KR101567633B1 - 감귤 미성숙과 추출물, 또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 STAT6의 활성저해, 에오탁신-1의 발현억제, 호산구의 응집작용을 저해함으로써 염증반응을 방지하여 알러지성 염증질환, 아토피성 피부염 등에 대한 예방 및 치료효과를 나타낸다. 또한 세포독성 및 피부 부작용이 없어 의약품 및 화장료에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

감귤 미성숙과 추출물, 또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treatment or prevention of inflammatory skin diseases comprising unripe Citurs unshiu extract, or synephrine or salts thereof}

본 발명은 감귤 미성숙과 추출물, 또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염(Atopic dermatitis)은 지속적인 소양감(Pruritus)과 피부의 급·만성 습진 병변을 특징으로 하는 만성염증성 피부질환으로 피부병변 외에도 천식, 알러지성 비염 등을 동반하기도 한다. 아토피성 피부염의 원인으로는 크게 유전적요인, 면역학적 요인 및 환경적인 요인 외에 최근 피부장벽 이상 등이 주요 원인으로 여겨지고 있다. 또한, 아토피성 피부염은 지질 중 감마 리놀렌산(γ-linolenic acid)의 결핍과 사이토카인(cytokine)이나 케모카인(chemokine)의 분비에 의한 아토피성 피부염 발생이 보고된 바 있다.

케모카인은 피부에 염증 세포가 침윤하는데 중요한 역할을 담당하는데, C-C 케모카인인 에오탁신-1(eotaxin-1)은 이러한 피부염 병변에서 특히 증가하며, 이는 C-C 케모카인 수용체3(CCR3)를 가진 호산구와 헬퍼-T세포 2형(Th2)의 화학주성과 밀접한 관계가 있다.

에오탁신-1은 호산구, 림프구, 대식 세포, 섬유아세포, 평활근 세포 및 상피세포 등 다양한 종류의 세포에서 발현하는데, 호산구를 피부염 병변으로 끌어들이는데 중요한 역할을 한다. 호산구들은 매우 독성이 강한 단백질기와 자유기(free radical)를 분비하므로 미생물과 기생충을 죽일 수 있지만, 부적절하게 활성화될 경우 숙주에게 심각한 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 매우 엄격하게 조절된다. 이러한 호산구들이 순환 혈액에서 조직으로 이동할 때 열쇠가 되는 물질이 에오탁신-1이며, 염증 부위의 조직으로부터 분비된 에오탁신-1이 호산구 표면의 CCR3 수용체에 결합함으로서 염증 병변으로의 호산구 이동이 이루어진다. 그러므로 에오탁신-1과 CCR3의 발현을 효과적으로 조절함으로써 피부 염증 반응을 막을 수 있다.

이러한 아토피는 1970년대 이후 선진국을 중심으로 발병되는 중요 질병 중의 하나로, 전 세계적으로 증가하는 추세이며 유병률이 인구의 20%라는 보고가 있다. 미국에서는 1,500만 명의 사람들이 아토피를 앓고 있으며, 한국에서도 초·중·고생의 16.3%가 아토피를 앓고 있다(Ahn S.Y. et al., J. Skin Barrier Res., 8, 47-51, 2006). 현재, 아토피성 피부염 치료제로는 스테로이드 제제, 국소 면역억제제 및 항히스타민 등이 사용되고 있으나, 상기 약물제제를 장기적으로 사용하는 경우 피부가 얇아지거나 피부색의 변색, 골다공증, 동맥경화, 발암 가능성 및 내성으로 인한 증상 악화 등의 문제점이 있기 때문에 천연물로부터 유래하여 안전하면서도 항염증 효과가 우수한 조성물의 개발이 이루어지고 있다.

한편, 감귤(Citrus unshiu, 온주밀감)은 운향과 감귤속의 상록교목으로, 우리나라에서는 제주도에서 자생하며, 일본, 중국, 중남미, 흑해 등지에 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. 감귤나무의 과실은 그 자체로 식용될 뿐만 아니라 주스, 통조림 등의 가공제품으로 20% 이상이 소비되고 있고, 타 과실에 비하여 풍부한 과즙, 독특한 향미 및 고 기능성 성분들을 가지고 있다. 그 예로, 감귤은 정유성분인 d-리모넨(d-limonene), 리나롤(linalool), 리날리아세테이트(linalylacetate), 플라보노이드(flavonoids)인 헤스페리딘(hesperidin), 나린긴(naringin), 포시린(porcirin), 노비레틴(nobiletin), 알카로이드(alkaloid)인 시네프린(synephrine), 펙틴(pectin), 아스코르빈산(ascorbic acid), 베타크립토산틴(beta-cryptoxanthin), 쿠마린(courin) 등의 물질을 함유하고 있으며, 이들은 소화기자극, 비만, 기침, 혈압상승, 항알레르기, 항균작용 등을 하는 것으로 알려져 있다.

그러나 최근 잦은 비, 습도 및 온도 등의 환경변화로 인해 미성숙과 및 품질이 저하된 감귤의 출하, 하우스 등의 시설재배를 통한 대량생산 및 수입 감귤 선호 등으로 감귤의 가격이 폭락하게 되었다. 이에 감귤의 생산량 감축 및 품질의 고급화를 위하여 미성숙과를 미리 수확하여 처리, 철저한 선별과 품질관리 및 미성숙과를 이용한 기능성 조성물 개발 등의 대책이 마련되고 있다. 한 예로, 미리 수확한 미성숙과의 생리활성물질 분리 또는 이들을 이용한 용도 개발을 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.

이와 관련된 기술로, 대한민국 등록특허 제1259791호는 미성숙 감귤류에 함유된 스트러스 플라보노이드를 이용한 건강보조식품의 제조방법 및 이를 이용한 건강보조식품에 대하여 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제1162761호는 미성숙감귤 추출물을 포함하는 비만예방 또는 치료용 조성물에 대하여 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제01315212호는 귤나무의 미성숙 과피로부터 분리한 추출물을 포함하는 우울증 치료제에 대하여 기재되어 있다.

이에 본 발명자들은 감귤 미성숙과의 활용 방안에 대하여 연구를 하던 중, 감귤 미성숙과 추출물 및 시네프린이 염증성 피부질환의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감귤 미성숙과 추출물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감귤 미성숙과 추출물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 감귤 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 감귤(Citrus unshiu, 온주밀감)은 운향과 감귤속의 상록교목이며, 상기 감귤 미성숙과는 과실 형성 후 3 내지 4개월된 미성숙한 과실을 말한다.

미성숙한 과실은 과실 형성 후 기간에 따라 함유성분의 변화가 있을 수 있는데, 본 발명의 감귤 미성숙과는 특히 시네프린을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다. 구체적 실험에서, 본 발명자들은 과실 형성 후 3 내지 4개월된 추출물은 다른 감귤 미성숙과의 추출물과 달리 시네프린을 함유하고 있음을 처음으로 밝혀냈다.

따라서, 본 발명의 감귤 미성숙과 추출물은 시네프린을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 감귤 미성숙과 추출물은 감귤 미성숙과의 과피, 과육 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하여 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 당업계에 공지된 추출방법 및 추출용매를 이용하여 수득할 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름 또는 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

또한, 상기 감귤 미성숙과 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제 과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획을 통하여도 감귤 미성숙과 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 염증성 피부질환은 알러지성 염증질환, 아토피성 피부염, 피부습진 또는 건선 등과 같이 다양한 경로로 발생하는 피부트러블 또는 피부질환을 말한다.

하나의 구체적 실시에서, 정상 섬유아세포(NIH/3T3)에 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)를 처리하여 에오탁신-1을 유도한 후 감귤 미성숙과 추출물의 농도에 따른 에어탁신-1의 mRNA 및 세포 내·외의 발현을 살펴본 결과, 감귤 미성숙과 추출물의 농도가 증가할수록 mRNA 및 세포 내·외의 발현이 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, 감귤 미성숙과 추출물을 포함한 크림을 이용하여 아토피 염증 개선효과를 시험한 결과, 인체 피부에 안전하고, 사용기간이 길어질수록 아토피 염증이 개선되는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 감귤 미성숙과 추출물은 알러지성 염증질환, 아토피성 피부염, 피부습진 또는 건선 등의 염증성 피부질환의 치료 및 예방 목적으로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 감귤 미성숙과는 식용 가능한 것인데, 이의 추출물의 인체에 대한 확인 실험을 통하여 안전성을 확인한 결과, 인체에 안전하게 사용가능하다.

본 발명의 감귤 미성숙과 추출물은 전체 조성물 중량 대비 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 상기 조성물에 포함된다. 감귤 미성숙과 추출물의 중량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 항염증 활성의 효능이 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 감귤 미성숙과 추출물의 함량 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 시네프린(synephrine)은 4-[1-하이드록시-2-(메틸마이노)에틸]페놀(4-[1-hydroxy-2-(methylamino)ethyl]phenol)의 IURAC명을 가진 물질로, 그 구조는 하기 화학식 1과 같다.

상기 시네프린은 항암, 우울증 및 비만에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 감귤류(Citrus)에 속하는 감귤속, 금감속, 및 탱자나무속, 바람직하게는 감귤속의 온주밀감, 보다 바람직하게는 온주밀감의 미성숙과에서 추출, 분리 및 정제되거나, 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃뿐만 아니라 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 미생물 배양을 통해 얻어지거나 화학적으로 합성 제조된 상품(예를 들어, Sigma 사의 (±)-synephrine)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시네프린의 염은 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산 부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마르산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.

하나의 구체적 실시에서, 정상 섬유아세포(NIH/3T3)에 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4)를 처리하여 에오탁신-1을 유도한 후 감귤 미성숙과 추출물의 농도에 따른 에어탁신-1의 mRNA 및 세포 내·외의 발현을 살펴본 결과, 감귤 미성숙과 추출물의 농도가 증가할수록 mRNA 및 세포 내·외의 발현이 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, 감귤 미성숙과 추출물을 포함한 크림을 이용하여 아토피 염증 개선효과를 시험한 결과, 인체 피부에 안전하고, 사용기간이 길어질수록 아토피 염증이 개선되는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 시네프린 또는 이의 염은 알러지성 염증질환, 아토피성 피부염, 피부습진 또는 건성 등의 염증성 피부질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 시네프린 또는 이의 염의 인체에 대한 확인실험을 통해 안정성을 확인한 결과, 인체에 안전하게 사용가능하다.

상기 시네프린 또는 이의 염은 전체 조성물 중량 대비 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 상기 조성물에 포함된다. 시네프린 또는 이의 염의 중량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 염증성 피부질환에 대한 치료 및 예방의 효능이 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 시네프린 또는 이의 염의 함량 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

한편, 본 발명의 상기 감귤 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물은 약제학적 조성물로서 이용가능하다.

상기 약제학적 조성물은 상기 감귤 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 하나의 예로, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물로 적합한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국소 투여 (topical application) 방식으로 적용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 약제학적 로 유효한 양은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류 및 이의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 추출물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인에게 1일에 0.1 내지 1000mg/kg, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 사용하는 것이 좋다. 다만 상기 투여량에 의한 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 치료 목적에 따라 약제학 분야에서 통상적인 제제로 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유제, 시럽제, 유탁제, 경고제, 연고제, 스프레이제, 오일제, 겔제, 주정제, 틴크제, 욕제, 리니먼트제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등으로 제형화될 수 있다. 또한, 환부에 직접 도포하는 국소투여를 목적으로 하는 피부 외용제로서 바람직하게 사용될 수 있는데, 이 경우 연고제, 로션제, 스프레이제, 젤 등의 형태가 바람직하다. 이들 피부외용제는 또한 치료 부위에 직접 적용될 수 있는 지지 기재(support base) 또는 매트릭스 등에 포함될 수 있으며, 지지기재의 예는 거즈 또는 붕대를 포함한다.

본 발명의 상기 감귤 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물은 화장료 조성물로서 이용가능하다.

상기 화장료 조성물은 감귤 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다. 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등으로 제형화될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있는데, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물은 STAT6의 활성저해, 에오탁신-1의 발현억제, 호산구의 응집작용을 저해함으로써 염증반응을 방지하여 알러지성 염증질환, 아토피성 피부염 등에 대한 예방 및 치료효과를 나타낸다. 따라서 감귤 미성숙과 추출물 및/또는 시네프린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 의약품 및 화장료에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 에오탁신-1의 세포내 발현 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 2는 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 에오탁신-1의 세포외 발현 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 3은 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 에오탁신-1 mRNA의 발현 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 4는 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 STAT6의 인산화 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 5은 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 STAT6의 핵내로의 전좌를 차단하는 효과를 관찰한 결과이다.
도 6은 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 농도에 따른 호산구의 응집작용 억제효과를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 감귤 미성숙과의 추출물 제조

미성숙한 감귤을 세척 및 분쇄한 후, 에탄올에 5일 동안 침지하여 추출하였다. 그 다음 여과 및 농축한 후, 동결건조하여 감귤 미성숙과 추출물 분말을 제조하였다.

실시예 2: 감귤 미성숙과로부터 시네프린 분리 및 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 감귤 미성숙과 추출물 분말을 Bulk C18 크로마토그래피로 정제하여 11개의 분획추출물로 나누고, 이러한 분획 중 2번째 분획을 Prep-HPLC를 이용하여 C18 컬럼크로마토그래피를 통해 신규 활성성분 물질을 단리 하였다. 상기 활성성분 물질에 대한 구조는 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 4-[1-hydroxy-2-(methylamino)ethyl]phenol(분자량: 167.21)임을 확인하였으며, 일반화학명은 시네프린(synephrine)으로 확인되었다.

실시예 3: 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 에오탁신-1 의 세포내 분비 억제 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)에 에오탁신-1 리포터 유전자를 슈퍼펙트 (superfect, Quigen사)를 이용하여 삽입하여 형질전환 시킨 후 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 형질전환된 섬유아세포를 DMEM 배지가 들어있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 1, 10 및 100 ppm의 미성숙 감귤 추출물 또는 10, 100 및 200μM의 시네프린을 각각 처리한 다음 에어탁신-1을 유도하는 것으로 알려진 인터루킨-4(R&D, Minneapolis MN, IL-4)를 50 ng/㎖을 함께 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 수집하였다. 그 다음 상기 수집한 세포를 파쇄하여 루시퍼레이즈의 기질과 반응시켜 발광(luminescence)을 측정하여 에오탁신-1의 프로모터 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험 결과, IL-4에 의해 유도된 에오탁신-1의 프로모터 활성을 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린이 감소시키는 것으로 나타났으며, 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린의 농도가 증가할수록 에오탁신-1의 프로모터 활성이 감소하는 것으로 보아 농도의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 4: 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 에오탁신-1 세포외 분비 억제 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 1, 10 및 100 ppm의 미성숙 감귤 추출물 또는 10, 100 및 200 μM의 시네프린을 각각 처리한 다음 인터루킨-4(R&D, Minneapolis MN, IL-4)를 50ng/㎖을 함께 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 배양액을 수집하였다. 그 다음 ELISA kit을 이용하여 에오탁신-1의 분비정도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, IL-4에 의해 유도된 에오탁신-1의 세포외 분비를 감귤 미성숙과 출물 및 이로부터 분리한 시네프린이 감소시키는 것으로 나타났으며, 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린의 농도가 증가할수록 에오탁신-1의 세포외 분비가 감소하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 5: 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 에오탁신-1 mRNA 발현 저해 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 1, 10 및 100 ppm의 미성숙 감귤 추출물 또는 10, 100 및 200 μM의 시네프린을 각각 처리한 다음 인터루킨-4(R&D, Minneapolis MN, IL-4)를 50ng/㎖을 함께 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 배양액을 수집하였다. 상기 수집한 세포에서 tRNA를 추출한 다음 추출한 tRNA를 바탕으로 상보성 DNA(cDNA)를 합성 후, 합성한 상보성 DNA를 주형으로 실시간 중합효소연쇄정량검사(quantitative Real-time PCR)를 실시하여 에오탁신-1의 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험 결과, IL-4에 의해 유도된 에오탁신-1 의 mRNA발현을 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린이 감소시키는 것으로 나타났으며, 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린의 농도가 증가할수록 에오탁신-1의 mRNA 발현이 감소하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 6: 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 STAT6 인산화 억제 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 10, 100 및 200 μM의 시네프린을 60분간 처리한 다음 50 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 20분 동안 배양하였다. 그 후 세포를 회수하여 용해시킨 다음 웨스턴블롯을 통해 STAT6의 인산화 저해정도를 측정한였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 시네프린은 IL-4에 의해 유도된 STAT6의 인산화를 효과적으로 차단하는 것으로 관찰되었다.

실시예 7: 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 STAT6의 핵내로의 전좌 (translocation) 억제효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 200 μM의 시네프린을 60분간 처리한 다음 50 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 세포를 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, ,PFA)로 고정 후, STAT6와 특이적으로 반응하는 1차 항체를 처리하였다. 그 다음 FITC가 붙어 있는 2차 항체를 처리하여 STAT6와 반응하는 곳에 형광물질로 표지해 주었으며, 훼히스트(Hoechst)를 이용하여 핵을 염색한 다음, 공초점 현미경을 이용하여 STAT6의 핵내로의 전좌 여부를 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실험 결과, 시네프린은 IL-4에 의해 유도된 STAT6의 핵내로의 전좌를 차단하는 것으로 관찰되었다.

실시예 8: 감귤 미성숙과 추출물로부터 분리한 시네프린의 호산구 응집작용 억제효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, NIH/3T3, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 공도배양 플레이트에 웰당 약 2 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 10, 100 및 200 μM의 시네프린을 60분 동안 처리한 후 50 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 에오탁신-1의 발현을 유도하였다. 동시에 호산구를 접종하여 24시간 동안 배양하여 막을 통과하여 플레이트의 하단으로 이동한 호산구의 이주(transmigration) 정도를 측정하였다. 측정은 CytoSelect^TM 24-Well Cell Migration Assay kit(Cell biolabs, INC., USA)를 이용하여 형광염색을 통해 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실험 결과, 시네프린은 IL-4 처리에 의해 발현된 에오탁신-1에 의해 유도되는 호산구의 이주를 저해하는 것을 확인하였다.

실시예 9: 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

감귤 미성숙과 추출물 또는 감귤 미성숙과로부터 분리한 시네프린이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 스쿠알렌을 기본으로 감귤 미성숙과 추출물을 1, 10 및 100 ppm 첨가한 제형을 제조하고, 시네프린을 10, 150 및 300 ppm 첨가한 피부외용제를 각각 제조하였다.

그 다음 상기 피부외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 감귤 미성숙과 추출물과 시네프린이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 스쿠알란을 베이스로 미성숙 감귤 추출물 또는 시네프린이 함유되지 않은 피부외용제를 사용하였다.

첩포는 핀 챔버 (Finn chanber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며 챔버에 상기에서 제조한 피부외용제를 각각 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 실험식 1을 이용하여 점수화 하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[실험식 1]

평균반응도 = [{(반응지수 × 반응도) / (총 피검자수 × 최고점수(4점)} × 100] / 검사회수

이때, 반응도에서 ± 는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질(ppm)		반응이 나타난 피검자 수									평균 반응도
		1주			2주			3주
		1차	2차	3차	1차	2차	3차	1차	2차	3차
		a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c
대조군		-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	1/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.09
감귤 미성숙과 추출물	1	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
	10	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
	100	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/1/-	-/-/-	-/-/-	0.09
시네프린	10	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
	150	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
	300	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
(a : ±, b : +, c :++를 나타냄)

실험 결과, 대조군의 경우 ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 2주차의 3차 첩포에서 각각 1명, 0명, 0명이었고, 나머지 기간에 대한 첩포에 대하여는 피부에 반응이 나타나지 않았다. 실시예 1의 감귤 미성숙과 추출물의 경우 100ppm이 함유된 피부외용제를 3주차 1차 첩포에서 각각 0명, 1명, 0명이었고, 나머지 농도 및 기간에 대한 첩포에 대하여는 피부에 반응이 나타나지 않았으며, 실시예 2의 시네프린의 경우 모든 시험군에서는 피부에 반응이 나타나지 않았다. 상기 표 1의 결과를 상기 실험식 1에 따라 계산한 결과, 대조군의 평균 반응도는 0.09이며, 미성숙 감귤 추출물의 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00 및 0.09이고, 시네프린의 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00 및 0.00로 나타나 감귤 미성숙과 추출물 및 이로부터 분리한 시네프린이 안전한 물질로 판단되었다.

실시예 10: 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린을 함유한 크림의 아토피 개선 효과 측정

10-1. 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린을 함유한 크림의 제조

하기 표 2와 같은 성분 및 함량을 가진 미성숙 감귤 추출물 또는 시네프린을 함유한 크림을 제조하였다. 구체적으로, 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 후, 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고, 미성숙 감귤 추출물 또는 시네프린을 전체 조성물 중량 대비 0.03 또는 0.01 중량% 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량(중량%)
감귤미성숙과추출물 또는 시네프린	0.03 또는 0.01
카보머940	0.12
트레할로스	3.00
솔비톨	1.00
1,3-부틸렌 글리콜	5.00
비스-피이지-18 메틸에티르 다이메틸 실란	1.00
글라이세롤	4.00
디엘-판테놀	0.30
이디티에이	0.02
폴리솔베이트 60	0.80
글리세롤 모노스테아레이트	1.20
글리세롤 스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	0.90
솔비탄 세스퀼레테이트	0.30
라네트-오	1.60
세틸 에틸헥소노에이트	3.00
카프릴릭/카르릭 트리글리세라이드	1.00
사이클로메티콘	6.50
트리에탄올 아민	0.13
페노닙	0.70
향, 방부제	미량
정제수	잔량
합계	100

10-2. 감귤 미성숙과 추출물 또는 이로부터 분리한 시네프린을 함유한 크림의 아토피 개선 효과 측정

상기 10-1의 방법으로 제조한 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린이 0.03 또는 0.01 함유된 크림을 30명의 소아 아토피 환자를 대상으로 1일 2회, 4주 동안 사용하게 하였다. 대조군으로는 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린 대신 정제수가 함유된 크림을 사용하였다.

아토피 개선 효과는 EASI(Eczema Area Severity Index) 스코어를 이용하여 측정하였으며, 판정기준은 아토피의 개선이 없는 경우를 5, 많은 경우를 0으로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

	시험경과일
	1주	2주	4주
대조군	2.85	2.57	2.28
감귤미성숙과 추출물	2.74	1.48	0.69
시네프린	2.82	1.51	0.63

실험 결과, 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린이 포함된 크림을 사용한 경우, 대조군에 비하여 EASI 스코어가 감소하며, 사용 기간이 길어질수록 EASI 스코어가 기간에 비례하여 감소하는 것으로 관찰되어 아토피 염증에 효과적인 효능이 있는 것으로 확인되었다.

제조예 1: 화장료의 제조

1-1. 크림의 제조

하기의 표 4과 같이 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효 성분으로 포함하는 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
감귤미성숙과추출물 또는 시네프린	0.03 또는 0.01
카보머940	0.12
트레할로스	3.00
솔비톨	1.00
1,3-부틸렌 글리콜	5.00
비스-피이지-18 메틸에티르 다이메틸 실란	1.00
글라이세롤	4.00
디엘-판테놀	0.30
이디티에이	0.02
폴리솔베이트 60	0.80
글리세롤 모노스테아레이트	1.20
글리세롤 스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	0.90
솔비탄 세스퀼레테이트	0.30
라네트-오	1.60
세틸 에틸헥소노에이트	3.00
카프릴릭/카르릭 트리글리세라이드	1.00
사이클로메티콘	6.50
트리에탄올 아민	0.13
페노닙	0.70
향, 방부제	미량
정제수	잔량
합계	100

1-2. 토너의 제조

하기의 표 5와 같이 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효 성분으로 포함하는 토너를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
감귤미성숙과 추출물 또는 시네프린	0.03 또는 0.01
다이소듐 이디티에이	0.01
아미노코트	1.00
디엘-판테놀	0.10
트레할로스	0.10
글리세롤	3.00
카보폴 이티디 2020	0.07
알콜	3.00
비스-피이지-18 메틸 에테르 디메틸 실란	0.20
페닐 트리메티콘	0.10
피이지-40 하이드로게네이티드 코스톨 오일	0.15
메틸파라벤	0.05
트리에탄올아민	0.13
페노닙	0.70
페녹시에탄올	0.50
향, 방부제, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

1-3. 로션의 제조

하기의 표 6과 같이 감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효 성분으로 포함하는 로션을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
감귤미성숙과 추출물 또는 시네프린	0.03 또는 0.01
카보머941	0.05
알란토인	3.00
허브엑스 히알루론	1.00
메틸파라벤	0.10
글리세롤	1.10
다이소듐 이디티에이	0.05
폴리솔베이트60	1.00
솔리탄 세스키올레이트	1.00
스테아릭 에시드	1.00
글리세롤 스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.50
세틸 알콜	1.30
프로필파라벤	0.05
부틸파라벤	0.05
마카다미아 오일	0.05
디메티콘	0.50
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	1.00
미네랄오일	4.50
트리에탄올아민	0.10
페녹시에탄올	0.50
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제조예 2: 약학적 제제의 제조

2-1. 정제의 제조

감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효성분으로 포함하는 정제를 제조하기 위하여, 하기 표 7의 성분을 혼합한 다음 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
감귤미성숙과 추출물 또는 시네프린	20
유당	20
전분	20
스테아린산 마그네슘	0.5

2-2. 캡슐제의 제조

감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효 성분으로 포함하는 캡슐제를 제조하기 위하여, 하기 표 8의 성분을 혼합한 다음 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
감귤미성숙과 추출물 또는 시네프린	20
유당	20
전분	20
스테아린산 마그네슘	0.5

2-3. 연고제의 제조

감귤 미성숙과 추출물 또는 시네프린을 유효 성분으로 포함하는 정제를 제조하기 위하여, 하기 표 9의 성분을 혼합한 다음 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

성분	함량(g)
감귤미성숙과 추출물 또는 시네프린	0.02
다이에탄올아민	1.5
전분폴리비닐피롤리돈	5
프로필렌글리콜	30
증류수를 가하여 전체 100ml로 제조

Claims (8)

1. 시네프린(synephrine) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 시네프린 또는 이의 염은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 시네프린(synephrine) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 상기 시네프린 또는 이의 염은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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