KR101508668B1 - 허혈-재관류 손상의 예방을 위한 ｃ１ 억제제의 용도 - Google Patents
허혈-재관류 손상의 예방을 위한 ｃ１ 억제제의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 허혈 및 재관류 손상의 예방, 감소, 치료를 위한 C1 억제제의 치료적 및 예방적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 C1 억제제는 허혈기간 및 재관류 후에 투여될 때 여전히 효과적이고, 그러므로 특히 예컨대 뇌졸증을 비롯한 허혈성 재관류의 예견치못한 발생에 유용하다.
허혈, 재관류, 뇌졸증
Description
본 발명은 허혈-재관류 손상, 특히 뇌졸증의 결과로 일어날 수 있는 대뇌 허혈-재관류 손상의 예방, 감소 및 치료를 위한 C1 억제제의 치료 및 예방적 용도에 관한 것이다.
허혈-재관류 손상은 병적 상태를 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 예견된 병적 상태 또는 예견되지 않은 병적 상태를 나타낼 수도 있다. 뇌졸증은 예견되지 않은 허혈-재관류 손상의 가장 일반적인 형태 중의 하나이다. 뇌졸증은 산업화된 국가들에서 사망 3번째 원인이고, 장기간 장애의 주요한 원인이다. 뇌졸증은 뇌 안의 그리고 뇌에 이르는 동맥에 영향을 주는 심장혈관의 질병의 일종이다. 뇌졸증은 그러한 동맥들이 클럿(clot)에 의해 막히고, 막힌 동맥으로 인해 대뇌 조직의 허혈이 생길 때 일어난다. 뇌의 직접적인 손상은 혈류의 방해에 의해 일어나고, 주로 생체 조직에 산소화(oxygenation)의 결여 때문에, 회복되지 않으면 결국 경색이 일어난다. 그러나 그런 손상이 회복되면(생리학적으로 또는 치료적으로), 그리고나서 허혈 조직의 재관류는 역설적으로 추가적인 간접적 손상을 일으킬 수 있다. 허혈이 오래 지속될 때, 산소결핍 단독으로부터 오는 "직접적인" 손상이 주요한 기전이다. 허혈이 짧게 지속되었을 때에는, 간접 또는 재관류 매개된 손상이 최종 결과에 훨씬 더 증가하게 중요해진다.
C1 억제제(C1INH), 보체 C1의 억제제는 대뇌 허혈-재관류 손상용 설치류(rodent) 모델내에 허혈-재관류 손상 감소에 의한 신경-보호 작용을 나타내는 것으로 보고되어 왔다(De Simoni et al., 2003, J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9; Akita et al., 2003, Neurosurgery 52: 395-400). 뇌 허혈-재관류 손상에서 C1INH의 신경 보호작용은 C1q를 필요로하지 않는다 (De Simoni et al., 2004, Am J Pathol. 164: 1857-63). 최근에 Storini 등(2005, Neurobiol Dis. 19: 10-7)은 C1INH가 염증 억제 및 맥관 구조로부터 허혈 부위로의 세포 보충을 통하여 허혈-재관류 손상에 대한 항-세포자살 작용 및 항염증 작용을 하는 것으로 보고하였다. 그러나, C1INH의 투여가 치료적으로 효능이 있는 뇌졸증 전후의 시간 범위(window in time)는 다소 좁다. 그러므로, 본 발명의 목적은 투여 시간에 관하여 넓은 윈도우를 가지는 C1INH를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 자연적으로 일어나는 혈장 유래 C1 억제제(C1INH)가, 허혈 후 투여될 때, 일시적인 대뇌 병소의 허혈을 위한 마우스 모델 내 허혈 재관류 손상을 줄이기 위한 대부분의 능력을 잃는 점에서, C1INH의 재조합적 조제품은 허혈 및/또는 재관류 후 최소한 1시간 후에 주입될 때에도 또한 여전히 그 신경 보호 효과를 발휘할 수 있다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. 놀랍게도, C1INH는 허헐 및/또는 재혈관 후 18시간 후에 주입될 때에도, 신경 보호 효과가 여전히 미친다. 자연적으로 일어나는 혈장 유래 C1INH와 재조합적으로 제조된 C1INH 사이의 차이는, 전자는 최소한 24시간동안의 혈장 반감기를 가지고, 완전히 시아릴레이트화된(sialylated) 글리코단백질이고, 후자는 감소된 혈장 반감기를 가지고, 혈장 유래된 생산물과 비교해 볼 때 상이한 글리코단백질을 가지고 있다.
자연적으로 일어나는 혈장 유래 C1INH와 재조합적으로 제조된 C1INH 사이에 알려진 다른 점은 글리코실화(glycosylation)의 종류와 범위이다. 재조합 글리코단백질은 올리고만노스-, 하이브리드-, 및 복합-형태 구조를 포함하는 상이한 N-글리칸들의 넓은 어레이를 포함하는 반면, 혈장 유래된 C1INH의 N-글리칸들은 주로 완전히 시아릴레이트화된(sialylated) 복합형태 구조로 구성된다. 글리코실화의 차이로 인해, 혈장 유래 글리코단백질은 최소한 24시간 혈장 반감기를 가지고, 재조합 C1INH는 감소된 혈장 반감기를 가진다.
일 면에서, 본 발명은 그러므로 적어도 하나의 허혈 및 재관류 손상의 예방, 감소 또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 이것에 의해 C1 억제제가 허혈 및/또는 재관류 후에 투여된다. 방법은 좋게는 혈장 유래된 C1INH의 혈장 반감기보다 적은 혈장 반감기를 가지는 C1INH의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다르게, 상기 방법은 좋게는, 혈장 유래된 C1INH과 비교하여 상이한 글리코실화를 가지는 C1INH 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 임의의 형태의 허혈-재관류 손상을 예방, 감소 및/또는 치료하기 위한 C1 억제제의 치료적 및/또는 예방적 용도에 관한 것이다.
C1 억제제는 또한 여기에 기재된 C1 에스터라제 억제제로써, 보체 C1의 억제제로써 언급된다. C1INH는 세린 프로테나제 억제제의 슈퍼패밀리에 속하고, 보체 시스템의 C1r 및 C1s의 유일한 억제제이며, 접촉 시스템의 인자 XIIa 및 칼리크레인( kallikrein)의 주요한 억제제이다. 그리고, C1INH는 인자 XI과 같은 혈전 용해 및 응고 시스템의 다른 세린 프로테아제들, 조직 타입 플라스미노겐 활성자(activator) 및 플라스민(plasmin)을 억제한다(Schapira et al. 1985, Complement 2: 111; Davis, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 595). 인간 C1INH는 22 아미노산 신호 서열을 포함하는 500 아미노산들의 단백질이다(Carter et al. 1988, Euro. J. Biochem. 173; 163). 혈장 C1INH는 약 76kDa의 글리코단백질이고, 탄수화물로 구성된 그 분자량의 26%까지 매우 글리코실화된다(Perkins et al., 1990, J.Mol.Biol.213,751). 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 C1INH는 좋게는 서열번호 1에 기재된 성숙 인간 C1INH의 아미노산 서열과 최소한 65, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 동일성을 가지는 단백질이다.
본 발명의 목적을 위해, 두 아미노산 서열의 동일성의 정도는 두 서열 사이의 동일한 아미노산들의 퍼센트로써 나타난다. 먼저, 상동 폴리펩티드 서열들은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 알고리즘을 이용하여 연구하였고, 이것은 Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)에 기재되었다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 통해 공중 이용 가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터들 W, B, 및 E는 민감성 및 서열정렬(alignment)의 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 워드(word) 길이(W) 3, BLOSUM62 스코아 매트릭스(scoring matrix)(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915(1989) 참고) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4을 디폴트(default) 값으로써 사용한다. 다음으로, 상동 서열의 동일성의 정도(상기 기재한 바와 같이)는 다음의 파라미터들을 이용하여 CLUSTALW 정렬 알고리즘(Higgins D. et al(1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)을 이용하여 측정된다; 갭 사이즈: 5, 갭 오픈: 11, 갭 익스텐션: 1, 미스매치: -15, 워드 사이즈: 3.
C1INH은 좋게는, 예컨대, Drouet et al.(1988, Clin Chim Acta. 174:121-30)에 기재된 바와 같이 분석될 수 있는 것과 같은 C1INH 활성을 가진다. 더욱 좋게는, C1INH는 사람에서 자연적으로 일어나는(예컨대, 서열번호: 1 또는 CAA30314과 같이) 아미노산 서열을 가지는 것으로 이해되지만, C1INH가 예컨대, 인간 혈장에서 생산되고 그로부터 수득되는 것으로 이해되지는 않는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 C1INH는 좋게는 혈장 유래된 C1INH의 혈장 반감기와 비교된 것과 같이 감소된 혈장 반감기를 가지고, 더욱 좋게는 본 발명에 따른 C1INH의 혈장 반감기는 인간 혈장으로부터 유래된 C1INH의 혈장 반감기보다 적다. "감소된 혈장 반감기"에 의해 혈장 유래된 C1INH의 순환 반감기와 관련된 본 발명의 C1INH의 반감기 순환에서 음의 변화를 의미한다. 본 문맥에서, 혈장 유래된 C1INH는 혈장으로부터 전형적으로 유래되고, 혈장으로부터 정제될 수 있지만 화학적으로 또는 효소적으로 변형되지 않는 자연적으로 일어나는 C1INH를 뜻한다.
혈장 반감기는 C1INH의 투여후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 각각의 샘플에서 C1INH의 농도를 측정함에 의해 측정된다. 시간과 혈청 농도의 상관관계는 혈장 반감기의 계산을 하게 해준다. 혈장 유래된 C1INH의 순환 반감기와 관련된 본 발명의 C1INH의 혈장 반감기의 감소는, 좋게는, 최소한 약 2배, 최소한 약 3배, 최소한 약 4배, 최소한 약 6배, 더 좋게는, 최소한 약 8배, 및 가장 좋게는 약 10배이다. 다시 말해서, 본 발명의 C1INH의 혈장 반감기는 좋게는 혈장 유래된 C1INH, 즉 자연적으로 일어나는 그것의 대응물의 혈장 반감기의 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12.5 또는 10%보다 적다.
예를 들어, 여기 실시예에서 사용되는 본 발명의 C1INH의 혈장 반감기는, 이것은 형질전환 래빗트의 젖으로부터 얻은 것으로, 약 3시간의 인간내 혈장 반감기를 가지고, 인간에서 혈장 유래된 C1INH의 평균 혈장 반감기보다 4배 내지 8배 적다. 혈장 유래된 C1INH와 비교한 것과 같이, 본 발명의 C1INH의 혈장 반감기 감소의 측정은 좋게는 만약 동일한 조건이 아니라면 유사한 조건, 즉 좋게는 상응하는 투약량, 샘플링 요법, 동일한 유기체, 이것은 마우스 또는 인간 대상들을 비롯한 실험실 동물 내, 그리고 실험 대상의 동일한 수에서 수행된다. 또한, C1INH 조제품 모두의 평균 혈장 반감기들은 통계적인 분석의 표준 방법에 의해 측정될 수 있는 것과 같이 비교된다.
자연적으로 일어나는 또는 재조합적으로 생산된 C1INH인 짧은 반감기를 가진 C1INH는 임의의 편리한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 그것은 변형된 탄수화물 구조(혈장 유래된 C1INH와 비교해 볼 때)를 가진 C1INH를 나타내는 재조합 숙주 세포 또는 유기체에서 생체 내(in vivo)에서 제조되거나, C1INH를 자연적으로 일으키는 탄수화물 구조는 시험관 내(in vitro) 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다. 좋게는, 본 발명의 C1INH는 혈장 유래된 C1INH와 비교되어 다음의 방법으로 변형된다: 탄수화물 모이어티(moiety)(자연적으로 일어나는 변이체 또는 재조합적으로 발현된 글리코단백질의 변이체)의 제거, 좋게는, N- 결합된 탄수화물 사슬로부터 시알산 및/또는 갈락토스의 제거 및/또는 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민 및/또는 퓨코스 잔기들의 노출이 일어나는 탄수화물 사슬의 제거.
본 발명의 다른 면에 따라, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 C1INH는 혈장 유래된 C1INH와 비교해 볼 때 상이한 글리코실화를 가진다. 본 발명의 C1INH의 탄수화물 구조에 대한 변형들은 C1INH의 아실알리로(asialio) 형태에 대한 저글리코실화, 과글리코실화를 일으키는 변형, 또는 다른 글리코실화 패턴을 가져오는 다른 변형들을 포함한다.
시험관 내(in vitro)에서, 저글리코실화는 C1INH의 완전한 탄수화물 사슬 또는 탄수화물 모이어티의 결실의 결과일 수 있다. 변형들은 N- 또는 O-결합된 탄수화물 사슬들, 또는 오직 한 유형의 사슬이 포함될 수 있다. 그것은 그 사슬의 모든 사슬들 또는 일부 사슬들을 포함할 수 있다. 예컨대, 과글리코실화는 C1INH 분자에 완전한 탄수화물 사슬 또는 여분의 탄수화물 모이어티의 추가로 나타날 수 있다. C1INH의 아시알로(asialo)-형태 또는 말단 시알산 잔기들의 감소된 수준을 가지는 형태는 전형적으로 시알산 그룹의 제거에 의해 수득될 수 있다. 혈액 내 글리코단백질의 반감기는 그것의 N-및 O-결합된 탄수화물 그룹의 구조 및 조성에 크게 의존한다. 일반적으로, 글리코단백질의 최대 반감기는 그것의 N- 및 O- 결합된 탄수화물 그룹들이 말단 시알산을 가질 것을 필요로 한다. 만약 말단 시알산이 존재하지 않는다면, 글리코단백질은 갈락토스 잔기의 노출로 인해 혈액으로부터 빠르게 제거된다. 글리코단백질의 탄수화물 모이어티들 내에 말단 갈락토스 잔기의 존재는 간에서 아시알로글리코단백질 수용체에 의한 증가된 혈장 제거(clearance)를 가져온다는 것은 잘 확립되어 있다. 그리하여, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용을 위한 C1INH는 혈장 유래된 인간 C1 억제제와 비교할 때 감소된 수준의 말단 시알산 잔기들을 가진다. 시알산은 여러 방법으로 제거될 수 있다. 예컨대, 그것은 화학적으로 또는 효소적으로, 예컨대, 시알리다제(sialidase)의 처리에 의해 제거될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 시알리다제는 Chou 등에 의해 기재될 수 있고(1996, J Biol Chem. 271(32):19219-24; and 1994, J Biol Chem. 269(29):18821-6), 예컨대, V-labs Inc.(Covington, Louisiana, USA)로부터 입수될 수 있다. 추가적인 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용을 위한 C1INH는 좋게는 노출된 만노스, N-아세틸글루코사민 포스포만노스, 갈락토스 및/또는 N-아세틸칼락토사민 잔기들을 가진다. 노출된 당 잔기는 보통, 잔기들(탄수화물 결합 도메인을 비롯한)에 친화력을 가지는 모이어티와 상호반응을 위해 접근가능한 최소한의 당 잔기들 또는 글리칸 가지 상에 있는 말단 당 잔기들일 수 있다. 노출된 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노스, 퓨코스, 또는 포스포만노스 잔기들이 있는 C1INH는 예컨대, 하나 이상의 β-D-N-아세틸헥소사미니다제, 엔도-β-갈락토시다제, 및/또는 α-D-N-아세틸갈락토사미니다제(예컨대, V-labs, Inc., Covington, Louisiana, USA로부터 또한 입수 가능한)로 효소적 처리에 의해 수득될 수 있다.
생체 내(in vivo) 에서, C1INH의 탄수화물 사슬의 변형은 재조합 생산 시스템 이용에 의해 도입될 수 있다. 효모 세포, 균주세포, 곤충세포 및 포유동물 세포들을 비롯한 원핵세포 및 진핵세포 배양 모두 이용될 수 있다. 예컨대, COS 세포들 및 CHO 세포들은 적절한 포유동물 생산 시스템이다. 포유동물 세포 배양 시스템은 시아릴레이트(sialylated)된 탄수화물 그룹이 있는 글리코단백질을 생산하기 위한 능력을 가짐에도 불구하고, 최적의, 자연적인 또는 완전한 글리코실화는 달성하는 것은 많은 경우 어렵고, 결과적으로, 재조합적으로 생산된 글리코단백질은 일반적으로 자연적인 카운터파트들보다 상이한 글리코실화 패턴을 가진다. 보통 이러한 상이한 글리코실화 패턴은(자연적인 카운터파트들과 비교해볼 때) 노출된 갈락토스, N-아세틸글루코사민 및/또는 만노스 잔기들을 가지고 불완전하다. 유사하게, 효모들 또는 진균들과 같은 진핵 미생물들 내 C1INH의 생산은 노출된 만노스 잔기들을 가진 C1INH를 결과적으로 가져올 것이다.
변형된 탄수화물 구조물들을 가진 C1INH은 또한 형질전환 동물들, 좋게는, 형질전환 래빗들, 소들, 마우스들, 래트(rat)들, 염소들 및 양들을 비롯한 비인간 동물들에서 제조될 수 있다. 좋게는, 상기 글리코단백질들은 이러한 비인간 형질전환 동물들의 유선에서 발현되므로, 상기 글리코단백질들은 동물들의 젖으로부터 수득될 수 있다. 당업자라면 어떠한 형질전환 동물이 생산을 위해 사용하기에 가장 좋을지에 대하여 생산되는 특이적 글리코단백질과, 생산되어야 하는 양에 의존되는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서 사용을 위한 특히 바람직한 C1INH는 형질전환 소 또는 라고몰파(Lagomorpha) 목, 레포리대(Leporidae) 과 , 더 좋게는 오릭토라거스(Oryctolagus) 속 그리고, 가장 좋게는 오릭토라거스 커니컬러스(Oryctolagus cuniculus) 종의 래빗으로부터 수득되는 C1INH이다.
C1INH 단백질의 탄수화물 사슬 구조에 대한 상이한 유형의 변형들은 그것의 자연적인 혈장 유래 카운터파트와 비교해 볼 때 상이한 글리코실화를 비롯한 재조합 생산 시스템으로부터 수득될 수 있고, 언더글리코실화 또는 오버글리코실화는 별개로 또는 조합하여, 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있고, 몇몇 유형들은 분자 일부분에 도입될 수 있는 반면, 다른 유형들은 분자의 다른 부분에 도입될 수 있다. 단백질들의 치료적 효능에 기여하는 변형들의 바람직한 조합들은 본 발명의 C1INH 상에 노출된 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코세아민, 만노스, 퓨코스 및/또는 포스포만노스 잔기들을 포함한다. 본 발명의 C1INH은 예컨대, 올리고만노스 유형 또는 하이만노스(highmannose) 유형의 글리칸들을 가질 수 있다. 좋게는, C1INH에서 글리칸 상에 말단 잔기들의 최소한 약 5, 10, 15, 20, 40 또는 60%는 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코세아민, 만노스, 퓨코스 및 포스포만노스 잔기들로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용을 위한 선호된 C1INH는 자연적인 카운터파트와 비교해 볼 때 약 2, 4, 5, 6배 적은 시알산을 포함하고/거나 그것의 N-결합된 글리칸들의 최소한 약 5, 10, 15, 20, 40 또는 60%는 만노스 및 N-아세틸글루코사민을 비롯한 이쿼토리얼(equatorial) 3- 및 4-OH 그룹들이 있는 말단 헥소오스를 가지는 중성(neutral)이다. 대조적으로, 혈장 유래된 C1INH는 올리고만노스 유형 글리코실화를 가지지 않는다. 본 발명에서 사용을 위한 선호되는 C1INH는 예컨대, 자연적인 카운터파트와 비교해볼 때 5-6배 적은 시알산을 가지는 래빗의 유선에서 생산되는 재조합 인간 C1INH이고, N-결합된 글리칸들의 약 15%는 말단 만노스 잔기들을 가진 중성이다.
선호된 구체예에서, 본 발명에서 사용을 위한 C1INH의 상이한 글리코실화는 그것의 혈장 유래된 카운터파트들과 비교해 볼 때 만노스 결합 단백질을 위한 더 높은 친화력이 생긴다. 만노스 결합 단백질(MBP)은 만노스-결합 단백질, 만노스-결합 렉틴( MBL), 만난-결합 렉틴, 또는 살균 Ra-반응성 인자로서 또한 언급된다. MBP는 용해성 Ca2+-의존성(C-유형) 렉틴들의 그룹에 속하는 콜렉틴(collectin)이다. MBP는 렉틴 경로(보체 활성화의 전형적이고 대안적 경로들과 다른)를 통한 보체의 활성자이다. 보체 시스템은 선천적인 면역 방어의 중요한 구성성분이고, 세가지 경로: 전형적인 경로, 대안적 경로, 및 최근 발견된 렉틴 또는 만노스 결합 렉틴(MBL) 경로에 의해 활성화된다.
촉매적 도메인 C1r 및 C1s가 인식 단백질 C1q 을 통해 면역 복합체에 결합할 때, 전형적인 경로의 활성화는 시작된다(도 11 참고).
대안적 경로는 항체 독립적 방식으로 느린 속도로 연속적으로 전환되어(turn over), 보체에 대하여 특이적으로 보호되지 않는 입자들을 공격할 것이다.
렉틴 또는 MBL 경로는 다양한 병원균 또는 다른 세포적 구조들 상에 존재하는 탄수화물 구조물들에 MBL가 결합함으로써 개시되거나 활성화된다. 2개의 세린 프로테아제들: 만난-결합 렉틴 연관된 세린 프로테아제(MASP)-1 및 -2(도 11 참고)들은 MBL과 관련있고, 세린 프로테아제들 C1s와 C1r과의 현저한 유사성을 나타낸다. 이 복합체는 만난에 결합하면 C4- 및 C3-활성화 능력들을 가진다. 이 복합체들은 이황화결합에 의해 연결된 2개의 세린 프로테아제들 MASP-1 및 MASP-2 를 포함한다. 이러한 형태에서, MASP는 C4 및 C3를 분해할 수 있고, 그 결과 그 활성화가 일어난다. 본 발명의 C1INH는 좋게는 그것의 혈장 유래된 카운터파트와 비교할 때 인간 MBP에 관한 높은 친화력을 가진다.
MBP는 만노스 및 N-아세틸글루코사민 및/또는 N-아세틸-헥소사민을 비롯한 이쿼토리얼 3- 및 4-OH 그룹이 있는 노출된 헥소스를 인지한다. 본 발명의 선호된 C1INH는 그러므로 그러한 말단 헥소스를 가진다. MBP, 좋게는 본 발명의 C1INH의 인간 MBP를 위한 높은 친화력은, 좋게는, 노출된 만노스 및 N-아세틸글루코사민 잔기들을 결여하는, 자연적으로 혈장 유래된 카운터파트들과 비교할 때 MBP의 더 효율적인 타겟팅, 결합 및/또는 억제를 가능하게 하는 그런 것이다. 여기에서 인간 MBP는 Taylor 등(1989, Biochem. J. 262(3), 763-771; NCBI accession no. CAA34079)에 의해 기재되는 바와 같은 아미노산 서열을 가지는, Kawasaki 등(1983, J. Biochem 94:937-47)에 의해 특징되는 단백질을 언급하는 것으로 이해된다. 올리고사카라이드와 복합화된 래트 MBP의 구조는 Weis 등에 의해 기재되어 있다(1992, Nature. 360:127-34). 인간 MBP의 추가적인 기재는, 예컨대, US 6,846,649 및 거기에 인용된 참조문헌들을 참고하라.
이러한 모든 경로들(전형적, 대안적 및 렉틴 또는 MBL)은 결과적으로 막 공격 복합체(MAC 또는 C5b-C9)의 집합(assembly)을 이끌어내는 중대한 효소적 활성을 생성한다(도 11 참고). 생리학적 조건에서, 보체 시스템의 활성화는 용해성 및 막-연결된 조절 단백질들의 조화된 작용에 의해 효과적으로 조절된다. 이러한 단백질들 중 하나는 C1 억제제(C1INH)인데, 전형적 경로의 현재 유일하게 알려진 생리적 억제제이자 C1s 및 C1r에 결합하는 세린 프로테아제 억제제이다. 추가적으로, C1INH는 MASP-1 및 MASP-2 결합 및 억제에 의한 MBL-매개된 보체 활성화를 비활성화시킬 수 있다.
상이한 보체 경로의 활성화는 좋게는 Wielisa 키트(product no. COMPL 300, Wieslab, Sweeden)에 의해 인간 혈청에서 측정된다. 이것은 일상적인 해독으로써 C5b-C9의 침착과 함께 각각의 3개의 보체 경로들을 측정하기 위해 특이적인, 상업적으로 이용가능한 효소 면역 분석이다. 간단히 말해서, 마이크로타이터 스트립들의 웰들은 각각의 3개의 보체 경로의 특이적 활성자들로 코팅된다. 인간 혈청은 오직 각각의 경로들이 활성화된다는 것을 보증하기 위해 특이적 차단제를 포함하는 희석제 내에서 희석된다. 본 발명의 C1INH 또는 그것의 혈장 유래된 카운터파트는 0 내지 75 μmol 사이 범위의 농도에서 더 추가되고, 실온에서 30분동안 인큐베이션되고, 웰들에 추가된다. 웰에서 60분동안 37℃에서 희석된 인간 혈청의 추가적인 배양동안, 보체는 특이적 코팅에 의해 활성화된다. 그 웰들은 그리고나서 세척되고, 형성된 C5b-C9는 항 C5b-C9 항체로 표지된 특이적 알칼린 포스파타제로 검출된다. 추가적인 세척 단계후에, 특이적 항체들의 검출은 알칼린 포스파타제 기질 용액으로 배양에 의해 수득된다. 보체 활성화의 양은 색깔 강도와 서로 관련 있고, 흡광도(광학 밀도 OD)로 측정된다. 이 키트를 이용하여, 본 발명의 인간 C1INH(rhC1INH) 및 혈장 유래된 C1INH(pdC1INH) 모두는 전형적인 경로를 위한 유사한 억제 능력을 가지는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발명의 C1INH는 플라즈마 유래 C1INH 보다 MBL 경로에 대하여 약 20% 더 억제 능력을 가지는 것으로 나타났다(실시예 3 참고).
그러므로, 따라서, 이 선호된 구체예에서, 본 발명에서 사용을 위한 C1INH의 상이한 글리코실화는 그것의 혈장 유래된 카운터파트들과 비교할 때 MBP에 대한 더 높은 친화력을 가져오고, 이것은 MBP의 더 효율적인 억제를 가져오고, 렉틴 경로의 더 효율적인 억제를 가져온다. 렉틴 경로의 더 효율적인 억제는 좋게는, 최소한 5% 더 억제, 좀 더 좋게는 최소한 10% 더 억제, 좀 더 좋게는 15% 더 억제, 좀 더 좋게는 20% 더 억제, 좀 더 좋게는 25% 더 억제, 좀 더 좋게는 30% 더 억제, 좀 더 좋게는 35% 더 억제, 좀 더 좋게는 40% 더 억제, 좀 더 좋게는 45% 더 억제, 좀 더 좋게는 50% 더 억제, 좀 더 좋게는 55% 더 억제, 좀 더 좋게는 60% 더 억제, 좀 더 좋게는 65% 더 억제, 좀 더 좋게는 70% 더 억제 , 좀 더 좋게는 75% 더 억제 , 좀 더 좋게는 80% 더 억제, 좀 더 좋게는 85% 더 억제, 좀 더 좋게는 90% 더 억제, 좀 더 좋게는 95% 더 억제, 가장 좋게는 98% 더 억제하는 것을 의미한다. 렉틴 경로의 활성화는 좋게는 상기한 바와 같이 Wielisa 에 의해 측정된다.
본 발명의 방법은 임의의 종류의 허혈 및 재관류 손상을 예방, 감소 또는 치료하기 위해 적용될 수 있다. 좋게는, 본 발명의 방법은 허혈 및 재관류 손상이 최소한 부분적으로 일으키는 것으로 알려져있고, 더 좋게는, 대부분이 렉틴 경로를 통해서 일어난다는 것이다. 심근 허혈 및 재관류 손상(J Immunology 2005, 175: 541-546), 신장 허혈-재관류 손상(Am J Pathol. 2004 165(5):1677-88), 위장 내 허혈 재관류 손상(J Immunol. 2005 15:174(10):6373-80), 및 뇌졸증(deSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63)에 대하여는, 재관류 손상은 대부분 렉틴 경로를 통해 대부분 일어나고 전형적 경로를 통해서는 거의 일어나지 않는다. 그러나, 본 발명의 C1INH는 좋게는 자연적 혈장 유래된 카운터파트와 비교해 볼 때 렉틴 경로의 더 우수한 억제제이다. 좋게는 본 발명의 C1INH는 그것의 자연적 혈장 유래된 카운터파트와 비교해볼 때 인간에서 렉틴 경로의 더 우수한 생체 내(in vivo) 억제제이다.
여기에 실시예에서 사용된 실험적 모델과 다르게, 실생활에서 허혈의 발생은 대개 예견치 못한 사건이다. 그러므로, 허혈의 발생 및/또는 그 다음의 재관류에 앞서 C1INH의 투여는 일반적으로 실행가능한 옵션이 아니고, 실제로 불가피하게 C1INH는 허혈 및/또는 그다음의 재관류 후에 몇시간 후는 아니더라도, 어느 시점에 투여될 것이다. 이것은, 그러나, 심각하게 종래의 혈장 유래 C1INH의 치료적 유용성을 제한하는데, 왜냐하면, 허혈 재관류 후에 투여될 때 대부분 비효과적이고, 치료적 효능을 위해 매우 작은 시간 범위를 오직 가지기 때문이다(도 1 및 deSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63 참고). 대조적으로, 상기한 바와 같이 본 발명에서 사용을 위한 C1INH는 최소한 허혈 후 1시간 또는 허혈 직후 및/또는 재관류 시작 후 30분동안에 주입될 때 또한 그것의 신경 보호적 효과를 여전히 발휘할 수 있다. 그러므로, 최소한 하나의 예견되지 않은 또는 예견된 허혈 및 재관류 손상의 발생의 예방, 감소 또는 치료를 위한 방법의 선호된 구체예에서, 본 발명의 C1INH는 허혈 기간 후, 또는 허혈기간 끝에, 즉, 허혈 조직이 재관류 되는 때 투여된다. 더 좋게는, 본 발명의 C1INH는 허혈 기간 또는 재관류 시작 후에 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 또는 120 시간에 투여된다. 좋게는, 본 발명의 C1INH는 허혈 후 또는 허혈 및/또는 재관류 개시 후 단지 24, 12, 6, 4 또는 3시간 이내에 투여된다. 다른 선호된 구체예에서, C1 억제제는 허혈 후 또는 허혈 및/또는 재관류 개시 후 최소한 3시간 후에 투여되고, 좋게는, 최소한 6시간, 더 좋게는 최소한 9시간, 심지어 좋게는 18시간 후에 투여된다.
선호된 구체예에서, 본 방법은 허혈 재관류의 갑작스런 또는 급성, 예상치못한 발생을 예방, 감소 또는 치료하기 위해 적용된다. 허혈 재관류 손상의 갑작스런 또는 급성, 예상치못한 발생과 관련된 상태들 및 질환들은 이것에 제한되는 것은 아니지만, 급성 심근 경색후, 주산기(perinatal) 뇌졸증을 포함하는 뇌졸증 후, 출혈 쇼크 후, 장 허혈 후, 실패된 경피 경관 관상동맥 성형술(PCTA, percutaneous transluminal coronary angioplasty)로 인한 비상 동맥 수술 후, 혈관 교차 클램핑(예컨대, 골격근 허혈을 일으키는 대동맥의 클램핑)을 하는 임의의 혈관 수술 후, 또는 췌관 또는 담관(ERCP)의 처치 후 췌장염 후의 허혈 재관류를 포함한다. 일 예에서, 본 발명을 위한 C1INH는 좋게는 급성 심근 경색 후, 주산기(perinatal) 뇌졸증을 포함하는 뇌졸증 후, 출혈 쇼크 후, 장 허혈 후, 실패된 PCTA(percutaneous transluminal coronary angioplasty)로 인한 비상 동맥 수술 후, 혈관 교차 클램핑(예컨대, 골격근 허혈을 일으키는 대동맥의 클램핑)을 하는 임의의 혈관 수술 후, 또는 췌관 또는 담관(ERCP)의 처치 후의 췌장염 후 최소한 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 또는 120분 후에 투여된다. 또 다르게, 본 발명의 C1INH를 투여하는 시간은 재관류 개시후 좋게는 최소한 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 또는 120분 후로 규정된다.
또한, 예상치못한 허혈 재관류 손상은 좋게는 허혈 재관류 손상으로 정의되고, 치료 또는 수술은 허혈이 아닌 재관류를 유도한다. 그러한 치료 또는 수술은 이것에 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함한다:
- 약리학적 혈전증, 뇌졸증을 위한 정맥내 및 혈관내 치료를 포함한, 급성 관상(coronary) 증후군, 말초 동맥 폐색, 폐 색전, 콩팥 동맥 폐색,
- 기계적 혈전증, 예컨대, 경피적 관상 동맥 중재술, 말초 동맥 혈관확장술, 내장근 동맥 혈관확장술,
- 관상 동맥 우회술,
- 경동맥 내막절제술(carotid endarterectomy) ,
- 장간막 허혈(mesenteric ischemia),
- 출혈성, 심장성, 신경성, 아나필락시(analphylactic)를 포함한 쇼크
- 플랩-페일(flap-failure), 예컨대, 성형 수술,
- 손가락, 발가락(digit) 및 사지(limbs)의 재이식,
-교액된 장(strangulated bowel).
또 다르게, 다른 선호된 구체예에서, 방법은 허혈 재관류의 예견된 발생을 예방, 감소 또는 치료하는데 적용된다. 허혈 재관류 손상의 예견된 발생은 좋게는 치료 또는 수술이 허혈 및 그 다음의 재관류를 모두 일으키는 셋팅을 포함한다. 비제한적 리스트는, 뒤이어 재관류가 일어나는, 혈류가 낮거나 전혀없는 즉, 허혈 또는 저산소증의 유도된 일시적 기간이 있는 하기 치료 또는 수술이 주어진다:
- 심폐 바이패스(cardiopulmonary bypass)
- 대동맥, 뇌동맥을 포함하는 동맥류 복구,
- 클램프가 수술동안에 사용되는 경동맥 내막절제술,
- 초 저체온 완전 순환 정지법,
- 지혈대 사용, 즉, 외상 셋팅에서,
- 고형 장기 이식,
- 의원성 기타 혈류 장애.
또한, 허혈 재관류 손상의 예견된 발생과 관련있는 상태 및 질환들은 이것에 제한되는 것은 아니지만, 장기(폐, 간, 신장, 심장)이식 후, 혈관 교차 클램핑(예컨대, 골격근 허혈에 이르는 대동맥 클램핑)을 하는 임의의 혈관 수술 후, 또는 췌관 또는 담관(ERCP)의 처치 후의 췌장염 후, 체외 순환법(ECC, extra corporal circulation) 동안 또는 후의 허혈 재관류 손상을 포함한다.
허혈 및 재관류 손상의 예견된 발생의 최소한 하나의 예방, 감소 또는 치료를 위한 방법의 선호된 구체예에서, 본 발명의 C1INH는 최소한 허혈 기간의 종료 또는 후에 즉, 허혈 조직이 재관류될 때, 투여된다. 더 좋게는, 본 발명의 C1INH는 재관류의 시작 후 또는 허혈 기간 후, 최소한 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 또는 120분에 투여된다. 좋게는, 본 발명의 C1INH는 허혈 개시 및/또는 재관류 개시 후 또는 허혈 후 단지 24, 12, 6, 4 또는 3시간에 투여된다. 다른 선호된 구체예에서, C1 억제제는 허혈 후 또는 허혈 및/또는 재관류 개시 후 최소한 1시간, 허혈 후 또는 허혈 및/또는 재관류 개시 후 최소한 3시간, 좋게는, 최소한 6시간, 더 좋게는 최소한 9시간, 더욱 더 좋게는 최소한 18시간에 투여된다.
또 다르게, 본 발명의 다른 면에서, 방법은 허혈 및 재관류 손상의 최소한 하나의 예견된 발생의 예방, 감소 또는 치료를 위해 제공되고, 본 발명의 C1INH는 허혈 및 재관류 동안 또는 전에 투여된다. 당업자라면 가능한 최선의 결과를 얻기 위해 본 발명의 C1INH의 혈장 반감기에 따라, 본 발명의 C1INH가 투여될 수 있는 가능한 가장 이른 시점을 조절할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 선호된 구체예에 따라, 본 발명의 C1INH는 필요로 하는 대상 및/또는 장기 이식의 경우에 이식되는 장기에 대하여 연속적으로 투여된다. 이식되는 장기는 좋게는 C1INH의 적절한 양과 적절한 배지를 포함하는 조성물 내에 보존된다.
또 다르게, 또는 전에 선호된 구체예와 조합하여, 허혈 및 재관류 손상의 예견된 유형의 발생 전이라는 것은, 투여가 허혈 및 재관류의 적어도 하나의 예견된 발생 전에 최대 3시간, 좋게는, 최대 2시간, 더 좋게는 최대 1시간 그리고 가장 좋게는 최대 30분에 수행된다는 것을 의미한다.
그것을 필요로 하는 대상은 허혈 및 재관류 손상의 예견된 발생이 일어날 수 있는 대상이다. 허혈 및 재관류 손상의 예견된 발생은 이미 여기에 기재되어 있다.
허혈 및 재관류 손상의 예견된 발생 전에 C1INH를 투여하는 것이 좋은데 그 이유는, 더 좋지는 않더라도, 허혈 및 재관류 손상 후에 C1INH가 투여될 때 존재하는 것과 동일한 방법으로, 허혈 및 재관류 손상과 관련된 모든 손상은 아니지만 대부분의 손상의 발생을 막을 수 있기 때문이다.
더 선호된 구체예에서, 본 방법은 허혈 재관류의 예상치못한 발생에 적용된다. 더욱 더 좋게, 허혈 재관류 손상은 뇌졸중 또는 주산기(perinatal) 뇌졸증 후 일어난다. 허혈 재관류의 예상치 못한 이러한 유형의 발생에서, 본 발명자들은 본 발명의 C1 억제제가 허혈 경계영역(penumbra)에서 신경보호 효과를 발휘한다는 것을 입증하였다. 허혈 경계영역은 좋게는, 해마 및/또는 피질을 의미한다. 신경보호적 효과는 좋게는 신경변성이, 해마에서 허혈 개시후 3시간까지, 피질에서 허혈 개시후 9시간까지 본 발명의 C1 억제제로 처리후 해마 및/또는 피질에서 저지된다. 더 좋게, 신경 변성은 허혈에서 10, 11, 12 시간 이상까지, 해마에서 4, 5, 6 시간 이상까지 저지된다. 신경변성은 좋게는 실시예 2 에서와 같이 평가된다: 뇌 절편이 신경 변성에 특이적인 마커, 좋게는 Jade(Schmued LC, et al, reference 4)로 염색되고, 형광 현미경에 의해 분석된다. 이 방법을 이용하여, 신경변성의 저지는 비처리된 샘플들과 비교되어 처리된 샘플들에서 최소한 2% 덜 염색된 세포들이 시각화됨을 의미한다. 좋게는, 신경변성의 저지는 최소한 5% 덜 염색된 세포들, 최소한 7%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40% 또는 그 이상 덜 염색된 세포들을 의미한다.
또 다르게 또는 전에 언급된 실시예와 조합하여, C1 억제제의 사용은 허혈 및/또는 재관류에 의해 유도된 손상을 감소시킨다. 더 좋게는, 뇌졸증 또는 주산기 뇌졸증 후 허혈 재관류 손상이 일어날 때, 본 발명의 C1 억제제의 사용이 경색 크기를 감소한다. 더 좋게는, 경색 크기가 실시예 2에서 나타난 바와 같이 정량된다. 더욱 더 좋게, 이러한 정량 방법을 이용하여, 허혈의 개시 후 최소한 3시간, 경색 크기의 최소한 10%의 감소에 도달하고, 더욱 더 좋게는, 최소한 20%, 더욱 더 좋게는 40%, 더욱 더 좋게는 60%, 더욱 더 좋게는 70%, 더욱 더 좋게는 80%, 그리고 가장 좋게는 최소한 90%의 감소에 도달한다.
본 발명의 방법에서 사용을 위한 C1INH는 약학적 조성물의 상태와 함께 조합되거나 부분이 될 수 있다. 이러한 약학적 조성물들은 전형적으로 C1INH 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 약학적 조성물들은 국부 또는 전신 치료가 바람직한지, 치료되는 영역 및 활성 화합물의 안정성에 따라 여러가지 방법으로 투여될 수 있다. 적절한 제형은 투여 방법에 따라 좌우될 것이다. 약학적 조성물은 좋게는 예컨대, 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 척수강내 또는 두개내 투여에 의한 것을 비롯한 비경구 투여에 의해 투여된다. 선호된 구체예에서, 정맥 주입에 의해 그것이 주입된다. 비경구 투여를 위한 적절한 제형은 기술분야에 알려져 있고, 전형적으로 액상 제형이다. 비경구 투여를 위한 C1INH 제조는 멸균이어야 한다. 멸균화는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 필터막을 통해 필터에 의해 쉽게 달성된다. C1INH 제조는 주입 또는 볼루스 주입에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 액상 C1INH 제형은 예컨대 주입 펌프에 의해 투여될 수 있다. 정맥 내 주입을 위한 전형적인 조성물은 임의로 20% 알부민이 보충된, 0.9% NaCl 또는 5% 글루코스 무균의 100 내지 500ml 용액 및 100 내지 500mg의 C1INH을 포함한다. 근육 내 주사를 위한 전형적인 약학적 조성물은 예컨데, 1-10ml의 무균 완충된 물 및 1 내지 250mg의 본 발명의 C1INH를 포함하여 만들어진다. 비경구적으로 투여가능한 조성물들을 만들기 위한 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)을 포함한 다양한 소스에서 상세하게 기재된다(모든 목적을 위해 전체로써 참고되어 포함된다).
유효량, 즉, 본 발명의 방법에서 사용될 때, C1INH의 효과적인 농도 및 빈도는 사용되는 특이적 약학적 조성물, 상태의 중증도 및 환자 건강의 일반적인 상태 에 좌우될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법에서 사용을 위한 C1INH에 기한 약학적 조성물의 유효 투여량은 일반적인 최적화에 의해 발견될 수 있다. 적절한 시작점은 혈장 유래된 C1INH에 근거된 동등한 약학적 조성물을 위해 사용되는 투여량이다. 본 발명의 약학적 조성물의 가장 큰 장점은 치료에서 사용될 수 있는 초기 높은 투여량이고, 이것은 성공적인 치료가능성을 높여준다. 높은 초기 투여량은 가능한데 그 이유는, 본 발명의 약학적 조성물 내에 C1INH가 그것의 자연적 카운터파트보다 빠른 제거를 나타내기 때문이다. 급성인 경우를 치료하는 경우 특별히, 본 발명의 C1INH 의 높은 초기 투여량은 유익할 수 있다. 이 높은 초기 투여량은 투여되는 자연적으로 일어나는 카운터 파트들의 최소한 1.5, 최소한 2, 3, 4 배일 수 있다.
선호된 구체예에서, 본 발명의 C1INH는 정맥내로 50, 100, 200, 400, 600, 800, 또는 1000 U/kg 체중을 초과하는 투여량으로, 좋게는 개체의 50-2000, 100-1000, 200-800, 400-700 또는 500-700 U/kg 체중 범위내에서 투여된다. C1INH의 하나의 유닛(U)은 1 밀리리터의 인간 혈액 내에 존재하는 C1INH의 양이다. 그러한 하나의 유닛은 약 275 마이크로그램 혈장 유래된 C1INH와 상응한다. 110,000 달톤의 분자량을 가정해 볼 때, C1INH의 인간 혈장 내 농도는 리터당 2.5 마이크로몰이다(Nuijens et al.(1989), J. Clin. Invest. 84:443).
본 발명의 방법의 추가적인 선호된 구체예에서, 약학적 조성물은 추가적으로 혈전용해제를 포함하고, 사용을 위해 혈전용해제와 조합되거나, 그러한 작용제로 처리한 다음에 사용된다. 혈전 용해제는 여기에서 혈액 클럿(혈전)을 용해할 수 있고, 동맥 또는 정맥을 다시 열 수 있는 작용제(약물)를 의미하는 것으로 이해된다. 혈전용해제는 보통 세린 프로테아제이고, 플라스미노겐에서 피브리노겐 및 피브린을 분해하고 클럿을 용해하는 플라스민으로 전환한다. 선호되는 혈전용해제는 레테플라제(r-PA 또는 Retavase), 알테플라제(t-PA 또는 Activase), 유로키나제(Abbokinase), 프로유로키나제, 아니솔레이트된 정제된 스트렙토키나제 활성자 복합체(APSAC), 및 스트렙토키나제를 포함한다.
추가적인 면에서, USA 이외의 관할지에서 특히, 본 발명은 상기 기재된 임의의 방법들에 따라 재관류 손상의 예방, 감소 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 여기에 기재된 바와 같은 본 발명의 C1INH의 용도에 관한 것이다.
이 문헌 및 청구항에서, "포함하는(to comprise)"라는 동사 및 그 활용형은 이 단어의 다음에 오는 항목들을 포함하는 것을 의미하기 위해 비제한적 개념으로 사용된 것이지만, 특이적으로 언급된 항목이 아니면 배제되지 않는다. 또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 구성요소에 관한 참고는, 문맥에서 분명하게 그것이 하나 및 오직 구성요소의 하나를 요구하는 것이 아니면, 구성 요소의 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 부정 관사 "a" 또는 "an"은 그리하여, "최소한 하나"를 보통 의미한다.
도 1 허혈 전, 후, 및 1시간 후 마우스 당 식염수 또는 15UrhC1INH(재조합 인간 C1INH, 실시예 1.2 참고)로 처리된 마우스들의 허혈 후 48시간 경색 크기의 평가.
도 2 허혈 전, 후, 및 1시간 후 마우스 당 식염수 또는 15U 혈장 유래된 hC1INH로 처리된 마우스들의 허혈 후 24시간 경색 크기의 평가.
도 3 허혈 초기로부터 상이한 시점에서 식염수 또는 래빗 rhC1-INH의 15U/마우스를 받는 마우스들의 허혈 후 48시간 평가된 폐색 부피이다. 데이터는 평균: SEM(그룹당 n=6 마우스들)로써 표현된다. *P<0.05, **P<0.01 대 식염수, 일원 ANOVA 및 사후 검정 시험으로서 Dunnett.
도 4 플루오로-제이드 염색의 반(semi)-정량 분석. - = 양성없음, += 낮은 양성, ++=중간 양성, +++= 높은 양성.
도 5 허혈의 개시로부터 상이한 시점들에서 래빗 rhC1-INH의 15U/마우스 또는 식염수를 받는 허혈 마우스들의 스트리아텀에서 플루오로-제이드 염색에 의한 신경변성(neurodegeneration )의 대표적인 이미지. 막대: 100㎛.
도 6 허혈의 개시로부터 상이한 시점들에서 래빗 rhC1-INH의 15U/마우스 또는 식염수를 받는 허혈 마우스들의 치아 이랑(dentate gyrus)에서 플루오로-제이드 염색에 의한 신경변성(neurodegeneration)의 대표적인 이미지. 막대: 100㎛.
도 7 허혈의 개시로부터 상이한 시점들에서 래빗 rhC1-INH의 15U/마우스 또는 식염수를 받는 허혈 마우스들의 피질에서 플루오로-제이드 염색에 의한 신경변성(neurodegeneration )의 대표적인 이미지. 막대: 100㎛.
도 8 허혈 개시후 3시간 후에 식염수 또는 5, 10, 15U/마우스 래빗 rhC1-INH를 받는 마우스들의 허혈 후 48시간 평가된 폐색 부피. 데이터는 평균 : SEM(그룹당 n=6 마우스들)로써 표현된다. **P<0.01 대 식염수, 일원 ANOVA 및 사후 검정 시험으로서 Dunnett.
도 9 허혈 개시 후 3시간 후에 식염수 또는 15U/마우스 pdC1-INH 또는 소(cow)의 rhC1-INH 또는 래빗의 rhC1-INH를 받은 마우스들의 허혈 후 48시간에 평가된 폐색 부피. 데이터는 평균: SEM(그룹당 n=6 마우스들)로써 표현된다. *P<0.05, **P<0.01 대 식염수, 일원 ANOVA 및 사후 검정 시험으로서 Dunnett.
도 10 허혈 개시 후 3시간 후에 15U/마우스 pdC1-INH 또는 소(cow)의 rhC1-INH 또는 래빗의 rhC1-INH를 받은 마우스들의 허혈 후 48시간 평가된 폐색 부피이다. 데이터는 평균: SEM(그룹당 n=6 마우스들)로써 표현된다. **P<0.01 대 식염수, 일원 ANOVA 및 사후 검정 시험으로서 Kruskal-Wallis.
도 11 보체 활성화의 상이한 경로들의 개요
도 12, 13 전형적 보체 경로의 활성화에 있어서의 rhc1INH 및 pdC1INH의 효과. rhC1INH 또는 pdC1INH의 투여량을 증가시키면서(x-축) 정상 인간 혈청의 두개의 상이한 샘플에 첨가하였다(윗 패널에 샘플 1. 아래 패널에 샘플 2). 대조군으로써, rhC1INH이 용해되는(20 mM 구연산염, 0.19 M 당 pH 6.8; 0.22㎛ 필터된) 버퍼를 rhC1INH와 동일한 희석으로 취하였다. 판독(readout)은 C5b-9의 침착에 대하여 하고, 분석에 사용한 정상 혈청 대조군을 100%(y축)로 하였다. 데이터는 평균 및 SD(n=3)이었다.
도 14, 15 MBL 보체 경로의 활성화에 있어서의 rhc1INH 및 pdC1INH의 효과. rhC1INH 또는 pdC1INH의 투여량을 증가시키면서(x-축) 정상 인간 혈청의 두개의 상이한 샘플에 첨가하였다(윗 패널에 샘플 1. 아래 패널에 샘플 2). 대조군으로써, rhC1INH이 용해되는(20 mM 구연산염, 0.19 M 당 pH 6.8; 0.22㎛ 필터된) 버퍼를 rhC1INH와 동일한 희석으로 취하였다. 판독(readout)은 C5b-9의 침착에 대하여 하고, 분석에 사용한 정상 혈청 대조군을 100%(y축)로 하였다. 데이터는 평균 및 SD(n=3)이었다.
도 16 전형적 및 MBL 보체 경로의 활성화에 있어서의 rhc1INH 및 pdC1INH의 효과. rhC1INH 또는 pdC1INH의 투여량을 증가시키면서(x-축) 정상 인간 혈청의 두개의 상이한 샘플에 첨가하였다(윗 패널에 샘플 1. 아래 패널에 샘플 2). 대조군으로써, rhC1INH이 용해되는(20 mM 구연산염, 0.19 M 당 pH 6.8; 0.22㎛ 필터된) 버퍼를 rhC1INH와 동일한 희석으로 취하였다. 판독(readout)은 C5b-9의 침착에 대하여 하고, 보체 활성화 퍼센트는 다음 식으로 측정치 당 계산되었다:(샘플-NC)/(PC-NC)x100. PC는 100%으로 하였다. 결과는 각각의 시험된 농도에서 3개의 독립 베더닝(verdunning)의 평균 SD값을 나타냈다.
실시예
1
선행한 실험들은, 혈장 유래 C1INH와 매우 유사한 방식으로, 본원의 대뇌의 허혈 병소의 마우스 모델에서 허혈 48시간 후에 측정하였을 때, 허혈 기간의 시작점에서 측정된 1회 투여량의 rhC1INH(15U/마우스)는 허혈 부피를 상당히 감소시키는 것을 보여주었다. 이 실시예에서, 본 발명자는 허혈 부피 및 기능 결손에 미치는 rhC1INH 신경보호활성의 효능에 대한 시간 범위를 연구하였다. 본 발명자는, 신경변성(neurodegeneration) 및 글리아 반응(glial response)을 측정함으로써 7일간 결과에 대해 rhC1INH의 효능을 연구하였다.
1. 방법
1.1 일시적인 국소 대뇌 허혈
이전에 기술한 바와 같이(De Simoni et al., 2003 및 2004, 상기문헌), 중간 대뇌동맥 폐색(MCAO)으로 허혈을 일으켰다. N2O/O2(70/30%) 혼합물 중의 5% 이소플루란으로 마취시키고, 상기와 동일한 혼합물 중의 1.5-2% 이소플루란으로 마취를 유지하였다. 각 동물에서 혈관 폐색이 적당히 되었는지를 확인하기 위해서, 하기의 좌표: AP = -1mm; L= -3,5mm에서, 뇌 표면에 배치되고, 두개골 위에 인상재로 고정된, 플렉서블 0.5 mm 광섬유 프로브(Transonic, Type M, 0.5 mm 직경)를 사용하는 레이저 도플러 유량계(flowmetry)(Transonic BLF-21)로 혈류를 측정하였다. 간단히 말하면, 오른쪽 총경동맥을 노출시키고, 총경동맥 상에 수행된 절개를 통해 실리콘 처리된 필라멘트(7-0)를 내부 경동맥으로 도입하여, 앞쪽 대뇌 동맥 및 MCA으로 분지되는 지점을 차단하도록 앞쪽 대뇌 동맥까지 넣는다. 허혈전 기준선(preischemic baseline)과 비교하여, 혈류가 70%를 초과하여 감소될 때까지 필라멘트를 넣었다. 허혈 30분 후에, 나일론 필라멘트를 조심스럽게 제거함으로써 혈류를 회복시켰다.
1.2 약물 처리
150㎕의 1회 분량의 15 U/마우스의 rhC1INH, 또는 동일한 양의 식염수를 허 혈 후 하기와 같은 상이한 시간 대에 마우스에게 1회 정맥 주사하였다:
- 허혈 기간 시작시(rhC1INH -pre)
- 허혈 기간 종료시(rhC1INH -post)
- 허혈 기간 시작 1시간 후(rhC1INH 1h -post)
본 연구에 사용된 rhC1INH는 WO 01/57079에서 기술된 바와 같이, 유선(mammary glands)에서 인간 C1INH를 발현하는 트랜스제닉 토끼에서 생성되어, 이들 동물로부터 수득된 밀크로부터 정제된 것이었다.
1.3 신경 손상의 평가
허혈 48시간 후에, 각 마우스를 마우스에 대해 특이적인 2개의 신경 기능 점수로 등급을 매겼는데, 이는 실험 조건에 대해 알지 못하는 숙련된 연구원을 통해 진행되었다. 전신 장애에 대해, 마우스를 0점 부터 28점까지 점수를 매겼는데, 그 범주는 다음과 같다: 털, 귀, 눈, 자세, 자발적인 활동, 간질 증세. 국소 장애에 대해서는 마우스를 0점부터 28점까지 점수를 매겼는데, 그 범주는 다음과 같다: 신체 좌우대칭(symmetry), 걷는 모양, 기어오르기, 돌기, 앞발 좌우대칭, 강제 돌기, 감각 반응. 데이터는 중간값(median) 및 25% 내지 75% 퍼센트(25th to 75th percentiles)로 표현한다.
1.4 경색 크기의 정량
허혈 48시간 후에, 마우스를 이퀴텐신(Equitensin(120 ㎕/마우스, ip)으로 깊게 마취시키고, 30 ml의 PBS 0.1 mol/ℓ, pH 7.4에 이어, PBS 중의 차가운 파라포름알데하이드(4%) 60 ml를 심장을 통해(transcardially) 관류시켰다. 두부에서 뇌를 조심스럽게 제거한 다음에, 이들을 동결방지(cryoprotection)를 위해 PBS 중의 30% 수크로스에 밤새 4℃에서 전달하였다. 이어서, 뇌를 -45℃에서 3분간 이소펜탄에 침지시킴으로써 신속하게 냉동시킨 다음에, 바이얼에 담아 밀봉하고, 사용하기 전에는 -70℃로 보관하였다. 병변 크기 측정을 위해서, 20 ㎛ 두정 뇌 절편(coronal brain section)을 240 ㎛ 간격으로 절단하고, 뉴트랄 레드(Neutral Red Gurr Certistain, BDH, England)로 염색하였다. 각각의 슬라이스에서, 경색된 부위는 대강 측정되었고, 이를 면역조직염색을 통해서 상대적으로 창백해 보이게 하여 윤곽을 잡았다. 경색된 부위는 각 절편에 대한 반대쪽 반구의 영역에서 같은쪽 반구내의 건강한 조직의 영역을 감산함으로써 측정하였다. 경색 부피는 컴퓨터 지원 이미지 분석기로 정량하고 Analytical Image System을 통해 계산된, 각 뇌 슬라이스 상의 경색된 부위를 더함으로써 계산되었다.
1.5 오픈 필드 테스트(
Open
field
test
)
오픈 필드 테스트를 통해서, 허혈 7일 후 마우스의 행동을 평가하였다. 이 테스트는 장기간 허혈 마우스에서, 불안 및 탐구 행동, 및 운동 활성(locomor activity)을 탐지하는데 유용하다. 오픈 필드는 4개의 물체를 함유하는 플라스틱 박스(41 x 41 x 41 cm)로 구성된다. 이 오픈 필드의 영역을 28 x 28 cm 중심 영역과, 이를 둘러싼 주위 영역으로 나누었다. 마우스를 오픈 필드의 중심에 각각 두고, 이들의 행동을 실험 조건에 대해 알지 못하는 연구원을 통해서 5분마다 관찰하도록 하였다. 내부를 횡단하는 수(주로 불안 행동과 관련)와, 외부를 횡단하는 수(주로 운동 활성과 관련), 후진하는 수(주로 탐색 행동과 관련) 및 물체와 접촉하는 수(주로 감각/운동 활성과 관련)를 세었다.
1.6 신경 계수
허혈 7일 후에, 마우스를 이미 기술한 바와 같이 심장을 통해 관류시켰다. 신경 수를 측정하기 위해서, 20 ㎛ 두정 뇌 절편을 640㎛ 간격으로 연속 절단하고, 크레실 바이올렛(Cresyl Violet acetate, Sigma, St. Louis, MO)으로 염색하였다. 같은 쪽 반구 및 반대쪽 반구로부터의 세 개의 20 ㎛ 절편을 신경 계수를 위해 선택하였다. 첫번째 절편은 정수리에서 정위좌표 전후방향 +0.86의 좌표에 있는 것이었다. 신경 손실의 양은, 반대쪽 반구의 %로서 표현되었고, 양 반구의 세개의 절편에서의 생존한 신경의 수를 합침으로써 계산되었다. Soft Imaging System Colorview 비디오 카메라 및 AnalySIS software와 인터페이스되는 Olympus BX61 현미경을 사용하였다. 정량 분석은, 처리 조건에 대해 알지 못하는 연구원으로 하여금, 40X 배율로 수행하도록 하였다.
1.7 성상세포 및
마이크로글리아에
대한 면역조직화학
허혈 7일 후에, 심장을 통해 관류시킨 허혈 마우스로부터 20 ㎛ 두께의 두정 절편을 만들고, 성상세포 및 마이크로글리아/마크로파지 면역염색의 측정을 위해 사용하였다. 간단히 말하면, 절편을 0.1 mol/L PBS 중의 0.4% Triton X-100으로 30분간 헹군 다음에, PBS 중의 0.1% Triton X-100 및 3% 정상 염소 혈청(NGS)으로 15분간 헹구었다. 절편을 성상세포 및 마이크로글리아에 대한 항체(항-GFAP 1:1500, Chemicon; 항-CD11b 1:250, Mario Negri Institute의 Dr. A. Doni 박사가 친히 기 증)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 절편을 PBS로 헹구고, 1시간 동안 바이오틴화 2차 항체와 인큐베이션한 다음에, 아비딘-바이오틴-퍼옥시다아제와 함께 인큐베이션하였다. 3',3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드와 반응시킨 다음에, 절편을 세척, 건조시키고, 그레이디드(graded) 알콜을 통해 탈수시킨 다음에, 자일렌으로 고정하고, CPX 마운턴트(mountant)를 사용하여 커버슬립을 덮은 후, 광학 현미경으로 분석하였다.
2. 결과
2.1 시간에 따른 효능 관찰
2.1.1. 신경 손상의 평가
허혈 48시간 후 rhC1INH 또는 식염수를 투여받은 허혈 마우스에서 신경 손상을 평가하였다. 식염수로 처리된 허혈 마우스와 비교하여, rhC1INH로 처리된 마우스의 각각의 군에서 유의하지는 않지만 적은 감소가 관찰되었다(rhC1INH -pre: 9 및 12; rhC1INH-post: 7 및 11; rhC1INH 1h-post: 9 및 13, 식염수: 10 및 12.5, 각각 전신 장애 및 국소 장애의 중간값)(데이터는 제시하지 않음).
2.1.2 경색 크기의 측정
허혈 48시간 후, rhC1INH로 처리된 마우스는, 식염수로 처리된 마우스에 비해서(41.51 ± 7.01mm3), 15U/마우스 -pre, -post 및 1h -post 투여량에서, 허혈 부피의 뚜렷한 감소(각각 13.67 ± 2.59mm3, 9.06 ± 0.77 mm3 및 8.24 ± 1.00 mm3)를 보였다(도 1, 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다)
2.2 7일 후 결과
2.2.1 오픈 필드 테스트
허혈은 나이브(naive) 동물에 비해서, 뒷발로 딛고 일어서기의 횟수 면에서 유의한 감소를 유도하였지만, rhC1INH로 처리된 군에서 이러한 변수는 비-허혈 마우스와 상이하지 않았다. 평가된 다른 변수는 세 가지 군 사이에서 어떠한 차이도 보이지 않았다.
2.2.2 신경 계수
rhC1INH의 보호 효과가 장기간 지속되는지 평가하기 위하여, 본 발명자는 허혈을 유도시키고 약물로 처리한 후 7일 후에, 신경이 손실된 양을 측정하였다. 그 결과, rhC1INH 보호 효과는 이때에도 여전히 존재함을 보이고 있다: 각각 식염수로 처리된 마우스와 rhC1INH로 처리된 마우스 평균 14% ± 2.18% 대 4% ± 1.24%)(데이터는 제시하지 않음)
2.2.3.
마이크로글리아
/
마크로파지
및 성상세포에 대한 면역조직화학
허혈 7일 후, 식염수를 투여받은 허혈 마우스의 병변이 있는 해마 및 선조체에서, 다량의 활성화된 마이크로글리아 및 침윤된 마크로파지가 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음). 15 유닛의 rhC1INH-pre는 관련된 영역 모두에서 이러한 활성 및 침윤을 방해할 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). 식염수로 처리한 허혈 마우스의 같은쪽 해마는 rhC1INH로 처리한 허혈 마우스에서 관찰된 것과 상이하지 않은, 적은 성상세포를 보였다(데이터는 제시하지 않음). 다른 뇌 영역은 어떠한 군에서도 임의의 해당하는 성상세포의 활성화를 보이지 않았다.
3. 결론
본 데이터는, 15U/마우스의 투여량의 rhC1INH는, 허혈 기간의 시작 시점(-pre) 또는 종료 시점(-post, 즉 재관류)에서 주어졌을 때, 허혈 부피를 감소시키는데 있어 유사한 효과를 가지는 것을 보여주고 있다. 더욱 중요한 것은, 허혈 시작 후 1시간 후에 주사되었을 때(1h-post)도, 억제제의 신경보호 효과는 존재할 수 있었다는 점이다. 또한, rhC1INH의 보호 효과는 허혈 7일 후에도 여전히 존재한다. 이러한 결과들은, 허혈 1시간 후 주사된 혈장 유래 hC1INH는 신경보호 효과를 유지할 수 있는 능력을 거의 완전히 손실하는 것과는 첨예하게 대립되는 결과이다(도 2 참조).
본 연구의 주요 결과는 다음과 같다:
1. 마우스 혈장의 rhC1INH의 반감기는 약 3시간이다(15U/마우스의 투여량에서). 항원과 기능적 활성 간의 양호한 상관관계는, 재조합 단백질은 이의 활성 형태로만 혈장내에서 순환함을 나타내고, 또한, 조직 분포가 혈장 수준 감소에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
2. 15U/마우스-pre의 투여량에서 rhC1INH는 허혈 부피의 감소에 매우 효과적이다(69% 감소)
3. 15U/마우스의 투여량에서 rhC1INH는 Fluoro-Jade 염색으로 측정하였을 때 해마에서의 손상 뉴런 수를 명백히 감소시킬 수 있고, 이는 허혈 부피의 감소는 뉴런의 여유분(sparing) 때문인 것을 나타낸다.
4. rhC1INH는 허혈 기간의 시작 시점(-pre), 허혈 기간의 종료 시점(-post, 즉 재관류 시점) 또는 허혈 시작 후 1시간째(1h -post, 즉 재관류 시작 후 30분)에 주어졌을 때 허혈 부피를 감소시키는 데 유사한 효과를 가진다. 그러므로 rhC1INH는 pdC1INH(허혈 1시간 후에 주어졌을 때 더 이상 효과적이지 않다)보다 더욱 폭넓은 시간에 따른 효능을 가진다.
5. rhC1INH-pre 투여량의 신경보호 효과는 장기간 지속되는 것이며, 이는 허혈 시작 후 7일 째에 수행된 신경 계수에 의해 증명된다.
6. 허혈 48시간 후 rhC1INH는 전신 장애 및 국소 장애의 약간의 개선을 유발하였다. 이러한 발견은, pdC1INH에 대해 관찰된 것과 유사한 것이다. 장기간 지속되는 행동 결과에 미치는 rhC1INH의 영향을 평가하기 위해서, 본 발명자는 오픈 필드 테스트를 통해 마우스 행동을 분석하였다. 허혈 7일 후, 뒷발로 딛고 일어서는 행동은, 나이브 마이스에 비해, 허혈 마우스에서 유의하게 더욱 낮은 점수를 보인다. 이러한 감소는 대조군 마우스와 점수가 상이하지 않은 rhC1INH로 처리된 마우스에서는 존재하지 않는다.
7. 초기(48시간) 및 후기(7일) 시점에서 모두 측정한 바에 따르면, 허혈 마우스 뇌에서 rhC1INH는 마이크로글리아/마크로파지의 활성화/재보충을 방해할 수 있다. 이러한 세포들은 뇌 조직의 염증 반응의 지표가 된다.
8. 48시간째에 허혈에 의해 유발된 강한 성상세포 반응은 rhC1INH에 의해 무디어진다(dampened). 성상세포 활성화는 2개의 실험군 모두에서 7일째에 현저히 감소되었고, 식염수 및 rhC1INH로 처리된 마우스 간의 차이는 관찰할 수 없었다.
실시예 2: 국소 대뇌 허혈의 마우스 모델에서, rhC1-INH의 신경보호 작용에 대한 연구
본 발명자는 허혈/재관류 시작 1시간 후에 투여된 경우에도 15U의 rhCl-INH가 쥣과(murine) 대뇌 허혈/재관류 모델에서 현저한 신경보호작용을 하는 점을 증명하였는데, 이는 처리후 시점에는 더 이상 효과적이지 않은 pdCl-ENH와는 다른 것이다. 이러한 신경보호는 장기간 지속성인데, 사실상 허혈 및 처리 7일 후에도, rhCl-INH로 처리된 마우스의 허혈 뇌는 감소된 경색 크기를 보인다. 하기의 실험에서, 본 발명자는 효능을 시간에 따라 측정하였고(1시간 후까지), 허혈 부피에 대한 rhCl-INH 신경보호 작용의 투여량-반응을 측정하였다. 그 뿐 아니라, 본 발명자는 동일한 프로토콜을 사용하여 pdCl-INH, 토끼 및 암소 rhCl-INH 간의 직접 비교(가장 효과적인 투여량에서, 토끼 rhCl-INH에 대한 시점으로)를 수행하였다.
방법
동물
실험 동물 및 이의 관리에 관한 절차는 국내법(D.L. n.116, G.U. suppl. 40, 18 February 1992) 및 국제법 및 국제정책(EEC Council Directive 86/609, OJ L 358,1; Dec.12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council 1996)에 부합하는 연구소 가이드라인에 적합하게 수행하였다. 수컷 C57B1/6 마우스(26-28 g, Charles River, Calco, Italy)를 우리당 5마리씩 사육하고, 일정한 온도(21±1℃)와 상대 습도(60%) 그리고, 주기적인 명/암 스케쥴(7 am-7pm)을 적용하였다. 먹이(마우스용 Altromin 펠릿) 및 물은 자유로이 주었다.
일시적인 국소 대뇌 허혈
전술한 바와 같이1,,3, 중간 대뇌동맥 폐색(MCAO)으로 허혈을 일으켰다. NaO/Oa(70/30%) 혼합물 중의 5% 이소플루란으로 마취시키고, 상기와 동일한 혼합물 중의 1.5-2% 이소플루란으로 마취를 유지하였다. 각 동물에서 혈관 폐색이 적당히 되었는지를 확인하기 위해서, 하기의 좌표: AP = -1mm; L= -3.5mm에서, 뇌 표면에 배치되고, 두개골 위에 인상재로 고정된, 플렉서블 0.5 mm 광섬유 프로브(Transonic, Type M, 0.5 mm 직경)를 사용하는 레이저 도플러 유량계(Transonic BLF-21)로 혈류를 측정하였다. 간단히 말하면, 오른쪽 총경동맥을 노출시키고, 총경동맥 상에 수행된 절개를 통해 실리콘 처리된 필라멘트(7-0)를 내부 경동맥으로 도입하여, 앞쪽 대뇌 동맥 및 MCA으로 분지되는 지점을 차단하도록 앞쪽 대뇌 동맥까지 넣었다. 허혈전 기준선과 비교하여, 혈류가 70%를 초과하여 감소될 때까지 필라멘트를 넣는다. 허혈 30분 후에, 나일론 필라멘트를 조심스럽게 제거함으로써 혈류를 회복시켰다.
약물 처리
상이한 시간에 상이한 투여량으로 Cl-INH(토끼 rhCl-INH, 암소 rhCl-INH 또는 pdCl-INH)를 마우스에 1회 정맥주사 하였다. 대조군 마우스에는 동일한 양의 식염수를 투여하였다.
신경 손상의 평가
허혈 48시간 후에, 각 마우스를, 마우스에 대해 특이적인 2개의 신경 기능 점수로 등급을 매겼는데, 이는 실험 조건에 대해 알지 못하는 숙련된 연구원을 통해 진행되었다. 전신 장애에 대해, 마우스를 0점 부터 28점까지 점수를 매겼는데, 그 범주는 다음과 같다: 털, 귀, 눈, 자세, 자발적인 활동, 간질 증세. 국소 장애에 대해서는 마우스를 0점 부터 28점까지 점수를 매겼는데, 그 범주는 다음과 같다: 신체 좌우대칭, 걷는모양, 기어오르기, 돌기, 앞발 좌우대칭, 강제 돌기, 감각 반응. 데이터는 중간값 및 퍼센트로 표현한다.
경색 크기의 측정
허혈 48시간 후에, 마우스를 이퀴텐신(Equitensin(120 ㎕/마우스, ip)으로 깊게 마취시키고, 30 ml의 PBS 0.1 mol/ℓ, pH 7.4에 이어, PBS 중의 차가운 파라포름알데하이드(4%) 60 ml를 심장을 통해 관류시켰다. 두부에서 뇌를 조심스럽게 제거한 다음에, 이들을 동결방지를 위해 PBS 중의 30% 수크로스에 밤새 4℃에서 전달하였다. 이어서, 뇌를 -45℃에서 3분간 이소펜탄에 침지시킴으로써 신속하게 냉동시킨 다음에, 바이얼에 담아 밀봉하고, 사용하기 전에는 -70℃로 보관하였다. 병변 크기 측정을 위해서, 20 ㎛ 두정 뇌 절편을 240 ㎛ 간격으로 절단하고, 뉴트랄 레드(Neutral Red Gurr Certistain, BDH, England)로 염색하였다. 각각의 슬라이스에서, 경색된 부위는 대강 측정되었고, 이를 면역조직염색을 통해서 상대적으로 창백해 보이게 하여 윤곽을 잡았다. 경색된 부위는 각 절편에 대한 반대쪽 반구의 영역에서 같은쪽 반구내의 건강한 조직의 영역을 감산함으로써 측정하였다. 경색 부피는 컴퓨터 지원 이미지 분석기로 정량하고 Analytical Image System을 통해 계산된, 각 뇌 슬라이스 상의 경색된 부위를 더함으로써 계산되었다.
신경변성의 측정
20 jam 두께의 절편에 대해, 신경변성의 마커로서 Fluoro-Jade4로 염색함으로써, 신경변성의 존재를 평가하였다. 간단히 말하면, 절편을 건조시키고, 에탄올(100% -75%) 및 증류수로 재수화시켰다(rehydrated). 그 다음에, 이들을 15분간 0.06% 과망간산칼륨에서 인큐베이션한 다음에, 증류수로 세척한 후, 30분간 0.001% Fluoro-Jade 염색액에 옮겼다. 염색 후에, 절편을 증류수로 헹구고, 건조시킨 후, 자일렌에 침지시킨 다음에, DPX 마운턴트(BDH, Poole, UK)를 사용하여 커버슬립을 덮은 후에 형광 현미경으로 분석하였다.
결과
일시적 허혈에서 시간-
윈도우에
따른 효능
시간-윈도우에 따른 효능을 평가하기 위하여, 15U의 토끼 rhCl-INH 또는 식염수를 허혈 시작 3, 6, 9, 18 및 24시간째에 주었다. 48시간 후, 허혈 시작 3 및 6시간 후에 토끼 rhCl-INH으로 처리된 허혈 마우스는, 식염수 처리된 허혈 마우스(44.43±5.94mm3)에 비해 현저한 허혈 부피의 감소를 보였다(각각 11.71±0.63mm3 및 20.38±2.37mm3). 또한 허혈 후 9 및 18시간째에 투여한 경우, 토끼 rhCl-INH는 여전히 소량이지만 효과가 있었다(각각 23.63±4.11mm3 및 27.13±2.58mm3). 허혈 후 24시간째에, 억제제는 이의 유리한 활성을 잃어버렸다(41.92±2.76mm3)(도 3). 식염수로 처리된 마우스에서, Fluoro-Jade로 염색한 결과, 신경변성이 선조체 피질 및 해마에서 존재함을 나타내주었다. 초기 시점에 투여된 경우, rhCl-INH는 해마(3시간까지) 및 피질(9시간까지)에서 신경변성을 방해할 수 있었다. 허혈 후 6 및 9시간째에 이 억제제를 마우스에 처리한 경우, 일부의 신경변성이 해마에서 관찰되었다. 더 늦은 시간에 처리한 것(18 및 24시간)은, 허혈 부피가 더욱 큰 경우, Fluoro-Jade 염색 결과, 피질내의 신경변성된 뉴런의 존재가 나타났다. 고려된 모든 시점에서, 선조체는 식염수로 처리된 동물 및 rhCl-INH로 처리된 동물 모두에서 강력한 신경변성을 보여주었다(도 5, 6, 7). 각 동물에 대한 Fluoro-Jade 염색의 반(semi-)정량 분석을 실험 조건에 대해 알지 못하는 연구원으로 하여금 수행하게 하였다(도 4).
일시적 허혈에서의 투여량-반응
유전성 혈관부종(angioedema)에 대하여 인간에서 사용된 Cl-INH의 투여량은 뇌졸중 치료를 위해 마우스에서 사용된 것보다 더 낮았기 때문에, 본 발명의 허혈모델에서는 더욱 낮은 투여량이 사용되었다. 전술한 실험의 결과를 기준으로 하여, 본원에서는 투여량-반응 실험을 위해 3h 후처리를 선택하였다. 각각 상이한 투여량의 토끼 rhCl-INH(5 및 10 유닛)를 허혈 및 재관류 시작 후 3시간째에 주었다. l0U/마우스의 투여량은 허혈 부피를 감소시키는 데에 여전히 효과적이었지만(22.10±3.65mm3), 5U의 토끼 rhCl-INH는 뇌 손상의 정도를 변화시키지는 않았다(47.39±4.08mm3). 이러한 데이터는, 토끼 rhCl-INH는 투여량 의존적인 방식으로 허혈 병변을 변화시킬 수 있다는 것을 보여준다(도 8).
10U의 rhCl-INH로 처리된 마우스에서, Fluoro-Jade 염색에 의해 증명되는 바와 같은 일부의 신경변성 뉴런은 선조체에서는 관찰되었지만, 해마 및 피질에서는 관찰되지 아니하였으며, 5U-처리된 허혈 마우스에서는, 선조체 피질에서 다량의 신경변성을 보였다(제시하지는 않음).
전신 신경 장애 및 국소 신경 장애는, 시간에 따른 효능 측정이나, 투여량-반응 실험 중 어느 것에서도 유의한 변화를 보이지 않았다(제시하지는 않음).
pdCl
-
INH
및
rhCl
-
INH
의 효능 간의 비교(토끼 및 암소 유래)
pdCl-INH에 대한 본 발명자의 기존의 데이터를, 일시적 뇌 허혈의 여러가지 모델에서 수득하였다. 직접적으로 pdCl-INH, 암소 rhCl-INH 및 토끼 rhCl-INH를 비교하기 위해서, 이들 화합물을 동일한 실험 프로토콜(실리콘 코팅된 필라멘트)로 허혈이 유도된 마우스에 주었다. 억제제는 허혈 시작 후 3시간째에, 15 U/마우스의 투여량으로 투입되었다.
예상한 바와 같이, pdCl-INH는 이 시점에서 신경보호 활성을 가질 수 없었다(47.39±4.08mm3). 변화로서, 암소의 rhCl-INH로 처리된 허혈 마우스는 토끼 rhCl-INH로 처리된 마우스에 비해서 더욱 낮은 양임에도 불구하고, 식염수 처리된 마우스에 비해서 유의하게 감소된 허혈 부피를 보였다(도 9). 놀랍게도 전신 장애 및 국소 장애는 암소 rhCl-INH에 의해 유의하게 개선되었다(도 10).
Fluoro-Jade 염색은, 모든 검토된 영역(피질, 선조체 및 해마)에서, pdCl-INH로 처리된 허혈 마우스의 뇌에서의 대량의 신경변성을 보여주었다. 암소 rhCl-INH로 처리된 마우스의 뇌를 염색한 것은, 피질 및 해마에서 다양한 단계의 신경변성을 보여주었는데, 이는 6마리 마우스 중 3마리에서 현저한 신경변성이 이들 영역 모두에서 관찰되었지만, 나머지 3마리에서 신경변성은 매우 적은 양으로 존재하였기 때문이다. 선조체는 6마리 마우스 중 6마리에서 넓은 범위에 걸친(extensive) Fluoro-Jade 염색을 보여주었다.
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본 발명의 작업에서 가장 가치있는 데이터는 토끼 rhCl-INH의 효능의 시간 범위를 관찰한 것이다. 15U/마우스의 투여량의 토끼 rhCl-INH는 허혈 시작 후 18시간까지, 허혈 부피를 유의하게 감소시킬 수 있었는데, 이는 허혈 3시간 후에는 이미 이의 신경보호 효과를 손실해버린 pdCl-INH과는 다른 것이다. 이러한 놀라운 특징은, 인간의 뇌졸증 치료를 위해서, rhCl-INH가 가능한 후보자가 될 수 있도록 해 준다. pd 및 rhCl-INH의 상이한 효능은 두 개의 분자의 상이한 글리코실화 때문일 수 있고, 이러한 상이한 글리코실화는 혈장에서 유래한 것과 비교하여, rhCl-INH의 만노스 결합 단백질(MBP)에 대한 더욱 높은 친화성을 초래할 수 있다. 결합 MBP, rhCl-MH는 심장, 신장 및 위장 허혈/재관류7,,9에서의 손상의 병리학에 관여된 보충적 렉틴 경로(complement lectin pathway)의 억제를 유발한다. 이러한 특징이 거의 알려져 있지 않은 경로의 역할은 뇌 허혈에서는 아직 공지되어 있지 않았고, rhCl-INH 신경보호의 메카니즘을 자세히 알기 위해서는 추가의 실험이 요구된다.
허혈 시작후 시간-윈도우에 따른, pdC1INH보다 더 우수한 rhC1INH의 신경보호 효과는 세포 표면 항원에 대한 결합 및/또는 더욱 효과적인 조직 침투를 통해, 조직 손상 부위에 재조합 분자를 더욱 효과적으로 표적화시키는 것으로서 추가로 설명할 수 있다. 본 발명에 설명된 관찰의 근거가 되는 정확한 분자적 기작을 완전히 설명하기 위해서는 추가의 연구가 더 필요하다.
Fluoro-Jade 염색은, 시간에 따라 어떻게 병변이 발달되는지를 간접적으로 증명한다. rhCl-INH로 초기에 처리한 것은 허혈 영역(penumbra)(해마 및 피질)을 완전히 구조해 주는 것을 제공한다. 나중에 치료제가 투여되면, 영역내의 더 많은 신경손상이 발견된다. 이러한 발견은, rhCl-INH가 허혈 영역 상에서 신경보호 작용을 하고 있음을 확인해 주는 것이다. 토끼 rhCl-INH는 투여량 의존적인 방식으로 허혈 부피를 감소시킬 수 있다. 시간에 따른 효능 관찰 실험에서 사용된 가장 효과적인 투여량의 rhCl-INH(15U/마우스, 약 600U/kg에 해당)는, 유전성 혈관부종에 대해 인간에서 사용된 것(약 25-100U/kg)보다 훨씬 높았다. 투여량이 낮을 수록 신경변성 및 허혈 경색을 감소시키는데 여전히 효과적인지를 확인하기 위하여, 투여량-반응 실험을 수행하였다. 그 결과, 400U/kg(l0 U/마우스)의 rhCl-INH은 저투여량임에도 불구하고, 허혈 결과를 유의하게 방해할 수 있었다. HAE(5U/마우스, 200U/kg)에 사용된 것보다 8배 더 높은 투여량은 효과적이지 않았다. 이들 결과는 많은 투여량의 Cl-INH가 각종 염증 세팅5에 치료제를 적용하기 위하여 요구된다는 것을 보여주는 증거와 연장선상에 있다. 특히 이러한 투여량은 허혈/재관류 뇌 손상의 병리학에 관여하는 내피 접착 물질6, 기작에 대해서 중요한 억제 효과에 다다르기 위해 필요하다. 마지막으로, 암소 rhCl-INH는 토끼 rhCl-INH보다 현저한 것은 아니지만, 15U/마우스의 투여량으로 허혈 3시간 후에 주었을 때 신경보호작용을 제공하였다. 상기 암소로부터의 억제제는 또한 식염수로 처리된 마우스에 비하여 신경 손상을 개선시킬 수 있었다. 이러한 발견들은, 이 분자가 허혈 마우스의 일반적인 증상을 완화할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 전형적 경로 및 MBL 경로의 활성화 억제에 대한 rhC1INH 및 혈장 유래된 C1INH의 능력 비교
재료 및 방법
전형적인 그리고 렉틴 경로의 기능상에 rhC1INH 및 pdC1INH(Cetor, Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)의 효과는 두개의 상이한 소스(source)의 혈청을 이용한 Wieslab TM 보체 시스템 스크린(Euro-Diagnostica, Malmø, Sweeden)에서 시험되었다. 하나의 혈청 소스는 키트 내에 포함되고, 그것이 양성 대조군으로써 사용된다(이하, 혈청 샘플 1로써 언급된다). 다른 혈청 샘플은 인간 혈청의 상업적으로 이용가능한 풀(25 상이한 기증자의 풀; Kordia, Leiden, The Netherlands)로부터 수득되었고, 이하 혈청 샘플 2로 언급된다. 혈청 샘플들 모두는 실온에서 30분동안 0, 15, 30 및 75μmol rhC1INH 또는 pdC1INH으로 독립적 트리플로(triplo's)에서 인큐베이션되었다. 그러므로, pdC1INH 및 rhC1INH의 저장 용액은 적절한 농도로 물에 희석되었다. 15, 30 및 75 μmol rhC1INH 또는 pdC1INH에 상응하는 부피들이 취해지고, 물로 15㎕로 조절된다. rhC1INH가 용해되는(20 mM 구연산염, 0.19 M 당 pH 6.8; 0.22 ㎛ 필터된) 버퍼는 Wieslab 보체 시스템과 상호작용을 조절하기 위해 rhC1INH와 동일한 희석에서 취해졌다. 전형적 및 MBL 경로(키트로 제공된) 양성 대조군(PC) 및 음성 대조군(NC)과 혈청 샘플들 모두는 제조자의 지시에 따라 MBL 경로를 위한 Diluent MP 및 전형적 경로를 위해 Diluent CP에서 1/101 희석되었다. 이러한 희석된 혈청의, 127.5㎕ 가 22.5㎕ 물, pdC1INH, rhC1INH 또는 버퍼로 보충되었고, 실온에서 30분동안 인큐베이션되었다. 다음으로, PC, NC, Diluent CP 또는 MP(블랭크들) 및 샘플들의 100㎕/웰은 적절한 플레이트에 파이펫팅되었고, 37℃에서 1시간동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후에, 웰들을 300㎕/웰 세척 용액으로 3번 세척하였고, 그 다음으로 실온에서 100㎕/웰의 콘쥬게이트와 함께 실온에서 30분동안 인큐베이션하였다. 다른 세척 후에, 웰들은 기질 100㎕/웰로 인큐베이션되었고, 다시 실온에서 30분동안 인큐베이션되었다. 그 반응은 100㎕/웰 5mM EDTA의 첨가에 의해 정지되었고, 흡광도는 405nm에서 읽었다.
결과들의 계산을 위해, 블랭크의 흡광도(Diluent CP or MP)는 PC, NC 및 샘플들로부터 감산했다. 퍼센트 보체 활성화는 다음의 식으로 측정치당 계산되었다:(샘플-NC)/(PC-NC)x100. 이는 PC가 항상 100%에 놓여있다는 것을 의미한다. 각각의 조건을 위해, 평균, 표준편차 및 CV%는 계산되었다.
결과
Wielisa 에 의해 시험된 전형적 경로상에 rhC1INH 및 pd-C1INH의 효과
전형적 경로 활성화 상에 rhC1INH 및 pdC1INH 모두의 억제 성질은 두개의 상이한 샘플들에서 분석되었다. 도 12, 13 및 16에서 나타난 바와 같이, rhC1INH 및 pdC1INH 모두는 혈청 샘플들 모두에서 전형적 경로 매개된 C5b-9 침착을 투여량 의존적으로 감소시켰다. 반면에, 75μM의 농도에서 rhC1INH는 pdC1INH 보다 조금 더 강한 혈청 1에서 전형적 경로 활성화를 억제하고, 그러한 효과는 혈청 샘플 2에서는 발견되지 않았다. 시험된 모든 다른 농도들에서, 억제 성질에 차이가 없음이 rhC1INH 및 pdC1INH 사이에서 관찰되었다. 그러므로, rhC1INH 및 pdC1INH 모두는 인간 혈청에서 전형적인 경로 활성화 억제에 동등하게 효과적인 것으로 결론내렸다.
Wielisa에 의해 조사된 MBL 경로 상에 rhC1INH 및 pdC1INH의 효과
동일한 세트의 실험에서, 또한, MBL 경로 활성화 상에 rhC1INH 및 pdC1INH 모두의 억제 성질이 또한 분석되었다. 도 14, 15, 및 16에 나타난 바와 같이, rhC1INH 및 pdC1INH 또한 MBL 경로의 활성화를 투여량-의존성으로 또한 감소시킨다. 그러나, 아무런 차이가 나타나지 않았던 전형적 경로와 대조적으로, rhC1INH는 pdC1INH와 비교해 볼 때, MBL 경로의 더 좋은 억제제인 것으로 나타났다. 혈청 샘플들 모두 및 시험된 모든 3 농도들에서, MBL 경로의 rhC1INH-매개된 억제는 pdC1INH와 비교할 때 ~20% 높다. 그러므로, pdC1INH 보다 rhC1INH 가 MBL 경로의 더 효과적인 억제제인 것으로 결론내렸다.
결론
이 결과는 rhC1INH 및 pdC1INH 모두가 동등하게 전형적 경로를 억제하는데 효과적이지만, rhC1INH는 MBL 경로의 더 좋은 억제제라는 것을 나타낸다. 모든 시험된 농도에서, rhC1INH 매개된 MBL 경로 억제는 pdC1INH와 비교해 볼 때, ~20% 강했다.
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Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln Asp Pro Glu Ser Leu Gln
1 5 10 15
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Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln Ala Leu Lys Gly Phe Thr
180 185 190
Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile Phe His Ser Pro Asp Leu
195 200 205
Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser Arg Thr Leu Tyr Ser Ser
210 215 220
Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp Ala Asn Leu Glu Leu Ile
225 230 235 240
Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn Lys Ile Ser Arg Leu Leu
245 250 255
Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val Leu Leu Asn Ala Ile Tyr
260 265 270
Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp Pro Lys Lys Thr Arg Met
275 280 285
Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile Lys Val Pro Met Met Asn
290 295 300
Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile Asp Gln Thr Leu Lys Ala
305 310 315 320
Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn Leu Ser Leu Val Ile Leu
325 330 335
Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu Asp Met Glu Gln Ala Leu
340 345 350
Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu Lys Leu Glu Met Ser Lys
355 360 365
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370 375 380
Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu Glu Phe Phe Asp Phe Ser
385 390 395 400
Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu Asp Pro Asp Leu Gln Val
405 410 415
Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Thr Gly Val
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Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val Ala Arg Thr Leu Leu Val
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Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val Leu Trp Asp Gln Gln His
450 455 460
Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr Asp Pro Arg Ala
465 470 475
Claims (22)
- 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나를 예방, 감소 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서,상기 약학적 조성물은 혈장 유래된 인간 C1 억제제와 비교하여 저감된 수준의 말단 시알산 잔기들을 가져 6시간 미만의 혈장 반감기를 가지는 C1 억제제를 포함하고, 재관류 시작 후 적어도 10분 후에 투여되는 것인, 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 C1 억제제는 갈락토스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노스 및 퓨코오스로부터 선택된 말단 잔기를 가지는 글리칸을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 C1 억제제는 서열번호: 1의 아미노산 서열과 최소한 65% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 C1 억제제는 유전자 조작된(genetically engineered) 세포 또는 유기체로부터 수득된 것인, 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 C1 억제제는 형질전환(transgenic) 비인간 동물로부터 수득된 것인, 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 C1 억제제는 형질전환 비인간 동물의 젖으로부터 수득된 것인, 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 형질전환 비인간 동물은 소(bovine) 또는 라고모르파(Lagomorpha) 목의 동물인 것인, 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 라고모르파목의 동물은 토끼(rabbit)인 것인, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 C1 억제제는 체중 kg당 50-2000 유닛의 범위의 양으로 사용되는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈전용해제를 더 함유하거나, 혈전용해제와 조합하여 사용하거나, 또는 그와 같은 혈전용해제에 의한 처치 후에 사용하기 위한 것인, 약학적 조성물.
- 제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 예견치 못한 돌발성 또는 급성 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나의 발생을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 뇌졸증 또는 주산기(perinatal) 뇌졸증 후 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나의 예방, 감소 또는 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
- 제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 예견된 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나의 발생을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 것인 용도, 약학적 조성물.
- 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나를 예방, 감소 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서,제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 기재된 C1 억제제를 포함하고, 상기 약학적 조성물은 예견된 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나의 발생 전에 투여되는 것인, 약학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 예견된 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나의 발생 전 최대 3시간 전에 투여; 및/또는이를 필요로 하는 대상 및/또는 장기 이식의 경우에는 이식될 장기에 연속적으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 예견된 허혈 및 재관류 손상의 발생은 장기 이식인 것인, 약학적 조성물.
- 제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 렉틴 경로를 통해 일어나는 것으로 알려져 있는 허혈 및 재관류 손상 중 적어도 하나 또는 뇌졸증의 예방, 감소 또는 치료를 위한 것인, 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 C1 억제제는 신경보호적 효과를 발휘하는 것인, 약학적 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 C1 억제제는 해마 및/또는 피질 내에서 신경보호적 효과를 발휘하는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항, 및 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 C1 억제제는 허혈 및/또는 재관류에 의해 유도되는 병변의 감소를 발휘하는 것인, 약학적 조성물.
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| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| PJ0201 | Trial against decision of rejection |
Patent event date: 20141114 Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal Patent event code: PJ02012R01D Patent event date: 20140814 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PJ02011S01I Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal Decision date: 20150102 Appeal identifier: 2014101007052 Request date: 20141114 |
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| PB0901 | Examination by re-examination before a trial |
Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event date: 20141114 Patent event code: PB09011R02I Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal Patent event date: 20141114 Patent event code: PB09011R01I Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event date: 20140403 Patent event code: PB09011R02I Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event date: 20130924 Patent event code: PB09011R02I Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event date: 20111219 Patent event code: PB09011R02I |
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Patent event date: 20150102 Comment text: Decision to Grant Registration Patent event code: PB07012S01D Patent event date: 20141216 Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial Patent event code: PB07011S01I |
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