 750 밀리그램 이상, 또는 건조 세포 중량 1 그램당 약 1000 밀리그램 이상의 이소프레노이드가 생산된다.
다른 구체예에서, 생산 수준은, 그것을 g/ℓ아니면 ㎎/건조 세포 중량 1 g 중 어느 것으로 나타내는지에 따라서, 약 150 시간 미만, 바람직하게는 약 96 시간 미만, 또는 약 72 시간 미만만큼 경과하였을 때 상기 수준에 도달할 수 있게 된다.
적당한 이소프레노이드에 관한 비 제한적인 예로서는 다음과 같은 것을 포함한다: 헤미테르펜(1개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 이소프렌; 모노테르펜(2개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 미르신; 세스퀴테르펜(3개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 아모르파-4,11-디엔; 디테르펜(4개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 탁사디엔; 트리테르펜(6개의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 스쿠알렌; 테트라테르펜(8개의 이소프레노이드로부터 유래) 예를 들어, β-카로틴; 그리고 폴리테르펜(8개 이상의 이소프렌 단위로부터 유래) 예를 들어, 폴리이소프렌. 몇몇 구체예에서, 이소프레노이드는 카로티노이드가 아니다. 다른 구체예에서, 이소프레노이드는 C5∼C20 이소프레노이드이다.
지금까지 본 발명을 특정 구체예와 함께 기술하였는데, 이하에 기술된 사항은 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 이를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 업계의 당 업자는 본 발명의 범위 내에 속하는 다른 측면, 이점 및 변형 예를 알 수 있을 것이다.
본 발명을 실시함에 있어서는, 달리 언급이 없는 한, 당 업자의 수준에 해당 하는, 생합성 산업에서 통상적으로 사용되는 기술 등을 사용할 수 있다. 본원에서는 이러한 기술에 관하여 전부 기술하고 있지 않지만, 당 업자는 과학 문헌에 개시된 이러한 기술들을 참고로 하여 응용할 수 있다.
이하 실시예에서는, 기재된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 정확성을 기하고자 노력을 하였으나, 이에 변형을 가할 수 있고 또한 편차도 있을 수 있으며, 본원에 제시된 수치상에 오기가 있을 경우, 본 발명이 속하는 분야의 당업자는 본원에 개시된 나머지 사항들을 참고로 하여, 정확한 양을 추론해낼 수 있다. 달리 언급이 없는 한, 온도는 섭씨 온도로 표시하였고, 압력은 해수면에서의 기압 또는 이에 가까운 기압이다. 달리 언급이 없는 한, 모든 시약은 시판중인 것으로 구입하였다. 이하 실시예는 오로지 예시를 위한 목적으로 제공된 것이지, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는, 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래하는, MEV 경로 효소를 포함하는 효소를 암호화하는 발현 플라스미드를 오페론의 형태로서 만드는 방법에 관하여 기술하고 있다.
MevT 오페론(서열 번호 1)을 pBAD33 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드인 pMevT를 제조하였다. 상기 MevT 오페론은 도처에 존재하는 전구체인 아세틸-CoA를 (R)-메발로네이트로 함께 전환시키는 MEV 경로 효소 즉, 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소 및 HMG-CoA 환원 효소 세트를 암호화한다. 에스케리치아 콜라이 게놈 DNA 즉, atoB 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: NC_000913 영역: 2324131..2325315)(아세토아세틸-CoA 티올라제를 암호화함), 사카로마이세스 세레비지아에 게놈 DNA 즉, ERG13 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: X96617, 영역: 220..1695)(HMG-CoA 합성 효소를 암호화함), 그리고 사카로마이세스 세레비지아에 게놈 DNA 즉, HMG1 유전자의 암호화 부위의 분절(유전자 은행 등록 번호: M22002, 영역: 1660..3165)(절단형 HMG-CoA 환원 효소(tHMGR)를 암호화함)을 PCR 증폭시켜 상기 MevT 오페론을 제조하였다. HMG1 유전자 단편을 증폭시키는데 사용되는 상류 PCR 프라이머는 인공 개시 코돈을 포함하였다. 중첩 연장법(overlap extensions; SOEing)을 이용하여 증폭된 단편들을 함께 스플라이싱하였는데, 이 과정이 진행되는 동안, 리보좀 결합 위치는 atoB 및 ERG13 암호화 서열 다음에 도입하였다. 3' A 돌출부를 부가한 다음, 상기 MevT 오페론을 TA 클로닝 벡터인 pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에 결찰시킨 다음, 이를 서열 결정하여 정확성을 확인하였다. 이후, 상기 MevT 오페론을 벡터 pBAD33의 XmaI PstI 제한 효소 위치에 결찰시켰다[Guzman외 다수 (1995) J. Bacteriol 177(14): 4121-4130]. 상기 오페론을 PLac 프로모터의 제어 하에 두기 위해서, pBAD33의 araC-PBAD NsiI-XmaI 단편을 pBBR1MCS의 NsiI-XmaI 단편으로 치환한 결과, 발현 플라스미드 pMevT가 생산되었다[미국 특허 제7,192,751호 참조].
MevT66 오페론을 pAM36 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드인 pAM36-MevT66을 제조하였다. AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsII-PmeI 제한 효소 위치를 함유하는 올리고뉴클레오티드 카세트를 pACYC184 벡터(유전자 은행 등록 번호: XO6403)에 삽입 하고, pACYC184 내 tet 내성 유전자를 제거하여, 벡터 pAM36을 제조하였다. 에스케리치아 콜라이로부터 유래하는 atoB 유전자(유전자 은행 등록 번호: NC_000913 영역: 2324131..2325315), 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래하는 ERG13 유전자(유전자 은행 등록 번호: X96617, 영역: 220..1695), 그리고 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래하는 HMG1 유전자의 절단형(유전자 은행 등록 번호: M22002, 영역: 1777..3285)(상기 3개의 유전자는 에스케리치아 콜라이 내에서 발현되기에 최적인 코돈임)을 포함하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 주형으로 사용하여, MevT66 오페론을 합성에 의해 제조하였다. 합성에 의해 제조된 MevT66 오페론에는 5' EcoRI 제한 효소 위치와 3' Hind III 제한 효소 위치가 측접하고 있어서, 클로닝 벡터 예를 들어, 표준적인 pUC 또는 pACYC 기원 벡터의 혼화 가능한 제한 효소 위치에 클로닝될 수 있었다. 이 구조물로부터, 측접하는 SfiI 및 AsiSI 제한 효소 위치를 가지는 MevT66 오페론을 PCR 증폭시켰으며, 이와 같이 증폭된 DNA 단편을 SfiI 및 AsiSI 제한 효소로 절단하여 이 반응을 완결시키고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석한 다음(키아젠(Qiagen)의 겔 정제 키트(Valencia, CA) 사용), 겔로부터 약 4.2 kb의 DNA 단편을 추출하였는데, 이와 같이 분리된 DNA 단편을 pAM36 벡터의 SfiI AsiSI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드인 pAM36-MevT66가 제조되었다.
MevT66 오페론을 pAM29 벡터에 삽입하여 발현 벡터 pAM25를 제조하였다. 벡터 pAM29는, p15A의 복제 기원과 pZS24-MCS1로부터 유래하는 kan 내성 유전자(Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res 25:1203-1210)를, 올리고뉴클레오티드-생성 lacUV5 프로모터와 조립함으로써 생성되었다. EcoRI 및 Hind III 제한 효소를 사용하여 MevT66 오페론을 포함하는 DNA 합성 구조물(상기 참조)을 분해함으로써 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동시켜 분석한 다음, 겔로부터 4.2 kb의 DNA 단편을 추출해내고, 이때 분리된 DNA 단편을 pAM29의 EcoRI HindIII 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드인 pAM25가 제조되었다.
MevB 오페론을 pBBR1MCS-1 벡터에 삽입하여, 발현 플라스미드인 pMevB-Cm를 제조하였다. 상기 MevB 오페론은 (R)-메발로네이트를 IPP로 전환시키는 효소들 즉, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 피로포스페이트 카복실라제의 세트를 암호화한다. 사카로마이세스 세레비지아에 게놈 DNA인 ERG12 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: X55875, 영역: 580..1911)(메발로네이트 키나제를 암호화함), ERG8 유전자(유전자 은행 등록 번호: Z49939, 영역: 3363..4718)(포스포메발로네이트 키나제를 암호화함), 그리고 MVD1 유전자(유전자 은행 등록 번호: X97557, 영역: 544..1734)(메발로네이트 피로포스페이트 카복실라제를 암호화함)을 PCR 증폭시키고, 중첩 연장법(SOEing)을 이용하여 PCR 단편들을 스플라이싱하여, MevB 오페론을 제조하였다. 증폭시 적당한 프라이머 서열을 선택하여, ERG12 및 ERG8의 종결 코돈을 TAA에서 TAG로 바꾸어, 리보좀 결합 위치를 도입하였다. 3' A 돌출부를 부가한 다음에, MevB 오페론을 TA 클로닝 벡터 pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 결찰하였다. PstI 제한 효소를 이용하여 클로닝 구조물을 분해하여 MevB 오페론을 절단함으로써, 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분석한 다음, 겔로부터 4.2 kb의 DNA 단편을 추출하고, 이때 분리된 DNA 단편을 벡터 pBBR1MCS-1[Kovach외 다수 , Gene 166(1) 175-176 (1995)]의 PstI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드인 pMevB-Cm이 제조되었다.
MBI 오페론을 pBBR1MCS-3 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드인 pMBI를 제조하였다. 상기 MBI 오페론은 MevB 오페론 효소 및, IPP에서 DMAPP로의 전환을 촉진하는 이소펜테닐 피로포스파타제 이성화 효소와 동일한 효소를 암호화한다. 5' 말단에 XmaI 제한 효소 위치를 포함하는 프라이머를 사용하여, 에스케리치아 콜라이의 게놈 DNA인, idi 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호 AF119715)을 PCR 증폭시키고, 이와 같이 증폭된 DNA 단편을 XmaI 제한 효소로 분해하여 반응을 종결시킨 다음, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분석하고, 이 겔로부터 0.5 kb인 단편을 추출한 후, 분리된 DNA 단편을 발현 플라스미드 pMevB-Cm의 XmaI 제한 효소 위치에 결찰시켜, MevB 오페론의 3' 말단에 idi를 배치함으로써, 상기 MBI 오페론을 제조하였다. 상기 MBI 오페론을 벡터 pBBR1MCS-3의 SalI 및 SacI 제한 효소 위치에 서브클로닝한 결과[Kovach외 다수 , Gene 166(1) 175-176 (1995)], 발현 플라스미드인 pMBI가 제조되었다[미국 특허 제7,192,751호 참조].
ispA 유전자를 pMBI에 삽입하여 발현 플라스미드 pMBIS를 제조하였다. 상기 ispA 유전자는, IPP 2분자와 DMAPP 1분자를 축합하여 파네실 피로포스페이트(FPP)로 만드는 과정을 촉진하는 파네실 피로포스페이트 합성 효소를 암호화한다. SacII 제한 효소 위치를 포함하는 순행 프라이머(forward primer)와 SacI 제한 효소 위치를 포함하는 역행 프라이머(reverse primer)를 사용하여, 상기 ispA 유전자의 암호 화 서열(유전자 은행 등록 번호: D00694, 영역: 484..1383)을, 에스케리치아 콜라이의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물을 SacII 및 SacI 제한 효소로 분해하여 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 0.9 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하였다. 분리된 DNA 단편을 pMBI의 SacII SacI 제한 효소 위치에 결찰하여, idi의 ispA 유전자 3' 말단과 MevB 오페론을 배치한 결과, 발현 플라스미드 pMBIS가 제조되었다[미국 특허 제7,192,751호 참조].
ispA 암호화 서열과 게라닐 디포스페이트 합성 효소("gpps")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 치환함으로써, 발현 플라스미드 pMBIS로 발현 플라스미드 pMBIS-gpps를 제조하였다. 상기 게라닐 디포스페이트 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을, 아라비돕시스 탈리아나의 gpps 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: Y17376, 영역: 52..1320), 에스케리치아 콜라이 내에서 발현하는데 최적인 코돈(주형)을 이용하는 합성 방법에 의해 합성하였다. 상기 뉴클레오티드 서열에는 리더 SacII 제한 효소 위치 및 말단 SacI 제한 효소 위치가 측접하고 있어서, 클로닝 벡터 예를 들어, 표준적인 pUC 또는 pACYC 기원 벡터의 혼화성 제한 효소 위치에 클로닝될 수 있다. SacII 및 SacI 제한 효소를 사용하여 DNA 합성 구조물을 분해하여 반응을 종결하고, 합성에 의해 생성된 게라닐 디포스페이트 합성 효소 서열을 분리한 후, 겔 전기 영동에 의해 반응 혼합물을 분석한 다음, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 약 1.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하고, 이 분리된 DNA 단편을 발현 플라스미드 pMBIS의 SacII SacI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pMBIS-gpps가 제조되었다 (플라스미드 맵에 관하여는 도 3 참조).
MBIS 오페론을 pAM36-MevT66에 삽입하고, 2개의 오페론 앞에 lacUV5 프로모터를 부가하여, 발현 플라스미드 pAM45를 제조하였다. 5' XhoI 제한 효소 위치 및 3' PacI 제한 효소 위치를 포함하는 프라이머를 이용하여, 상기 MBIS 오페론을 pMBIS로부터 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물을 XhoI 및 PacI 제한 효소를 이용분해하여 반응을 종결시킨 다음, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 5.4 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하고, 분리된 DNA 단편을 pAM36-MevT66의 XhoI PacI 제한 효소 위치에 결찰한 결과, 플라스미드 pAM43이 제조되었다. 올리고뉴클레오티드로부터 lacUV5 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성한 후, 이를 pAM43의 AscI SfiI 및 AsiSI XhoI 제한 효소 위치에 서브 클로닝한 결과, 발현 플라스미드 pAM45가 제조되었다.
실시예 2
본 실시예에서는, 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래하는, MEV 경로 효소를 포함하는 효소를 암호화하는 발현 벡터를 오페론의 형태로서 만드는 방법에 관하여 기술하고 있다.
사카로마이세스 세레비지아에 HMG-CoA 환원 효소를 암호화하는 HMG1 유전자의 암호화 서열을, 스타필로코커스 아우레우스 HMG-CoA 환원 효소를 암호화하는 mvaA 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: BA000017, 영역:2688925..2687648)과 치환함으로써, 발현 플라스미드 pAM25로부터 발현 플라스미드 pAM41을 제조하였다. 프라이머 4-49 mvaA SpeI(서열 번호 2) 및 4-49 mvaAR XbaI(서열 번호 3)을 사용하여, 상기 mvaA 유전자의 암호화 서열을 스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스(ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시키고, 이 증폭된 DNA 단편을 SpeI 제한 효소를 이용하여 분해함으로써 반응을 종결시켰으며, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 약 1.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하였다. HindIII 제한 효소를 이용하여 상기 플라스미드 pAM25를 분해해 반응을 종결시킴으로써, 상기 HMG1 암호화 서열을 이 플라스미드로부터 분리하였다. 결과로 생성된 선형 DNA 단편의 말단 돌출부를, T4 DNA 중합 효소를 사용하여 뭉툭하게(blunt) 만들었다. 이후, SpeI 제한 효소를 사용하여 상기 DNA 단편을 부분적으로 분해하고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 4.8 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하였다. 분리된 DNA 단편을 SpeI-분해된 mvaA PCR 생성물과 함께 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM41이 제조되었다. pAM41에 포함된 atoB(opt):ERG13(opt):mvaA의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 41의 서열이다.
사카로마이세스 세레비지아에 HMG-CoA 합성 효소를 암호화하는 ERG13 유전자의 암호화 서열을, 스타필로코커스 아우레우스 HMG-CoA 합성 효소를 암호화하는 mvaS 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: BA000017, 영역: 2689180..2690346)과 치환하여, 발현 플라스미드 pAM41로부터 발현 플라스미드 pAM52를 제조하였다. ERG13은 HMGS 또는 HMG-CoA 합성 효소로도 알려져 있다. 프라이머 HMGS 5' Sa mvaS-S(서열 번호 4) 및 HMGS 3' Sa mvaS-AS(서열 번호 5)를 사용하여, 스타필로코커스 아우레우스 아종 아우레우스(ATCC 70069) 게놈 DNA로부터 상기 mvaS 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭시키고, 이와 같이 증폭된 DNA 단편을 PCR 프라이머로 사용하여, 문헌[Geiser외 다수, BioTechmques 31:88-92 (2001)]의 방법에 따라서 pAM52 내 HMG1 유전자의 암호화 서열과 치환한 결과, 발현 플라스미드인 pAM52가 제조되었다. pAM52에 포함된 atoB(opt):mvaS:mvaA 오페론의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 42의 서열이다.
MevT66 오페론을 발현 플라스미드 pAM52의 (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론으로 치환하여, 발현 플라스미드 pAM45로부터 발현 플라스미드 pAM97을 제조하였다. AsiSI 및 SfiI 제한 효소를 이용하여 발현 플라스미드 pAM45를 분해해서 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, MevT66 오페론이 결여된 8.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하였다. 프라이머19-25 atoB SfiI-S(서열 번호 6) 및 19-25 mvaA-AsiSI-AS(서열 번호 7)을 사용하여, pAM52의 (atoB(opt):mvaS:mvaA) 오페론을 PCR 증폭시키고, SfiI 및 AsiSI 제한 효소를 이용하여 PCR 생성물을 분해해 반응을 종결시킨 다음, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 3.7 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 이와 같이 분리된 DNA 단편을 발현 플라스미드 pAM45의 AsiSI Sfil 제한 효소 위치에 결찰한 결과, 발현 플라스미드 pAM97이 제조되었다.
pAM97의 MBIS 오페론을 pAM45의 MBI 오페론과 치환하여, 발현 플라스미드 pAM97 및 pAM45로 발현 플라스미드 pAM97-MBI를 제조하였다. 프라이머 9-70C(서열 번호 8) 및 26-39B(서열 번호 9)를 사용하여, pAM45로부터 상기 MBI 오페론을 PCR 증폭시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 4.5 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편은 SacI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 분해해 반응을 종결시켰다. 발현 플라스미드 pAM97도 SacI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 분해함으로써 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 7.6 kb의 단편을 겔로부터 추출하고, 분리된 DNA 단편을 MBI 오페론 PCR 생성물과 결찰한 결과, 발현 플라스미드인 pAM97-MBI가 제조되었다.
pAM97의 MBIS 오페론을 pAM45의 MevB 오페론으로 치환함으로써, 발현 플라스미드 pAM97 및 pAM45로부터 발현 플라스미드 pAM97-MevB를 제조하였다. 프라이머 9-70C(서열 번호 8) 및 26-39A(서열 번호 10)을 사용하여 pAM45로부터 상기 MevB 오페론을 PCR 증폭시킨 후, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 3.9 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편은 SacI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 분해해 반응을 종결시켰다. 발현 플라스미드 pAM97을 SacI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 7.6 kb의 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 MevB 오페론 PCR 생성물과 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM97-MevB가 제조되었다.
발현 플라스미드 pAM97의 MBIS 오페론과 (atoB(opt):mvaS:mvaA)을, RK2 플라스미드 복제, 분리 및 유지 시스템을 포함하는 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드인 pAM128을 제조하였는데, 이 경우에는, 더 이상 숙주 세포 형질 전환체를 항생제로 선별할 필요가 없다. 상기 RK2 플라스미드를 PstI 제한 효소로 분해하여 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 전체 par 위치를 포함하는, 약 6.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 미니 RK2 레플리콘 pRR1O의 PstI 제한 효소 위치에 서브클로닝한 결과[Roberts외 다수 (1990) J Bacteriol. 172(11): 6204-6216], 벡터 pAM132가 제조되었다. AscI 및 SacI 제한 효소를 사용하여 발현 플라스미드 pAM97을 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 약 9.4 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 pAM132의 MluI SacI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM128이 제조되었다.
실시예 3
본 실시예에서는, 엔테로코커스 패컬리스로부터 유래하는, MEV 경로 효소를 포함하는 효소를 암호화하는 발현 벡터를 오페론의 형태로서 만드는 방법에 관하여 기술하고 있다.
엔테로코커스 패컬리스의 mvaE 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF290092 영역: 1479..3890)(아세틸-CoA 아세틸전이효소/HMG-CoA 환원 효소(HMGR)를 암호화함)을 pBlueScripII-KS(+) 벡터에 삽입하여 플라스미드 pAM16을 제조하였다. 5'-인산화 프라이머 4-40 mvaEF BamHI(서열 번호 11) 및 4-40 mvaERHindIII(서열 번호 12)를 사용하여, 엔테로코커스 패컬리스의 게놈 DNA(ATCC 700802)로부터 상기 mvaE 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭시켰다. [프라이머 4-40 mvaEF BamHI은 mvaE 유전자의 개시 코돈을, 증폭된 PCR 생성물 내에서 TTG로부터 ATG로 바꾼다는 점에 주의]. 결과로 생성된 PCR 생성물을 pBlueScripII-KS(+)(Stratagene, La Jolla, CA)의 SmaI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM16이 제조되었다.
엔테로코커스 패컬리스의 mvaS 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF290092 영역: 142..1293)(HMG-CoA 합성 효소(HMGS)를 암호화함)을 pBlueScripII-KS(+) 벡터에 삽입하여, 플라스미드 pAM18를 제조하였다. 5' 인산화 프라이머 4-40 mvaSF BgIII(서열 번호 13) 및 4-39 mvaSR BamHI(서열 번호 14)를 사용하여, 엔테로코커스 패컬리스 게놈 DNA(ATCC 700802)로부터 mvaS 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭시키고, 상기 PCR 생성물을 pBlueScripII-KS(+)(Stratagene, La Jolla, CA)의 SmaI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드인 pAM18이 제조되었다.
발현 플라스미드 pAM16의 mvaE 유전자의 암호화 서열을 pZE21-PL-lacO1 벡터에 삽입하여, 발현 플라스미드 pAM22를 제조하였다. 벡터 pZE21-PL-lacO1은 벡터 pZE21-MCS-l의 유도체로서, tet 프로모터가 PL-lacO1 프로모터로 치환된 것이다[Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210]. BamHI 및 HindIII 제한 효소를 사용하여 발현 플라스미드 pAM16을 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 상기 mvaE 암호화 서열을 함유하는 약 2.4 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 pZE21-PL-lacO1의 BamHI HindIII 제한 효소 위치에 삽입한 결과, 발현 플라스미드 pAM22가 제조되었다.
발현 플라스미드 pAM18의 mvaS 유전자의 암호화 서열을 발현 플라스미드 pAM22에 삽입하여, 발현 플라스미드 pAM33을 제조하였다. BgIII 및 BamHI 제한 효소를 이용하여 발현 플라스미드 pAM18을 분해하여 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, mvaS 유전자의 암호화 서열을 함유하는 약 1.2 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 발현 플라스미드 pAM22의 BamHI 위치에 삽입한 결과, 발현 플라스미드 pAM33이 생성되었다.
발현 플라스미드 pAM33의 mvaS-mvaE 오페론을 벡터 pAM29에 삽입하여 발현 플라스미드 pAM34를 제조하였다. EcoRI 제한 효소를 사용하여 pAM33을 부분적으로 분해하고, MluI 제한 효소를 사용하여 상기 결과로 생성된 선형 DNA 단편을 분해한 다음, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하고, 약 3.6 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하여, mvaS-mvaE 오페론을 분리하였다. MluI 및 EcoRI 제한 효소를 사용하여 발현 벡터 pAM25를 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 약 2.1 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출함으로써, pAM29의 벡터 골격을 얻었다. 2개의 분리된 DNA 단편을 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM34가 제조되었다.
실시예 4
본 실시예에서는, 에스케리치아 콜라이로부터 유래하는 DXP 경로 효소를 포함하는 효소를 암호화하는 발현 플라스미드를 오페론의 형태로서 만드는 방법에 관하여 기술하고 있다.
"상행(top)" DXP 경로 효소를 암호화하는 유전자를 pAM29 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드 pAM408을 제조하였다. "상행" DXP 경로 효소로서는, 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 dxs 유전자에 의해 암호화됨), 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 리덕토이소머라제(에스케리치아 콜 라이의 dxr 유전자에 의해 암호화됨), 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispD 유전자에 의해 암호화됨), 그리고 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispE 유전자에 의해 암호화됨)를 포함하며, 이 효소들은 피루베이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트를, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트로 전환시킨다. PCR 프라이머(서열 번호 15∼18)를 사용하여, 최적의 샤인 달가노 서열과, 5' 및 3' 제한 효소 위치를 포함하는, 에스케리치아 콜라이 균주 DH1(ATCC #33849)으로부터 유래하는 유전자인 dxs의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 437539..439401), dxr(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 193521..194717), ispD(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 2869803..2870512), 및 ispE(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 1261249..1262100)를 PCR 증폭시켜, "상행" DXP 경로 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 제조하였다. PCR 생성물을 겔 전기 영동시켜 분석하여, 이를 키아젠(Valencia, CA)의 겔 정제 키트를 사용하여 겔로부터 추출한 다음, 적당한 제한 효소[XhoI 및 KpnI(dxs 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); KpnI 및 ApaI(dxr 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); ApaI 및 NdeI(ispD 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); NdeI 및 MluI(ispE 유전자를 포함하는 PCR 생성물용)]로 분해해 반응을 종결시킨 다음, 이를 키아젠(Valencia, CA)의 PCR 정제 키트로 정제하였다. 이후, 대략 동몰량의 PCR 생성물 각각을 결찰 반응물에 첨가하여, 각각의 유전자가 오페론으로 조립되도록 하였다. 이와 같은 결찰 반응물로부터, 1 ㎕의 반응 혼합물을 취한 다음, 이를 2개의 별도 유전자 카세 트 즉, dxs-dxr 및 ispD-ispE 유전자 카세트를 PCR 증폭시키는데 사용하였다. 프라이머 67-1A-C(서열 번호 15) 및 67-1D-C(서열 번호 18)를 사용하여 상기 dxs-dxr 유전자 카세트를 PCR 증폭시키고, 프라이머 67-1E-C(서열 번호 19) 및 67-1H-C(서열 번호 22)를 사용하여 ispD-ispE 유전자 카세트를 PCR 증폭시켰다. 상기 2개의 PCR 생성물을 겔 전기 영동시켜 분석하고, 겔로부터 추출하였다. XhoI 및 ApaI 제한 효소를 사용하여 dxs-dxr 유전자 카세트를 포함하는 PCR 생성물을 분해해 반응을 종결시키고, ApaI 및 MluI 제한 효소를 사용하여 ispD-ispE 유전자 카세트를 포함하는 PCR 생성물을 분해해 반응을 종결시킨 다음, 2개의 PCR 생성물을 정제하였다. SalI 및 MluI 제한 효소를 사용하여 벡터 pAM29를 분해해 반응을 종결시키고, "상행" DXP 경로 오페론을 함유하는 2개의 분해된 PCR 생성물을 pAM29 벡터의 SalI MluI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM408가 제조되었다(플라스미드 맵에 관하여는 도 4 참조).
"하행(bottom)" DXP 경로 효소를 암호화하는 유전자를 pAM369 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드 pAM409를 제조하였다. 상기 "하행" DXP 경로 효소로서는 2C-메틸-D-에리트리톨-2,4-사이클로디포스페이트 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispF 유전자에 의해 암호화됨), 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispG 유전자에 의해 암호화됨), 및 이소펜테닐/디메틸알릴 디포스페이트 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispH 유전자에 의해 암호화됨)를 포함하는데, 이들 효소는 모두, 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트를 IPP와 DMAPP로 전환한다. IPP는 또한, 이소펜테닐 디포스페이트 이성화 효소(에스케리치아 콜라이의 idi 유전자에 의해 암호화됨)의 활성에 의해 DMAPP로 전환된다. DMAPP는 또한 파네실 디포스페이트 합성 효소(에스케리치아 콜라이의 ispA 유전자에 의해 암호화됨)의 활성을 통해 FPP로 전환될 수도 있다. 최적의 샤인 달가노 서열과, 5' 및 3' 제한 효소 위치를 포함하는, 에스케리치아 콜라이 균주 DH1(ATCC #33849)로부터 유래하는 ispF(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 2869323..2869802), ispG(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 2638708..2639826), ispH(유전자 은행 등록 번호: U00096 영역: 26277..27227), idi(유전자 은행 등록 번호: AF119715), 및 ispA(유전자 은행 등록 번호: D00694 영역: 484..1383) 유전자를 PCR 증폭하여(적당한 PCR 프라이머 사용함), "하행" DXP 경로 효소와, 이소펜테닐 디포스페이트 이성화 효소, 그리고 파네실 디포스페이트 합성 효소를 암호화하는 오페론을 제조하였다. 상기 PCR 생성물을 겔 전기 영동법에 의해 분석하여, 이를 겔로부터 추출하고, 적당한 제한 효소[BamHI 및 ApaI(ispF 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); KpnI 및 ApaI(ispG 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); SalI 및 KpnI(ispH 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); SalI 및 HindIII(idi 유전자를 포함하는 PCR 생성물용); HindIII 및 NcoI(ispA 유전자를 포함하는 PCR 생성물용)]로 분해한 다음, 정제하였다. 이후, 대략 동 몰량의 PCR 생성물 각각을 결찰 반응물에 첨가하여, 각각의 유전자들을 오페론으로 조립시켰다. 이와 같은 결찰 반응물로부터, 반응 혼합물 1 ㎕를 취하고, 이를 사용하여 2개의 별도 유전자 카세트 즉, ispF-ispG 및 ispH-idi-ispA 유전자 카세트를 PCR 증폭하였다. 프라이머 67-2A-C(서열 번호 23) 및 67-2D-C(서열 번호 26)를 사용하여, 상기 ispF-ispG 유전자 카세트를 PCR 증폭시키고, ispH-idi-ispA 유전자 카세트는 프라이머 67-2E-C(서열 번호 27) 및 67-2J-C(서열 번호 32)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 상기 2개의 PCR 생성물을 겔 전기 영동법에 의해 분석하고, 이를 겔로부터 추출하였다. 상기 ispF-ispG 유전자 카세트를 포함하는 PCR 생성물을 BamHI 및 KpnI 제한 효소를 이용하여 분해해 반응을 종결시키고, ispH-idi-ispA 유전자 카세트를 포함하는 PCR 생성물은 KpnI 및 NcoI 제한 효소를 사용하여 분해해 반응을 종결시킨 다음, 상기 2개의 PCR 생성물을 정제하였다. 올리고뉴클레오티드-생성 lacUV5 프로모터를 이용하여, pAM29의 p15A 복제 기원과 암피실린 내성에 대한 베타-락타마제 유전자(pZE12-luc 유래; Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210)를 조립하여 벡터 pAM369를 제조하였다. BamHI 및 NcoI 제한 효소를 사용하여 벡터 pAM369을 분해해 반응을 종결시키고, "하행" DXP 경로 오페론을 포함하는 분리된 PCR 생성물 2개를 pAM369 벡터의 BamHI NcoI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM409가 제조되었다.
pAM409의 lacUV5 프로모터와 ispFGH-idi-ispA 오페론을, pAM257 벡터로 옮겨, 숙주와의 혼화성 범위가 넓은 발현 플라스미드 pAM424 즉, 발현 플라스미드 pAM409의 유도체를 제조하였다. 벡터 pAM257를 다음과 같이 제조하였다: 프라이머 9-156A(서열 번호 33) 및 9-156B(서열 번호 34)를 사용하여, RK2 플라스미드 DNA로부터 RK2 par 위치를 PCR 증폭시키고[Meyer외 다수 (1975) Science 190: 1226-1228], AatII 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 2.6 kb의 PCR 생성물을 분해해 반응을 종결시킨 다음, 이 DNA 단편을, 벡터 pZA31-luc[Lute and Bujard (1997) Nucl Acids Res 25:1203-1210]로부터 유래하는 p15 복제 기원과 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 플라스미드에 결찰한 결과, pAM37-par가 제조되었다; 이 pAM37-par를 제한 효소인 SacI 및 HindIII를 이용하여 분해해 반응을 종결시키고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동법에 의해 분석하였으며, RK2 par 위치와 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 미니-RK2 레플리콘 pRR1O의 SacI HindIII 위치에 결찰한 결과[Roberts외 다수 (1990) J Bacteriol. 172:6204-6216], 벡터 pAM133이 제조되었다; BgIII 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 이 pAM133를 분해해 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 암피실린 내성 유전자가 결여된, 약 6.4 kb의 DNA 단편이 제조되었으며, oriT 접합 기원도 겔로부터 추출해내고, 합성에 의해 생산된, PciI 및 XhoI 제한 효소 위치를 함유하는 다중 클로닝 위치를 포함하는 DNA 단편과, 분리된 DNA 단편을 결찰한 결과, 벡터 pAM257이 제조되었다. XhoI 및 PciI 제한 효소를 이용하여, 발현 플라스미드 pAM409를 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, 겔로부터 약 4.4 kb의 DNA 단편을 추출하였다. 제한 효소 XhoI 및 PciI를 사용하여 벡터 pAM257을 분해해 반응을 종결시키고, lacUV5 프로모터와 ispFGH-idi-ispA 오페론을 함유하는 분리된 DNA 단편을 pAM257 벡터의 XhoI PciI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM424가 제조되었다(플라스미드 맵에 관하여는 도 5 참조).
실시예 5
본 실시예는 FPP 또는 GPP를 전환시키는 효소를 암호화하는 발현 플라스미드 를 제조하는 방법에 관하여 기술하고 있다.
아모르파-4,11-디엔 합성 효소("ADS")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을, 벡터 pTrc99A에 삽입하여, 발현 플라스미드 pTrc99A-ADS를 제조하였다. 상기 아모르파-4,11-디엔 합성 효소 서열을 합성하여 제조하고, 이 서열을 번역하여 문헌[Merke외 다수 (2000) Ach Biochem Biophys 381:173-180]에 개시된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 합성하였으며, 상기 아모르파-4,11-디엔 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 에스케리치아 콜라이 내에서 발현되기 적당하도록 만들었으며, 상기 뉴클레오티드 서열에는 5' NcoI 및 3' XmaI 제한 효소 위치가 측접하도록 만들었다[미국 특허 제7,192,751호 참조]. NcoI 및 XmaI 제한 효소를 이용하여 상기 뉴클레오티드 서열을 분해해 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하고, 이 겔로부터 약 1.6 kb의 DNA 단편을 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 pTrc99A 벡터의 NcoI XmaI 제한 효소 위치에 삽입한 결과[Amman외 다수 (1985) Gene 40:183-190], 발현 플라스미드인 pTrc99A-ADS가 제조되었다[플라스미드 맵에 관하여는 도 6 참조].
발현 플라스미드 pAM113은 pTrc99A-ADS의 클로람페니콜-내성 유도체이다. 5'-인산화 프라이머 19-137 cml-pAM37-AS(서열 번호 35) 및 19-137 cml-pAM37-S(서열 번호 36)을 이용하여, 벡터 pZA31-luc[Lute and Bujard (1997) Nucl Acids Res 25:1203-1210]로부터 유래하는 클로람페니콜 내성 유전자를 PCR 증폭시키고, 920 bp PCR 생성물을 발현 플라스미드 pTrc99A-ADS의 FspI 제한 효소 위치에 삽입한 결과, 발현 플라스미드인 pAM113이 제조되었다.
nudF 유전자의 암호화 서열과 상류 게놈 서열(유전자 은행 등록 번호: Z99116 영역: 49364..48548)을 포함하는 바실러스 서브틸리스 6051의 게놈 DNA 단편을 벡터 pTrc99A에 삽입하여, 발현 플라스미드 pC9를 제조하였다[Amann외 다수 (1988) Gene 69:301-315]. 바실러스 서브틸리스 6051 nudF 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: Z99116 영역: 49105..48548)을 벡터 pTrc99A에 삽입하여, 발현 플라스미드 pNudF-H를 제조하였다. 바실러스 서브틸리스 6051 yhfR 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: Z99109 영역: 97583..97002)을 벡터 pTrc99A에 삽입하여, 발현 플라스미드 pyhfR을 제조하였다.
아르테미시아 아누아의 β-파네센 합성 효소("FSB")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(유전자 은행 등록 번호: AY835398) 즉, 에스케리치아 콜라이 내에서 발현되기에 최적인 코돈을 pTrc99A 벡터에 삽입하여, 발현 플라스미드 pAM373을 제조하였다. β-파네센 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 합성에 의해 제조하고, PCR(적당한 프라이머 사용)하여 이것의 DNA 합성 구조물로부터 이를 증폭시켰다. β-파네센 합성 효소 암호화 서열을 포함하는 PCR 생성물에 리더 NcoI 제한 효소 위치를 만들기 위해, 원래의 폴리펩티드 서열 내에 제2의 아미노산을 암호화하는 코돈(세린을 암호화하는 TCG)을, 5' PCR 프라이머(서열 번호 37) 내 아스파르트산을 암호화하는 코돈(GAC)으로 치환하였다. 결과로 생성된 PCR 생성물을 NcoI 제한 효소를 이용하여 부분적으로 분해하고, SacI 제한 효소를 이용하여 분해해 반응을 종결시킨 다음, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법으로 분석하여, β-파네센 합성 효소 암호화 서열을 포함하는, 약 1.7 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 후, 분리된 DNA 단편을 pTrc99A 벡터의 NcoI SacI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pAM373이 제조되었다[플라스미드 맵에 관하여는 도 6을 참조하시오].
α-파네센 합성 효소("FSA"), γ-테르피넨 합성 효소("GTS"), α-피넨 합성 효소("APS") 또는 테르피놀렌 합성 효소("TS")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 pTrc99A 벡터에 삽입하여, 발현 플라스미드 pTrc99A-FSA, pTrc99A-GTS, pTrc99A-PS, pTrc99A-TS를 제조하였다. 주형으로서는 예를 들어, 피세아 에이비스의 α-파네센 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY473627, 영역: 24..1766), 아르테미시아 아누아의 β-파네센 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY835398), 사이트러스 리몬의 γ-테르피넨 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF514286 영역: 30..1832), 에이비스 그랜디스의 α-피넨 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: U87909, 영역: 6..1892) 또는 파이너스 타에다의 α-피넨 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF543530 영역: 1..1887), 또는 오시뮴 바실리쿰의 테르피놀렌 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY693650), 또는 슈도츄가 멘지에시의 테르피놀렌 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY906866 영역: 10..1887) 또는 에이비스 그랜디스의 테르피놀렌 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF139206)을 사용하여, 상기 DNA 단편 삽입물을 합성하였는데, 이때, 상기 모든 뉴클레오티드 서열은 에스케리치아 콜라이 내에서 발현되기에 최적인 코돈이다. FSA 에 대한 DNA 단편을, 그것의 DNA 합성 구조물로부터 PCR에 의해 증폭하였으며, 이대 사용된 프라이머 서열은 서열 번호 39의 서열과 서열 번호 40의 서열이었다. NcoI 및 SacI 제한 효소를 이용하여, 결과로 생성된 PCR 생성물을 분해해 반응을 종결시키고, 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법에 의해 분석하여, α-파네센 합성 효소 암호화 서열을 포함하는, 약 1.7 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출하였으며, 상기 분리된 DNA 단편을 pTrc99A 벡터의 NcoI SacI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pTrc99A-FSA가 제조되었다[플라스미드 맵에 관하여는 도 6 참조]. GTS, APS 및 TS에 대한 DNA 단편에 리더 XmaI 제한 효소 위치 및 말단 XbaI 제한 효소 위치가 측접하도록 상기 DNA 단편을 디자인하고, 이를 클로닝 벡터 예를 들어, 표준 pUC 또는 pACYC 기원 벡터의 혼화성 제한 효소 위치에 클로닝하였는데, 이때, XbaI 및 XmaI 제한 효소를 사용하여 DNA 합성 구조물을 분해해 반응을 종결시키고, 이 반응 혼합물을 겔 전기 영동법에 의해 분석한 다음, 1.7∼1.9 테르펜 합성 효소 암호화 DNA 단편을 겔로부터 추출하여, 상기 DNA 단편을 다시 분리하였다. 분리된 DNA 단편을 벡터 pTrc99A의 XmaI XbaI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과[Amman외 다수 , Gene 40:183-190 (1985)], 플라스미드 pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS 또는 pTrc99A-TS가 제조되었다[플라스미드 맵에 관하여는 도 6 참조].
α-파네센 합성 효소("FSA") 또는 β-파네센 합성 효소("FSB")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 pRS425-Gal1 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드 pRS425-FSA 및 pRS425-FSB를 제조하였다[Mumberg et. al. (1994) Nucl Acids Res 22(25): 5767-5768]. 주형으로서 예를 들어, 피세아 에이비스의 α-파네센 합성 효소 유전 자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY473627, 영역: 24..1766), 아르테미시아 아누아의 β-파네센 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AY835398), 그리고 사카로마이세스 세레비지아에 내에서 발현되기 적합한 코돈을 사용하여, 뉴클레오티드 서열 삽입물을 합성하였다. 합성된 뉴클레오티드 서열에 5' BamHI 위치 및 3' XhoI 위치를 측접시켜, 이를 클로닝 벡터 예를 들어, 표준적인 pUC 또는 pACYC 기원 벡터의 혼화성 제한 효소 위치에 클로닝하였다. BamHI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 DNA 합성 구조물을 분해해 반응을 종결시켜, 합성된 뉴클레오티드 서열을 분리하였다. 반응 혼합물을 겔 전기 영동으로 분석하고, α-파네센 합성 효소 또는 β-파네센 합성 효소 암호화 서열을 포함하는, 약 1.7 kb의 DNA 단편을 겔로부터 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 pRS425-Gal1 벡터의 BamHI XhoI 제한 효소 위치에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드 pRS425-FSA 또는 pRS425-FSB가 각각 제조되었다.
리날룰 합성 효소("LLS"), 리모넨 합성 효소("LMS"), β-피넨 합성 효소("BPS"), β-펠란그렌("PHS"), 카렌 합성 효소("CS") 또는 사비닌 합성 효소("SS")를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 pTrc99A 벡터에 삽입하여, 발현 플라스미드 pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-CS 및 pTrc99A-SS를 제조하였다. 주형으로서 예를 들어, 아르테미시아 아누아의 리날룰 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF154124, 영역: 13.. 1764), 에이비스 그랜디스의 리모넨 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF006193 영역: 73..1986), 아르테미시아 아누아의 β-피넨 합성 효소 의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF276072 영역: 1..1749), 에이비스 그랜디스의 β-펠란드렌 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF139205 영역: 34..1926), 살비아 스테노필라의 카렌 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF527416 영역: 78..1871), 또는 살비아 오피시날리스의 사비넨 합성 효소 유전자의 암호화 서열(유전자 은행 등록 번호: AF051901 영역: 26..1798)을 사용하여, 상기 뉴클레오티드 서열 삽입물들을 합성하였다. β-피넨, 사비닌 및 β-펠란드렌 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에, 리더 XmaI 제한 효소 위치와 말단 XbaI 제한 효소 위치가 측접하도록 만들고, 리날룰과 카렌 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는, 리더 NcoI 제한 효소 위치와 말단 XmaI 제한 효소 위치가 측접하도록 만들고, 리모넨 합성 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 리더 NcoI 제한 효소 위치와 말단 PstI 제한 효소 위치가 측접하도록 만들었다. XmaI 및 XbaI(β-피넨, 사비닌 및 β-펠란드렌 합성 효소 구조물용)를 사용하거나, NcoI 및 XmaI 제한 효소(리날룰 및 카린 합성 효소용), 또는 XbaI 및 PstI 제한 효소(리모넨 합성 효소 구조물용)를 사용하여, DNA 합성 구조물을 분해해 반응을 종결시켰다. 상기 반응 혼합물을 겔 전기 영동법에 의해 분석하고, 이 겔로부터 약 1.7∼1.9 kb인 DNA 단편을 추출한 다음, 분리된 DNA 단편을 pTrc99A 벡터의 XmaI XbaI 제한 효소 위치(β-피넨, 사비닌 및 β-펠란드렌 합성 효소 구조물용), NcoI XmaI 제한 효소 위치(리날룰 및 카렌 합성 효소 삽입물용), 또는 XbaI PstI 제한 효소 위치(리모넨 합성 효소 삽입물용)에 결찰시킨 결과, 발현 플라스미드인 pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-CS, 및 pTrc99A-SS가 제조되었다[플라스미드 맵에 관하여는 도 6 참조].
실시예 6
본 실시예는 본 발명에 유용한 에스케리치아 콜라이 숙주 균주를 생산하는 방법에 관하여 기술하고 있다.
이하 표 1에 자세히 나열되어 있는 바와 같이, 숙주 균주는 화학적으로 수용성인 에스케리치아 콜라이 모 세포를, 하나 이상의 발현 플라스미드(실시예 1∼실시예 5의 플라스미드)를 사용하여 화학적으로 형질 전환하여 생산되었다.
Figure 112012035378799-pct00054
삭제
숙주 세포 형질 전환체를, 표 1에 나열한 항생제를 포함하는 루리아 버토니(Luria Bertoni; LB) 아가 상에서 선별하였다. 하나의 콜로니 군체를 상기 LB 아가에서 LB 액체 배지 5 ㎖와 항생제를 함유하는 배양 튜브로 옮겼다. B003, B617, B618, B619, B650, B651, B652 및 B653 숙주 세포 형질 전환체를 회전식 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 30시간 동안 항온 처리하였다. 기타 숙주 세포 형질 전환체 전부를 정상 상태에 도달할 때까지 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 상기 세포를 0.8% 글루코스와 항생제를 함유하는 M9-MOPS 배지에서 4∼5회 연속 계대 배양함으로써 최소 배지에 이 세포를 적응시켰다(M9-MOPS 배지의 조성에 관하여는 표 2 참조). 이 세포를, 400 uL의 멸균 글리세롤(50%)과 600 uL의 액체 배양액으로 이루어진 스톡 분취액 1 ㎖가 담긴 동결 시험관 내에 보관하였다(-80℃).
Figure 112008083397046-pct00027
실시예 7
본 실시예는, 항생제가 존재하지 않을 때, RK2 플라스미드 복제 시스템, 분리 시스템 및 유지 시스템을 포함하는 발현 플라스미드를 보유하는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서의 발현 플라스미드의 안정성에 관하여 기술하고 있다.
균주의 스톡 분취액을 125 ㎖의 플라스크(40 ㎖ M9-MOPS, 2% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제(표 1 참조) 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 숙주 균주 B255의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD60O 값이 약 0.05일 때, 상기 종균 배양액을 각각 40 mL M9-MOPS 배지, 2% 글루코스 및 0.5% 효모 추출물을 함유하는 250 ㎖들이 플라스크 2개에 접종하였다. 1번 배양액은 또한 100 ug/㎖ 카베니실린 및 34 ug/㎖ 클로람페니콜을 함유하였다. 2번 배양액은 어떠한 항생제도 포함하지 않았다. 상기 2개의 배양액의 OD60O값이 약 0.2(즉, 40 uL의 1M IPTG를 배양 배지에 첨가함으로써 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔 생산이 유도되는 시점)가 될 때까지, 상기 양 배양액들을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 상기 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도되었을 때, 이 배양액을 유기 상층 8 ㎖로 덮어, 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 총 72 시간 동안 시료를 주기적으로 취하였다. 2개의 배양액 중에서 숙주 균주에 의해 아모르파-4,11-디엔이 생산되었는지 여부를 GC/MS로 확인하였다(실시예 10 참조).
2개의 세포 배양액 중 플라스미드의 안정성을 평가하기 위하여, 72 시간 경과시 각 배양액 시료를 분리하고, 이를 LB 아가 평판(항생제 불포함)상에 조흔(streak)하였다. 37℃에서 밤새도록 항온 처리한 후, 각각의 배양액으로부터 얻은 50개의 각 콜로니들을 항생제(34 ug/㎖ 클로람페니콜, 100 ug/㎖ 카베니실린) 함유 LB 아가 평판과, 항생제 불포함 LB 아가 평판(무 항생제) 상에 복제 도말하였다. 37℃에서 다시 밤새도록 항온 처리한 다음 분석해 본 결과, 상기 항생제 포함 LB 아가 평판과 항생제 불포함 LB 아가 평판은 약 50개의 콜로니들을 포함하는 것으로 확인되었는데, 이는 곧, 배양 배지 중에 항생제를 포함하든 포함하지 않든간에, 플라스미드 보유율은 약 100%임을 말해주는 것이다.
실시예 8
본 실시예는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서, 엔테로코커스 패칼리스 HMGR의 비 활성과 안정성이, 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR의 비 활성과 안정성에 비하여 우수함을 입증하는 것이다.
20 ㎖의 M9-MOPS 배지, 0.8% 글루코스 그리고 항생제(표 1 참조)를 함유하는 125 ㎖들이 플라스크에 각각의 균주의 스톡 분취액을 첨가하고, 이 배양액을 포화 상태가 될 때까지 생육시켜, 숙주 균주 B61 및 B62의 종균 배양액을 확립하였다. 종균 배양액을, 500 ㎖들이 플라스크 내 신선한 배지 140 ㎖에서 1:100으로 희석하고, 이를 다시 OD550이 약 0.1이 될 때(즉, 140 uL 1 M IPTG를 각각의 배양액에 첨가하여 아모르파-4,11-디엔의 생산을 유도하는 시점)까지 생육시켰다. 상기 유도 후 4, 12, 20, 28, 36 및 49 시간 경과시, 시료를 각각의 배양액으로부터 분리하고, 세포를 원심 분리에 의해 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 드라이 아이스 상에서 스냅 동결(snap frozening)시킨 다음, 이를 -80℃에 보관하였다.
효소 검정법을 수행하기 위하여, 세포 펠릿을 얼음 상에서 해동시킨 다음, 버그버스터(Bugbuster; Novagen, Madison, WI) 함유 단백질 분해 효소 억제제 혼합물#3(Calbiochem, San Diego, CA), 벤조나제(20 μL oer5 mL 버그버스터; Novagen, Madison, WI) 그리고 라이소자임(30 ug/㎖)을 사용하여 용해하였다. 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR의 효소 활성을 50 mM Tris HCl(pH7.5), 0.2 mM NADPH(Sigma, St. Louis, MO) 및 0.3 mM DL-3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 나트륨 염(Sigma, St. Louis, MO) 중에서 분석하였다. 세포 용해물을 첨가하여 분석을 시작하였으며, 이때, 34O㎚의 흡광도를 통해 NADPH가 사라지는 것을 알 수 있었다. NADPH가 비 특이적으로 사라지는 것에 대해 규명하기 위해, HMG-CoA를 사용하지 않은 대조군 검정법에서 얻은 결과들은 테스트 시료에서 얻은 결과에서 공제하였다. 엔테로코커스 패칼리스 HMGR의 효소 활성을 상기와 유사하게 측정하였는데, 다만, 이 경우, 검정 완충액은 100 mM의 인산칼륨 완충액(pH6.5), 0.4 mM NADPH, 1.0 mM EDTA, 및 100 mM KCl을 함유하였다.
브래드포드[Bradford, (1976) Anal Biochem. 72:248-254]의 방법에 따라서 단백질을 분석하였다. 비 활성을 Δnmol NADPH/분/mg 단백질로서 계산하였다.
도 8에 도시한 바와 같이, 엔테로코커스 패칼리스 HMGR의 비 활성과 안정성은, 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR의 비 활성과 안정성에 비하여, 더욱 크고 또한 증가하였다.
실시예 9
본 실시예는, 건조 세포 중량(dry cell weight; "DCW")을 OD600에서 측정하는 방법에 대해 기술하고 있다.
DCW 및 OD600 사이의 관계를 구하기 위해, 각각의 균주 B32를, 실시예 10∼14에 기술된 바와 유사한 고 세포 밀도 방법으로 생육시켰다. 방법을 수행하면서 시료를 취하고, 각 시료에 대해 OD600 및 DCW를 측정하였다. DCW를 측정하기 위하여, 세포를 펠릿으로 만들고, 상청액은 버렸다. 세포 펠릿을 물로 1회 세척하고 나서, 3일 이상의 기간 동안 80℃의 오븐에서 건조시켰다. 세포 펠릿을 함유하는 튜브를 측량하고, 이 튜브의 중량을 측정된 중량으로부터 공제한 다음, 나머지 중량을 각 시료의 초기 부피(0.0015 ℓ)로 나누어, DCW를 구하였다.
도 9는, 이 실험에서 측정된 DCW와 OD600 사이의 관계를 나타내는 것이다.
실시예 10
본 실시예는, 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR과 HMGS을 발현하는 숙주 균주에 비하여, 스타필로코커스 아우레우스 HMGR과 HMGS를 발현하는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서 아모르파-4,11-디엔이 더욱 많이 생산되는 것을 입증하는 것이다.
각각의 균주 B32, B153, B210, B282, B292, B86, B255 및 B256의 스톡 분취액을 별도의 125 ㎖들이 플라스크(25 ㎖ M9-MOPS 배지, 0.8% 글루코스 및 항생제(표 1 참조) 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 상기 숙주 균주의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD60O이 약 0.05일 때, 종균 배양액을 40 ㎖ M9-MOPS 배지, 2% 글루코스 및 항생제를 함유하는 250 ㎖들이 별도 플라스크에 접종하였다. 상기 배양액의 OD600이 약 0.2에 도달할 때(즉, 40 uL의 1M IPTG를 상기 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도되는 시점)까지, 상기 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 이 배양액을 유기 상층(예를 들어, 도데칸, 올레산메틸 또는 이소프로필 미리스테이트) 8 ㎖로 덮었다. 유기 상층의 시료와 발효액을 72시간 동안 하루에 한번 채취하였다. 발효액 시료를 사용하여 OD600 값을 측정하였다. 유기 상층 5 uL를 깨끗한 유리 바이알(500 uL 아세트산에틸 함유, 베타- 또는 트랜스-카리오필렌을 내부 표준으로 함)에 옮겨, 아모르파-4,11-디엔의 농도를 측정하였다.
단지 2개의 이온, 분자 이온(204 m/z) 및 189 m/z 이온에 대해서만 스캐닝하여, 유기 상층/아세트산에틸 시료를 휴렛-팩커드 6890 기체 크로마토그래피/질량 분광 분석기(GC/MS) 상에서 분석하였다[Martin외 다수 (2001) Biotechnol. Bioeng. 75:497-503]. 분석 시간을 단축하기 위하여, 온도 프로그램과 컬럼 매트릭스를 변경하여, 피크 해상도를 최적으로 만들고, 총 실행 시간도 최단으로 만들었다. 1 uL의 시료를 DB-XLB 컬럼(Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)과 헬륨 담체 기체를 사용하는 GC 상에서 분리하였다. 분석용 온도 프로그램은 다음과 같았다: 100℃, 0.75분, 분당 60℃→300℃로 상승, 300℃에서 0.5분간 방치. 분석된 시료를, 이온 189 및 204 m/z에서 관찰하는, 휴렛-팩커드 모델 5973 질량-선택 검출기로 분석하였다. 이전의 질량 스펙트럼을 통하여, 아모르파-4,11-디엔 합성 효소 생성물은 아모르파-4,11-디엔이고, 아모르파-4,11-디엔의 체류 시간(GC 프로토콜에 의해 측정함)은 3.7분이었음을 알 수 있었다. 베타- 또는 트랜스-카리오필렌을 정량을 위한 내부 표준으로 사용하였다. 내부 표준 대 아모르파-4,11-디엔 피크 표면적[카리오필렌-스파이킹 아세트산 에틸 중 정제된 아모르파-4,11-디엔(0.63∼10 ㎎/ℓ의 KJF17-109-3)의 정량 곡선을 기준으로 함]을 바탕으로 하여, 아모르파-4,11-디엔의 역가를 계산하였다.
도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스의 HMGR 및 HMGS를 발현한 균주 B153 및 B282는, 사카로마이세스 세레비지아에 tHMGR 및 HMGS를 발현한 균주 B32, B210, B255, B256 및 B292에 비하여, 아모르파-4,11-디엔을 높은 수준으로 생산하였다.
실시예 11
본 실시예는 차선의 온도에서 생육한 에스케리치아 콜라이 숙주 세포에 의해 아모르파-4,11-디엔이 더욱 많이 생산됨을 입증하고 있다.
균주의 스톡 분취액 0.5 ㎖를, 50 ㎖의 M9-MOPS 배지와 항생제(표 1 참조)를 함유하는 250 ㎖ 들이 플라스크에 첨가하고, 이 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 밤새도록 생육시켜, 숙주 균주 B32의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD60O이 약 0.05일 때, 250 ㎖들이 플라스크 4개(각각의 플라스크는 40 ㎖의 발효조 회분 배지(배지의 조성에 관하여는 표 3 참조), 100 mM MOPS 완충액(pH 7.1) 및 항생제를 함유함)에 종균 배양액을 접종하였다. 상기 배양액의 OD60O이 0.18→0.22가 될 때(즉, 40 uL의 1M IPTG를 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도될 때)까지, 이 배양액을 회전식 진탕기(250 rpm, 30℃ 또는 37℃)에서 항온 처리하였다. 상기 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도될 때, 이 배양액을 유기 상층 8 ㎖로 덮어, 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 시료를 하루에 한번씩 채취하고, 이를 실시예 10에 기술된 바와 같이 분석하였다.
도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, 30℃에서 발효를 진행시켰을 경우, 세포 생장에는 아무런 영향을 미치지 않았으나, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주에 의한 아모르파-4,11-디엔의 비 생산 수준은 약 50% 정도 증가하였다.
실시예 12
본 실시예는, 제한된 탄소 공급 조건 하에서 생육된 에스케리치아 콜라이 숙주 균주에 의해 아모르파-4,11-디엔의 생산 수준이 증가함을 입증하는 것이다.
0.25 uL의 균주 스톡 분취액을, 50 ㎖의 M9-MOPS 배지 및 항생제(표 1 참조)를 함유하는 250 ㎖들이 플라스크에 첨가하고, OD600 값이 1→2로 도달할 때까지, 이 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 항온 처리하여, 발효(실시 번호 050608-1 및 050629-1)용 숙주 균주 B32의 종균 배양액을 확립하였다.
균주의 스톡 분취액을 250 ㎖ 들이 플라스크(50 ㎖의 M9-MOPS 배지 및 항생제(표 1) 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 최전식 진탕기(37℃, 250rpm)에서 밤새도록 항온 처리하여, 발효(실시 번호 060403-3)용 숙주 균주 B32의 종균 배양액을 확립하였다. 초기 OD600이 약 1일 때, 각각의 종균 배양액을, 250 ㎖들이 플라스크(40 ㎖의 M9-MOPS 배지 및 항생제 포함)에 접종하고, OD600이 3→5가 될 때까지, 이 배양액을 다시 회전식 진탕기(37℃, 250rpm)에서 항온 처리하였다.
모든 발효 공정에 있어서, 생물 반응기(ADI 1010 제어기 장착 2L 어플리콘 바이오콘솔(Applikon Bioconsole) ADI 1025s; Applikon Biotechnology, Foster City, CA)에서 KH2PO4, K2HPO43H2O, EDTA, 시트르산 및 (NH4)2SO4를 가열 살균하였다. 나머지 배지 성분들을 스톡 용액으로서 여과 멸균하고, 이를 헤드플레이트(headplate)를 통해 주입하였다. 표 3은 발효(실시 번호 050608-1 및 050629-1)에 대한 최종 배지 조성을 나타낸 것이다. 표 4는 발효(실시 번호 060403-3)에 대한 최종 배지 조성을 나타낸 것이다. 실시 번호 050608-1의 출발 부피는 0.8 ℓ였으며, 실시 번호 050629-1의 출발 부피는 1.2 ℓ였고, 실시 번호 060403-3의 출발 부피는 1 ℓ였다. 모든 발효 실시액에는 헤드플레이트를 통하여 50 ㎖의 종균 배양액을 접종하였다.
Figure 112008083397046-pct00028
Figure 112008083397046-pct00029
발효 실시액 050608-1(과량의 탄소 포함)에 있어서, 유도시 공급을 개시하였으며, 공급 속도는 수동으로 맞추어, 도 12c에 나타낸 농도로 글루코스가 제공되도록 하였다. 발효 실시액 050629-1(탄소-제한)에 있어서, 공급액을 표 5에 나타낸 프로토콜에 따라서 발효조에 공급하였다. 발효 실시액 060403-3(탄소 농도가 가장 낮음)에 있어서, 초기의 글루코스 볼루스(15 g)가 전부 소모되고, 용해 산소가 스파이킹될 때, 공급액을 자동으로 공급하기 시작하였다. 최대 27.6 g/hr가 되었을 때, 다음의 등식에 따라서 공급 속도를 계산하였다.
Figure 112008083397046-pct00030
[상기 식 중, t0는 초기 글루코스가 전부 소모되는 시간임]. 최대 속도에 도달하였을 때, 글루코스 공급 속도를 9.5 g/hr로 제한하고, 실시액의 나머지는 이 속도로 유지하면서 공급하였다.
Figure 112008083397046-pct00031
발효 실시액 050608-1 및 050629-1을 37℃에서 수행하였다. 생물 반응기 내 기류는 1∼2 ℓ/분으로 설정하고; pH는 수산화암모늄 및/또는 수산화나트륨을 이용하여 7로 유지시켰으며; 초기 교반 속도는 500∼600 rpm으로 하고; 거품은 소포제 B(Sigma-Aldich, St. Louis, MO)로 억제하고; 용해 산소 수준은 교반 케스케이드를 이용하여 30% 이상으로 유지시켰다. 5∼6시간 동안 배양한 다음, 0.8 ㎖의 1 M IPTG를 실시액 050608-1에 첨가하고, 1.2 ㎖의 IPTG를 실시액 050629-1에 첨가하여, 숙주 세포에 의한 아모르파-4,11-디엔의 생산을 유도하였다. 유도시, 배양 온도는 30℃로 낮추었다.
실시액 060403-3을 30℃에서 발효시켰다. 생물 반응기 내 기류는 1∼2 ℓ/분으로 설정하고; pH는 수산화암모니아를 이용하여 7로 유지시켰다. 교반 케스케이드와 산소 증량을 통하여 용해 산소 수준을 30% 이상으로 유지시켰다. OD60O 값이 약 28일 때(접종 후 19시간 경과시), 1 ㎖의 1 M IPTG를 첨가하여, 숙주 세포에 의한 아모르파-4,11-디엔의 생산을 유도하였다.
2개의 상이한 프로토콜에 따라서, 아모르파-4,11-디엔을 포집하여 추출하였다. 실시액 050608-1 및 050629-1에 있어서, 배출-기체 중에 존재하는 휘발성 아모르파-4,11-디엔은 기체 세척기(gas-washer)(200 ㎖의 헵타놀 함유)를 통해 상기 배출 기체를 배기시킴으로써 포집하였다. 이후, 시료 중 상기 아모르파-4,11-디엔 농도가 0.63 ∼ 20 ㎎/ℓ가 될 때까지, 상기 헵타놀을 아세트산에틸로 희석하였다. 실시액 060403-3에 있어서, 유도가 일어날 때, 200 ㎖의 유기 상층을 발효조에 첨가하여, 아모르파-4,11-디엔을 생물 반응기 내에서 포집하였다. 25 uL 발효액과 유기 상층(975 uL 아세토니트릴 포함)을 합한 후, 이 시료를 피셔 보텍스 제니 2™(Fisher Vortex Genie 2™) 혼합기(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY)에서 최대 속도로 3분 이상 동안 진탕시킨 다음, 원심 분리에 의해 시료로부터 세포를 제거하고, 아모르파-4,11-디엔의 시료 중 농도가 0.63∼20 ㎎/ℓ가 될 때까지 아세토니트릴 용액을 아세트산에틸로 희석하여, 생산물의 농도를 측정하였다. 실시예 10에 기술한 바와 같이, GC/MS를 사용하여 상기 아세트산에틸 시료를 분석하였다.
도 12a 및 12b에 도시한 바와 같이, 발효 실시액 050608-1(과량의 탄소 포함)에서는 최대 세포 밀도와 아모르파-4,11-디엔의 생산 수준이 각각 낮았는데, 그 이유는, 아세트산염 수준이 비교적 신속하게 증가하는 것과 적어도 부분적으로나마 관련되어 있다(도 12d). 이와는 대조적으로, 발효 실시액 050629-1(탄소-제한)에서는 아모르파-4,11-디엔의 생산 수준이 증가하였으며(도 12b), 아세트산염 생산 개시 시점은 지연되었다. 이와 같은 결과는, 과량의 글루코스가 공급되면 아세트산염이 신속하게 생산되고 세포가 조기에 사멸한다는 가설과 일치하는 것이다.
발효 실시액 060403-3(탄소 농도가 최저)에 추가로 글루코스를 제한한 결과, 100시간 이상 동안 아세트산염의 생산 수준이 낮았으며(도 12d), 최대 세포 밀도와 아모르파-4,11-디엔 생산 수준은 상당히 높았다(도 12a 및 12b).
실시예 13
본 실시예는 탄소 공급을 제한하고, 차선의 온도에서 생육된 에스케리치아 콜라이 숙주 균주에 의한 아모르파-4,11-디엔의 생산 수준이 증가함을 입증하는 것이다.
균주의 스톡 분취액을 250 ㎖들이 플라스크(50 ㎖ M9-MOPS 배지 및 항생제(표 1 참조) 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 생육시켜, OD600이 3.5→4.5가 되도록 하여, 숙주 균주 B153의 종균 배양액을 확립하였다.
2 ℓ들이 생물 반응기(바이오컨트롤러(Biocontroller) ADI 1010, 바이오콘솔 ADI 1025 장착; Applikon Biotechnology, Foster City, CA)를 준비하고, 이를 실시예 12에 실시액 060403-3에 대해서 기술된 바와 동일한 방법으로 진행시키되, 다만, 균주와 유도 시간에는 변화를 주었다.
1 ㎖의 1 M IPTG를 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔의 생산을 유도하였다. 도 13a에 나타낸 발효 실시액에서, OD600이 약 2가 될 때, 아모르파-4,11-디엔 합성을 유도하였으며, 이때, 발효조는 과량의 글루코스를 포함하였다. 도 13b에 나타낸 발효 실시액에서는, OD60O이 약 33일 때(글루코스를 제한하여 공급하기 시작한 이후), 아모르파-4,11-디엔의 합성이 유도되었다.
2개의 상이한 프로토콜에 따라서, 아모르파-4,11-디엔을 포집 및 추출하였다. 도 13a에 나타낸 발효 실시액에 있어서, 200 ㎖의 헵타놀을 함유하는 기체 세척기를 통해 배출 기체를 배기시킴으로써, 배출 기체 중에 존재하는 휘발성 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 이후, 시료 중 상기 아모르파-4,11-디엔 농도가 0.63∼20 ㎎/㎖가 될 때까지, 헵타놀을 아세트산에틸로 희석하였다. 도 13b에 나타낸 발효 실시액에 있어서, 유도될 때, 200 ㎖의 유기 상층을 발효조에 첨가하여 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다.
25 uL의 발효액과 975 uL의 아세토니트릴을 합하고, 이 시료를 피셔 보텍스 제니 2™ 혼합기(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY)에서 최대 속도로 3분 이상 동안 진탕시킨 다음, 원심 분리에 의하여 이 시료로부터 세포를 분리하고, 시료 중 아모르파-4,11-디엔 농도가 0.63∼20 ㎎/ℓ가 될 때까지, 아세토니트릴 용액을 아세트산에틸로 희석하여, 배양 배지로부터 아모르파-4,11-디엔을 추출하였다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, 아세트산에틸 시료를 GC/MS로 분석하였다. 도 13a에 나타낸 발효 실시액에 있어서, 아모르파-4,11-디엔의 총량은, 배출 기체 내에 존재하는 아모르파-4,11-디엔의 양과 배양 배지 중에 존재하는 아모르파-4,11-디엔의 양을 합한 후, 이를 발효조 부피로 나누어서 구하였다.
도 13a에 나타낸 발효액의 최대 OD600 값은 93이었으며, 최대 아모르파-4,11-디엔의 농도는 3.2 g/ℓ였다. 이와는 반대로, 도 13b에 나타낸 발효액의 최대 OD600 값은 245였으며, 아모르파-4,11-디엔의 최대 농도는 15 g/ℓ였다. 2개의 배양액에서 관찰된 세포 생장 수준 및 아모르파-4,11-디엔 생산 수준의 차이에 관하여 유사한 결과가 나왔는데, 즉, 도 13a에 나타낸 발효 실시액에서는, 과량의 글루코스를 소모하기 전에 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도되었으며, 글루코스의 생체 이용률을 제한하지 않은 경우에는, 메발로네이트 경로의 중간 물질의 독성 수준이 누적되어서 세포가 사멸되었음을 알 수 있었다. 도 13b에 나타낸 발효 실시액에 있어서는, 글루코스 전달이 제한된 후에 유도가 진행되었는데, 이는 경로의 중간 물질이 축적되는 것을 막아주어, 세포 밀도와 아모르파-4,11-디엔 생산 수준을 더욱 증가시켰다.
실시예 14
본 실시예는 탄소 및 질소 공급을 제한하는 조건과 차선의 온도에서 생육된 에스케리치아 콜라이 숙주 균주에 의해 아모르파-4,11-디엔의 생산 수준이 증가함을 입증하는 것이다.
균주의 스톡 분취액을 250 ㎖들이 플라스크(50 ㎖의 M9-MOPS 배지 및 항생제(표 1 참조) 함유)에 첨가하여, 숙주 균주 B86의 종균 배양액을 확립하였다. 이 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 밤새도록 생육시키고, 다음날 아침, OD600 값이 약 1이 될 때, 동일한 배지에 계대 배양한 다음, 이를 37℃ 및 250 rpm에서, OD600이 3→5가 될 때까지 생육시켰다.
2 ℓ들이 생물 반응기(바이오컨트롤러 ADI 1010, 바이오콘솔 ADI 1025 장착; Applikon Biotechnology, Foster City, CA) 4개를 준비하고, 이를 실시예 12에 실시액 060403-3에 대해 기술된 바와 동일한 방법으로 발효를 진행시키되, 다만, 질소 제한 발효 실시액은 공급액 중 황산암모니아를 포함시키지 않았다.
초기 글루코스 볼루스(15 g)가 모두 소모되고, 용해 산소가 스파이킹될 때, 6시간 동안의 증식 시간을 거친 지수기의 글루코스 공급액을 자동으로 공급하기 시작하였다. 최대 30.4 g/hr가 될 때까지, 다음의 등식에 따라서 공급 속도를 계산하였다:
Figure 112008083397046-pct00032
[상기 식 중 μ는 비 생장률이고, t0는 초기 글루코스 볼루스가 소진되었을 때의 시간임].
최대 속도에 이르렀을 때, 글루코스 공급 속도를 11.4 g/hr로 늦추고, 이 속도를 나머지 발효 기간 동안 유지시켰다. 발효 실시액 060710-4, 060724-5 및060619-5(탄소 제한 및 질소 제한)에 있어서, 암모니아를 제한함으로 말미암아 배지 중 글루코스가 축적될 때, 글루코스 공급 속도를 더 늦췄다.
온도를 30℃로 낮추고 발효를 진행시켰다. 생물 반응기 내 기류를 1 vvm으로 설정하고; 초기 교반 속도를 700 rpm으로 하였으며; 거품은 소포제 B(Sigma-Aldich, St. Louis, MO)를 사용하여 억제하고; 용해 산소 분압은 교반 케스케이드(700∼1,200 rpm)를 이용하여 40%로 조절하고, 산소를 증량하였다. 발효 실시액 060327-3(탄소-제한)에 있어서는, 20% NH4OH를 사용하여 pH를 7로 유지하였고; 발효 실시액 060710-4, 060724-5 및 060619-5(탄소-제한 및 질소-제한)에 있어서는, 처음에는 20% NH4OH를 사용하고, 72시간 경과시에는 2.5 N NaOH 및 1O N NH4OH의 50/50 혼합물을 사용하여 pH를 7로 유지하였으며, 발효조에 들어가는 암모니아의 양을 더 제한하였다.
OD600이 약 30일 때, 1 ㎖의 1 M IPTG를 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔의 생산을 유도하였다.
배지를 10%(v/v)의 유기 상층으로 덮어주어 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 이후, 25 uL의 발효액과 975 uL의 메탄올을 합한 후, 이 시료를 피셔 보텍스 제니 2™ 혼합기(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY)에서 15분 이상 동안 진탕시킨 다음, 원심 분리에 의하여 이 시료로부터 세포를 분리하고, 메탄올 용액 10 uL를 990 uL의 아세트산에틸(10 uL/ℓ 트랜스-카리오필렌 함유)에 첨가하여, 아모르파-4,11-디엔을 추출하였다.
실시예 10에 기술된 바와 같이, GC/MS로 시료를 분석하였다.
도 14a∼14e는 발효 실시액 060327-3(탄소 제한)에 관한 데이터를 나타내는 것이다. 발효시 최대 농도의 아모르파-4,11-디엔(16 g/ℓ)이 생성되었다(도 14a). 숙주 균주의 최대 균체 생산성은 200 ㎎/ℓ/hr 이상이었다(도 14b). 숙주 균주의 최대 비 생산성은 2 ㎎/ℓ/hr/OD600을 초과하였다(도 14c). 발효 개시시 배양 배지중 암모니아의 농도는 약 30 mM이었는데, 지수 생장기 동안에는 공급 용액을 첨가할 때마다 상기 농도는 약 76 mM까지 상승하였으며, 나머지 발효 진행 기간 중에는 이 농도를 60 mM 이상으로 유지하였다(도 14d). 최대 OD60O 값은 약 290에 이르렀는데(도 14d), 이는 116 g DCW/ℓ에 해당하는 값이다. 20 시간이 채 지나지 않아서, 배양 배지중 글루코스 농도는 15 g/ℓ에서 1 g/ℓ 이하로 감소하였으며, 이 농도는 낮게 유지되었다(도 14e). 발효 전 과정을 통틀어서 아세트산염의 수준은 낮았다(도 14e).
도 15a∼15e는 발효 실시액 060710-4, 060724-5 및 060619-5(탄소-제한 및 질소-제한)으로부터 얻은 데이터를 나타내는 것이다. 발효를 통하여, 아모르파-4,11-디엔의 최대 농도가 약 20 g/ℓ에서 30 g/ℓ로 되었다(도 15a). 숙주 균주의 최대 균체 생산성은 3개의 발효 실시액 전부에서 400 ㎎/ℓ/hr 이상이었는데(도 15b), 이는 질소 비 제한 발효에서 얻어지는 최대 균체 생산성보다 훨씬 높은 것이다(도 14b). 숙주 균주의 최대 비 생산성은 발효 실시액 전부에 대하여 2 ㎎/ℓ/hr/OD600을 초과하였으며, 이 생산성은 발효 실시 내내 높게 유지되었다(도 15c). 발효 개시시 배양 배지 중 암모니아의 농도는 약 35∼50 mM였으며, 이는 지수 생장 동안 공급 용액을 첨가함에 따라서 떨어졌고, 또한 나머지 발효 진행 기간 동안에는 10 mM 이하로 유지되었다(도 15d)[발효 실시액 060327-3의 암모니아 수준에 비하여 암모니아 수준이 떨어짐은(도 14d), 공급 용액 중 암모니아가 결여되었으며, pH를 유지시키는데 사용된 염기 중 암모니아가 감소하였기 때문임]. 발효 실시액 060710-4 및 060619-5의 경우, 발효 진행 기간 중 마지막에 암모니아의 농도가 고정되었으나, 이와 같은 고정 현상은 다량의 아모르파-4,11-디엔이 생성된 이후에나 발생하였다. 최대 OD600 값은 170에서 220에 이르게 되었는데(도 15d), 이는 68 ∼88 g DCW/ℓ에 해당하는 것이다. 20 시간이 채 지나지 않아서, 배양 배지 중 글루코스의 농도는 15 g/ℓ에서 1 g/ℓ 이하로 떨어졌는데, 이 농도는 낮게 유지되었다(도 15e). 발효 전 과정을 통틀어서 아세트산염의 수준은 낮았다(도 15e).
실시예 15
본 실시예는, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내 DXP 경로를 통하여 아모르파-4,11-디엔이 생산되는 것에 관하여 기술하고 있다.
각 균주 B003, B617, B618 및 B619의 스톡 분취액을 별도의 125 ㎖들이 플라스크(25 ㎖ M9-MOPS 및 항생제(표 1 참조) 포함)에 부가한 후, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 숙주 균주의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD600이 약 0.05가 되었을 때, 40 ㎖ M9-MOPS 배지, 45 ug/㎖ 티아민, 미량 영양소, 1.00E-5 mol/ℓ FeSO4, 0.1 M MOPS, 0.5% 효모 추출물, 20 g/ℓ의 D-글루코스 및 항생제를 함유하는 별도의 250 ㎖들이 플라스크에 종균 배양액을 접종하였다. 이 배양액의 OD600이 0.2에서 0.3에 이를 때(즉, 40 uL의 1M IPTG를 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 아모르파-4,11-디엔의 생산이 유도되는 시점)까지, 배양액을 습윤 항온 처리 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다.
유도시, 상기 배양액을 8 ㎖의 유기 상층으로 덮어서, 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 여러 시점에서 시료를 채취하였으며, 이로부터 아모르파-4,11-디엔을 추출하여, 실시예 10에 기술된 바와 같이 GC/MS로 분석하였다. 각각의 숙주 균주의 독립적인 클론 2개를 이용하여 실험을 실시하였으며, 그 결과들을 평균내었다. 시료간 편차는 10% 미만이었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 B619 즉, 전체가 조작된, DXP 경로 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 균주는 약 45 ㎎/g DCW의 아모르파-4,11-디엔을 생산하였다.
실시예 16
본 실시예는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서 3-메틸-부트-3-엔-1-올 및 3-메틸-부트-2-엔-1-올을 생산하는 것에 관하여 기술하고 있다.
각 균주 B286, B287, B288 및 B291의 스톡 분취액을 표 1에 나열한 항생제를 함유하는 LB 아가 상에 조흔하여, 숙주 균주를 확립하였다. 각각의 균주에 대해 3개의 독립적인 콜로니들을 골라냈는데, 각각의 콜로니를 항생제를 함유하는 LB 배지 7 ㎖에 접종하였다. 후기 지수기가 될 때까지, 상기 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 밤새도록 생육시켰다. 이후, OD60O이 약 0.05가 될 때, 상기 배양액을 250 ㎖들이 플라스크(40 ㎖의 M9-MOPS, 2% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제 함유)에 접종하였다. 배양액의 OD600이 약 0.2가 될 때(즉, 1 M IPTG 40 uL를 첨가하여, 유도가 진행되는 때)까지, 배양액을 회전식 진탕기(37℃, 250 rpm)에서 밤새도록 생육시켰다. 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 250 rpm) 상에서 72 시간 동안 생육시켰다. 하루에 1∼2회, 각 배양액의 OD600을 측정하였으며, 이로부터 700 uL의 시료를 분리하였다. 배양 발효액으로부터 3-메틸-부트-3-엔-1-올 및 3-메틸-부트-2-엔-1-올을 추출하기 위하여, 600 uL의 아세트산에틸을 300 uL의 분리된 시료 각각에 첨가하였다. 이후, 상기 시료를 15분 동안 와류시키고, 상층의 아세트산에틸 상 400 uL을 깨끗한 유리 바이알에 옮겨서 분석하였다.
시료를 휴렛-팩커드 6890 기체 크로마토그래피/질량 분광 분석기(GC/MS) 상에서 분석하였다. 1 uL의 시료를 DB-5 컬럼(Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)과 헬륨 담체 기체를 사용하는 GC 상에서 분리하였다. 분석용 온도 프로그햄은 다음과 같았다: 60℃, 3분, 분당 60℃→300℃로 상승, 300℃에서 2분간 방치. 총 진행 시간은 9분이었다. 분석된 시료를 휴렛-팩커드 모델 5937 질량 선택 검출기로 분석하였다. 이전의 질량 스펙트럼을 통하여, 3-메틸-3-부텐-1-올과 3-메틸-2-부텐-1-올의 체류 시간은 2.067 분임을 알 수 있었다(GC 프로토콜 이용). 3-메틸-부트-3-엔-1-올과 3-메틸-부트-2-엔-1-올의 검출에 집중하기 위하여, 3-메틸-부트-3-엔-1-올 및 3-메틸-부트-2-엔-1-올 내 56번 및 68번 이온만을 관찰하는 선택적-이온 관찰 방법(selective-ion-monitoring)을 수행하였다.
실시예 17
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지아에 숙주 균주에 의한 아모르파-4,11-디엔의 생산 방법에 관하여 기술하고 있다.
숙주 균주 EPY224의 생산 방법에 관하여는 문헌[Ro외 다수, Nature 440:940-943, 2006; 및 PCT 특허 공보 WO2007/005604]에 개시되어 있다. 숙주 균주 EPY224는, 발현 플라스미드 pRS425ADS를 YPD 배지 중에서 생육시키고[Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 ed., ISBN 0-87969-728-8], YPD 아가 상에서 하나의 콜로니 군체로 도말한 다음, 하나의 콜로니 군체를 CSM-Met His 아가 및 CSM-Met Leu 아가에 패칭(patching)하여 구제하였다. CSM-Met His 아가 상에서는 생장하되, CSM-Met Leu 아가 상에서는 생장하지 않는 클론들을 구제하였다[즉, 플라스미드 pRS425ADS를 상실한 것을 구제함]. 이와 같은 하나의 클론을 EPY300라 명명하였다. EPY300을 발현 플라스미드 즉, pRS425-ADS와 동일하되, 다만, LEU2 대신 LEU2d 선별 마커를 포함하는 pRS425-ADS-LEU2d로 형질 전환시킨 결과[Erhart and Hollenberg (1983) J Bactenol 156:625-635], 숙주 균주 Y185가 생산되었다.
Y185 숙주 세포 형질 전환체를, 2% 글루코스와 모든 아미노산(다만, 하스티딘, 루신 및 메티오닌 제외)을 함유하는 합성 한정 배지(CSM-글루코스; MP Biomedicals, Solon, OH) 상에서 선별하였다. 숙주 균주 EPY300은 루신 생합성에 대해 영양 요구성이지만(leu2), Y185 중 발현 플라스미드 pRS425-ADS-LEU2d는 루신 원영양성을 회복한다(LEU2). 하나의 콜로니 군체를 선별 배지(CSM-글루코스-히스티딘, 루신, 메티오닌) 상에 패칭하고, 이를 2일 동안 생육시켰다. 상기 세포를 상기 평판으로부터 긁어낸 다음, 이를 동결 튜브 내 25% (v/v) 글리세롤 1 ㎖에 첨가하였다. 현탁액을 혼합한 다음, 이를 -80℃에 보관하였다.
균주의 스톡 분취액을 125 ㎖들이 플라스크(루신과 메티오닌이 결여된 25 ㎖의 CSM-글루코스 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 숙주 균주 Y185의 종균 플라스크를 확립하였다. 초기 OD600이 약 0.05가 되었을 때, 상기 배양액을 250 ㎖의 배플링된(baffled) 플라스크(루신이 결핍된 40 ㎖의 합성 한정 배지와, 0.2% 글루코스, 1.8% 갈락토스 및 1 mM 메티오닌 함유)에 접종하였다. 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 200 rpm)에서 항온 처리하였다. 배지 중 글루코스가 존재하면, 갈락토스에 의해 GAL1 프로모터가 유도되는 것이 억제되므로, 세포가 배지 중 글루코스를 모두 다 사용하고, 스위칭되어 갈락토스를 주요 탄소 공급원으로서 사용할 때까지, 아모르파-4,11-디엔의 생산은 유도되지 않았다. 접종시, 상기 배양액을 8 ㎖의 유기 상층으로 덮어서, 아모르파-4,11-디엔을 포집하였다. 5 uL의 유기 용매 층을 깨끗한 유리 바이알(내부 표준으로서 베타- 또는 트랜스-카리오필렌을 공지의 농도로 포함하며, 500 uL의 아세트산에틸 함유)에 옮긴 후, 72 시간 경과시 시료를 채취하였다.
유기 상층/아세트산에틸 시료를 휴렛-팩커드 6890 기체 크로마토그래피/질량 분광 분석기(GC/MS) 상에서 분석하였다(실시예 10 참조).
생장 후 72시간 경과시, 3개의 효모 배양액을 분석한 결과, 60.68, 54.48 및 59.25 ㎎/ℓ의 아모르파-4,11-디엔이 생산되었음을 알 수 있었다.
실시예 18
본 실시예는, 숙주 세포가 원래의 메발로네이트 경로와 이종 조절 인자의 제어 하에 있는 이종 메발로네이트 경로를 포함하는 경우, 사카로마이세스 세레비지아에 숙주 균주 내에서의 아모르파-4,11-디엔의 생산에 관하여 기술하고 있다.
효모 균주 CEN.PK2-1C(Y002)(MATA; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2)와 CEN.PK2-1D(Y003)(MAT알파; ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2)[J. P. van Dijken외 다수, Enzyme Microb Technol 26, 706 (Jun 1, 2000)]를, 통합적 형질 전환체, 체류 플라스미드 및 감수 분열 자손을 선별할 수 있도록 만들어주는, 적당한 영양소가 결여된 한정된 합성 배지 또는 표준 풍부 배지(YPD) 중 어느 하나의 배지에서 배양하였다[. D. Rose, F. Winston, P. Heiter, Methods in yeast genetics: a laboratory course manual.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1990].
문헌[R. H. Schiestl, R D. Gietz, Curr Genet 16, 339 (Dec, 1989)]에 개시된 바와 같은 아세트산리튬 방법을 이용하여, 에스.세레비지아제로의 DNA-매개 형질 전환을 수행하였다. 표현형 분석, 콜로니 중합 효소 연쇄 반응("PCR") 및 증폭된 게놈 DNA의 서열 결정을 통하여, 모든 유전자의 파열 및 치환 여부를 확인하였다. pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad CA)을 사용하여 플라스미드 pAM489-pAM498을 구성하였으며, 이를 도 7a∼7c와 표 6에 개략적으로 나타내었다. HISMX 마커 서열에 관하여는 문헌[M. S. Longtine외 다수, Yeast 14, 953 (JuI, 1998)]에 개시되어 있다. 에스케리치아 콜라이 균주 DH5α 내에서 플라스미드 DNA를 증식시켰다.
Figure 112008083397046-pct00033
유도성 메발로네이트 경로 유전자를 도입하기 위하여, 다음과 같이 에스.세레비지아에 균주 Y002 및 Y003를 준비하였다. pAM328로부터 유래하는 KanMX-PMET3 부위(서열 번호 43)를, 원래의 ERG9 프로모터와 상동성인 염기쌍을 45개 함유하는 프라이머 50-56-pw100-G(서열 번호 44) 및 50-56-pw101-G(서열 번호 45)를 사용해 PCR 증폭시켜, ERG9 프로모터를 에스.세레비지아에 MET3 프로모터와 치환하였다. 결과로 생성된 PCR 생성물 10 ㎍을, 40% w/w 폴리에틸렌 글리콜 3350(Sigma-Aldrich St Louis, MO), 100 mM 아세트산리튬(Sigma), 1O ㎍ 연어 정자 DNA(Invitrogen)를 사용하여, 지수적으로 생장하고 있는 Y002 및 Y003 균주에 형질 전환시키고, 이를 30℃에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 42℃에서 30분 동안 열 충격을 주었다[Schiestl & Gietz, Curr. Genet. 16: 339 (1989)]. 형질 전환체가 0.5 ㎍/㎖의 제네티신(Geneticin; Invitrogen Co, Carlsbad, CA)을 함유하는 풍부 배지에서 생장하는 능력에 의해 포지티브 형질 전환체를 동정하였으며, 진단 PCR에 의해 이를 확인하였다. 결과로 생성된 클론들을 Y93(MAT A) 및 Y94(MAT 알파)라 명하였다. 그 다음, ADE1 개방 해독틀을 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) LEU2 유전자(CgLEU2)와 치환하였다. ADE1 개방 해독 틀(ORF)과의 상동성인 50개의 염기쌍이 측접하고 있는 프라이머 61-67-CPK066-G(서열 번호 46) 및 61-67-CPK067-G(서열 번호 47)를 이용하여, 씨.글라브라타 게놈 DNA(ATCC, Manassas, VA)로부터 3.5KB CgLEU2 게놈 위치를 증폭시켰다. 전술한 바와 같이, 결과로 생성된 PCR 생성물 10 ㎍을 지수적으로 생장하고 있는 Y93 및 Y94에 형질 전환시켰으며, 루신이 보충되지 않은 환경 하에서 ade1- 균주를 선별하여, 이를 진단 PCR로 확인하였다. 결과로 생성된 클론을 Y176(MAT A) 및 Y177(MAT 알파)라 명하였다.
에스.세레비지아에 균주 Y188을 생산하기 위해, pAM491로부터 유래하는 플라스미드 DNA(서열 번호 48) 및 pAM495로부터 유래하는 플라스미드 DNA(서열 번호 49) 2 ㎍씩을 각각 PmeI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 밤새도록 분해한 다음, 전술한 바와 같이, 지수적으로 생장하고 있는 Y176에 도입하였다. 우라실과 히스티딘이 결핍된 배지상에서 생장시켜, 포지티브 재조합체를 선별하였다. 올바른 게놈 위치에 통합되었는지 여부를 진단 PCR로 확인하였다.
에스. 세레비지아에 균주 Y189를 생산하기 위해, pAM489로부터 유래하는 플라스미드 DNA(서열 번호 50) 및 pAM497로부터 유래하는 플라스미드 DNA(서열 번호 51) 2 ㎍씩을 각각 PmeI로 밤새도록 분해한 다음, 전술한 바와 같이, 지수적으로 생장하고 있는 Y177에 도입하였다. 트립토판과 히스티딘이 결핍된 배지상에서 생장시켜, 포지티브 재조합체를 선별하였다. 올바른 게놈 위치에 통합되었는지 여부를 진단 PCR로 확인하였다.
Y188 및 Y189로부터 유래하는 약 1 × 107개의 세포를 실온에서 6시간 동안 YPD 배지 평판 상에서 혼합하여 교배시켰다. 이후, 혼합된 세포 배양액을 히스티딘, 우라실 및 트립토판이 결핍된 배지 상에 도말하여, 2배체인 세포를 선별하였다. 2 ㎍의 플라스미드 DNA(pAM493 유래(서열 번호 52))를 PmeI로 밤새도록 분해한 다음, 전술한 바와 같이, 지수적으로 생장하고 있는 2배체 세포에 도입하였다. 아데닌이 결핍된 배지상에서 생장시켜, 포지티브 재조합체를 선별하였다. 올바른 게놈 위치에 통합되었는지 여부를 진단 PCR로 확인하였다. 결과로 생성된 균주를 Y238이라 명하였다.
도입된 유전자의 전체 상보체를 함유하는 반수체 균주를 생산하기 위하여, Y238을 2% 아세트산칼륨 및 0.02% 라피노스 액체 배지 중에서 생식 세포를 형성시켰다. 싱거 인스트루먼트 MSM300 시리즈 미세 조작 기구(Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK)를 사용하여, 약 200개의 유전자 4배체(tetrad)(4배체란, 4개의 생식 세포가 형성된 감수 분열 생성물을 말함)를 분리하였다. 도입된 유전 물질의 적당한 상보체를 함유하는 독립된 유전 분리체를, 이 분리체가, 아데닌, 히스티딘, 우라실 및 트립토판이 존재하지 않는 환경 하에서 생장할 수 있는지 DUQN에 의하여 동정하였다. 도입된 DNA 전부가 통합되었는지 여부를, 진단 PCR에 의해 확인하였다. 결과로 생성된 균주를 Y210(MAT A) 및 Y211(MAT 알파)라 명하였다.
에스.세레비지아에 GAL1 프로모터로부터 발현된, 에스.세레비지아에 코돈 최적화 아모르파디엔 합성 효소(ADS)를 함유하는, pAM426 유래 플라스미드 DNA(서열 번호 53) 2 ㎍을, 전술한 바와 같이, 지수적으로 생장중인 Y210 및 Y211에 도입하였다. pAM426 플라스미드를 함유하고 있는 에스.세레비지아에 균주를, 이 균주가 루신이 보충되지 않은 환경 하에서 생장할 수 있는지 여부에 의해 선별하였다. 결과로 생성된 균주를 Y225(MAT A) 및 Y227(MAT 알파)라 명하였다.
에스.세레비지아에 코돈 최적화 아모르파디엔 합성 효소(ADS), 에스.세레비지아에 GAL1으로부터 발현된 사이토크롬 P450 모노옥시게나제(AMO), 그리고 에스.세레비지아에 GAL1O 프로모터로부터 발현된 사이토크롬 P450 산화 환원 효소(CPR)를 함유하는, pAM322 유래 플라스미드 DNA(서열 번호 54) 2 ㎍을, 전술한 바와 같이, 지수적으로 생장중인 Y210 및 Y211에 도입하였다. pAM322 플라스미드를 함유하는 에스.세레비지아에 균주를, 이 균주가 루신이 보충되지 않은 환경 하에서 생장할 수 있는지 여부에 의해 선별하였다. 결과로 생성된 균주를 Y222(MAT A) 및 Y224(MAT 알파)라 명하였다.
실시예 19
본 실시예는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서의 α-파네센 또는 β-파네센의 생산에 관하여 기술하고 있다.
각 균주 B552 및 B592에 대한 스톡 분취액을, 25 ㎖ M9-MOPS, 0.8% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제(표 1 참조)를 함유하는 125 ㎖들이 플라스크에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 숙주 균주의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD600이 약 0.05일 때, 상기 종균 배양액을, 40 ㎖의 M9-MOPS, 2% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제를 함유하는 250 ㎖들이 플라스크에 접종하였다. 상기 배양액의 OD600이 약 0.2에 도달할 때(즉, 40 uL의 1M IPTG를 상기 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 α-파네센 또는 β-파네센의 생산이 유도되는 시점)까지, 상기 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 유도시, 이 배양액을 유기 상층 8 ㎖로 덮어서, α-파네센을 포집하였다. 2∼10 uL의 유기 상층을, 1 ㎖의 아세트산에틸을 함유하는 깨끗한 유리 바이알에 옮겨담아서, 매 24∼120 시간마다(총 5회) 시료를 채취하였으며, 이때, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 뿐만 아니라, 1 ㎖의 배양 분취액을 스핀-다운(spin-down)시키고, 세포 펠릿을 250 uL의 멸균 수에 재현탁하였으며, 세포 현탁액을, 1 ㎖의 아세트산에틸을 함유하는 깨끗한 유리 바이알에 옮겨담았으며, 이때, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 또한, 전체 배양 발효 분취액 0.5 ㎖를 , 1 ㎖의 아세트산에틸을 함유하는 깨끗한 유리 바이알에 옮겨담았으며, 이때, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 상기 유리 바이알을 10분 동안 와류시켜 전체 배양 발효액 시료를 아세트산에틸 중에서 추출한 다음, 600 uL의 아세트산에틸 추출물을 깨끗한 유리 바이알에 옮겼다.
유기 상층/아세트산에틸 시료 및 아세트산에틸-추출 전체 배양 발효액 시료를 에질런트 6890N 기체 크로마토그래피(전체 스캔 모드(50∼500 m/z)로 에질런트 5975 질량 분광 분석기(GC/MS) 장착)로 분석하였다. 분석 시간을 단축하기 위하여, 온도 프로그램과 컬럼 매트릭스를 변경하여, 피크 해사오를 최적으로 만들고, 총 실행 시간도 최단으로 단축시켰다. 1 uL의 시료를 HP-5MS 컬럼(Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)과 헬륨 담체 기체를 사용하여 분리하였다. 분석용 온도 프로그햄은 다음과 같았다: 150℃, 3분 동안 방치, 분당 25℃→200℃로 상승, 분당 60℃→300℃로 상승, 300℃에서 1분간 방치. 이전의 잘량 스펙트럼을 통하여, β-파네센 합성 효소의 생성물은 β-파네센이고, β-파네센의 체류 시간은 4.33분임을 알 수 있었다(GC 프로토콜 이용). 트랜스-카리오필렌-고정 아세트산에틸 중 정제된 β-파네센(Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO)의 정량 계측 곡선에 대한, 출현 피크의 표면적을 비교하여, 파네센의 역가를 계산하였다.
숙주 균주 B592는 약 400 ㎎/ℓ의 α-파네센을 생산하였으며(120 시간 경과시, 3개의 독립된 클론 군체에 대해 평균냄), 최대 비 생산성은 약 46 ㎎/ℓ/OD600이었다. 숙주 균주 B552는 약 1.1 g/ℓ의 β-파네센을 생산하였으며(120 시간 경과시, 3개의 독립된 클론에 대해 평균냄), 최대 비 생산성은 약 96 ㎎/ℓ/OD600이었다(하나의 대표 클론).
실시예 20
본 실시예는 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내 DXP 경로를 통한 β-파네센의 생산에 관하여 기술하고 있다.
각각의 균주 B650, B651, B652 및 B653의 스톡 분취액을 별도의 125 ㎖들이 플라스크(25 ㎖의 M9-MOPS 및 항생제(표 1) 함유)에 첨가한 후, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 상기 숙주 균주의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD600이 약 0.05일 때, 상기 종균 배양액을, 40 ㎖의 M9-MOPS 최소 배지, 45 ug/㎖의 티아민, 미량 영양소, 1.00E-5 mol/ℓ FeSO4, 0.1 M MOPS, 0.5% 효모 추출물, 20 g/ℓ D-글루코스 및 항생제를 함유하는 250 ㎖들이 플라스크에 접종하였다. 상기 배양액의 OD600이 0.2→0.3에 도달할 때(즉, 40 uL의 1M IPTG를 상기 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 β-파네센의 생산이 유도되는 시점)까지, 상기 배양액을 가습 항온 처리 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 유도시, 상기 배양액을 8 ㎖의 유기 상층으로 덮어서, β-파네센을 포집하였다. 상부 유기 상층에 있던 100 uL의 시료를 깨끗한 튜브에 옮김으로써, 여러 시점에서의 시료를 채취하였다. 상기 튜브를 원심 분리하여, 남아있던 세포 또는 배지를 분리해내고, 유기 상층 시료 10 uL를 깨끗한 유리 GC 바이알 내 500 uL의 아세트산에틸에 옮겼다[내부 표준으로서 베타- 또는 트랜스-카리오필렌을 사용함]. 상기 혼합물을 30초 동안 와류시킨 다음에, 실시예 18에 기술된 바와 같이 분석하였다. 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 B653은 약 7 ㎎/g DCW의 β-파네센을 생산하였다.
실시예 21
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지아에 숙주 균주 내에서의 α-파네센 또는 β-파네센의 생산에 관하여 기술하고 있다.
풍부 배지 중에서 사카로마이세스 세레비지아에 균주 EPY224(Ro외 다수 (2006) Nature 440:940-943; PCT 특허 출원 공보 WO2007/005604)를 배양하여, 이 균주로부터 발현 플라스미드를 분리함으로써 균주 EPY300을 생산하였다. 이후, 균주 EPY300을 발현 플라스미드 pRS425-FSA 또는 pR425-FSB로 형질 전환한 결과, 숙주 균주 Y166 및 Y164가 생산되었다.
2% 글루코스와 모든 아미노산(루신 제외)을 함유하는 한정 합성 배지(SM-glu) 상에서 숙주 세포 형질 전환체를 선별하였다. 상기 숙주 균주 EPY300은 루신 생합성에 대해 영양 요구성이었지만(leu2), 발현 플라스미드 pRS425-FSA 또는 pRS425-FSB는 루신의 원영양성을 회복시켰다. 하나의 콜로니 군체를, 루신이 결핍된 액체 SM-glu 5 ㎖를 함유하는 배양 바이알로 옮겼다. 이 콜로니 군체의 생장이 정상기에 이르게 될 때까지 상기 배양액을 진탕하면서 항온 처리하였다(30℃). 상기 세포를 동결-바이알(400 ㎕ 50% 글리세롤 및 600 ㎕ 액체 배양액으로 이루어진, 동결 분취액 1 ㎖함유) 내(-80℃)에 보관하였다.
루신이 결핍된 25 ㎖의 SM-glu를 함유하는 125 ㎖들이 플라스크에 스톡 분취액을 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 종균 배양액을 확립하였다. 초기 OD600이 약 0.05가 될 때, 상기 종균 배양액을, 루신이 결핍된 한정 합성 배지 40 ㎖, 0.2% 글루코스 및 1.8% 갈락토스를 함유하는, 배플링된 플라스크(250 ㎖ 들이)에 접종하였다. 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 200 rpm)에서 항온 처리하였다. 배지 중 글루코스가 존재함으로 말미암아, 갈락토스에 의한 Gal1 프로모터의 유도가 억제되므로, 이 세포가 배지 중 글루코스를 모두 소모하여 갈락토스를 주요 탄소 공급원으로 사용하도록 스위칭될 때까지, 파네센의 생산은 유도되지 않았다. 상기 배양액을 8 ㎖의 올레산메틸 또는 이소프로필 미리스테이트로 덮었다. 유기 용매층 2∼10 uL을, 내부 기준으로서 공지의 농도의 베타- 또는 트랜스-카리오필렌을 함유하고, 500 uL 아세트산에틸을 함유하는 깨끗한 유리 바이알에 옮겨담음으로써, 시료를 24시간 마다 1회씩 채취하였다. 뿐만 아니라, 전체 배양 발효액 0.5 ㎖의 분취액을, 1 ㎖의 아세트산에틸을 함유하는 유리 바이알에 첨가하였으며, 이때, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 상기 유리 바이알을 10분 동안 와류시켜 전체 배양 발효액 시료를 아세트산에틸 중에서 추출한 후, 아세트산에틸 추출물 600 uL를 깨끗한 유리 바이알에 옮겼다.
숙주 균주 Y166은, 120시간 경과시 약 9.8 ㎎/㎖(3개의 독립된 클론에 대해 평균낸 값)의 α-파네센을 생산하였으며, 최대 비 생산성은 약 3 ㎎/ℓ/OD600(하나의 대표 클론)이었다. 숙주 균주 Y164는, 120 시간 경과시 약 56 ㎎/ℓ(3개의 독립된 클론에 대해 평균낸 값)의 β-파네센을 생산하였으며, 최대 비 생산성은 약 20㎎/ℓ/OD600(하나의 대표 클론)이었다.
실시예 22
본 실시예는, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서의 γ-테르피넨, α-피넨 및 테르피놀렌의 생산에 관하여 기술하고 있다.
각각의 균주의 스톡 분취액을 125 ㎖들이 플라스크(25 ㎖의 M9-MOPS, 2% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제(표 1) 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 후기 지수기에 이를때까지 생육시켜, γ-테르피넨(이.콜라이 DH1-T1r[pMevT, pMevB-Gpps, pAM445]), α-피넨(이.콜라이 DH1-T1r[pMevT, pMevB-Gpps, pAM443 또는 pAM442]) 또는 테르피놀렌(이.콜라이 DH1-T1r[pMevT, pMevB-Gpps, pAM444])을 생산하기 위해 숙주 균주의 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD600이 약 0.05일 때, 40 ㎖의 M9-MOPS, 2% 글루코스, 0.5% 효모 추출물 및 항생제를 함유하는 250 ㎖들이 플라스크에 종균 배양액을 접종하였다. 접종시, 배양액도 4 ㎖의 헥사데칸으로 덮었다. 배양액의 OD600이 약 0.2에 도달할 때(즉, 40 uL의 1 M IPTG를 첨가하여 숙주 세포 내 목적 화합물의 생산이 유도되는 때)까지 회전식 진탕기(30℃, 200∼250 rpm)에서 배양액을 항온 처리하였다. 96 시간 동안 매일 1회씩 상기 헥사데칸 층 200 uL를 0.6 ㎖들이 미세 원심 분리 튜브에 옮겨서 시료를 채취하였다. 분석을 위하여, 1.8 ㎖들이 GC 바이알 내 상기 헥사데칸 상층을 아세트산에틸을 사용하여 1:1 또는 1:10의 비율로 희석하였으며, 이 경우, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 또한, 배양액을 1 ㎖ 분취하여 이를 스핀-다운시키고, 세포 펠릿을 250 uL의 멸균수 중에 재현탁하였으며, 또한 세포 현탁액을, 1 ㎖의 아세트산에틸을 함유하는 유리 바이알에 옮겨 담았는데, 이때, 내부 표준은 트랜스-카리오필렌으로 하였다. 상기 유리 바이알을 15분 동안 와류시켜 아세트산에틸 중에서 세포 펠릿을 추출한 후, 아세트산에틸 추출물 500 uL을 깨끗한 유리 바이알에 옮겨담았다.
헥사데칸/아세트산에틸 시료 및 아세트산에틸-추출 세포 펠릿 시료를 에질런트 6890N 기체 크로마토그래피(전체 스캔 모드(50∼500 m/z)로 에질런트 5975 질량 분광 분석기(GC/MS)장착)로 분석하였다. 분석 시간을 단축하기 위하여, 온도 프로그램과 컬럼 매트릭스를 변경하여, 피크 해상도를 최적으로 만들고, 총 실행 시간은 최단으로 만들었다. 1 μL의 시료를 나눈 다음(나눌 때의 비율은 시료의 농도를 기준으로 하여 1:2∼1:50으로 선택함), HP-5MS 컬럼(Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)과 헬륨 담체 기체를 사용하여 분리하였다. 분석용 온도 프로그햄은 다음과 같았다: 75℃, 3분 동안 방치, 분당 20℃→115℃로 증가, 분당 60℃→300℃로 증가, 300℃에서 0.5분간 방치. 5.4분, 4.1분, 5.4분 및 5.9분 경과시 다양한 생성물 즉, γ-테르피넨, α-피넨 및 테르피놀렌을 관찰하였다. 트랜스-카리오필렌-고정 아세트산에틸 중 정제된 표준물의 정량 계측 곡선에 대한, 출현 피크 표면적을 비교하여 역가를 계산하였다.
실시예 23
본 실시예는, 에스케리치아 콜라이 숙주 균주 내에서 리날룰, 리모넨, β-피넨, β-펠란드렌, 카렌 또는 사비닌의 생산에 관하여 기술하고 있다.
각각의 균주의 스톡 분취액을 별도의 125 ㎖들이 플라스크(25 ㎖의 M9-MOPS, 0.5% 효모 추출물, 2% 글루코스 및 항생제(표 1)를 함유)에 첨가하고, 이 배양액을 밤새도록 생육시켜, 종균 배양액을 확립하였다.
초기 OD600이 약 0.05가 될 때, 상기 종균 배양액을, 40 ㎖의 M9-MOPS, 0.5% 효모 추출물, 2% 글루코스 및 항생제를 함유하는, 배플링된 플라스크(250 ㎖ 들이)에 접종하였다. 배양액의 OD600이 약 0.2에 도달할 때(즉, 40 ul의 1 M IPTG를 배양 배지에 첨가하여, 숙주 세포 내 목적 화합물의 생산이 유도되는 때)까지, 상기 배양액을 회전식 진탕기(30℃, 250 rpm)에서 항온 처리하였다. 용매-용매 추출법이나, 목적 화합물의 역가가 상기 배지를 포화시키기에 충분히 커서 제2의 상을 형성시킬 수 있으면 침강 및 폐기함으로써, 상기 배양 배지로부터 목적 화합물을 분리하였다.
SEQUENCE LISTING <110> RENNINGER, NEIL STEPHEN NEWMAN, JACK REILING, KEITH KINKEAD REGENTIN, RIKA PADDON, CHRISTOPHER JOHN <120> PRODUCTION OF ISOPRENOIDS <130> 33934-702.201 <140> 11/754,235 <141> 2007-05-25 <150> 60/808,989 <151> 2006-05-26 <150> 60/870,592 <151> 2006-12-18 <160> 54 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 4247 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 gaattcaaag gaggaaaata aaatgaagaa ctgtgtgatt gtttctgcgg tccgcacggc 60 gatcggcagc tttaacggct ctttagcgag cacctctgca atcgatctgg gtgcgacggt 120 cattaaggcc gccattgaac gcgccaaaat cgacagccag cacgttgatg aggtgatcat 180 gggcaatgtg ttacaagccg gcctgggtca aaacccagcg cgtcaagcac tgttaaaatc 240 tggtctggcc gagaccgtgt gtggcttcac cgtcaataag gtttgcggct ctggcctgaa 300 gagcgtggcc ctggcagcac aagcgattca agccggtcag gcacaaagca tcgttgcggg 360 tggcatggag aacatgtctc tggcgccgta cttattagat gccaaagccc gcagcggtta 420 tcgcctgggc gatggtcagg tgtacgacgt catcttacgc gatggcttaa tgtgcgcgac 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ttagcttgcc tcgtccccgc cgggtcaccc ggccagcgac 600 atggaggccc agaataccct ccttgacagt cttgacgtgc gcagctcagg ggcatgatgt 660 gactgtcgcc cgtacattta gcccatacat ccccatgtat aatcatttgc atccatacat 720 tttgatggcc gcacggcgcg aagcaaaaat tacggctcct cgctgcagac ctgcgagcag 780 ggaaacgctc ccctcacaga cgcgttgaat tgtccccacg ccgcgcccct gtagagaaat 840 ataaaaggtt aggatttgcc actgaggttc ttctttcata tacttccttt taaaatcttg 900 ctaggataca gttctcacat cacatccgaa cataaacaac catggcagaa ccagcccaaa 960 aaaagcaaaa acaaactgtt caggagcgca aggcgtttat ctcccgtatc actaatgaaa 1020 ctaaaattca aatcgctatt tcgctgaatg gtggttatat tcaaataaaa gattcgattc 1080 ttcctgcaaa gaaggatgac gatgtagctt cccaagctac tcagtcacag gtcatcgata 1140 ttcacacagg tgttggcttt ttggatcata tgatccatgc gttggcaaaa cactctggtt 1200 ggtctcttat tgttgaatgt attggtgacc tgcacattga cgatcaccat actaccgaag 1260 attgcggtat cgcattaggg caagcgttca aagaagcaat gggtgctgtc cgtggtgtaa 1320 aaagattcgg tactgggttc gcaccattgg atgaggcgct atcacgtgcc gtagtcgatt 1380 tatctagtag accatttgct gtaatcgacc 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cttgaaaata tatacagaac tcgatcatgc 4800 aaattctaga tttatggatg gactatctaa actagatcgc ttacacgaga ctcatgacga 4860 ttacagcgat cagatatttg agtctcttga gaggaatgac tgtacctgtc aaaagtatcc 4920 tgagatcaca gaagttagag atgcagttgc cacaattaga cgttccttta gaaaaataac 4980 taaagaatct ggtgccgata tcgaacctcc cgtacaaact agcttattgg atgattgcca 5040 gaccttaaaa ggagttctta cttgcttaat acctggtgct ggtggttatg acgccattgc 5100 agtgattgct aagcaagatg ttgatcttag ggctcaaacc gctgatgaca aaagattttc 5160 taaggttcaa tggctggatg taactcaggc tgactggggt gttaggaaag aaaaagatcc 5220 ggaaacttat cttgataaat aacttaaggt agataatagt ggtccatgtg acatctttat 5280 aaatgtgaag tttgaagtga ccgcgcttaa catctaacca ttcatcttcc gatagtactt 5340 gaaattgttc ctttcggcgg catgataaaa ttcttttaat gggtacaagc tacccgggaa 5400 agattctctt tttttatgat atttgtacat aaactttata aatgaaattc ataatagaaa 5460 cgacacgaaa ttacaaaatg gaatatgttc atagggtaga cgaaactata tacgcaatct 5520 acatacattt atcaagaagg agaaaaagga ggatgtaaag gaatacaggt aagcaaattg 5580 atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa gaattgcact ttaacattaa tattgacaag 5640 gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt aacagaaaat catgaaacta tgattcctaa 5700 tttatatatt ggaggatttt ctctaaaaaa aaaaaaatac aacaaataaa aaacactcaa 5760 tgacctgacc atttgatgga gtttaagtca ataccttctt gaaccatttc ccataatggt 5820 gaaagttccc tcaagaattt tactctgtca gaaacggcct taacgacgta gtcgacctcc 5880 tcttcagtac taaatctacc aataccaaat ctgatggaag aatgggctaa tgcatcatcc 5940 ttacccagcg catgtaaaac ataagaaggt tctagggaag cagatgtaca ggctgaaccc 6000 gaggataatg cgatatccct tagtgccatc aataaagatt ctccttccac gtaggcgaaa 6060 gaaacgttaa cacgtttaaa c 6081 <210> 52 <211> 4933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 gtttaaacta ctcagtatat taagtttcga attgaagggc gaactcttat tcgaagtcgg 60 agtcaccaca acacttccgc ccatactctc cgaatcctcg tttcctaaag taagtttact 120 tccacttgta ggcctattat taatgatatc tgaataatcc tctattaggg ttggatcatt 180 cagtagcgcg tgcgattgaa aggagtccat gcccgacgtc gacgtgatta gcgaaggcgc 240 gtaaccattg 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cgatcagatg ctaatacagg agcttctgcc aaaattgaaa 1980 gagccttcct acgtaccgca accgctctcg tagtatcacc taattttttc tccaaagcgt 2040 acaaaggtaa cttaccgtga ataaccaagg cagcgacctc tttgttcttc aattgttttg 2100 tatttccact acttaataat gcttctaatt cttctaaagg acgtattttc ttatccaagc 2160 tttcaatatc gcgggaatca tcttcctcac tagatgatga aggtcctgat gagctcgatt 2220 gcgcagatga taaacttttg actttcgatc cagaaatgac tgttttattg gttaaaactg 2280 gtgtagaagc cttttgtaca ggagcagtaa aagacttctt ggtgacttca gtcttcacca 2340 attggtctgc agccattata gttttttctc cttgacgtta aagtatagag gtatattaac 2400 aattttttgt tgatactttt atgacatttg aataagaagt aatacaaacc gaaaatgttg 2460 aaagtattag ttaaagtggt tatgcagctt ttgcatttat atatctgtta atagatcaaa 2520 aatcatcgct tcgctgatta attaccccag aaataaggct aaaaaactaa tcgcattatt 2580 atcctatggt tgttaatttg attcgttgat ttgaaggttt gtggggccag gttactgcca 2640 atttttcctc ttcataacca taaaagctag tattgtagaa tctttattgt tcggagcagt 2700 gcggcgcgag gcacatctgc gtttcaggaa cgcgaccggt gaagaccagg acgcacggag 2760 gagagtcttc cgtcggaggg 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caatgaacca tggggtgaac atgaaattga ttacatccta 3660 ttttataaga tcaacgctaa agaaaacttg actgtcaacc caaacgtcaa tgaagttaga 3720 gacttcaaat gggtttcacc aaatgatttg aaaactatgt ttgctgaccc aagttacaag 3780 tttacgcctt ggtttaagat tatttgcgag aattacttat tcaactggtg ggagcaatta 3840 gatgaccttt ctgaagtgga aaatgacagg caaattcata gaatgctata acaacgcgtc 3900 aataatatag gctacataaa aatcataata actttgttat catagcaaaa tgtgatataa 3960 aacgtttcat ttcacctgaa aaatagtaaa aataggcgac aaaaatcctt agtaatatgt 4020 aaactttatt ttctttattt acccgggagt cagtctgact cttgcgagag atgaggatgt 4080 aataatacta atctcgaaga tgccatctaa tacatataga catacatata tatatatata 4140 cattctatat attcttaccc agattctttg aggtaagacg gttgggtttt atcttttgca 4200 gttggtacta ttaagaacaa tcgaatcata agcattgctt acaaagaata cacatacgaa 4260 atattaacga taatgtcaat tacgaagact gaactggacg gtatattgcc attggtggcc 4320 agaggtaaag ttagagacat atatgaggta gacgctggta cgttgctgtt tgttgctacg 4380 gatcgtatct ctgcatatga cgttattatg gaaaacagca ttcctgaaaa ggggatccta 4440 ttgaccaaac tgtcagagtt ctggttcaag ttcctgtcca acgatgttcg taatcatttg 4500 gtcgacatcg ccccaggtaa gactattttc gattatctac ctgcaaaatt gagcgaacca 4560 aagtacaaaa cgcaactaga agaccgctct ctattggttc acaaacataa actaattcca 4620 ttggaagtaa ttgtcagagg ctacatcacc ggatctgctt ggaaagagta cgtaaaaaca 4680 ggtactgtgc atggtttgaa acaacctcaa ggacttaaag aatctcaaga gttcccagaa 4740 ccaatcttca ccccatcgac caaggctgaa caaggtgaac atgacgaaaa catctctcct 4800 gcccaggccg ctgagctggt gggtgaagat ttgtcacgta gagtggcaga actggctgta 4860 aaactgtact ccaagtgcaa agattatgct aaggagaagg gcatcatcat cgcagacact 4920 aaattgttta aac 4933 <210> 53 <211> 8425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 240 accattatgg 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tgtactcatt tagaatttga tatttccaat actggactat cgtatgaaac 8580 tggcgaccat gtcggtgtat atgtggaaaa cctgtctgaa gttgtagatg aagccgaaaa 8640 attgattggg cttcctccac atacatactt ttctgtgcat acagataatg aagatggtac 8700 tccacttggc ggagcctcgt taccacctcc ctttccacca tgtacactta gaaaagctct 8760 tgcatcttat gcagatgtac tttcttcacc aaagaaaagt gcattactag ctctagccgc 8820 ccatgctacc gactctactg aagctgaccg tttgaaattc tttgcttcac ctgctggcaa 8880 agacgagtac gcacagtgga ttgtggcatc tcacagatca ttgctggaag tgatggaagc 8940 cttcccatcg gcaaagccac cattaggcgt gtttttcgca tctgttgccc cacgtttaca 9000 gcctagatac tattccatat cttctagccc aaaatttgcc cccaatcgta ttcatgtgac 9060 gtgtgcgctg gtgtatgaac aaactccatc aggaagggta cataaaggtg tctgtagtac 9120 atggatgaaa aacgcggtgc caatgactga atctcaagat tgttcgtggg caccaattta 9180 tgttcgtact tctaatttta gactacctag tgaccctaaa gtaccagtga ttatgatcgg 9240 gcctgggaca ggactagcgc cattcagagg tttcttacaa gaaagattgg cccaaaagga 9300 agcaggtacg gaattaggaa ccgcaattct attctttggt tgtcgtaata gaaaagttga 9360 ctttatatac gaagatgagt taaacaactt cgttgaaact ggagcgttat cagaattagt 9420 gacagcattc tctagggaag gtgcaacaaa agaatacgtc caacataaaa tgacccaaaa 9480 ggccagcgat atatggaatt tgctgtccga gggtgcctat ttgtacgttt gtggtgatgc 9540 aaagggaatg gctaaagatg ttcacaggac attgcataca attgttcagg aacaaggttc 9600 cttggattcc tctaaggcag aactttatgt taaaaacctt cagatggctg gtagatattt 9660 gcgtgatgtt tggtgagcta gctaagatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa 9720 cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt 9780 atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg 9840 aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaagatcc agctgcatta atgaatcggc 9900 caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 9960 tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 10020 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 10080 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 10140 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 10200 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 10260 cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 10320 cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 10380 ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 10440 gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 10500 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 10560 acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 10620 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 10680 attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 10740 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 10800 ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 10860 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 10920 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 10980 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 11040 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 11100 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 11160 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 11220 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 11280 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 11340 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 11400 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 11460 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 11520 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 11580 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 11640 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 11700 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 11760 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 11820 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga acgaagcatc 11880 tgtgcttcat tttgtagaac aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc aaacaaagaa 11940 tctgagctgc atttttacag aacagaaatg caacgcgaaa gcgctatttt accaacgaag 12000 aatctgtgct tcatttttgt aaaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca 12060 aagaatctga gctgcatttt tacagaacag aaatgcaacg cgagagcgct attttaccaa 12120 caaagaatct atacttcttt tttgttctac aaaaatgcat cccgagagcg ctatttttct 12180 aacaaagcat cttagattac tttttttctc ctttgtgcgc tctataatgc agtctcttga 12240 taactttttg cactgtaggt ccgttaaggt tagaagaagg ctactttggt gtctattttc 12300 tcttccataa aaaaagcctg actccacttc ccgcgtttac tgattactag cgaagctgcg 12360 ggtgcatttt ttcaagataa aggcatcccc gattatattc tataccgatg tggattgcgc 12420 atactttgtg aacagaaagt gatagcgttg atgattcttc attggtcaga aaattatgaa 12480 cggtttcttc tattttgtct ctatatacta cgtataggaa atgtttacat tttcgtattg 12540 ttttcgattc actctatgaa tagttcttac tacaattttt ttgtctaaag agtaatacta 12600 gagataaaca taaaaaatgt agaggtcgag tttagatgca agttcaagga gcgaaaggtg 12660 gatgggtagg ttatataggg atatagcaca gagatatata gcaaagagat acttttgagc 12720 aatgtttgtg gaagcggtat tcgcaatatt ttagtagctc gttacagtcc ggtgcgtttt 12780 tggttttttg aaagtgcgtc ttcagagcgc ttttggtttt caaaagcgct ctgaagttcc 12840 tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc aaagcgtttc cgaaaacgag 12900 cgcttccgaa aatgcaacgc gagctgcgca catacagctc actgttcacg tcgcacctat 12960 atctgcgtgt tgcctgtata tatatataca tgagaagaac ggcatagtgc gtgtttatgc 13020 ttaaatgcgt acttatatgc gtctatttat gtaggatgaa aggtagtcta gtacctcctg 13080 tgatattatc ccattccatg cggggtatcg tatgcttcct tcagcactac cctttagctg 13140 ttctatatgc tgccactcct caattggatt agtctcatcc ttcaatgcta tcatttcctt 13200 tgatattgga tcatactaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 13260 tatcacgagg ccctttcgtc 13280

Claims (43)

  1. (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 생성하는 메발로네이트 경로의 하나 이상의 효소를 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 다수의 박테리아 또는 진균 숙주 세포를 얻는 단계로서, 하나 이상의 효소의 발현은 하나 이상의 이종 전사 조절 인자의 제어 하에 있고, 상기 메발로네이트 경로는
    (ⅰ) 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA와 축합시켜 HMG-CoA를 형성하는 효소;
    (ⅱ) HMG-CoA를 메발로네이트로 전환시키는 효소;
    (ⅲ) 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 효소;
    (ⅳ) 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 전환시키는 효소; 및
    (ⅴ) 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 전환시키는 효소
    를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 배지가 박테리아 또는 진균 숙주 세포에 대해 최대 비 생장률의 75% 이하를 제공하도록 탄소 공급원이 제한되는 배지에서 박테리아 또는 진균 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 최대 비 생장률은 박테리아 또는 진균 숙주 세포의 성장에 대한 최적 온도 및 영양소가 과량 존재하는 배지 중에서 박테리아 또는 진균 숙주 세포를 배양함으로써 얻어지는 생장률인 단계
    를 포함하는 이소프레노이드의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 이종 전사 조절 인자는 유도가능한 것인 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 메발로네이트 경로 효소는 단일 전사 조절 인자의 제어 하에 있는 것인 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 메발로네이트 경로 효소는 복수의 전사 조절 인자의 제어 하에 있는 것인 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 숙주 세포는 메발로네이트 경로의 효소 모두를 암호화하는 다수의 이종 핵산을 포함하는 것인 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli)인 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서, 이종 핵산은 내인성 메발로네이트 경로를 가지는 진균으로부터 유래하는 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, 숙주 세포는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)인 생산 방법.
  9. 제1항에 있어서, 이종 핵산은 내인성 메발로네이트 경로를 가지는 박테리아로부터 유래하는 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 박테리아는 엔테로코커스(Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)로부터 선택되는 속에 속하는 것인 생산 방법.
  11. 제1항에 있어서, 이종 핵산은 아세틸-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성 효소, HMG-CoA 환원 효소 및 메발로네이트 키나제로부터 선택되는 메발로네이트 경로 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서, 이종 핵산은 제II군 HMG 환원 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 생산 방법.
  13. 제1항에 있어서, 숙주 세포를 영양소와 온도 둘 다가 숙주 세포에 대해 최대 비 생장률을 제공하는 수준보다 낮은 수준으로 유지되는 배지 중에서 배양하는 것인 생산 방법.
  14. 제1항에 있어서, 배지의 온도는 최적 온도보다 2∼20℃ 이상 낮은 것인 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 숙주 세포를 최적 온도보다 5℃ 이상 낮은 온도에서 배양하는 것인 생산 방법.
  16. 제14항에 있어서, 배지의 온도는 최적 온도보다 10℃ 이상 낮은 것인 생산 방법.
  17. 제1항에 있어서, 배지는 최대 비 생장률의 60% 이하를 제공하는 것인 생산 방법.
  18. 제1항에 있어서, 배지는 최대 비 생장률의 50% 이하를 제공하는 것인 생산 방법.
  19. 제1항에 있어서, 배지는 최대 비 생장률의 40% 이하를 제공하는 것인 생산 방법.
  20. 제1항에 있어서, 배지는 최대 비 생장률의 25% 이하를 제공하는 것인 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, 배지는 최대 비 생장률의 75∼10%를 제공하는 것인 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, 배지는 질소가 제한되는 것인 생산 방법.
  23. 제1항에 있어서, 이소프레노이드가 배지 1 ℓ당 10 g보다 많은 양으로 생산되는 것인 생산 방법.
  24. 제1항에 있어서, 이소프레노이드가 건조 세포 중량 1 그램당 50 ㎎보다 많은 양으로 생산되는 것인 생산 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 이소프레노이드의 양이 150 시간보다 적은 시간 내에 생산되는 것인 생산 방법.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 이소프레노이드의 양이 96 시간보다 적은 시간 내에 생산되는 것인 생산 방법.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 이소프레노이드의 양이 72 시간보다 적은 시간 내에 생산되는 것인 생산 방법.
  28. 제1항에 있어서, 이소프레노이드는 헤미테르펜, 모노테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 세스퀴테르펜 및 폴리테르펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생산 방법.
  29. 제1항에 있어서, 이소프레노이드는 세스퀴테르펜인 생산 방법.
  30. 제1항에 있어서, 이소프레노이드는 C5-C20 이소프레노이드인 생산 방법.
  31. 제1항에 있어서, 이소프레노이드는 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파네센, β-파네센, 파네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날룰, 리모넨, 미르신, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르핀덴 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생산 방법.
  32. 제1항에 있어서, 영양소는 탄소 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 것인 생산 방법.
  33. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 α-파네센인 생산 방법.
  34. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 β-파네센인 생산 방법.
  35. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 아모르파디엔인 생산 방법.
  36. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 파네솔인 생산 방법.
  37. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 네롤리돌인 생산 방법.
  38. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 패출롤인 생산 방법.
  39. 제29항에 있어서, 세스퀴테르펜은 발렌센인 생산 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소는 박테리아 효소인 생산 방법.
  41. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소는 진균 효소인 생산 방법.
  42. 삭제
  43. 삭제
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