KR101548480B1

KR101548480B1 - 혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법

Info

Publication number: KR101548480B1
Application number: KR1020150021189A
Authority: KR
Inventors: 이상현
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-08-31
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: US10266854B2; CA2920617C; BR102016002452A2; CA2920617A1; US20160230196A1

Abstract

본 발명은 목질계 당화액 미생물 저해물질에 내성을 가지면서 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미생물에서, 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로 또는 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된, 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미생물들을 이용한 부탄올 생산 방법에 대한 것이다.

Description

혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법{MICROORGANISM CAPABLE OF STIMULTANEOUS FERMENTATION OF SACCHARIDE MIXTURE AND PRODUCTION METHOD OF BUTANOL USING IT}

본 발명은 혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법에 대한 것이다.

부탄올은 다양한 종류의 케미칼 중간체로 이용되고 바이오연료로도 사용할 수 있는 등 활용범위가 매우 넓은 화합물로 그 효용성이 매우 크다

1900년 초 클로스트리디움 균주로 당을 발효하여 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생산하는 방법이 사용되었으나 석유가격이 낮아지고 옥소법(oxo process)을 이용하여 부탄올을 저렴하게 생산할 수 있게 되면서 생물학적 생산방법은 석유화학적 생산방법으로 대체되었다. 하지만, 최근 지구온난화 문제 등 석유자원의 사용으로부터 유래되는 다양한 환경문제로 인하여, 최근에는 다시 재생 가능한 자원으로부터 미생물의 발효를 통해 친환경적으로 부탄올을 생산하기 위한 요구가 증가하고 있다.

그러나 미생물을 이용하여 상업적 수준으로 부탄올을 생산하기 위하여는 미생물이 원료로 이용할 수 있는 바이오매스의 가격이 저렴하고 또한 비 식량자원이어야 바람직하다. 실제로 전통적인 전분질계 원료로 부탄올을 생산 시 원가의 60%가 원료비용으로 알려져 있다. 이는 곡물가격의 상승과 낮은 균주의 발효 수율에서 기인한 것이다. 그러므로, 바이오부탄올을 산업적 규모로 경제성 있게 생산하기 위해서는 재생가능하고 저렴하며 바이오매스로 비 식량자원이 고려되어야 한다. 이런 조건을 충족하는 자원은 셀룰로오식 바이오매스(Cellulosic biomass)임은 자명한 사실이다.

셀룰로오식 바이오매스는 포도당이 β-1,4 결합으로 이루어진 셀룰로오스(cellulose)와 다양한 오탄당과 육탄당의 결합으로 이루어진 헤미셀룰로오스(아라비노자일란(arabinoxylan), 갈락토만난(galactomannan) 및 자일로글루칸(xyloglucan))등으로 구성되어 있어, 당화 시 포도당(glucose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose) 같은 6탄당과 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose) 등의 오탄당 및 셀로바이오스(cellobiose)등의 2당류가 혼재된 상태로 존재한다. 그 중, 자일로스는 포도당 다음으로 풍부하게 존재하는 당으로 알려져 있다. 그러나, 미생물, 특히 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC824 균주 경우 포도당과 다른 종류의 당이 동시에 존재할 경우 포도당에 의해 다른 종류의 당 대사가 저해되는 현상 (CCR, carbon catabolite repression)이 나타나는 것으로 알려져 있다 (Ounine K, Petitdemange H, Raval G, Gay R. 1985. Appl Environ Microbiol 49:874-8). 이런 CCR현상은 당화액 내 혼합당의 완전한 발효를 저해하게 되어 수율이 감소하며 결과적으로 균주의 발효성능을 감소시키게 된다. 예컨대, 클로스트리디움 sp. AH-1(FERM-P 6093 ATCC39045)의 경우 아라비노스 및 자일로스의 이용이 가능하기는 하나, 글루코스를 우선적으로 이용하고 아라비노스 및 자일로스를 그 다음으로 이용하게 된다. 그러므로 글루코스를 먼저 이용하고, 그 다음에 아라비노스 및 자일로스의 이용에 필요한 유전자들을 발현시킨 후, 아라비노스 및 자일로스를 이용하게 된다. 따라서 클로스트리디움 sp. AH-1(FERM-P 6093 ATCC39045)를 이용하여 혼합당을 연속 발효시킬 경우, 배양액 내에 아라비노스 및 자일로스가 누적되게 될 뿐 아니라 이들의 이용을 위한 유전자 발현에 수 시간이 소요되는 문제가 있다.

그러므로 CCR 현상 없이 당화액 내 혼합당을 동시에 발효하여 부탄올을 생산할 수 있는 미생물이 필요하다.

최근 대사공학 기술의 발달과 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 경우 게놈서열이 알려지면서 좀더 효율적으로 부탄올을 생산하고자 하는 노력이 지속되고 있으며 대사경로 조작과 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다. 예컨대, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 catabolite control protein A (ccpA) 유전자를 제거했을 때 CCR현상이 완화되어 포도당과 자일로스가 동시에 발효된다고 보고된 바 있다(Ren C, Gu Y, Hu S, Wu Y, Wang P, et al. 2010. Metabolic engineering 12:446-54). 그러나, 이 경우 포도당 및 자일로스의 이용 수준이 미미하고 산업적 규모로 이용하기에는 균주의 성능이 부족하다. 또한, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 glucose phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system의 제2효소(enzyme II of the D-glucose phosphoenol-depnedent phosphotransferase system(PTS)) 유전자를 제거하고 자일로스 트란스퍼라아제 (xylose transferase), 자일로스 아이소머라이제 (xylose isomerase) 및 자일룰로오스 5-인산화 효소 (xylose kinase)를 발현하였을 때 CCR 현상이 완화되어 자일로스를 포도당과 동시에 발효하여 부탄올을 생산한다고 보고된 바 있다(Xiao H, Gu Y, Ning Y, Yang Y, Mitchell WJ, et al. 2011. Appl Environ Microbiol 77:7886-95). 하지만 이 결과 약 5g/L의 자일로스만 동시발효 가능했으며 (즉, 자일로스의 동시발효능이 낮다), 생산성 (0.31 g/L/h) 및 수율(16%(wt/wt))이 매우 낮아 상업적으로 이용하기에는 한계가 있다.

또한 셀룰로오식 바이오매스(나무, empty fruit bunch(EBF), 옥수수대, 볏짚등의 목본계 및 초본계 (이하 통칭하여 “목질계” 라고 함) 바이오매스를 전처리하여 생산된 당화액 내에는 당화 과정에서 처리되는 산이나 염기에 의해 부반응이 초래되고, 결과적으로 당화액 내에는 미생물의 생장에 저해를 나타내는 미지의 물질들이 포함되어 있다. 따라서, 혼합당을 동시에 효과적으로 발효하기 위해서는 상기의 혼합당 동시발효를 위한 유전자 조작뿐 아니라 저해물질에 내성을 가지는 미생물의 개발이 동시에 진행되어야 한다. 하지만, 현재까지 상기의 미생물 저해물질에 내성을 가지면서 혼합당을 동시에 효과적으로 발효하여 상업적으로 이용 가능한 수준의 미생물은 개발된 사례가 없다.

본 발명의 목적은 당화액에 내성을 가지면서도 혼합당 동시발효능을 갖는 부탄올 생산 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물을 제공한다.

본 발명의 미생물은 목질계 당화액 내 혼합당을 동시발효하여 부탄올을 높은 선택도로 생산할 수 있다.

도 1은 당화액 내성 균주들인 TM1-1 내지 TM1-20의 부탄올 생성능을 나타낸다.
도 2는 포도당 대신 당화액으로 제조한 CGM 고체배지에서 2일 배양 후 대조군과 비교한 TM1-3 균주이다.
도 3은 자일로스-포도당 동시발효균주인 TM2-1 내지 TM2-20의 부탄올 생성능을 나타낸다.
도 4는 TM2-1, TM2-16 및 TM2-19 균주들의 포도당과 자일로스의 동시발효능을 나타낸다.
도 5는 자일로스를 40% 포함하는 배지에서 TM2-1 균주의 동시발효능을 나타낸다.
도 6은 pGS1-AdhE1 플라스미드를 나타낸다.
도 7은 pGS1-CtfAB 플라스미드를 나타낸다.
도 8은 pGS1-E1AB의 플라스미드를 나타낸다.
도 9는 혼합당을 포함하는 목질계 당화액으로 TM2-1-C(pGS1-E1AB) 균주를 162.5 시간 동안 연속 발효 시 발효 시간에 따른 배지 내 당 프로파일을 나타낸다.

본 발명은,

목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고,

또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

둘 이상의 당을 포함하는 배지를 준비하는 단계;

상기 배지에 상기 미생물을 접종하는 단계;및

상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물에서,

부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로 또는 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된,

부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

둘 이상의 당을 포함하는 배지를 준비하는 단계;

상기 배지에 본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물

본 발명은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물에 대한 것이다. 상기 미생물은 목질계 당화액에 대하여 내성을 가지며, 좀더 바람직하게는 목질계 당화액 내 미생물 성장 저해물질에 대하여 내성을 갖는다. 또한 상기 미생물은 글루코스 및 자일로스의 동시발효능을 갖는다.

상기 미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 돌연변이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이며, 더더욱 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 △pta △buk 유래의 돌연변이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이다. 상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 △pta △buk 은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824에서 인산-아세테이트 전달 효소(phosphotransacetylase)를 발현하는 유전자인 pta와 부티레이트 인산화효소(butyrate kinase)를 발현하는 유전자인 buk가 동시에 결실된 재조합 미생물이다.

바람직하게는 상기 미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C(기탁번호 KCTC 12604BP)이다.

목질계 당화액

본 발명의 미생물은 목질계 당화액에 내성을 가지며, 또한 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 상기 목질계 당화액은 목질계 원료 (예를 들면, 나무, EFB(empty fruit bunch), 옥수수대, 사탕수숫대, 볏짚 등)를 가수분해한 가수분해물이며, 바람직하게는 목질계 원료를 가수분해한 후 리그닌을 제거하고 남은 가수분해물이다. 상기 목질계 당화액 내에는 혼합당이 포함되어 있는데, 상기 혼합당은 둘 이상의 당을 포함한다. 바람직하게는 상기 당화액 내에는 포도당, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스, 아라비노스, 셀로바이오스 등 오탄당, 육탄당 및 2당류들이 포함되어 있으며, 특히 포도당 및 자일로스의 함량이 높다.

목질계 당화액 내성

본 발명의 미생물은 목질계 당화액에 내성을 갖는다. 목질계 당화액에 내성을 갖는다는 것은 상기 미생물이 당화액 포함 배지에서 성장이 가능하며, 당화액 내 성분에 의하여 미생물의 성장 저해가 일어나지 않는다는 것을 의미한다.

동시발효능

본 발명의 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 동시발효능이란 하나의 당이 또 다른 당보다 우선하여 발효되지 않는다는 의미이다. 본 발명의 미생물은 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖기 때문에 동시발효능의 대상이 되는 당들 간에는 어느 한 당에 의하여 또 다른 당의 대사가 저해되는 현상이 방지된다.

재조합 미생물

본 발명은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖고, 또한 부탄올 생성능을 갖는 미생물에서, 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로 또는 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된, 부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대한 것이다.

상기 재조합 미생물은 코에이트랜스퍼라제의 활성이 증가됨으로써 부티레이트를 부티릴코에이로 전환하는 경로가 촉진되거나 또는 부티릴코에이를 부탄올로 전환하는 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 가지며, 동시발효를 통하여 ABE를 생산하는데, 특히 부탄올의 생산성 및 부탄올 선택도가 높다.

부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로의 촉진

부탄올 생산 경로에서 부티릴 코에이는 부탄알(butanal)을 거쳐 부탄올로 전환될 수 있다. 상기 경로는 부티릴 코에이의 부탄알로의 전환 단계 또는 부탄알의 부탄올로의 전환 단계를 촉진함으로써 촉진될 수 있다. 각 단계는 효소 활성의 증가와 같은 공지의 방법을 이용하여 촉진될 수 있다.

예컨대, 알데히드/알코올 디하이드로게나아제는 부티릴 코에이의 부탄알로의 전환 및 부탄알의 부탄올로의 전환을 조절하는데, 상기 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 활성이 증가됨으로써 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 활성 증가는 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 발현 증가, 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 알데히드/알코올 디하이드로게나아제를 코드하는 유전자인 다양한 adhE 유전자의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 활성을 증가시킬 수 있다.

부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로의 촉진

부탄올 생산 경로에서 코에이트랜스퍼라제(CoA transferase)는 부티레이트의 부티릴 코에이로의 전환을 조절한다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킴으로써 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진될 수 있다. 상기 코에이트랜스퍼라제의 활성 증가는 코에이트랜스퍼라제의 발현 증가, 코에이트랜스퍼라제의 효소 활성 증가 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 코에이트랜스퍼라제를 코드하는 유전자인 cftA 또는 ctfB(이하, "ctfAB"라 한다)의 도입, 증폭, 재배열, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등 당업자는 적절한 방법을 선택하여 코에이트랜스퍼라제의 활성을 증가시킬 수 있다.

재조합 미생물의 동시발효능

본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당에 대하여 동시발효능을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스의 동시발효능을 갖는다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 자일로스의 동시발효률이 90% 이상이며, 바람직하게는 95% 이상이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 아라비노스의 동시발효률이 90% 이상이며, 바람직하게는 95% 이상이고, 더욱 바람직하게는 98% 이상이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 셀로비오스의 동시발효률이 85% 이상이며, 바람직하게는 90% 이상이고, 더욱 바람직하게는 92% 이상이다. 상기 동시발효률이란 배지에 공급되는 당화액 내 포함된 각 당들의 양에서 연속발효 후 잔류한 당량의 차이를 총 투입 당량으로 나눈 값이다.

동시발효률(%)={(총 투입 당(g) - 발효 후 총 잔류 당(g))/총 투입 당(g)} X 100

예) 자일로스 동시발효률(%)

자일로스 동시발효률={(총 투입 자일로스량(g) - 발효 후 잔류 자일로스량(g))/(총 투입 자일로스 량(g))} X 100

재조합 미생물의 부탄올 생성능

본 발명의 재조합 미생물은 목질계 당화액 내 둘 이상의 당을 발효시켜 ABE를 생산하는데, 특히 부탄올 생성능이 우수하다.

본 발명의 재조합 미생물은 유가식 배양을 기준으로 부탄올 선택도가 70% 이상이며, 바람직하게는 75% 이상이다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 유가식 배양을 기준으로 아세톤 선택도가 20% 미만이며, 바람직하게는 15% 미만이고, 더욱 바람직하게는 13% 미만이다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 유가식 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 20% 미만이며, 바람직하게는 15% 미만이고, 더욱 바람직하게는 13% 미만이다.

본 발명의 재조합 미생물은 유가식 배양 시 균주의 exponential phase를 기준으로 부탄올 생산성이 0.5 g/L/h 이상일 수 있고, 또는 0.8 g/L/h 이상일 수 있고, 또는 1.0 g/L/h 이상일 수 있고, 또는 1.5 g/L/h 이상일 수 있고,또는 1.8 g/L/h 이상일 수 있고, 또는 2.0 g/L/h 이상일 수 있다

재조합 미생물을 이용한 부탄올의 생산 방법

본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 목질계 당화액 내 둘 이상의 당을 동시발효시켜 부탄올을 생산하는 방법에 대한 것이다. 또한 본 발명은 둘 이상의 당을 포함하는 배지를 준비하는 단계; 상기 배지에 본 발명의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법에 대한 것이다. 상기 둘 이상의 당은 자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스이다. 상기 배지는 목질계 당화액을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

재료 및 방법

클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 야생균주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양 받았다.

유전자 결실 균주인 돌연변이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 △pta △buk (이하 "클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 △pta △buk"는 "ABKO"라 한다)는 상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824를 이용하여 WO2011/037415에 기재된 방법으로 제작하였다. 상기 돌연변이 ABKO는 부탄올 생성능을 갖는 균주이다.

유전자의 무작위 돌연변이를 위해 사용한 돌연변이원인 메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(Methyl-N-Nitro-N-nitrosoguanidine, MNTG) 은 TCI(Tokyo Chemical Industry, Japan)에서 구입하였다.

한편, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 균주의 바이오 부탄올 생성능의 평가 시, 특정 산물의 선택도(생산되는 혼합산물(ABE: 아세톤, 부탄올, 에탄올) 중 특정 산물의 비율), 부탄올 생산성 및 수율은 하기와 같이 계산하였다.

-부탄올 선택도(%): {부탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g)} × 100

-에탄올 선택도(%): {에탄올 생산량(g)/ABE 생산량(g)} × 100

-아세톤 선택도(%): {아세톤 생산량(g)/ABE 생산량(g)} × 100

-부탄올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 부탄올의 양

(이 때, 회분식 및 유가식 방법에서 부탄올 생산성은 exponential phase 기준임, 연속배양에서는 전체 phase에서 생산된 누적 ABE량을 기준으로 계산함)

-수율(%): {ABE 생산량(g)/탄소원(g)} × 100

-ABE 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 ABE의 양

본 발명의 실험예들에서 사용한 당화액은 하기의 방법으로 제조하였다.

황산 70%를 포함하는 반응기에 폐목재를 잘게 썰어서 첨가하고 이를 약 100℃ 정도로 30분 교반하면서 반응시켜 전처리하였다. 전처리된 슬러리에 물을 적당히 첨가하여 가수분해하였다. 이렇게 가수분해된 용액에는 셀룰로오스(cellulose) 및 헤미셀룰로오스(hemicelluloses) 로부터 유래된 포도당, 자일로스를 포함하여 여러 당들이 혼합물들의 형태로 존재한다(상기 당들의 혼합물을 이하 “혼합당”이라 한다). 상기 가수분해 용액을 필터프레스를 이용하여 약 3bar 정도로 압착하면 액에는 혼합당이 포함되고 필터내부에는 리그닌이 고형으로 분리된다. 이렇게 가수분해용액으로부터 리그닌을 제거하고, 남은 용액(혼합당이 포함되어 있음)으로부터 음이온교환수지를 이용하여 황산을 분리하고 약 100g/L 의 혼합당 농도를 갖는 당화액을 생산하였다. 이렇게 생산된 당화액을 다시 혼합당 농도가 약 200g/L 되도록 농축하여, 상기 농축물을 연속배양을 위한 배양액으로 이용하였다.

<실험예 1> 당화액 내성균주의 제작

<1-1> 무작위 돌연변이 유발

ABKO 균주를 CGM(Clostridium Growth Media) 액체배지(0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g/L, MgSO4·7H2O, 0.017 g/L MnSO4·5H2O, 0.01 g/L, FeSO4·7H2O, 2 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L NaCl, 2 g/L asparagine, 0.004 g/L p-aminobenzoic acid, 5 g/L, yeast extract, 4.08 g/L CH3COONa·3H2O, 및 80 g/L glucose) 60ml에서 600 nm에서의 흡광도(absorbance)가 0.5가 될 때(즉, OD600=0.5)까지 37℃, 혐기 조건에서 배양한 후 배양액을 7000g로 10분 동안 4℃ 에서 배양액을 원심 분리하였다. 세포 펠렛(pellet)을 CGM 액체배지로 3회 씻은 후 다시 50ml CGM 액체배지로 재 현탁하였다. 그 후 MNTG를 최종 농도 50 μg/ml이 되도록 처리하고 37℃에서 20분 동안 방치하여 약 2.5%의 생존율을 갖는 돌연변이 Library를 제작하였다.

<1-2> 당화액 내성 균주의 선별

상기 <1-1>에서 제작한 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 희석하였다. 상기 희석된 균주들을 포도당 대신 당화액으로 제조한 CGM 고체배지에서 약 100 콜로니 정도가 형성되도록 2000장의 고채배지 상에 도말하였다. 무작위 돌연변이 균주로 도말된 고체배지를 상기 <1-1>에서와 동일한 조건에서 약 2일 동안 배양하면서 내성을 가지고 생존한 20개의 콜로니를 선별하였다.

<1-3> 당화액 내성 균주의 부탄올 생성능력 평가

상기 <1-2>에서 선별한 20종의 무작위 돌연변이 균주는 돌연변이 과정에서 부탄올 생성능을 유실했을 가능성이 있으므로 액체배양을 통하여 부탄올 생성능이 유지되는 돌연변이를 선별하였다.

상기 <1-2>에서 선별한 20종의 당화액 내성 균주들을 40ml CGM배지와 CaCO3 5g/L가 포함된 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고 36시간 동안 상기 <1-1>의 37℃ 혐기 조건에서 배양하여 부탄올 생성능을 확인하였다. 부탄올 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며 분석 조건은 하기 표 1과 같다.

또한, 당 분석은 액체 크로마토그래피를 이용하였다. 이때 사용한 이동상은 0.01N H2SO4 용액이며 칼럼은 Bio-Rad사의 Aminex87H를 이용하였다.

분석 결과를 도 1에 나타내었으며, 이 때 대조군은 ABKO 균주이다. 당화액 저해물질에 내성을 가지는 무작위 돌연변이 균주들을 20종 선택하고, 이들을 TM1-1 내지TM1-20으로 명명하였다(도 1). 그리고 이들 중 가장 부탄올 생성능이 우수한 돌연변이 균주 TM1-3을 이후의 실험에 사용하였다.

도 2는 포도당 대신 당화액으로 제조한 CGM 고체배지에서 2일 배양 후 대조군과 비교한 TM1-3 균주이다. 대조군은 ABKO 균주이다. 도 2에서 대조군은 2일 배양에서 당화액, 구체적으로는 당화액 내 미생물 생장 저해물질에 의해 생장이 되지 않았지만 TM1-3 균주는 정상 생장한 것을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 회분식 배양에 의한 자일로스 동시발효균주 선별

<2-1> 무작위 돌연변이 유발

상기 <실험예 1>에서 제작한 돌연변이 균주들 중 부탄올 생성능이 가장 높았던 TM1-3 균주를 이용하여 무작위 돌연변이를 유발함으로써 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 상기 돌연변이 라이브러리 제작 방법은 상기 <1-1>과 동일한 방법을 이용하였다.

<2-2> 자일로스-포도당 동시발효균주 선별

상기 <2-1>에서 제작한 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 희석하였다. 상기 희석된 균주들을 3g/L의 포도당 및 3g/L의 자일로스로 제조한 CGM 고체배지에서 약 100 콜로니 정도가 형성되도록 고채배지 상에 도말하였다. 무작위 돌연변이 균주로 도말된 고체배지를 상기 <1-2>에서와 동일한 조건에서 약 2일 동안 배양하였다. 그리고 빨리 생장한 20개의 콜로니를 선별하고 TM2-1 내지 TM2-20으로 명명하였다.

<2-3> 자일로스-포도당 동시발효균주의 부탄올 생성능력 평가

상기 <2-2>에서 선별한 20종의 무작위 돌연변이 균주는 돌연변이 과정에서 부탄올 생성능을 유실했을 가능성이 있으므로 액체배양을 통해 부탄올 생성능이 유지되는 돌연변이를 선별하였다. 구체적인 돌연변이 선별 방법은 하기와 같다. 상기 <2-2>에서 제작한 20종의 균주(TM2-1 내지 TM2-20)를 40ml CGM배지와 CaCO3 5g/L가 포함된 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 36시간 동안 상기 <1-1>의 37℃ 혐기조건에서 배양하여 부탄올 생성능을 확인하였다. 부탄올 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였다.

그 결과 TM2-1, TM2-16, 및 TM2-19 의 돌연변이 균주들이 대조군인 TM1-3과 유사한 부탄올 생성능을 보이는 것으로 확인하였다(도 3).

<2-4> 포도당과 자일로스의 동시발효능 평가

상기 <2-3>에서 대조군과 유사한 부탄올 생성능을 갖는 것으로 평가된 내성 균주들 중 TM2-1, TM2-16 및 TM2-19에 대하여, 포도당과 자일로스의 동시발효 성능을 회분식 발효를 통해 평가하였다. 발효배지는 CGM 액체배지에 혼합당 (포도당 45 g/L, 자일로스 20 g/L; 약 30 중량% 자일로스 비율 )을 포함하는 배지를 이용하였다. 이때 당 분석은 액체크로마토그래피를 이용하였다.

그 결과는 도 4와 같다. 상기 균주들 중 TM2-1 균주의 포도당과 자일로스 동시발효 성능이 매우 우수한 것으로 판단되었다.

상기 TM2-1 균주에 대하여 40 중량% 자일로스(자일로스 28(g/L) / 포도당 42(g/L))를 포함하는 혼합당을 이용 시 부탄올 생성능 및 동시발효능을 평가하였다.

그 결과는 도 5와 같다. TM2-1균주는 고농도의 자일로스가 함유된 혼합당에서도 21 시간동안 전체 대사당(포도당 40.9 g/L, 자일로스 19.0 g/L) 중 자일로스의 대사비율이 31%로 매우 높음을 알 수 있다. 즉 21시간 동안 투입된 자일로(28 g/L)의 약 68% 가 동시발효 되어 ABE로 전환되었다.

그러므로 상기 TM2-1 균주를 2014년 6월 9일 국제기탁기관인 한국유전자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 “TM2-1-C”라는 균주명으로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 12604BP). 향후 혼합당 동시발효 실험은 TM2-1-C 균주를 사용하였다.

<실험예 3>TM2-1-C(E1AB)균주의 제작

선행특허 PCT/KR2013/001951 및 PCT/KR2013/001954를 바탕으로 pGS1-E1 AB를 제작하였다.

상기 국제특허공보들에 의하면 ABKO(즉, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 △pta △buk) 균주에 adhE1(알데히드 알코올 디하이드로게나아제) 유전자와 ctfAB(코에이 트란스퍼라아제) 유전자를 증폭할 경우 에탄올 생성능이 감소하면서 부탄올 생성능이 증가하는 특징을 가지는 것으로 보고되었다. 따라서, 상기 TM2-1-C 균주에 adhE1 및 ctfAB유전자를 증폭하여 당화액 내 혼합당의 동시발효성능 및 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생성능을 평가하였다.

<3-1> pGS1-E1AB 플라스미드의 제작

먼저 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 균주를 RCM 고체배지에 도말 후 24시간 혐기 배양하였다. 그리고 혐기 배양된 고체배지에서 콜로니 하나를 취하여 이를 액체배지 3ml에 18시간 배양하고, 그 후, 배양액을 원심 분리하여 세포를 수득하고, 이를 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사, USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.

상기 분리된 염색체를 이용하여 adhE1 유전자를 증폭하였는데, 이는 프라이머 AdhE1-UP-PstI (서열번호 2) 및 AdhE1-DN-XhoI(서열번호 3)을 사용하여 상기 분리된 염색체를 주형으로 하여 adhE1 유전자(서열번호 1)를 증폭하여 수행하였다(표 2). dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 1 units을 첨가하여 PCR 반응 혼합물 100μl을 제조하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안 중합과정을 30회 반복하였다. 증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 PstI, XhoI제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 PCT/KR2013/001951 및 PCT/KR2013/001954에서 기재된 pGS1-MCS 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-AdhE1을 제작하였다(도 6).

한편, PCT/KR2013/001951 및 PCT/KR2013/001954에서 기재된 pGS1-MCS(BglII) 벡터에 ctfAB유전자를 도입하여 pGS1-CtfAB를 제작하였다. 먼저 프라이머 CtfAB-UP-BglII(서열번호 5) 와 CtfAB-DN-EcoRI(서열번호 6)을 사용하여 상기 분리한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824 염색체를 주형으로 하여 ctfAB 유전자(서열번호 4)를 증폭하여 pGS1-MCS에 클로닝하여 pGS1-CtfAB를 완성하였다(표 3, 도 7).

다음으로 프라이머 THL-UP-XhoI(서열번호 7)과 CtfAB-DN-EcoRI(서열번호 6)을 이용하여, 상기 pGS1-CtfAB를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 ctfAB 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭된 ctfAB 유전자를 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 XhoI, EcoRI 제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pGS1-AdhE1 벡터에 라이게이션 하여 pGS1-E1AB를 제작하였다(도 8).

<3-2> TM2-1-C(pGS1-E1AB) 균주의 제작

TM2-1-C 균주를 CGM(Clostridium Growth Media) 액체배지(0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g/L, MgSO4·7H2O, 0.017 g/L MnSO4·5H2O, 0.01 g/L, FeSO4·7H2O, 2 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L NaCl, 2 g/L asparagine, 0.004 g/L p-aminobenzoic acid, 5 g/L, yeast extract, 4.08 g/L CH3COONa·3H2O, 및 80 g/L glucose) 60ml에서 600 nm에서의 흡광도(absorbance)가 0.5가 될 때(즉, OD600=0.5)까지 혐기 조건에서 배양하였다. 그 후 배양액을 얼음에서 10분 동안 방치하고, 그 후 7000g로 10분 동안 4℃ 에서 배양액을 원심 분리하였다. 세포 펠렛(pellet)을 전기천공(electroporation) 완충용액으로 3회 씻은 다음 같은 완충용액 2ml에 현탁하여 형질전환용 세포를 제작하였다. 이렇게 제작된 형질전환용 세포 500ul에 상기 <3-1>에서 제조한 pGS1-E1AB 플라스미드들 2.0ug을 첨가하고, Bio-Rad사의 Gene pulser II를 이용하여 전기천공(4mm cuvette, 2.5kV, ∞Ω, 25uF)을 수행하였다. 그리고 이를 항생제가 첨가된 배지에서 혐기 배양하여, 형질전환 균주 TM2-1-C(pGS1-E1AB)를 제작하였다.

한편, 대조군 실험을 위해 ABKO 균주에 상기와 동일한 방법으로 pGS1-E1AB 플라스미드를 전기천공 시켜, ABKO(pGS1-E1AB)를 제작하였다.

<실험예 4> 연속배양방법을 이용한 바이오 부탄올의 생산

상기 <3-2>에서 제작한 TM2-1-C(pGS1-E1AB)균주에 대하여 혼합당을 이용 시 바이오 부탄올 생성능을 평가하였다. 이는 혼합당을 포함하는 당화액을 이용하여 TM2-1-C(E1AB)균주를 연속 배양함으로써, 혼합당을 이용한 부탄올 생산균주로서의 성능을 최종적으로 확인하는 것이다.

유가식 배양을 위한 feeding 용액은 하기와 같이 제작하여 이용하였다. 먼저, 상기 미리 제조한 혼합당 농도가 약 200g/L인 당화액 농축물에 옥수수 침출액 3%(wt/v), 액체배지(MgSO4·7H2O, 0.017 g/L MnSO4·5H2O, 0.01 g/L, FeSO4·7H2O, 1 g/L NaCl) 및 물을 첨가하여 최종 당 농도가 약 150g/L 되도록 조절하여 feeding solution을 제조하였다. 그리고 상기 feeding solution을 배양기 내로 최종 포도당 농도가 2g/L 이하가 되게 조절하면서 주입하였다. Feeding solution을 포함하는 유리병은 실리콘 튜브를 이용하여 발효기에 연결되게 제작하였고 펌프를 이용하여 연속적으로 포도당을 주입하였다. 1-1.5시간 간격으로 포도당의 농도를 HPLC로 측정하면서 포도당 용액의 주입 속도를 조절하였다. 포도당 농도를 2g/L 이하로 낮게 유지하면 하기의 연속발효과정 중 배출 배양액을 통해 유실되는 당을 최소화 할 수 있어 수율을 증가시킨다. 배양액 내 당의 농도가 높으면 배출액을 통해 유실되는 당 농도도 높기 때문에, 전체적으로 부탄올로 전환되는 당이 감소하고 결과적으로 수율이 감소한다. 또한 포도당 농도를 낮게 유지하면 포도당에 의한 다른 혼합당들의 대사저해 현상(CCR, carbon catabolite repression)을 완화할 수 있다.

또한 연속 공정을 위한 배양기를 한국특허출원 제 10-2012-0038770호를 바탕으로 제작하였다. 먼저 3L의 부피를 가지는 칼럼에 위 아래로 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하고자 약 150um 정도의 필터를 장착하였다. 그 후 상기 칼럼에 교반기를 장착하고 흡착제 300g을 충진하여 칼럼 2 개를 완성하였다. 상기 칼럼들을 상기 배양기에 실리콘 튜브를 이용하여 연결하고 펌프를 장착하여 배양액이 각 칼럼 간을 순환하도록 장착하였다. 칼럼의 inlet과 outlet은 4-way 밸브를 장착하여 배양 과정에서 칼럼 내의 흡착제가 부탄올 및 혼합용매로 포화될 때 용출용 용매를 칼럼 내로 흘려보내 실시간으로 포화된 흡착제를 탈착할 수 있도록 하였다. 첫 번째 칼럼을 탈착시킬 경우, 이 때 배양액이 두 번째 칼럼으로 공급되도록 배양액을 순환시켜, 배양액의 흐름이 연속적으로 이루어질 수 있도록 하였다. 참고로, 본 실험에서는 배양액의 순환 방향은 칼럼의 위쪽에서 아래로 순환하였으나 그 방향은 문제가 되지 않는다. 제작한 배양기로 TM2-1-C(pGS1-E1AB)균주를 배양하였다.

먼저 배양기 내에 약 50 g/L의 농도로 당화액을 포함하는 배지 2.6L을 넣었다. 그리고 상기 당화액 포함 배지에 CGM 액체배지에서 혐기 배양한 TM2-1-C(pGS1-E1AB) 종균 600ml를 접종하면서 배양을 시작하였다. 배양 시작 후 부탄올 농도가 약 6 내지 7 g/L가 되면 배양액을 상기 배양기로부터 빼내어 제1칼럼으로 보냈다. 이 때 펌프를 통해 배양액의 유속을 100ml/분으로 하여 제1칼럼을 통과시키면서 배양액을 순환시켰다. 제1칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제가 배양액에 현탁되어 묽은 슬러리상을 형성하게 되는데, 흡착제가 포화되지 않은 상태에서는 배양액의 흐름이 cell flock에 의해 막히지 않고 칼럼을 통과하게 된다. 칼럼 내 흡착제가 포화되어 부탄올 흡착 성능이 저하되는 것을 방지하기 위하여, 칼럼 통과직전과 통과 직후의 배양액 시료를 채취하여 모니터링 하면서 칼럼 내 부탄올 농도가 8g/L 이하가 되게 유지하였다. 상기 배양은 162.5 시간 동안 연속발효공정으로 수행되었다.

그 결과, feeding solution으로 투입된 혼합당들 중 자일로스는 총 957.3g이 투입되어, 잔여배양액, 배출액 및 용매탈착액에 약 31g만 잔류하고, 나머지는 혼합용매(ABE)로 전환되었는바, 97% 동시발효된 것이 확인되었다. 또한 오탄당인 아라비노스는 100% 동시발효 되었다. 셀로바이오스는 383.2g이 투입되어 약 363.8g이 혼합용매(즉, ABE)로 전환되고, 잔여배양액, 배출액 및 용매탈착액 약 19.4g 잔류하여 95% 이상 동시발효 가능한 것으로 판단되었다(도 9, 표 4).

한편, 대조군으로 ABKO(pGS1-E1AB)을 이용하여 동일한 실험을 하였다. 그러나 ABKO(pGS1-E1AB)는 당화액 내 미생물 저해물질에 내성이 없는바, 배양이 실질적으로 불가능하였다.

총 투입 혼합당: feeding solution으로서 투입된 혼합당

총 잔류 당: 잔여배양액, 배출액 및 용매탈착액에 남은 당

동시발효률={(총 투입 당(g)-총 잔류 당(g))/총 투입 당(g)} X 100

배출액: 연속배양과정에서 feeding 용액을 주입하면서 증가하는 부피만큼 발효기로부터 제거해주는 발효액

용매탈착액: 칼럼 내 흡착제에 발효산물인 아세톤, 부탄올 및 에탄올(ABE)가 흡착되면서 포화되면 steam을 통해 흡착된 ABE를 탈착하면서 생성되는 액

혼합당 비율(%)={(각 당의 총 투입량(g)/총 투입 당(g)} X 100

예) 혼합당내 자일로스 비율={자일로스 총 투입량 957.32 (g)/총 투입 당 3963 (g)}X 100=24.16%

또한 칼럼 내 흡착제에서 흡착된 발효산물들을 분석한 결과, TM2-1-C(pGS1-E1AB) 균주는 당화액 내 혼합당에 포함된 저해물질에 내성을 가지면서도 혼합당을 혼합용매로 동시에 발효하여 전체적으로 수율 33.9%, 생산성 2.8 g/L/h, 그리고 부탄올 선택도79.3%를 달성하였다. 이는 현재까지 보고된 어떠한 혼합당 동시발효 균주보다 우수한 성능이다(표 5).

한국생명공학연구원

KCTC12604BP

20140610

<110> GS CALTEX <120> MICROORGANISM CAPABLE OF STIMULTANEOUS FERMENTATION OF SACCHARIDE MIXTURE AND PRODUCTION METHOD OF BUTANOL USING IT <130> DNP150067 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene <400> 1 atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60 aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120 gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180 ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300 gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360 atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420 agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 480 ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540 ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600 tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt 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ctcgaattgc agattatata 2340 aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 2400 ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460 ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520 aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580 caaccttaa 2589 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 cacctgcaga tgaaagtcac aacagtaaag gaattagat 39 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 cacctcgagt taaggttgtt ttttaaaaca atttatatac a 41 <210> 4 <211> 1324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 atgaactcta aaataattag atttgaaaat ttaaggtcat tctttaaaga tgggatgaca 60 attatgattg gaggtttttt aaactgtggc actccaacca aattaattga ttttttagtt 120 aatttaaata taaagaattt aacgattata agtaatgata catgttatcc taatacaggt 180 attggtaagt taatatcaaa taatcaagta aaaaagctta ttgcttcata tataggcagc 240 aacccagata ctggcaaaaa actttttaat aatgaacttg aagtagagct ctctccccaa 300 ggaactctag tggaaagaat acgtgcaggc ggatctggct taggtggtgt actaactaaa 360 acaggtttag gaactttgat tgaaaaagga aagaaaaaaa tatctataaa tggaacggaa 420 tatttgttag agctacctct tacagccgat gtagcattaa ttaaaggtag tattgtagat 480 gaggccggaa acaccttcta taaaggtact actaaaaact ttaatcccta tatggcaatg 540 gcagctaaaa ccgtaatagt tgaagctgaa aatttagtta gctgtgaaaa actagaaaag 600 gaaaaagcaa tgacccccgg agttcttata aattatatag taaaggagcc tgcataaaat 660 gattaatgat aaaaacctag cgaaagaaat aatagccaaa agagttgcaa gagaattaaa 720 aaatggtcaa cttgtaaact taggtgtagg tcttcctacc atggttgcag attatatacc 780 aaaaaatttc aaaattactt tccaatcaga aaacggaata gttggaatgg gcgctagtcc 840 taaaataaat gaggcagata aagatgtagt aaatgcagga ggagactata caacagtact 900 tcctgacggc acatttttcg atagctcagt ttcgttttca ctaatccgtg gtggtcacgt 960 agatgttact gttttagggg ctctccaggt agatgaaaag ggtaatatag ccaattggat 1020 tgttcctgga aaaatgctct ctggtatggg tggagctatg gatttagtaa atggagctaa 1080 gaaagtaata attgcaatga gacatacaaa taaaggtcaa cctaaaattt taaaaaaatg 1140 tacacttccc ctcacggcaa agtctcaagc aaatctaatt gtaacagaac ttggagtaat 1200 tgaggttatt aatgatggtt tacttctcac tgaaattaat aaaaacacaa ccattgatga 1260 aataaggtct ttaactgctg cagatttact catatccaat gaacttagac ccatggctgt 1320 ttaa 1324 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 cacagatcta tgaactctaa aataattaga tttg 34 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 cacgaattct taaacagcca tgggtctaag ttcattggat atga 44 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 ataaagctta gaatgaagtt tcttatgcac aagtattttt tattac 46

Claims

글루코스 및 자일로스에 대하여 동시발효능을 갖고,
또한 부탄올 생성능을 갖는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C(기탁번호 KCTC 12604BP).
제 1항에 있어서,
목질계 당화액에 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C.
삭제
제 1항에 있어서,
글루코스 및 자일로스의 동시발효능은 배치발효 기준으로 총 대사된 당 량의 30%이상이 자일로스이고, 부탄올 생산성이 1.0 g/L/h 이상인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C.
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글루코스를 포함하는 배지를 준비하는 단계;
상기 배지에 제 1항의 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C를 접종하는 단계;및
상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C를 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법.
제 1항의 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 TM2-1-C에서,
알데히드/알코올 디하이드로게나아제에 의하여 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로 또는 코에이트랜스퍼라제에 의하여 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진된,
부탄올 생성능이 증가된 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
알데히드/알코올 디하이드로게나아제의 활성이 증가됨으로써 부티릴 코에이를 부탄올로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
코에이트랜스퍼라제의 활성이 증가됨으로써 부티레이트를 부티릴 코에이로 전환하는 경로가 촉진되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스에 대하여 동시발효능을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
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제 9항에 있어서,
유가식 배양을 기준으로 부탄올 선택도가 70% 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
유가식 배양을 기준으로 아세톤 선택도가 20% 미만인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
유가식 배양을 기준으로 에탄올 선택도가 20% 미만인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 9항에 있어서,
유가식 배양을 기준으로 부탄올 생산성이 0.5 g/L/h 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
자일로스, 아라비노스 및 셀로비오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당과 글루코스를 포함하는 배지를 준비하는 단계;
상기 배지에 제 9항의 재조합 미생물을 접종하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법.
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제 18항에 있어서,
상기 배지는 목질계 당화액을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.