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KR101520383B1 - Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물 - Google Patents

Ｈｐｖ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물 Download PDF

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KR101520383B1
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Abstract

본 발명은 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환, 보다 구체적으로는 HPV 감염 관련 암, 보다 더 구체적으로는 자궁경부암(cervical cancer)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 개시하는 뉴클레오타이드 서열, 이들의 염기가 변형된 서열 및 이들의 특정 조합을 사용할 경우, HPV 16 형 또는 HPV 18 형 바이러스의 E6/E7 유전자의 발현을 크게 억제함으로써 효율적인 HPV 감염 관련 질환의 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＨＰＶ 감염과 관련된 암의 치료용 조성물{Composition for Treating HPV-related Cancers}
본 발명은 자궁경부암을 비롯한 HPV 감염과 관련된 질환에 대한 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
고위험성(High-risk) 인간 유두종 바이러스(Human Papilloma Virus: 이하, HPV) 16, 18 타입은 자궁경부암 및 자궁경부이형화의 주된 원인이 되는 요인이며 다른 생식기 암과 머리와 목 편평상피세포 암을 일으키는 원인이 된다. 자궁경부암은 여성에게 악성종양의 가장 일반적인 타입 중의 하나이다. 침윤성 자궁경부암의 발병률은 서서히 감소하고 있지만, 개발도상국의 모든 여성에게는 가장 빈번한 암으로 여성암의 25%를 차지한다. HPV는 대략 8,000개의 염기서열을 가진 양성 악성 종양을 일으키는 작은 DNA 바이러스이다. 현재까지 게놈의 차이에 따라 100여개 이상의 HPV 아류형이 확인되었으며, 대략 90개 정도의 HPV는 유전자형이 완전하게 분석되어있다. 이러한 타입 중에서 고위험성 HPV 타입(예를 들면, HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56)은 자궁경부암의 거의 90%에 관계하고 있다. HPV에 감염된 자궁경부암의 50% 이상은 HPV-16 타입이 관련이 있으며 다음으로 HPV-18(12%), HPV-45(8%), HPV-31(5%) 타입이 관련이 있다. 이러한 HPV는 2개의 발암성(oncogenic) 단백질 E6와 E7을 코드화한다. 이 단백질들은 모두 HPV를 매개로 한 세포의 불멸화 및 세포 형질 전환에 관계한다. 발암성 E6 단백질은 야생형의 p53 종양 억제 단백질에 결합하여 유비퀴틴 경로를 통하여 p53을 분해시킨다. 한편, E7 단백질은 직접 Rb에 결합하여 과-인산화를 시킨다. 먼저 E6는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제(ubiquitin-protein ligase)인 E6-AP(E6-associated protein)와 복합체를 형성한다. 그 후, E6/E6-AP 복합체는 야생형의 p53과 결합하여 유비퀴틴화 시킴으로 DNA 손상에 대한 p53을 매개로 하는 세포의 반응을 방해한다. 주로, p53 종양억제 단백질은 Mdm2를 매개로 하는 유비퀴틴화에 의해서 조절되지만, HPV에 감염된 자궁경부암 세포에서는 p53의 분해는 Mdm2에서 E6를 매개로 하는 유비퀴틴화로 완전하게 교체된다. 따라서 다른 많은 암과 달리, HPV에 감염된 자궁경부암은 거의 모두 야생형의 p53 유전자를 가진다. 그러나 일관적으로 E6 단백질에 의해서 분해되므로, p53 단백질의 발현 레벨은 매우 낮다. 특히, HPV E6단백질은 오로지 자궁경부암 세포만을 죽일 수 있는 특정 타깃이기에 상당한 주목을 받고 있다. E6 혹은 E6/E6-AP복합체를 타깃으로 하는 이러한 전략들은 여러 가지 치료를 포함하고 있다.
세포 독소 약의 사용, 바이러스의 E6 발암성 단백질의 아연을 방출하는 억제제, E6-AP의 모방의 에피토프펩티드(mimotope), 항-E6 리보자임, 바이러스의 E6 발암성 단백질을 타깃으로 하는 펩티드 압타머, 바이러스의 E6 발암 유전자를 타깃으로 하는 siRNA 및 이들의 병용처리 등이 있다. 최근, siRNA는 동물 세포에서 선택적으로 내부 유전자를 침묵시키는 것뿐만이 아니라, 바이러스에 의해 발생된 질병 중에서도 바이러스의 유전자를 선택적으로 침묵시킬 수 있음이 증명되었다. siRNA의 형질감염에 의해서 일어난 RNA 간섭(RNAi)은 인간의 바이러스 감염을 치료하기 위한 새로운 치료법으로서 등장했다. HPV에 감염된 자궁경부암 세포에서 E6와 E7의 유전자를 타깃으로 하는 siRNA는 p53과 pRb의 축적을 일으켜 아폽토시스(apoptosis) 또는 세포노화를 일으킨다. HPV-16에 감염된 자궁경부암 세포주와 HPV-18에 감염된 세포주의 경우에는 바이러스의 E6 및 E7암 유전자를 타깃으로 하는 RNAi가 선택적으로 이들 단백질의 발현을 침묵시키는 것이 밝혀졌다.
한편, 다양한 핵산에 대한 변형(예를 들어 , 염기, 당 및/또는 포스페이트)을 가진 핵산은 혈청 리보뉴클레아제에 의한 분해가 억제됨으로써 효능이 증가될 수 있다. 핵산으로 도입될 수 있는 당, 염기 및 포스페이트 변형을 기술하는 몇 가지 예가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를, 뉴클레아제 저항성 기에 의한 변형, 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-H,뉴클레오티드 염기 변형에 의해 안정성을 증대시키고/시키거나 생물학적 활성을 증대시키도록 변형시킨다.(Eckstein et al., PCT 공개 공보 WO 92/07065; 문헌[Perrault et al., Nature 344:565-568, 1990]; 문헌[Pieken et al., Science 253: 314-317, 1991]; 문헌[Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17: 334-339, 1992]; Usman et al. PCT 공개 공보 WO 93/15187; Sproat, 미국 특허 제5,334,711호 및 문헌[Beigelman et al., J. Biol. Chem., 270:25702, 1995]; Beigelman et al., PCT 공개 공보 WO 97/26270; Beigelman et al., 미국 특허 제5,716,824호; Usman et al., 미국 특허 제5,627,053호; Woolf et al., PCT 공개 공보 WO 98/13526; Thompson et al., 미국 특허 출원 제60/082,404호(1998년 4월 20일에 출원); 문헌[Karpeisky et al., Tetrahedron Lett., 39:1131, 1998]; 문헌[Earnshaw and Gait, Biopolymers(Nucleic acid Sciences) 48:39-55, 1998]; 문헌[Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998]; 및 문헌[Burlina et al., Bioorg. Med. Chem. 5: 1999-2010, 1997] 참조). 유사한 변형을 본 발명의 핵산을 변형시키는 데 이용할 수 있다.
1999년에 시스플라틴(cisplatin)에 근거한 화학요법과 방사선 치료를 병용처리한 결과, 현저하게 로컬에 중증의 자궁경부암을 가진 여성의 생존률을 개선했다. 현재 시스플라틴은 난소, 경부, 머리 및 목, 비소세포 폐암 등을 포함하는 암을 치료하기 위해서 넓게 사용되는 DAN 손상 약물이다. 보다 최근, 플라티눔(Platinum)에 근거한 약제의 작용 메커니즘이 조사되었다. 그러나 세포 상에서 시스플라틴의 치료에 의한 약물의 흡수 및 배출 조절, DNA 손상의 시그널링, 세포 주기 추적, DNA 복구 및 세포 사멸을 포함하는 과정은 아직 완전하게는 이해되지 않았다. HPV-18 헬라(HeLa) 세포에서 시스플라틴 치료 후에 p53 단백질은 E6를 매개로 한 분해로부터 빠져나와 핵인에 우선적으로 축적되었다. 또한 HPV-16 SiHa 세포는 동시적인 방사선 요법과 시스플라틴 치료에 의해 p53 기능을 회복해 방사선 감수성이 증가되었다.
이에, 본 발명자들은 E6/E7에 특이적인 siRNA에 화학적인 변형을 주어 단독 또는 복합적인 조합의 함암 효과 또는 기존의 화학요법 또는 방사선 요법과 병용 수행 시, 상승 효과를 낼 수 있는 효과적인 새로운 서열의 siRNA를 탐색하고자 노력한 결과, 하기의 실시예 및 청구항에 나열된 뉴클레오타이드 및 이들의 특정 조합이 관련 단백질인 TP53 및 E7의 발현과 HPV E6 mRNA를 감소시키고 세포의 사멸을 유도함을 확인하였으며, 염기서열 잔기 변형이 없는 RNA보다 단독 또는 항암제와의 병용투여에서 효능이 훨씬 우월하다는 것을 실험적으로 증명하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 HPV의 감염을 원인으로 하여 발생하는 다양한 질환에 대한 효율적인 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, HPV 16 형 또는 HPV 18 형 바이러스의 E6/E7 유전자를 타겟으로 하는 발현 억제용 특정 RNA 또는 이들의 염기가 변형된 RNA 서열을 이용할 경우, HPV의 유전자 발현이 효율적으로 억제되어 자궁경부암을 비롯한 HPV 감염 관련 질환에 대해 우수한 치료 활성을 보인다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환, 보다 구체적으로는 HPV 감염 관련 암, 보다 더 구체적으로는 자궁경부암(cervical cancer)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제16서열, 제22서열, 제28서열, 제34서열, 제40서열, 제66서열, 제72서열, 제84서열, 제90서열, 제108서열 및 이들의 안티센스 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 HPV의 감염을 원인으로 하여 발생하는 다양한 질환에 대한 효율적인 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, HPV 16 형 또는 HPV 18 형 바이러스의 E6/E7 유전자를 타겟으로 하는 발현 억제용 특정 RNA 또는 이들의 염기가 변형된 RNA 서열을 이용할 경우, HPV의 유전자 발현이 효율적으로 억제되어 자궁경부암을 비롯한 HPV 감염 관련 질환에 대해 우수한 치료 활성을 보인다는 사실을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제16서열, 제22서열, 제28서열, 제34서열 및 제40서열은 HPV 16 형 바이러스를 타겟으로 하며, 서열목록 제72서열, 제84서열, 제90서열 및 제108서열은 HPV 16 형 바이러스를 타겟으로 하는 발현 억제용 RNA 핵산서열이다.
본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 리보뉴클레오타이드를 의미하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세성에서 용어“발현 억제”는 표적 유전자의 기능 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람작한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 HPV 18형 또는 HPV 16형 바이러스의 E6/E7 유전자에 대한 유전자 침묵(silencing) 능력을 가지는 RNA 서열이며, 보다 바람직하게는 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 용어 “siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 17 내지 23 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “shRNA(small hairpin RNA)”는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 즉, shRNA는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열이다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 15-30개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다. shRNA는 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 유전자 발현억제가 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합한다. 이들 RISC는 mRNA에 결합하여 이를 절단한다. shRNA는 RNA 폴리머레이즈 Ⅲ에 의해 전사된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 루프 부위 양쪽으로 존재하는 이중가닥의 스템 서열을 이루는 shRNA 구조를 구성할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 유전자 발현을 조절하며, 전장 10-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15-40개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 17-25개 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.
본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해한다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 2-O-메틸 우라실, 2-O-메틸 구아닌 및 2-플루오로 시토신 등이 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 siRNA 서열이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 변형된 골격(backbone) 또는 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 서열목록 제1서열, 제7서열, 제12서열, 제16서열, 제22서열, 제28서열, 제34서열, 제40서열, 제46서열, 제51서열, 제56서열, 제62서열, 제66서열, 제72서열, 제78서열, 제84서열, 제90서열, 제96서열, 제102서열, 제108서열 및 이들의 안티센스 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 즉, 상기 나열된 뉴클레오타이드 서열에서 골격이 변형되거나 염기가 변형된 뉴클레오타이드가 본원발명의 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물이 될 수 있다.
본원발명의 뉴클레오타이드에 적용되는 골격 또는 염기의 변형은 안정성 또는 목적하는 활성을 증가시키기 위해 당업계에서 통상적으로 가해지는 어떠한 변형도 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 변형된 골격은 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포아미데이트, 포스페이트 에스테르, 카바메이트, 아세트아미데이트, 카복시메틸 에스테르, 카보네이트, 및 포스페이트 트리에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 변형된 염기는 메틸화(methylation), 글리코실화(glycosylation) 및 할로겐화(halogenation)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 변형된 염기는 2’-O 메틸화(methylation)되거나 2’-플루오로화(fluorination)된 염기이다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 HPV 16 형 또는 HPV 18 형 바이러스의 E6/E7 유전자를 타겟으로 하는 발현 억제용 RNA의 특정 위치에 2’-O 메틸화 또는 2’-플루오로화의 변형을 가할 경우, 변형 전 핵산분자에 비하여 타겟 유전자의 발현억제 효율이 크게 상승하고, 사람의 혈장 등에서 안정성이 증가하였으며, 동물에서의 약물동태학 실험에서도 반감기가 두 배 이상 현격히 증가된 것을 확인하였다.
2’-O 메틸화는 RNA 분자의 리보오스(ribose)의 2번 탄소에 결합한 하이드록시기에 메틸화가 되어가 2’-메톡시기로 변형되는 것을 의미하며, 2’-플루오로화는 RNA 분자의 리보오스의 2번 탄소에 결합한 하이드록시기가 플루오로기로 치환되어 2’-플루오로기로 변형되는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드에서 2’-O 메틸화(methylation)된 염기는 U 또는 G이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드에서 2’-플루오로화(fluorination)된 염기는 C이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 하나 이상의 염기가 2’-O 메틸화(methylation)되거나 2’-플루오로화(fluorination)된 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열, 제3서열, 제5서열, 제6서열, 제8서열, 제10서열, 제11서열, 제13서열, 제15서열, 제17서열, 제18서열, 제20서열, 제21서열, 제23서열, 제24서열, 제26서열, 제27서열, 제29서열, 제30서열, 제32서열, 제33서열, 제35서열, 제36서열, 제38서열, 제39서열, 제41서열, 제42서열, 제44서열, 제45서열, 제47서열, 제49서열, 제50서열, 제52서열, 제54서열, 제55서열, 제57서열, 제58서열, 제60서열, 제61서열, 제63서열, 제65서열, 제67서열, 제68서열, 제70서열, 제71서열, 제73서열, 제74서열, 제76서열, 제77서열, 제79서열, 제80서열, 제82서열, 제83서열, 제85서열, 제86서열, 제88서열, 제89서열, 제91서열, 제92서열, 제94서열, 제95서열, 제97서열, 제98서열, 제100서열, 제101서열, 제103서열, 제104서열, 제106서열, 제107서열, 제109서열, 제110서열, 제112서열 및 제113서열의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열, 제4서열, 제8서열, 제9서열, 제12서열 및 제15서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군; 서열목록 제18서열, 제21서열, 제29서열 및 제32서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군; 서열목록 제42서열, 제45서열, 제52서열 및 제55서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군; 서열목록 제58서열, 제59서열, 제63서열 및 제65서열로 이루어진 혼합군; 서열목록 제68서열, 제71서열, 제91서열 및 제94서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군; 및 서열목록 제98서열, 제100서열, 제109서열 및 제112서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 혼합군을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 특정 조합을 이루는 혼합군으로서 사용될 경우, 단일 서열의 RNA를 사용하는 경우에 비하여 타겟 유전자의 억제 효율이 크게 증가함으로써 HPV 감염 관련 질환 에 대한 보다 우수한 치료 활성을 가진다는 사실을 발견하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료되는 HPV 감염 관련 질환은 성기 사마귀(genital warts), 질염(vagina inflammation) 골반염(pelvic inflammation) 및 암으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물로 치료되는 암은 자궁경부암(cervical cancer), 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물로 치료되는 암은 자궁경부암이다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 핵산 분자의 약제학적 유효량이 포함된 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 본 발명의 관절염 예방, 경감 또는 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 사이클로덱스트린과 그의 공중합체 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여, 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 항암제로서 사용되는 경우, 당업계에서 통상적으로 사용되는 항암 조성물과 병용하여 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 시스플라틴 도는 파크리탁셀 등의 항암제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 핵산분자는 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함되어 있다.
본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달체을 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 릴랙신 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, U6 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 포함하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc . Natl . Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 양이온성 리포좀(cationic liposome)을 이용하여 전달된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 HPV(human papilloma virus) 감염 관련 질환, 보다 구체적으로는 HPV 감염 관련 암, 보다 더 구체적으로는 자궁경부암(cervical cancer의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열, 이들의 염기가 변형된 서열 및 이들의 특정 조합을 사용할 경우, HPV 16 형 또는 HPV 18 형 바이러스의 E6/E7 유전자의 발현을 크게 억제함으로써 효율적인 HPV 감염 관련 질환의 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1는 HPV 16, 18번 siRNA에 있어서, 염기서열의 잔기 치환 변화에 따른 안정성의 향상(도 1a), 단백질 분자 수준에서의 효과 상승(도 1b) 및 mRNA 분자수준에서의 효과 상승(도 1c)를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 HPV 18번 형태의 siRNA 염기서열 잔기 치환의 우수한 세포 노화 유도 효과(도 2a) 및 세포 사멸 효과(도 2b)를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 HPV 18번 형태의 바이러스에 감염된 HeLa 자궁경부암 세포주에서 염기서열이 치환된 426 siRNA와 항암제 시스플라틴과의 병용치료에 의한 세포 노화 유도 효과(도 3a) 및 이를 현미경으로 관찰한 결과(도 3b)를 나타낸 그림이다.
도 4는 HPV 16, 18번 형태의 염기서열이 치환된 우수한 siRNA 혼합 치료 효과 및 시스플라틴과의 병용치료 효과에 의한 상승효과를 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4a, 도 4b 및 도 4c는 각각 세포 증식 억제 효과, 세포 사멸 효과, 단백질 분자 수준에서의 효과를 나타낸다.
도 5는 HPV 18번 형태의 siRNA 세포와 동물에서의 off-target 효과를 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 도 5a 및 5b는 각각 세포상에서의 IL-6 감소 효과 및 동물에서의 INF-gamma 감소 효과를 나타낸다.
도 6은 HPV 18번 형태의 426 siRNA를 Stem-loop Real-Time PCR를 통하여 정량화 한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 다양한 형태의 리포좀에서도 siRNA가 세포에서 동일한 세포 사멸 효과를 보인다는 사실을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 동물실험에서 우수한 효과를 나타낸 염기서열 치환- siRNA들의 혼합군과 항암제의 병용치료에 의한 상승효과를 확인한 그림이다. 도 8a, 도 8b 및 도 8c는 각각 마우스 종양 크기 변화, 마우스 종양 사진 및 마우스 몸무게의 변화 수치를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
HPV 16, 18번 형태의 siRNA 제작
하기 표 1 내지 3의 siRNA는 (주)바이오니아(korea)에 주문 제작하여 습득하였다. 하기 표에서 밑줄로 나타낸 siRNA 서열은 염기잔기에 메틸기가 결합시킨 2'-O-Me 변형 뉴클레오타이드로 치환된 염기를 나타내며, 두꺼운 이탤릭체로 나타낸 서열은 염기잔기의 하이드록시기를 플루오로로 치환한 2'-F 변형 뉴클레오타이드로 치환된 염기를 나타낸다.
HPV 16번 형태에 대한 siRNA
서열번호 서열 비고
서열 1 5’-GCA AAG ACA UCU GGA CAA A- 3' HPV 16 Type siRNA 366
서열 2 5’-GCA AAG ACA UCU GGA CAA A- 3'
서열 3 5’-GCA AAG ACA UCU GGA CAA A- 3'
서열 4 5’-UUU GUC CAG AUG UCU UUG C- 3'
서열 5 5’-UUU GUC CAG AUG UCU UUG C- 3'
서열 6 5’-UUU GUC CAG AUG UCU UUG C- 3'
서열 7 5’-UCA AGA ACA CGU AGA GAA A- 3' HPV 16 Type siRNA 448
서열 8 5’-UCA AGA ACA CGU AGA GAA A- 3'
서열 9 5’-UUU CUC UAC GUG UUC UUG A- 3'
서열 10 5’-UUU CUC UAC GUG UUC UUG A- 3'
서열 11 5’-UUU CUC UAC GUG UUC UUG A- 3'
서열 12 5’-GAC CGG UCG AUG UAU GUC UUG- 3' HPV 16 Type siRNA 497
서열 13 5' -GAC CGG UCG AUG UAU GUC UUG- 3'
서열 14 5' -AGA CAU ACA UCG ACC GGU CCA- 3'
서열 15 5' -AGA CAU ACA UCG ACC GGU CCA- 3'
서열 16 5’-GGA GCG ACC CAG AAA GTT A- 3’ HPV 16 Type siRNA 39
서열 17 5’-GGA GCG ACC CAG AAA GTT A- 3’
서열 18 5’-GGA G C G A CC C AG AAA GTT A- 3’
서열 19 5’-UAA CUU UCU GGG UCG CUC C- 3’
서열 20 5’-UAA CUU UCU GGG UCG CUC C- 3’
서열 21 5’-UAA CUU UCU GGG UCG CUC C- 3’
서열 22 5’-CAG AAA GTT ACC ACA GTT A- 3’ HPV 16 Type siRNA 48
서열 23 5’-CAG AAA GTT ACC ACA GTT A- 3’
서열 24 5’- C AG AAA GTT A CC A C A GTT A- 3’
서열 25 5’-UAA CUG UGG UAA CUU UCU G- 3’
서열 26 5’-UAA CUG UGG UAA CUU UCU G- 3’
서열 27 5’-UAA CUG UGG UAA CUU UCU G- 3’
서열 28 5’-GCA CAG AGC TGC AAA CAA C- 3’ HPV 16 Type siRNA 68
서열 29 5’-GCA CAG AGC TGC AAA CAA C- 3’
서열 30 5’-G C A CAG AG C TG C AAA C AA C- 3’
서열 31 5’-GUU GUU UGC AGC UCU GUG C- 3’
서열 32 5’-GUU GUU UGC AGC UCU GUG C- 3’
서열 33 5’-GUU GUU UGC AGC UCU GUG C- 3’
서열 34 5’-GCA AAC AAC TAT ACA TGA T- 3’ HPV 16 Type siRNA 78
서열 35 5’-GCA AAC AAC TAT ACA TGA T- 3’
서열 36 5’-G C A AA C AA C TAT A C A TGA T- 3’
서열 37 5’-AUC AUG UAU AGU UGU UUG C- 3’
서열 38 5’-AUC AUG UAU AGU UGU UUG C- 3’
서열 39 5’-AUC AUG UAU AGU UGU UUG C- 3’
서열 40 5’-AGC AAA GAC ATC TGG ACA A- 3’ HPV 16 Type siRNA 365
서열 41 5’-AGC AAA GAC ATC TGG ACA A- 3’
서열 42 5’-AG C AAA GA C AT C TGG A C A A- 3’
서열 43 5’-UUG UCC AGA UGU CUU UGC U- 3’
서열 44 5’-UUG UCC AGA UGU CUU UGC U- 3’
서열 45 5’-UUG UCC AGA UGU CUU UGC U- 3’
서열 46 5’-CAC CUA CAU UGC AUG AAU AUA- 3’ HPV 16 Type siRNA 573
서열 47 5’-CAC CUA CAU UGC AUG AAU AUA- 3’
서열 48 5’-UAU AUU CAU GCA AUG UAG GUG- 3’
서열 49 5’-UAU AUU CAU GCA AUG UAG GUG- 3’
서열 50 5’-UAU AUU CAU GCA AUG UAG GUG- 3’
서열 51 5’-CUU CGG UUG UGC GUA CAA AGC- 3’ HPV 16 Type siRNA 792
서열 52 5’-CUU CGG UUG UGC GUA CAA AGC- 3’
서열 53 5’-GCU UUG UAC GCA CAA CCG AAG- 3’
서열 54 5’-GCU UUG UAC GCA CAA CCG AAG- 3’
서열 55 5’-GCU UUG UAC GCA CAA CCG AAG- 3’
HPV 18번 형태에 대한 siRNA
서열번호 서열 비고
서열 56 5’-CAA CCG AGC ACG ACA GGA A- 3' HPV 18 Type siRNA 426
서열 57 5’- C AA CC G AG C A C G A C A GGA A- 3'
서열 58 5’-CAA CCG AGC ACG ACA GGA A- 3'
서열 59 5’-UUC CUG UCG UGC UCG GUU G- 3'
서열 60 5’-UUC CUG UCG UGC UCG GUU G- 3'
서열 61 5’-UUC CUG UCG UGC UCG GUU G- 3'
서열 62 5’-CCA ACG ACG CAG AGA AAC A- 3' HPV 18 Type siRNA 450
서열 63 5’-CCA ACG ACG CAG AGA AAC A- 3'
서열 64 5’-UGU UUC UCU GCG UCG UUG G- 3'
서열 65 5’-UGU UUC UCU GCG UCG UUG G- 3'
서열 66 5’-ACT GCA AGA CAT AGA AAT A- 3’ HPV 18 Type siRNA 72
서열 67 5’-ACT GCA AGA CAT AGA AAT A- 3’
서열 68 5’-A C T G C A AGA C AT AGA AAT A- 3’
서열 69 5’-UAU UUC UAU GUC UUG CAG U- 3’
서열 70 5’-UAU UUC UAU GUC UUG CAG U- 3’
서열 71 5’-UAU UUC UAU GUC UUG CAG U- 3’
서열 72 5’-GTA TAT TGC AAG ACA GTA T- 3’ HPV 18 Type siRNA 97
서열 73 5’-GTA TAT TGC AAG ACA GTA T- 3’
서열 74 5’-GTA TAT TG C AAG A C A GTA T- 3’
서열 75 5’-AUA CUG UCU UGC AAU AUA C- 3’
서열 76 5’-AUA CUG UCU UGC AAU AUA C- 3’
서열 77 5’-AUA CUG UCU UGC AAU AUA C- 3’
서열 78 5’-GCA AGA CAG TAT TGG AAC T- 3’ HPV 18 Type siRNA 103
서열 79 5’-GCA AGA CAG TAT TGG AAC T- 3’
서열 80 5’-G C A AGA C AG TAT TGG AA C T- 3’
서열 81 5’-AGU UCC AAU ACU GUC UUG C- 3’
서열 82 5’-AGU UCC AAU ACU GUC UUG C- 3’
서열 83 5’-AGU UCC AAU ACU GUC UUG C- 3’
서열 84 5’-ATT GGA ACT TAC AGA GGT A- 3’ HPV 18 Type siRNA 113
서열 85 5’-ATT GGA ACT TAC AGA GGT A- 3’
서열 86 5’-ATT GGA A C T TA C AGA GGT A- 3’
서열 87 5’-UAC CUC UGU AAG UUC CAA U- 3’
서열 88 5’-UAC CUC UGU AAG UUC CAA U- 3’
서열 89 5’-UAC CUC UGU AAG UUC CAA U- 3’
서열 90 5’-CTC CAA CGA CGC AGA GAA A- 3’ HPV 18 Type siRNA 448
서열 91 5’-CTC CAA CGA CGC AGA GAA A- 3’
서열 92 5’-CT C CAA C GA C G C AGA GAA A- 3’
서열 93 5’-UUU CUC UGC GUC GUU GGA G- 3’
서열 94 5’-UUU CUC UGC GUC GUU GGA G- 3’
서열 95 5’-UUU CUC UGC GUC GUU GGA G- 3’
서열 96 5’-ACG CAG AGA AAC ACA AGT A- 3’ HPV 18 Type siRNA 456
서열 97 5’-ACG CAG AGA AAC ACA AGT A- 3’
서열 98 5’-ACG CAG AGA AAC ACA AGT A- 3’
서열 99 5’-UAC UUG UGU UUC UCU GCG U- 3’
서열 100 5’-UAC UUG UGU UUC UCU GCG U- 3’
서열 101 5’-UAC UUG UGU UUC UCU GCG U- 3’
HPV 18번 형태에 대한 siRNA-계속
서열번호 서열 비고
서열 102 5’-GCA GAG AAA CAC AAG TAT A- 3’ HPV 18 Type siRNA 458
서열 103 5’-GCA GAG AAA CAC AAG TAT A- 3’
서열 104 5’-G C A GAG AAA C A C AAG TAT A- 3’
서열 105 5’-UAU ACU UGU GUU UCU CUG C- 3’
서열 106 5’-UAU ACU UGU GUU UCU CUG C- 3’
서열 107 5’-UAU ACU UGU GUU UCU CUG C- 3’
서열 108 5’-CAG AGA AAC ACA AGT ATA A- 3’ HPV 18 Type siRNA 459
서열 109 5’-CAG AGA AAC ACA AGT ATA A- 3’
서열 110 5’- C AG AGA AA C A C A AGT ATA A- 3’
서열 111 5’-UUA UAC UUG UGU UUC UCU G- 3’
서열 112 5’-UUA UAC UUG UGU UUC UCU G- 3’
서열 113 5’-UUA UAC UUG UGU UUC UCU G- 3’
siRNA 의 안정성 확인
siRNA을 10% 우혈청 또는 10% 사람 혈청에 섞어 준 후, 37℃에 넣어 시간별로 샘플을 취한 후 급속 냉각 시켜 -70℃에 보관하였다. 취합된 샘플들을 12% 폴리아크릴라마이드 젤에 50V로 1시간 반 동안 전기영동을 하여 Et-Br로 염색 후 UV로 측정하였다.
세포배양 및 siRNA 형질도입
자궁경부암세포와 HPV 18번 형태의 바이러스에 감염된 HeLa 자궁경부암 세포주(HeLa; ATCC CCL-2) 또는 HPV 16번 형태의 바이러스에 감염된 SiHa (SiHa; ATCC HTB-35) 또는 CaSki (ATCC CRL-1550) 자궁경부암 세포주를 6-웰 플레이트에 2× 105 또는 1.5 × 105 의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 10%의 우혈청이 들어간 RPMI1640 또는 DMEM 배지에서 각각 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 동안 배지에서 배양하여 세포가 배양용기 표면에 흡착되면, 대조군으로 비변형 siRNA와 실험군으로 상술한 방법으로 변형시킨 siRNA 올리고뉴클레오티드 각각 20 nM을 DharmaFECT 1 (Dharmacon, USA)를 사용하여 형질도입한 뒤, 24시간 동안 배양하였다.
항암제 처리
상술한 방법으로 6-웰 플레이트에 2× 105 또는 1.5 × 105 세포로 분주하여 1일간 배양된 HeLa 또는 Caski 세포주에 siRNA를 형질도입시킨 후, 시스플라틴(CDDP) 최종 농도 각각 2.5uM로 처리하여 배양하였다.
세포노화에 관련한 β 갈락토시다아제 ( SA -β- gal ) 활성 측정
상술한 방법으로 HeLa 또는 Caski 세포주에 siRNA를 단독으로 형질도입하거나 혹은 항암제와 병용 투여한 후 하루 동안 배양하였다. 세포노화 측정 킷트 (BioVision, USA)를 이용하여 PBS로 세척하고 SA-β-gal 염색용액에 37℃에서 12시간 처리하였다. 일반광학현미경을 이용하여 100-200배의 배율로 파란색으로 염색된 세포들을 관찰하였다.
유세포 분석기를 이용한 세포사멸 측정
상술한 방법으로 HeLa 또는 Caski 세포주에 siRNA를 단독으로 형질도입하거나 혹은 항암제와 병용 투여한 후 하루 동안 배양하였다. 세포사멸 측정 킷트(BD, USA)를 이용하여 Annexin V와 PI(propidium iodide) 시약으로 염색하여 상온에서 30분 반응을 시킨 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포의 사멸을 확인하였다.
siRNA 의 치료 영향 조사
상술한 방법으로 HeLa 또는 Caski 세포주에 siRNA를 단독으로 형질도입하거나 혹은 항암제와 병용 투여한 후 하루 동안 배양하였다. 단백질의 변화를 관찰하기 위해 세포를 RIPA 세포용해 완충액 RIPA lysis buffer : 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜레이트 및 1% NP-40]를 첨가하여 파쇄하였고 일반적인 웨스턴 블럿 방법에 의해 단백질 변화량을 관찰하였다. 항-TP53, 항-E7, 항-Actin 마우스 항체는 Santa Cruz사(USA)에서 구입하였으며, 1:1000 으로 희석해서 사용하였다. 염소 -항-마우스 IgG HRP 접합 항체 (Goat-anti-mouse IgG HRP conjugate antibody)는 Jackson Laboratories사 (USA)에서 구입하여 1:3000 으로 희석하여 사용하였다.
또한, mRNA의 변화량을 관찰하기 위해 세포를 트리졸 용액(Trizol solution, Invitrogen, USA)을 이용하여 파쇄하였고, 에탄올 정제를 통해 RNA를 검출하여 일반적인 Real-time PCR (실시간 중합효소 연쇄 반응) 방법에 의해 mRNA 변화량을 관찰하였다.
siRNA 의 off - target 효과의 영향 조사
HeLa 또는 Caski 세포주를 6-웰 플레이트에 분주 한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 10%의 우혈청이 들어간 RPMI1640 또는 DMEM 배지에서 각각 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군 β-gal siRNA와 siRNA를 형질도입하여 배양한 후 배지를 취하여 일반적인 IL-6 (BD, USA) ELISA 방법을 수행하였다.
6주령의 마우스에 양성대조군 β-gal siRNA와 음성대조군 siRNA, siRNA를 정맥주사하여 6시간 동안 반응을 시킨 후에 마우스의 혈액을 채취하여 혈청 분리 후 INF-gamma (BD, USA) ELISA를 수행하였다.
siRNA 의 정량화를 위한 스템 -루프( Stem - loop ) Real - time PCR
260~300g 정도의 4주령 래트에 siRNA를 정맥내 주사로 투여하여 시간별로 렛 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장을 0.25% triton X-100 완충액에 희석시켜 Taqman microRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystem, USA)로 cDNA를 합성한 후 Real-time PCR 방법으로 정량화하여 siRNA를 검출하였다.
siRNA 의 동물실험
암컷 누드마우스에 HPV 18 type의 HeLa 세포주 5 × 10 6을 이종 이식하여 10일 후에 암세포가 생성된 것을 확인한 후, 사용된 siRNA는 3 mg/kg으로 2-3일 간격으로 꼬리에 정맥주사 하였으며, 시스플라틴(2mg/kg)과 파크리탁셀(4mg/kg)을 3-4일 간격으로 복강 주사하여 9회 반복 주사 하고 2-3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다.
실험결과
siRNA 처리 농도 및 치료 횟수의 변화
HPV 16, 18번 형태의 바이러스에 감염시킨 Caski 혹은 HeLa 세포주에 siRNA의 형질도입과 항암제 단독 혹은 병용치료 수행시, 종래의 기술로는 장기간 동안 고농도(100 nM)로 연속처리한 경우에만 siRNA의 효능을 확인할 수 있었지만, 본 발명의 변형 siRNA를 이용할 경우 단기간, 저농도(20 nM 이하)로 단회 처리하여도 우수한 효능을 발휘하였다.
잔기 치환된 siRNA 안정성 평가
상술한 방법으로 수득한 조합 51 내지 조합 54의 siRNA를 10% 인간 혈청과 섞어준 후 37℃ 온도에서 각각의 siRNA를 시간 별로 취하여 -70℃에 보관한 뒤 12% 폴리아크릴라마이드 젤에 전기영동하여 Et-Br로 염색 후 UV로 측정하였다. 그 결과 도 1a에서 나타난 바와 같이 염기서열의 잔기치환이 없는 조합51의 경우 2시간 이내에 siRNA가 사라지지만, 염기서열의 잔기를 치환시킨 조합 52 내지 조합 54의 경우 siRNA가 4시간 이상 잔존하여 안정성이 크게 증가됨을 확인하였다. 특히 조합 54의 경우 24시간이 지나도 잔존하는 가장 우수한 안정성을 보여주었다.
잔기 치환된 siRNA 의 분자수준에서의 효과
상술한 방법으로 HPV 18번 형태의 siRNA 조합 44 내지 조합 50의 siRNA와 대조군 Mock, GFP siRNA를 HeLa 세포주에 형질도입하여 TP53, E7 단백질의 변화량을 확인하였으며 액틴을 하우스키핑 유전자로 사용하였다. 도 1b에서 나타난 바와 같이 염기 서열의 잔기 치환이 없는 조합 44과 염기 서열의 잔기를 치환 시킨 조합 45 내지 조합 50의 TP53과 E7의 단백질 변화량을 비교하였다. 이때, 조합 48에서 TP53 단백질 발현의 증가와 E7 단백질 발현의 감소는 다른 서열들에 비해 우수한 효능을 가지는 것을 확인하였다.
또한, HPV 16번 형태의 siRNA 497의 경우, 상술한 방법으로 조합 12 내지 조합 15를 Caski 세포주에 형질 도입한 후 mRNA를 추출하여 E6 mRNA와 p21 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과 도 1c에서 염기서열의 잔기를 치환 시킨 조합 13이 대조군에 비해 E6 mRNA가 60% 이상 감소하였고, p21 mRNA는 1100% 이상 증가함을 확인하였다. 염기서열의 잔기 치환이 없는 조합 12와 비교하였을 때도 조합 13이 다른 서열들에 비해 우수함을 확인하였다.
잔기 치환된 siRNA 의 세포 노화 유도 효과
상술한 방법으로 처리된 HeLa 또는 Caski 세포주의 SA β-Gal 활성을 측정하였다. 그 결과 도 2a에서는 기존 발명에 사용된 HPV 18E6/E7 siRNA군과 450 siRNA의 염기서열 잔기치환이 없는 조합 51을 형질도입한 경우 대군 siRNA에 비해 10-20배 정도 증가된 SA-β Gal 활성을 보여주는 반면, siRNA 염기서열을 잔기치환 시킨 조합 54 에서는 50배 이상 높은 SA-β Gal 활성을 보여주고 있다. 이는 염기서열을 치환 시킨 조합 54 이 염기서열을 치환시키지 않은 조합 51에 비하여 세포노화 효과가 크게 우수함을 보여주고 있다.
잔기 치환된 siRNA 의 세포 사멸 효과
상술한 방법으로 유세포 분석기를 사용하여 세포 사멸 효과를 측정하였다. HPV 18E6/E7, 18E6 siRNA군과 염기서열 잔기를 치환시킨 조합 48, 조합 54군을 대조군과 비교하여 세포사멸 효과를 확인한 결과, 대조군에 비해 HPV 18E6/E7, 18E6 siRNA군은 15-20 % 에 불과한 세포 사멸 효과를 나타내고 있는데 비해, 잔기를 치환시킨 siRNA군에서는 약 60% 이상의 세포 사멸 효과를 나타냄을 확인하였다. (도 2b). 이는 기존의 siRNA에 비해 염기서열을 치환시킨 siRNA 서열들이 암세포 사멸 효과가 더욱 현저하게 증대되었음을 보여주고 있다.
잔기 치환된 siRNA 와 시스플라틴과의 병용치료 효과
상술한 방법으로 HeLa 세포 주에 시스플라틴과 염기서열 잔기를 치환시킨 조합 48을 처리하여 SA β-Gal 활성을 측정한 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이 시스플라틴과 조합 48을 각각 단독으로 처리한 세포주에서도 세포가 파란 색으로 염색되어 SA β-Gal의 활성을 보여주지만, 조합 48과 시스플라틴의 병용 치료군에서는 거의 모든 세포가 진한 파란색으로 염색되어 강한 SA β-Gal의 활성을 나태내고 있다. 이러한 결과는 siRNA와 시스플라틴의 단독 치료군보다 병용 치료군의 세포노화 효과가 월등히 우수함을 보여주고 있다.
siRNA 혼합물의 단독치료 및 병용치료에 의한 세포 증식 억제 효과
상술한 방법으로 HPV 16 번 Caski 세포주에 HPV 16번 형태의 염기 서열을 치환시킨 siRNA 조합 2, 조합 9, 및 조합 13을 단독군으로 각각 20 nM 처리를 하고, 조합 2와 조합 9을 10nM씩 처리한 혼합 군, 조합 2와 조합 13을 10 nM씩 처리한 혼합 군, 조합 9와 조합 13을 10 nM씩 처리한 혼합군, 조합 9와 조합 13을 10nM씩 처리한 혼합군, 그리고 조합 2, 조합 9, 조합 13을 7nM씩 처리한 혼합 군을 형질도입시킨 후, 24시간 뒤에 세포 수를 측정하였다. 그 결과 도 4a에서 나타난 바와 같이 염기 서열을 치환시킨 각 siRNA 단독 처리군과 siRNA 혼합물 처리 군에서 유사한 형태로 세포 증식이 감소하였다. 특히, siRNA 3가지 혼합물 처리군에서는 각각의 siRNA가 7 nM의 양만 처리 되었음에도 불구하고 효과는 단독으로 siRNA를 20 nM 처리 했을 때와 같은 효과를 보여주고 있다.
본 발명에서 사용된 siRNA 혼합군의 조합은 하기의 표 4에 나타내었으며, 이들 조합 중 특히 높은 세포증식 억제 효과를 가지는 조합들을 2개 이상 혼합한 siRNA 혼합군(siRNA Pool)은 하기의 표 5에 나타내었다.
siRNA의 조합
조합번호 센스 안티센스 비고
조합1 서열 1 서열 4 HPV 16 type siRNA 366
조합2 서열 2 서열 4
조합3 서열 2 서열 5
조합4 서열 2 서열 6
조합5 서열 3 서열 4
조합6 서열 3 서열 5
조합7 서열 3 서열 6
조합8 서열 7 서열 9 HPV 16 type siRNA 448
조합9 서열 8 서열 9
조합10 서열 8 서열 10
조합11 서열 8 서열 11
조합12 서열 12 서열 14 HPV 16 type siRNA 497
조합13 서열 12 서열 15
조합14 서열 13 서열 14
조합15 서열 13 서열 15
조합16 서열 16 서열 19 HPV 16 Type siRNA 39
조합17 서열 17 서열 20
조합18 서열 18 서열 21
조합19 서열 18 서열 21
조합20 서열 22 서열 25 HPV 16 Type siRNA 48
조합21 서열 23 서열 25
조합22 서열 24 서열 26
조합23 서열 24 서열 27
조합24 서열 28 서열 31 HPV 16 Type siRNA 68
조합25 서열 29 서열 32
조합26 서열 30 서열 32
조합27 서열 30 서열 33
조합28 서열 34 서열 34 HPV 16 Type siRNA 78
조합29 서열 35 서열 37
조합30 서열 36 서열 38
조합31 서열 36 서열 39
조합32 서열 40 서열 43 HPV 16 Type siRNA 365
조합33 서열 41 서열 44
조합34 서열 42 서열 44
조합35 서열 42 서열 45
조합36 서열 46 서열 48 HPV 16 Type siRNA 573
조합37 서열 46 서열 49
조합38 서열 47 서열 48
조합39 서열 47 서열 50
조합40 서열 51 서열 53 HPV 16 Type siRNA 792
조합41 서열 51 서열 55
조합42 서열 52 서열 54
조합43 서열 52 서열 55
조합44 서열 56 서열 59 HPV 18 type siRNA 426
조합45 서열 57 서열 59
조합46 서열 57 서열 60
조합47 서열 57 서열 61
조합48 서열 58 서열 59
조합49 서열 58 서열 60
조합50 서열 58 서열 61
조합51 서열 62 서열 64 HPV 18 type siRNA 450
조합52 서열 62 서열 65
조합53 서열 63 서열 64
조합54 서열 63 서열 65
조합55 서열 66 서열 69 HPV 18 Type siRNA 72
조합56 서열 67 서열 70
조합57 서열 67 서열 69
조합58 서열 68 서열 71
조합59 서열 72 서열 76 HPV 18 Type siRNA 97
조합60 서열 73 서열 75
조합61 서열 73 서열 77
조합62 서열 74 서열 77
조합63 서열 78 서열 83 HPV 18 Type siRNA 103
조합64 서열 79 서열 82
조합65 서열 80 서열 81
조합66 서열 80 서열 82
조합67 서열 84 서열 89 HPV 18 Type siRNA 113
조합68 서열 85 서열 87
조합69 서열 86 서열 88
조합70 서열 86 서열 89
조합71 서열 90 서열 95 HPV 18 Type siRNA 448
조합72 서열 91 서열 94
조합73 서열 92 서열 93
조합74 서열 92 서열 95
조합75 서열 96 서열 99 HPV 18 Type siRNA 456
조합76 서열 97 서열 99
조합77 서열 98 서열 100
조합78 서열 98 서열 101
조합79 서열 102 서열 107 HPV 18 Type siRNA 458
조합80 서열 103 서열 106
조합81 서열 103 서열 107
조합82 서열 104 서열 105
조합83 서열 108 서열 113 HPV 18 Type siRNA 459
조합84 서열 109 서열 112
조합85 서열 110 서열 112
조합86 서열 110 서열 113
siRNA 혼합군 (siRNA Pool)
혼합번호 센스 안티센스 조합번호 비고
SP1 서열 2 서열 4 2 HPV 16 type siRNAs 366/448/497
서열 8 서열 9 9
서열 12 서열 15 13
SP2 서열 18 서열 21 18 HPV16 type siRNAs 39/68
서열 29 서열 32 25
SP3 서열 42 서열 45 35 HPV16 type siRNAs 365/792
서열 52 서열 55 43
SP4 서열 58 서열 59 48 HPV 18 type siRNAs 426/450
서열 63 서열 65 54
SP5 서열 68 서열 71 58 HPV18 type siRNAs 72/448
서열 91 서열 94 72
SP6 서열 98 서열 100 77 HPV18 type siRNAs 456/459
서열 109 서열 112 84
siRNA 혼합물의 단독치료 및 병용치료에 의한 세포 사멸 효과
상술한 방법으로 HPV 18번 HeLa 세포주에 HPV 18번 형태의 염기서열을 치환시킨 siRNA 조합 48번 20 nm 과 조합 54번 20 nM 처리와, siRNA 조합의 혼합군인 SP4(조합48(5 nM)과 조합 54(5 nM))를 10nM 처리한 혼합군을 형질도입 시킨 후, 24시간 뒤에 Annexin V와 프로피듐 이오다이드로 염색시킨 뒤에 유세포 분석기를 사용하여 세포의 사멸 효과를 확인하였다. 그 결과 도 4b에서 나타난바와 같이 염기서열이 치환된 siRNA 단독 처리군과 siRNA 혼합군(SP4) 모두 세포가 80% 이상 사멸되는 효과를 나타내었다. 이 결과는 siRNA 단독군을 20 nM 처리했을 때와 siRNA 혼합군으로 10 nM씩 처리했을 때 세포 사멸 효과가 유사하게 나타남으로써 siRNA 혼합군의 우수함을 확인할 수 있다.
siRNA 혼합물의 단독치료 및 병용치료에 의한 분자수준에서의 효과
상술한 방법으로 HPV 16번 형태의 CaSki 세포주에 염기서열을 치환시킨 조합 2, 9, 13과 시스플라틴의 병용치료군, 시스플라틴 단독치료군, 조합 2와 조합 9의 혼합군과 시스플라틴의 병용치료군, 조합 2와 조합 13의 혼합군과 시스플라틴의 병용치료군, 조합 9와 조합 13의 혼합군과 시스플라틴의 병용치료군, 혼합군 SP1(조합2, 조합 9 및 조합 13의 혼합군)과 시스플라틴의 병용치료군에서 TP53 단백질 발현량을 비교하기 위해 웨스턴 블럿 방법을 사용하였다. 그 결과 도 4C에서 나타난 바와 같이 siRNA 혼합군과 시스플라틴과의 병용 치료군들 중 7 nM의 낮을 농도로 처리한 혼합군 SP1에서 TP53 단백질 발현량이 가장 많이 증가하였다.
이는 자연상에 존재하는 siRNA 혼합군의 특징을 모방하면서 유능하고 효율적인 siRNA만을 선택적으로 혼합물로 구성하였기 때문에, 기존의 처리 농도보다 낮은 농도로 혼합하여 사용할 수 있고, off-target 효과도 줄일 수 있음을 보여주는 것이다.
siRNA 의 off - target 효과
상술한 방법으로 HPV 18번 형태의 HeLa 세포주에 양성 대조군 β-gal siRNA와 잔기 치환이 없는 조합 44와 염기서열 잔기를 치환시킨 조합 48을 형질도입하여 IL-6의 면역반응 실험을 수행하였다. 그 결과 도 5a에서 나타내는 바와 같이 양성 대조군과 조합 44 에서는 IL-6의 면역 반응이 증가 되었지만, 염기서열의 잔기가 치환된 조합 48 에서는 IL-6 면역 반응이 양성 대조군 1/2 수준으로 감소하였다.
또한, 6주령의 마우스에 면역반응을 유발시키는 β-gal siRNA와 HPV 18번 형태의 siRNA 조합 44와 48을 정맥 주사하여 6시간 동안 반응 시킨 후 INF-gamma의 면역반응 실험을 수행하였다(도 5b). 양성 대조군 β-gal siRNA와 조합 44 에서는 INF-gamma의 수준이 증가되어 면역 반응이 관찰되었지만, 조합 48 에서는 INF-gamma가 음성 대조군 수준으로 INF-gamma가 증가되지 않아 면역반응이 관찰되지 않았다.
이를 통하여 잔기를 치환시킨 siRNA의 처리군에서 잔기를 치환시키지 않은 siRNA에 비해 면역반응이 감소됨을 알 수 있었다.
잔기 치환된 siRNA 의 약물동태학 실험
상술한 방법으로 래트에 HPV 18번 형태의 siRNA 조합 44와 조합 48을 정맥내 주사로 투여하여 시간별로 혈액을 채취하여 혈장을 분리하여 stem-loop Real-time PCR 방법으로 siRNA를 정량화하였다. 그 결과 도 6a에서 나타내는바와 같이 조합 48이 조합 44보다 반감기가 두 배 이상 길게 나타났으며, 이는 체내에서 염기서열이 잔기 치환된 조합 48이 더 안정적임을 알 수 있었다.
다양한 형태의 Liposome 에서의 siRNA 효과
상술한 방법으로 HPV 18번 형태의 HeLa 세포주에 상업적으로 판매되고 있는 Dharmacon사의 Dharmafect, Invitrgen사의 Oligofectamine과 Lipofectamine 2000 약물 전달 시스템과 본 발명자들이 제조한 양이온성 리포좀을 사용하여 siRNA를 형질 도입 시켜 24시간 후에 세포수를 측정하여 증식 억제 효과를 확인하였다. 그 결과 도 7에서 나타내는바와 같이 다양한 약물전달 시스템에서 효과적으로 HPV에 감염된 세포 주에 siRNA를 전달시킬 수 있음을 확인하였다.
siRNA 혼합군과 항암제의 병용치료 효과
상술한 방법으로 마우스에 암세포를 이종 이식하여 10일 후에 암세포가 생성된 것을 확인한 후, siRNA와 항암제를 9회 반복 주사하여 2-3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과 도 8a에서 나타내는바와 같이 SP4 (조합 48과 54 혼합군)와 항암제의 병용치료 군이 유의적으로 조합 44와 51 혼합군과 항암제의 병용치료군 보다 뛰어난 치료 효과를 보여주고 있다. 이는 염기서열의 잔기가 치환된 SP4가 염기 서열의 잔기 치환이 없는 siRNA 조합 44와 51의 혼합군보다 효능 효과가 우수함을 알 수 있었다. 또한, 도 8b와 같이 17일째 시스플라틴과 파크리탁셀 항암 투여군과 항암제와 SP4 혼합 병용투여군 마우스 종양을 비교해 보면 크기와 상태가 매우 차이가 남을 확인할 수 있었다. 그리고, 도 8c에서 나타내는바와 같이 약물 투여 후 9일째와 28일째 마우스 몸무게 변화량을 관찰한 결과 독성에 의한 몸무게 감소가 나타나지 않았다. 이로써 siRNA의 독성에 의한 부작용이 없음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REFERENCE BIOLABS <120> Composition for Treating HPV-related Cancer <130> PN120369 <160> 113 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 gcaaagacau cuggacaaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 2 gcaaagacau cnnnacaaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 3 ncaaanacau cunnacaaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 uuuguccaga 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modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 17 gnagcnaccc anaaantta 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n denotes F modified cytosine <400> 18 ggagngannn agaaagtta 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 uaacuuucug ggucgcucc 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 20 uaacnuucng ggncgcncc 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 21 uaacuuucun ngucncucc 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 cagaaagtta ccacagtta 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 23 canaaantta ccacantta 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes F modified cytosine <400> 24 nagaaagtta nnanagtta 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 uaacuguggu aacuuucug 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 26 uaacnguggn aacnuucng 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 27 uaacununnu aacuuucun 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 gcacagagct gcaaacaac 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 29 ncacananct ncaaacaac 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes F modified cytosine <400> 30 gnacagagnt gnaaanaac 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 guuguuugca gcucugugc 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 32 gnugunugca gcncugngc 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 33 guunuuunca ncucunugc 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 gcaaacaact atacatgat 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 35 ncaaacaact atacatnat 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes F modified cytosine <400> 36 gnaaanaant atanatgat 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 aucauguaua guuguuugc 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 38 ancaugnaua guugnungc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 39 aucaunuaua nuunuuunc 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 agcaaagaca tctggacaa 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 41 ancaaanaca tctnnacaa 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes F modified cytosine <400> 42 agnaaagana tntgganaa 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 uuguccagau gucuuugcu 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 44 unguccagau gncnungcu 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 45 uunuccanau nucuuuncu 19 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 caccuacauu gcaugaauau a 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 47 caccnacauu ncangaauan a 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 uauauucaug caauguaggu g 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 49 uananucaug caanguaggn g 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 50 uauauucaun caaunuannu g 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 cuucgguugu gcguacaaag c 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 52 cnucnguugu ncgnacaaag c 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 gcuuuguacg cacaaccgaa g 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 54 gcnnngnacg cacaaccgaa g 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 55 gcuuunuacn cacaaccnaa n 21 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 caaccgagca cgacaggaa 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes F modified cytosine <400> 57 naanngagna nganaggaa 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 58 caaccnanca cnacannaa 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 59 uuccugucgu gcucgguug 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 60 uuccngncgn gcncgguug 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 61 nnccngncgn gcncgguug 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 62 ccaacgacgc agagaaaca 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 63 ccaacnacnc ananaaaca 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 64 uguuucucug cgucguugg 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 65 ugunucucng cgncgnugg 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 66 actgcaagac atagaaata 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 67 actncaanac atanaaata 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes F modified cytosine <400> 68 antgnaagan atagaaata 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 69 uauuucuaug ucuugcagu 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 70 uanuncuaug ncungcagu 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 71 uauuucuaun ucuuncanu 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 72 gtatattgca agacagtat 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 73 ntatattnca anacantat 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes F modified cytosine <400> 74 gtatattgna aganagtat 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 75 auacugucuu gcaauauac 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 76 anacngucuu gcaananac 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 77 auacunucuu ncaauauac 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 78 gcaagacagt attggaact 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 79 gcaanacant attnnaact 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes F modified cytosine <400> 80 gnaaganagt attggaant 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 81 aguuccaaua cugucuugc 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 82 agnuccaana cugncuugc 19 <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 83 anuuccaana cugucuunc 19 <210> 84 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 84 attggaactt acagaggta 19 <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 85 attgnaactt acanannta 19 <210> 86 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <400> 86 attggaantt anagaggta 19 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 87 uaccucugua aguuccaau 19 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 88 uaccncngua agnnccaau 19 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 89 uaccucunua anuuccaau 19 <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 90 ctccaacgac gcagagaaa 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 91 ctccaacnac ncananaaa 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <400> 92 ctncaangan gnagagaaa 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 93 uuucucugcg ucguuggag 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 94 unucncugcg ncgnuggag 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 95 uuucucuncn ucnuugnag 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 96 acgcagagaa acacaagta 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 97 acncananaa acacaanta 19 <210> 98 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes F modified cytosine <400> 98 angnagagaa ananaagta 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 99 uacuuguguu ucucugcgu 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 100 uacungnguu ncucngcgu 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 101 uacuununuu ucucuncnu 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 102 gcagagaaac acaagtata 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 103 ncananaaac acaantata 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n denotes F modified cytosine <400> 104 gnagagaaan anaagtata 19 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 105 uauacuugug uuucucugc 19 <210> 106 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 106 uanacuugug nuucncngc 19 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 107 uauacuunun uuucucunc 19 <210> 108 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 108 cagagaaaca caagtataa 19 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 109 cananaaaca caantataa 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes F modified cytosine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes F modified cytosine <400> 110 nagagaaana naagtataa 19 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 111 uuauacuugu guuucucug 19 <210> 112 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n denotes o methyl modified uracil <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n denotes o methyl modified uracil <400> 112 unauacungu guuncucng 19 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n denotes o methyl modified guanine <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n denotes o methyl modified guanine <400> 113 uuauacuunu nuuucucun 19

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 서열목록 제1서열, 제7서열, 제12서열, 제56서열 및 제62서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 상기 뉴클레오타이드 서열의 안티센스 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 쌍(pair)을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 상기 뉴클레오타이드 쌍은 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 변형된 하나 이상의 염기를 포함하고, 상기 변형된 염기는 2’-O 메틸화(methylation)된 U, 2’-O 메틸화된 G 및 2’-플루오로화(fluorination)된 C로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 서열목록 제2서열과 제4서열; 제8서열과 제9서열; 제12서열과 제15서열; 제13서열과 제14서열; 제13서열과 제15서열; 제57서열과 제59서열; 제57서열과 제60서열, 제58서열과 제59서열; 제58서열과 제60서열; 제58서열과 제61서열; 및 제63서열과 제65서열의 뉴클레오타이드 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 뉴클레오타이드 쌍을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 2 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 siRNA (small interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 서열목록 제2서열, 제4서열, 제8서열, 제9서열, 제12서열 및 제15서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 혼합군; 또는 서열목록 제58서열, 제59서열, 제63서열 및 제65서열로 이루어진 혼합군을 유효성분으로 포함하는 HPV(human papilloma virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 2 항, 제 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HPV(human papilloma virus) 감염 질환은 성기 사마귀(genital warts), 질염(vagina inflammation), 골반염(pelvic inflammation) 및 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암(cervical cancer), 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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