KR101634706B1 - Primer set for rapid and exactly diagnosing influenza virus subtype, and uses thereof - Google Patents
Primer set for rapid and exactly diagnosing influenza virus subtype, and uses thereofInfo
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Abstract
본 발명은 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 아형 구분이 가능하므로 새로운 조류 인플루엔자 바이러스의 출현에 따른 조기 진단 및 국가 방역 대책 자료에 널리 활용될 수 있다.The present invention provides a kit for influenza virus diagnosis comprising a primer set for influenza virus diagnosis comprising at least one primer set selected from the group consisting of seven primer sets, a kit for influenza virus diagnosis including the primer set, The present invention can be applied to early detection of a new avian influenza virus and to national preventive measures data because the subtype of influenza virus can be classified.
Description
본 발명은 인플루엔자 바이러스 아형 진단을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 진단하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a primer set for diagnosis of influenza virus subtypes and a use thereof, and more particularly to a primer set for influenza virus diagnosis comprising at least one primer set selected from the group consisting of seven primer sets, And a method for diagnosing influenza virus using the primer set.
인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 NP(nuleocapsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 HA(hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H16형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다 (참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 사람에서는 인플루엔자 A 및 B형 바이러스가 하기도 감염증을 포함한 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는데 특히, A형 감염에 의해서 유행기간 동안 매년 약 10,000 여명의 사망자가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다.Influenza viruses are classified as A, B, and C due to the antigenicity of NP (nuleocapsid) and M (matrix) proteins as the major causative agents of viral respiratory diseases. Among them, type A is again classified as H1 to H16 according to the antigenic characteristics of HA (hemagglutinin) protein and N1 to N9 type according to the NA protein antigen characteristics (Reference: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56: 365-394, 1987). In humans, influenza A and type B viruses are known to cause diseases including the following infectious diseases. Especially, it is known that about 10,000 deaths occur every year during the period of A type infection.
인플루엔자는 동절기 주요 급성 호흡기 질환의 병원체로서 호흡기를 통한 전염으로 높은 전파력을 가지며, 특히 인플루엔자 A의 경우는 조류를 포함하여 가축, 사람 등에 감염이 가능하여 교차 감염이 빈번하다. 인플루엔자는 음성가닥 RNA 바이러스로서 게놈 복제시 돌연변이가 빈번하고, 게놈이 8개의 분절된 형태를 포함하고 있어서 하나의 숙주에 동시 감염시 서로 다른 게놈이 재배열되어 새로운 인플루엔자가 발생될 수 있다. 이와 같은 결과로 인플루엔자는 매 발생시마다 새로운 바이러스로 나타날 수 있으며, 따라서 백신의 효능이 오래 지속되지 못하는 단점이 있다.Influenza is a major pathogen of acute respiratory illness in winter, and has a high spreading power through the respiratory tract. In particular, influenza A is infectious to livestock and people including birds. Influenza is a negative strand RNA virus that is frequently mutated during genome replication, and the genome contains eight segmented forms, so that when a single host is co-infected, different genomes are rearranged and new influenza can develop. As a result, influenza can appear as a new virus every time it occurs, and therefore the vaccine does not last long.
지난 4월 중국에서 발생한 인플루엔자 A/H7N9은 인체감염 조류인플루엔자로서 조류 인플루엔자가 직접적으로 사람에게 감염될 수 있음을 시사하였다. A/H7N9은 저독성이긴 하지만 조류인플루엔자가 사람에게 직접적으로 감염되는 첫 사례로 기록되었다. 이는 고위험성 조류 인플루엔자(A/H5N1)가 이미 국내에 토착화된 상황을 고려할 때 매우 우려되는 상황이다. Influenza A / H7N9, which developed in China last April, is a human-infected avian influenza, suggesting that avian influenza can be directly transmitted to humans. Although A / H7N9 is low toxic, it has been recorded as the first case of direct infection of people with avian influenza. This is very worrisome considering the situation that high-risk avian influenza (A / H5N1) has already been inhabited in Korea.
몇몇 인플루엔자는 타미플루나 릴렌자 등과 같은 항 바이러스제로 치료가 가능하나 인플루엔자의 잦은 변이와 재배열에 의한 새로운 변종의 발생이 빠른 상황에서 치료제에 저항성을 띠는 인플루엔자가 발생될 수 있다.Some influenza can be treated with antiviral agents such as Tamiflu or Lilanza, but influenza resistant to the therapeutic agent can occur when the frequent mutation of influenza and the emergence of a new strain due to rearrangement.
현재 인플루엔자에 대한 실험실 진단은 임상검체에서 바이러스를 배양하거나 핵산을 추출하여 인플루엔자의 존재를 증명한 경우 확진을 하게 된다. 또한, 인플루엔자의 아형 진단은 바이러스를 배양하고 혈청학적 진단을 통해 조사하거나 2단계 이상의 실시간 PCR을 통하여 조사하고 있으나 시간 및 비용이 많이 소요되며 특수 장비를 필요로 한다. The current laboratory diagnosis for influenza is to confirm the presence of influenza by culturing the virus in a clinical sample or by extracting nucleic acid. In addition, the subtype diagnosis of influenza is carried out by culturing the virus, conducting a serological diagnosis, or conducting a real-time PCR using two or more steps, but it takes time and expense and requires special equipment.
유전자 분석 기술의 발달로 최근에는 분리된 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 게놈 분석이 이루어지고 있으며, 국내에서는 질병관리본부에서 운영하는 인플루엔자 유전정보 데이터베이스에서 쉽게 그 정보를 확인할 수 있다. 실시간 PCR을 이용한 인플루엔자 진단법은 인플루엔자의 타입별로 A, B를 구분하고 인플루엔자 A의 경우는 2차로 헤마글루티닌 유전자를 이용한 아형 구분을 하고 있다. 이것은 인플루엔자의 정확한 아형 분석을 위해서 2번의 분석이 요구되고 있다.With the development of genetic analysis technology, the entire genome of the isolated influenza virus has been analyzed and the information can be easily found in the influenza genetic information database operated by the CDC in Korea. Influenza detection using real-time PCR distinguishes A and B according to the type of influenza, and in the case of influenza A, the subtype is divided into two, using the hemagglutinin gene. This requires two assays for accurate subtyping of influenza.
인플루엔자를 대상으로 통상적인 PCR(conventional PCR) 또는 실시간 PCR법으로서, 인플루엔자 A/H1, H3, B 타입을 구별할 수 있는 방법은 이미 보고된 바 있다. 하지만, one step RT-PCR을 이용한 인플루엔자 A/H1, H3, H5, H7N9, B 모두를 한번에 판독하거나, 이를 바탕으로 인플루엔자 발생을 예측하는 연구는 아직 보고된 바 없다. Methods for distinguishing influenza A / H1, H3, and B types from conventional influenza as conventional PCR or real-time PCR have been reported. However, studies have not yet been conducted on influenza A / H1, H3, H5, H7N9 and B all at once using one step RT-PCR or predicting influenza onset.
이에 본 발명에서는 임상검체로부터 한 번의 분석으로 인플루엔자의 아형을 분석할 수 있는 프라이머 세트를 제조하고, 이를 이용하여 빠른 시간 내에 인플루엔자의 아형을 판독할 수 있음을 확인하였다. In the present invention, a primer set capable of analyzing the subtypes of influenza by a single analysis from a clinical sample was prepared, and it was confirmed that subtypes of influenza can be read out quickly using the primer set.
한국등록특허 제0796007호에서는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머, 이를 이용한 검출방법 및 검출키트가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1223944호에서는 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 이용한 신종 및 계절 인플루엔자 바이러스 검출방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같은 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.Korean Patent No. 0796007 discloses a primer for detecting influenza virus, a detection method and a detection kit using the same, and Korean Patent No. 1223944 discloses a new and seasonal influenza virus detection method using multiplex real-time RT-PCR However, the primer set for the diagnosis of influenza virus as in the present invention and its use have not been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 종래에 알려진 인플루엔자 아형 타입별(A/H1, A/H3, A/H5, A/H7N9, B) 백신주 및 국내 분리주 32종의 인플루엔자의 매트릭스 유전자, 헤마글루티닌 유전자 및 뉴라미니데이즈 유전자를 대상으로 각 타입별 특이 보존 서열을 추출하여 7개의 프라이머 세트를 제조하였다. 상기 7개의 프라이머 세트로 one step RT-PCR을 수행하여 A형 또는 B형의 인플루엔자 바이러스를 진단할 수 있는 것과 동시에 A형의 인플루엔자 바이러스 아형(subtype)인 A/H1, A/H3, A/H5, A/H7, A/N9형의 인플루엔자 바이러스를 또한 상호 간섭없이 정확하게 진단할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.(A / H1, A / H3, A / H5, A / H7N9, B) vaccine strains and 32 domestic strains of influenza strains 7 primer sets were prepared by extracting the specific conserved sequences for each type of matrix gene, hemagglutinin gene, and neuraminidase gene. A / H1, A / H3, and A / H5, which are subtypes of influenza A virus, can be diagnosed by conducting one step RT-PCR using the seven primer sets described above to diagnose influenza A or B influenza virus , A / H7, and A / N9 types of influenza viruses can also be accurately diagnosed without mutual interference.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NOS: 13 and 14, for the diagnosis of influenza virus.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 진단을 위한 키트를 제공한다.Further, the present invention provides a primer set comprising: the primer set; Reverse transcriptase; And a reagent for carrying out an amplification reaction. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
또한, 본 발명은 In addition,
검체에서 총 RNA를 분리하는 단계;Separating the total RNA from the specimen;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying the target sequence by performing RT-PCR using the separated total RNA as a template and using a primer set for the diagnosis of influenza virus; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 진단하는 방법을 제공한다.And detecting the amplification product. The present invention also provides a method for diagnosing an influenza virus.
본 발명에서는 7개의 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 바이러스 아형(subtype)인 A, A/H1, A/H3, A/H5, A/H7, A/N9 또는 B형의 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 아형 구분이 가능하므로 새로운 조류 인플루엔자 바이러스의 출현에 따른 조기 진단 및 국가 방역 대책 자료에 널리 활용될 수 있다.In the present invention, it is possible to simultaneously diagnose the influenza virus subtypes A, A / H1, A / H3, A / H5, A / H7, A / N9 or B influenza viruses using 7 primer sets Respectively. Accordingly, since the present invention can classify subtypes of influenza viruses, it can be widely used for early diagnosis and national antipiracy measures data due to the emergence of new avian influenza viruses.
또한, 본 발명에서는 인플루엔자를 진단함에 있어 기존의 2회 반복 진단을 포함하여 진단 시간의 장기화를 25분 이내로 획기적으로 단축하였다. 또한, 기존의 타입 분석용으로 사용하는 인플루엔자 타입 A, B 분석과 인플루엔자 A 타입에서 H1, H3, H5의 아형을 2회에 걸쳐 분석하던 것을 본 발명에서는 한 번의 PCR로 분석할 수 있도록 멀티플렉스 PCR을 구축하였다. 기존의 2가지 또는 3가지를 구분하던 방법에서 본 발명에서는 기존의 5가지를 포함하여 최근 중국에서 발생한 A/H7N9을 추가하여 진단할 수 있도록 7가지를 한 번에 진단할 수 있도록 개발하였다. 본 발명은 인플루엔자에서 7가지를 동시에 한번의 PCR로 진단할 수 있는 장점을 가지고 있으며, 본 방법을 GeneChecker와 같은 실시간 PCR 장비에 적용하여 야전에서 질병의 확진에 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 현재 유행하는 인플루엔자의 타입을 쉽고 빠르게 분석함으로써 향후 인플루엔자 발생 모니터링 및 유행 주기 연구에 활용할 수 있다.In addition, in the present invention, diagnosis of influenza is greatly shortened to 25 minutes or less, including twice the conventional diagnosis. In addition, in the analysis of influenza types A and B used for conventional type analysis and analysis of subtypes of H1, H3 and H5 in Influenza A type two times, in the present invention, multiplex PCR . In the present invention, seven types of A / H7N9 were newly diagnosed at a time, including 5 existing ones, in addition to A / H7N9. The present invention has the advantage of being able to diagnose seven kinds of influenza simultaneously by one PCR, and it is considered that the present method can be applied to the real-time PCR apparatus such as GeneChecker to confirm the disease in the field. In addition, the type of influenza currently being analyzed can be analyzed quickly and easily, so that it can be used to monitor influenza occurrence and to study trends in the future.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 아형을 진단하기 위한 최적 PCR 조건을 분석한 결과이다. A, 각 타입별 진단용 프라이머의 최적 반응을 확인하기 위하여 프라이머 결합 온도를 확인함. 47℃에서 약 2℃ 간격으로 60℃까지 분석하여 최적조건을 확인함; B, A에서 확인된 최적조건을 활용하여 각 타입에 따른 교차반응을 확인함; C, 인플루엔자 A/H7N9 진단용 프라이머 이용한 결과임.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 아형을 진단하기 위해 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 수행한 결과이다. 인플루엔자 A/H1, A/H3, A/H5, A/H7N9 및 B 타입에 대한 멀티플렉스 PCR을 이용한 진단으로 1㎕의 cDNA를 주형으로 35회 반복으로 PCR을 수행하였고, 1x TBE, 12% PAGE 전기영동을 이용하여 분석하였다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 아형을 진단하기 위해 One step RT-PCR을 수행한 결과이다. 인플루엔자 타입별 RNA와 특이 프라이머를 이용하여 One step RT-PCR을 수행하였다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 아형을 진단하기 위해 실시간 PCR을 수행한 결과이다. A, GeneChecker를 이용한 One step RT-PCR 결과임. 플라스틱 칩의 8개 웰에 각각 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트를 이용하여 One Step RT-PCR을 수행하여 각각 A/H1, A/H3, A/H7, A/N9을 진단할 수 있었음. A, 인플루엔자 A/H1; B, 인플루엔자 A/H3; C, 인플루엔자 A/H7N9; D, 인플루엔자 B
도 5는 GeneChecker 장비를 나타낸다.FIG. 1 shows the results of analysis of optimal PCR conditions for diagnosing influenza subtypes using the primer set of the present invention. A, confirm primer binding temperature to confirm optimal reaction of diagnostic primer for each type. Analyze up to 60 캜 at about 2 캜 intervals at 47 캜 to confirm optimum conditions; B, and A to identify cross-reactions for each type; C, results of using A / H7N9 diagnostic primer for influenza.
2 is a result of performing multiplex PCR to diagnose an influenza subtype using the primer set of the present invention. PCR was performed by repeating 35 cycles of 1 μl of cDNA as a template by using multiplex PCR for influenza A / H1, A / H3, A / H5, A / H7N9 and B, And analyzed using electrophoresis.
FIG. 3 shows the results of one-step RT-PCR for diagnosing influenza subtypes using the primer set of the present invention. One step RT-PCR was performed using influenza-type RNA and specific primers.
4 is a result of real-time PCR for diagnosing influenza subtypes using the primer set of the present invention. A, One step RT-PCR with GeneChecker. Primer sets of SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively, in 8 wells of a plastic chip; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And A / H9, A / H7 and A / N9, respectively, by performing One Step RT-PCR using primers set forth in SEQ ID NOS: 13 and 14, respectively. A, influenza A / H1; B, influenza A / H3; C, influenza A / H7N9; D, influenza B
Figure 5 shows a GeneChecker instrument.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 진단을 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a primer set for influenza virus diagnosis comprising at least one primer set selected from the group consisting of seven primer sets.
본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.The primer set of the present invention specifically comprises a primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And a set of primers of SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 7개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.The primer set of the present invention preferably includes one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or more than six primer sets selected from the group consisting of the seven primer sets, Preferably seven primer sets, i.e., a primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And primer sets of SEQ ID NOS: 13 and 14, respectively.
상기 7개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 인플루엔자 바이러스(influenza virus)로부터 인플루엔자 바이러스 아형(subtype)을 더욱 효율적으로 구분할 수 있다.Use of the seven primer sets simultaneously can more effectively distinguish the influenza virus subtype from the influenza virus.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primers include, according to the sequence length of each primer, a primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And an oligonucleotide consisting of fragments of at least 16, at least 17, at least 18, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23 consecutive nucleotides in the sequence of the primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14, Nucleotides < / RTI > For example, the primers (24 oligonucleotides) of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 contain at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, At least 21, at least 22, at least 23 contiguous nucleotides. Also, the primers include a primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2; A primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4; A primer set of SEQ ID NOS: 5 and 6; A primer set of SEQ ID NOS: 7 and 8; A primer set of SEQ ID NOS: 9 and 10; A primer set of SEQ ID NOS: 11 and 12; And addition, deletion or substitution of the nucleotide sequence of the primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, a "primer" refers to a single strand oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primer should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.As used herein, an oligonucleotide used as a primer may also include a nucleotide analogue, such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate, or peptide nucleic acid, or alternatively, And may include an intercalating agent.
본 발명의 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A, A/H1, A/H3, A/H5, A/H7, A/N9 또는 B형의 인플루엔자 바이러스일 수 있다.In the primer set for influenza virus diagnosis according to the present invention, the influenza virus may be influenza A virus, A / H1, A / H3, A / H5, A / H7, A / N9 or B virus.
본 발명의 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 멀티플렉스(multiplex) PCR 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 프라이머 세트는 서로 간섭 없이 PCR 산물을 생성하므로 하나의 반응 튜브에 7개 세트의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 수행할 수 있다.In the primer set for influenza virus diagnosis of the present invention, the primer set is preferably, but not limited to, a multiplex PCR primer set. Since the primer set of the present invention generates PCR products without interfering with each other, it is possible to perform PCR by adding 7 sets of primers to one reaction tube.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve still another object of the present invention,
본 발명에 따른 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 진단을 위한 키트를 제공한다.A primer set according to the present invention; Reverse transcriptase; And a reagent for carrying out an amplification reaction. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In the kit of the present invention, the reagent for carrying out the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffer and the like. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performing conditions. The manual is a printed document that explains how to use the kit, for example, how to prepare PCR buffer, the reaction conditions presented, and so on. The manual includes instructions on the surface of the package including a brochure or leaflet in the form of a brochure, a label attached to the kit, and a kit. In addition, the brochure includes information that is disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve still another object of the present invention,
검체에서 총 RNA를 분리하는 단계;Separating the total RNA from the specimen;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying the target sequence by performing reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using the separated total RNA as a template and using a primer set for influenza virus diagnosis according to the present invention; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 진단하는 방법을 제공한다.And detecting the amplification product. The present invention also provides a method for diagnosing an influenza virus.
본 발명의 방법은 조류, 가축 또는 인간에서 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상업적인 키트를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 역전사효소를 이용한 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성한 후, 이를 PCR 주형으로 하여 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.The methods of the invention include isolating RNA from algae, livestock, or humans. As a method for separating RNA from the sample, a method known in the art may be used, or a commercial kit may be used. Using the separated RNA as a template, reverse transcription using a reverse transcriptase is performed to synthesize cDNA, and the amplified reaction is carried out using the primer set according to one embodiment of the present invention as a PCR template to obtain a target sequence Can be amplified. The reverse transcriptase may be a reverse transcriptase from various sources such as avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase (AMV RTase), murine leukemia virus-derived reverse transcriptase virus-derived virus reverse transcriptase (MuLV RTase) and Rous-associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase).
표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Strand displacement amplification or amplification with Q [beta] replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 RT-PCR은 원스텝(One Step) RT-PCR일 수 있으며, 상기 원스텝(One Step) RT-PCR은 50℃에서 5분으로 cDNA를 합성하고, 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5-10초간 변성(denaturation), 50℃에서 5-10초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5-10초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method of the present invention, the RT-PCR may be one-step RT-PCR, and the one step RT-PCR is performed by synthesizing cDNA at 50 ° C for 5 minutes, After denaturation, denaturation at 95 ° C for 5-10 seconds, primer annealing at 50 ° C for 5-10 seconds, and extension at 72 ° C for 5-10 seconds were repeated 35 times, followed by 72 Lt; 0 > C for 2 minutes, but is not limited thereto.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material can be, but is not limited to, a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When the target sequence is amplified, PCR is carried out by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, and the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. When the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, the amplification product may be synthesized and the radioactive substance may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be labeled as radioactive.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
The method of the present invention comprises detecting said amplification product. The detection of the amplification product can be performed through capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As a method of detecting the amplification product, gel electrophoresis can be performed, and gel electrophoresis can be performed using acrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis according to the size of the amplification product. In addition, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis, for example, can use the ABi Sequencer. Also, in the fluorescence measurement method, Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer. When PCR is carried out, the target is labeled with a fluorescent label capable of detecting the target sequence. The labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter can do. In addition, in the case of performing the PCR, the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to mark the amplification product, and then a radioactive measurement device such as a Geiger counter or liquid scintillation counter The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
타겟target 유전자 및 Gene and 프라이머primer 선정 selection
타겟 유전자는 인플루엔자 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1, A/H7N9, B의 매트릭스유전자, 헤마글루티닌 유전자, 뉴라미니데이즈 유전자를 진뱅크와 질병관리본부 KISED에서 다운 받아 multialin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각각의 염기서열중에 A, B 타입의 매트릭스 유전자에서 A 타입에 대한 보존서열을 선정하여 인플루엔자 타입 A/B를 구분하였다. 헤마글루티닌의 서브타입을 결정하기 위해서는 각 H1, H3, H5, H7의 염기서열을 비교하여 타입별로 특이 서열을 선정하여 구분할 수 있도록 하였다.
The target gene can be downloaded from GeneBank and CDC (KISED) by using multialin ( http: //www.kised.com/), the matrix gene for influenza A / H1N1, A / H3N2, A / H5N1, A / H7N9, B, hemagglutinin gene, //multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ ) program. The influenza type A / B was identified by selecting the conserved sequence for the A type from the A and B type matrix genes among the respective nucleotide sequences. In order to determine the subtypes of hemagglutinin, the nucleotide sequences of H1, H3, H5 and H7 were compared and specific sequences could be selected and identified by type.
인플루엔자 바이러스 Influenza virus
인플루엔자는 질병관리본부에서 자원번호 42464(influenza A/Brisbane/59/07(H1N1)), 42465(influenza A/Brisbane/10/07(H3N2)), 42466(influenza B/Brisbane/60/08(B)), 42467(influenza A/California/07/09(H1N1)), 42468(influenza A/Perth/16/09(H3N2)), 42469(influenza B/Florida/04/06(B)), 43000(influenza A/Korea/01/09(H1N1)), 42471(influenza A/Victoria/361/11-like virus(H3N2)) 및 42470(influenza B/Wisconsin/01/10-like virus;victoria(B))를 분양받아 유정란 배양을 통하여 배양하였으며, 인플루엔자 신속 진단 키트를 검증하는데 사용하였다.
Influenza has been reported to the Disease Control Headquarters under the number 42464 (influenza A / Brisbane / 59/07 (H1N1)), 42465 (influenza A / Brisbane / 10/07 (H3N2)), 42466 (influenza B / ), 42467 (influenza A / California / 07/09 (H1N1)), 42468 (influenzae / Perth / 16/09 (H3N2) influenza A / Korea / 01/09 (H1N1)), 42471 (influenza A / Victoria / 361/11-like virus (H3N2)) and 42470 (influenza B / Wisconsin / 01 / Were cultured in the presence of fertilized eggs and used to test the rapid influenza diagnostic kit.
PCRPCR 주형 분리 Mold separation
인플루엔자는 질병관리본부에서 분양 받은 A/H1N1, A/H3N2, B 타입을 유정란에서 배양하여 퀴아젠의 QIAAmp MinElut Virus prep 키트의 매뉴얼에 따라 인플루엔자의 RNA를 분리하고 -80℃에서 보관하며 사용하였다. 계절 인플루엔자 외의 A/H5N1, A/H7N9의 경우는 충남대 독감바이러스 연구소에서 추출하여 PCR의 주형으로 사용하였다.Influenza A / H1N1, A / H3N2, and B strains were purchased from the Disease Control Headquarters and cultured in fertilized eggs. Influenza RNA was isolated according to the QIAAmp MinElut Virus prep kit manual of Quiagen and stored at -80 ° C. A / H5N1 and A / H7N9 other than seasonal influenza were extracted from the Chungnam National University Flu virus laboratory and used as PCR templates.
Influenza A/Brisbane/59/07, A/California/07/09, A/Korea/01/09, A/Brisbane/10/07, A/Perth/16/09, B/Brisbane/60/08, B/Florida/04/06, B/Wisconsine/01/10, A/H5N1(HPAI) 및 A/H7N9(중국, 안후이)의 10주의 백신주 및 국내 분리주, 고위험성 조류인플루엔자 그리고 중국에서 발생한 A/H7N9의 게놈 RNA를 QIAamp MinElut Virus Spin kit (QIAGEN)를 이용하여 추출하였다.
A / Brisbane / 10/07, A / Perth / 16/09, B / Brisbane / 60/08, B / Brisbane / 59/07, A / A / H7N9 (China, Anhui), 10 separate vaccines and domestic isolates, high-risk avian influenza, and A / H7N9 in China Genomic RNA was extracted using QIAamp MinElut Virus Spin kit (QIAGEN).
cDNAcDNA 합성 synthesis
cDNA는 각각의 인플루엔자에서 분리한 RNA를 사용하여 합성하였다. cDNA는 GenDepot사의 cDNA 합성 키트를 사용하여 합성하고 -20℃에 보관하면서 사용하였다. PCR 증폭에 사용한 cDNA는 각각 1㎕를 사용하였다. 상기 게놈 시료는 표 1과 같은 조성으로 cDNA를 합성하였다. cDNA는 50℃, 1시간 반응 후에 95℃, 10분으로 변성시켜서 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.cDNA was synthesized using RNA isolated from each influenza strain. cDNA was synthesized using GenDepot cDNA synthesis kit and stored at -20 ° C. Each 1 μl of the cDNA used for PCR amplification was used. The genomic samples were synthesized with the same composition as shown in Table 1. The cDNA was denatured at 95 ° C for 10 minutes at 50 ° C for 1 hour and used as a template for PCR reaction.
PCR(PCR ( PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction ))
PCR은 1㎕ cDNA를 주형으로 사용하였다. PCR의 조건은 최초 95℃에서 2분간 가열하여 이중가닥을 형성한 cDNA를 해리시켰다. 그 후에 95℃ 5-10초, 50℃ 5-10초, 72℃ 5-10초의 조건으로 35회 반복하였으며, 마지막 72℃ 2분으로 마무리하였다. 모든 PCR에서 35회 반복을 기본으로 사용하였다. PCR 조성은 cDNA 1㎕, 프라이머 각각 5pmole을 사용하였으며, Bio-Rad에서 구입한 2x Sso Fast EvaGreen Supermix를 사용하여 진행하였다. 상기 반응 시료는 표 2와 같은 조성으로 PCR을 수행하였다.PCR was performed using 1 cDNA cDNA as a template. The PCR conditions were initially heated at 95 ° C for 2 minutes to dissociate the double stranded cDNA. Thereafter, the reaction was repeated 35 times at 95 ° C for 5-10 seconds, 50 ° C for 5-10 seconds, and 72 ° C for 5-10 seconds, and the reaction was terminated at 72 ° C for 2 minutes. 35 cycles were used as a basis for all PCR. PCR was carried out using 1 μl of cDNA and 5 pmoles of each primer, using 2x Sso Fast EvaGreen Supermix purchased from Bio-Rad. The reaction samples were subjected to PCR using the compositions shown in Table 2.
OneOne stepstep RTRT -- PCRPCR
One Step RT-PCR은 인플루엔자 바이러스 RNA로부터 한번의 반응으로 cDNA 합성과 PCR을 동시에 진행하는 것으로서, 인플루엔자 RNA 추출물 1㎕를 주형으로 사용하였으며, 각 세트에 포함된 프라이머의 농도는 각각 5 pmole/㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응물 조성은 표 3과 같으며, 상용화된 cDNA 합성 키트(iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad))와 PCR premix kit (2×Sso Fast PCR pre Mix(Bio-Rad))를 혼용하였다.One-step RT-PCR is a one-step reaction from influenza virus RNA, which involves simultaneous cDNA synthesis and PCR. One μl of influenza RNA extract is used as a template. The concentration of each primer in each set is 5 pmole / μl . The PCR product composition was as shown in Table 3. The PCR mix kit (iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)) and the PCR premix kit (2 × Sso Fast PCR pre mix (Bio-Rad)) were mixed.
One Step RT-PCR의 조건은 50℃에서 5분으로 cDNA를 합성하고, 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5-10초간 변성(denaturation), 50℃에서 5-10초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5-10초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 하였다. 상기 PCR 산물을 3% 아가로스겔, 1x TAE에서 전개하여 인플루엔자의 타입을 진단할 수 있도록 하였다.
One step RT-PCR was carried out by synthesizing cDNA at 50 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 2 minutes, denaturation at 95 ° C for 5-10 seconds, primer at 50 ° C for 5-10 seconds Annealing and extension for 5-10 seconds at 72 ° C were repeated 35 times, followed by extension at 72 ° C for 2 minutes. The PCR product was developed on 3% agarose gel and 1x TAE to allow diagnosis of influenza type.
MultiplexMultiplex PCRPCR
시료의 분석대상 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 멀티플렉스 PCR용 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, 인플루엔자 분석대상 타입의 특이 염기서열을 포함할 수 있도록 올리고뉴클레오타이드 형태의 14종 프라이머를 제작하였는데, 각 타입별 PCR용 프라이머의 길이는 18 내지 30 염기가 되도록 하고, Tm(melting temperature) 값이 45~60℃, 그리고 각 PCR 산물의 크기는 타입별로 구분이 가능하도록 320bp 이하로 10bp 이상의 차이가 나도록 하였으며, 멀티플렉스 PCR이 가능하도록 프라이머간 간섭이 없도록 하였다. 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머는 각 타입별로 간섭이 없는 특이서열의 프라이머를 1:1의 비율로 섞어서 최종 농도 각각 5pmole/㎕가 되도록 제작하였다.A multiplex PCR primer capable of simultaneously amplifying the target gene of the sample was prepared. Specifically, 14 kinds of primers of the oligonucleotide type were prepared so as to include a specific base sequence of influenza analysis target type. The length of PCR primers for each type was set to be 18 to 30 bases, and the value of Tm (melting temperature) And the size of each PCR product was classified as 320 bp or less by 10 bp or more. In order to enable multiplex PCR, primer-free interferences were avoided. The multiplex PCR primers were prepared so that the primers of specific sequence having no interference for each type were mixed at a ratio of 1: 1 to a final concentration of 5 pmole / μl.
인플루엔자의 게놈으로부터 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 3 종류의 분석대상 유전자를 증폭하였다. 구체적으로, 타입별로 2 또는 3 종류의 PCR 산물을 동시에 제조할 수 있도록 상기 선정된 프라이머를 혼합하여 프라이머 세트를 각각 제조하였다. 프라이머 세트는 인플루엔자 A 타입의 매트릭스를 증폭할 수 있고, 동시에 각각의 타입별로 H1, H3, H5, H7, N9, B를 증폭할 수 있도록 하였다. 각 세트에 포함된 프라이머의 농도는 각각 5 pmole/㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응물 조성은 표 4와 같으며, 상용화된 PCR 예비 혼합액 중에서 2×Sso Fast PCR pre Mix(Bio-Rad)를 사용하였다.Three kinds of genes to be analyzed were amplified from the genome of influenza using multiplex PCR method. Specifically, a primer set was prepared by mixing the above-mentioned primers so that two or three kinds of PCR products could be produced by type at the same time. The primer set was able to amplify the influenza A type matrix and at the same time amplify H1, H3, H5, H7, N9 and B for each type. The concentrations of the primers contained in each set were adjusted to be 5 pmole / l each. The composition of the PCR reaction mixture is shown in Table 4, and 2 x Sso Fast PCR pre-mix (Bio-Rad) was used in the PCR primer mixture.
멀티플렉스 PCR은 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5-10초간 변성(denaturation), 50℃에서 5-10초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5-10초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 하였다. 상기 PCR 산물을 3% 아가로스겔, 1x TAE에서 전개하여 인플루엔자의 타입을 진단할 수 있도록 하였다.
Multiplex PCR was performed by denaturation at 95 ° C for 2 minutes, denaturation at 95 ° C for 5-10 seconds, primer annealing at 50 ° C for 5-10 seconds, extension at 72 ° C for 5-10 seconds ) Was repeated 35 times, followed by extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. The PCR product was developed on 3% agarose gel and 1x TAE to allow diagnosis of influenza type.
RealReal timetime PCRPCR 키트Kit
상기 프로토콜의 멀티플렉스 PCR 또는 One Step RT-PCR에 사용된 조성은 EvaGreen이 섞여 있어서 실시간 PCR 장비에서는 실시간으로 확인이 가능하다. 특히 진단시간의 단축을 위하여 사용한 GeneChecker의 경우는 투시창을 통하여 반응이 완료된 후에 육안으로 PCR 반응 여부를 확인할 수 있도록 하였다.
The composition used in the multiplex PCR or One Step RT-PCR of the above protocol is mixed with EvaGreen and can be confirmed in real time in real-time PCR equipment. In particular, GeneChecker, which was used for shortening the diagnosis time, was able to visually confirm the PCR reaction after the reaction was completed through the sight window.
실시예Example 1. 진단용 1. Diagnostic 프라이머primer 선정 selection
인플루엔자는 8개의 분절된 게놈에 11-12개의 유전자를 암호화하고 있다. 그중 헤마글루티닌 유전자와 매트릭스 유전자 그리고 뉴라미니데이즈 유전자를 대상으로 각 타입별 특이 염기 서열을 분석하였다. 각 유전자는 타입별로 WHO 백신주를 포함하여 32개 이상의 유전자를 genebank와 질병관리본부 KISED에서 다운받아 multialin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 헤마글루티닌 유전자에서는 인플루엔자 A 타입에서 아형을 분석하기 위하여 각각 A/H1, H3, H5, H7에 대한 특이 보존서열을 추출하여 프라이머로 선정하였다. 또한 B 타입의 인플루엔자를 분석하기 위해서 B 타입의 헤마글루티닌 유전자에서 높은 보존서열을 가지면서 A 타입의 헤마글루티닌과 다른 부위를 추출하였다. 매트릭스 유전자에서는 인플루엔자 A 타입을 분석하기 위하여 A 타입의 모든 인플루엔자에서 보존된 서열을 확인하여 프라이머로 선정하였다. 인플루엔자 A/H7N9을 분석하기 위해서 헤마글루티닌 H7에서 보존서열과 뉴라미니데이즈 N9에서 보존 서열을 확인하여 프라이머로 선정하였다. 각각의 프라이머는 아래 표 5에 염기서열, Tm, GC%를 보여주고 있다. Influenza is encoding 11-12 genes in eight segmented genomes. Among them, hemagglutinin gene, matrix gene, and neuraminidase gene were analyzed and specific nucleotide sequences of each type were analyzed. Each gene was analyzed by using multialin ( http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ ) program and downloading more than 32 genes including type WHO vaccine from genebank and CDC KISED. In the hemagglutinin gene, a specific conserved sequence for A / H1, H3, H5 and H7 was extracted and analyzed as a primer to analyze subtypes of influenza A type. To analyze B type influenza, A type hemagglutinin and other sites were extracted with high conserved sequence in B type hemagglutinin gene. In order to analyze the influenza A type in the matrix gene, a sequence conserved in all influenza A strains was identified and selected as a primer. In order to analyze influenza A / H7N9, a conserved sequence was confirmed in hemagglutinin H7 and a conserved sequence was confirmed in neuraminidase N9 and selected as a primer. Each primer shows the nucleotide sequence, Tm, GC% in Table 5 below.
(℃)Tm
(° C)
실시예Example 2. 인플루엔자의 2. Influenza PCRPCR 진단 최적 조건 확립 Establishing optimal conditions for diagnosis
질병관리본부에서 분양받은 인플루엔자는 유정란 배양을 통하여 생산하였으며, 각각의 역가는 혈구응집반응(Hemmaglutinin assay)을 통하여 분석한 결과 27 ~ 210의 역가를 보여주었다. 생산한 바이러스를 이용한여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 PCR 주형으로 사용하였다. PCR은 1㎕의 cDNA를 주형으로 프라이머는 타입별로 구분하여 반응당 5pmole 농도를 사용하여 총액 10㎕로 혼합하였다. PCR 반응 조건은 최초 95℃에서 2분간 가열하여 이중가닥을 형성한 cDNA를 해리시켰다. 그 후에 95℃ 10초, 48℃에서 2℃ 간격으로 60℃까지 온도구배를 형성하여 10초, 72℃ 10초의 조건으로 35회 반복하였으며, 마지막 72℃ 2분으로 마무리하였다. 모든 PCR에서 35회 반복을 기본으로 사용하였다. 그 결과 도 1A에서 보는 바와 같이 인플루엔자 A/H1N1, A/H3N2, B 타입에서 각각의 예상되는 PCR 생성물을 확인할 수 있었으며, PCR 최적 조건으로는 50℃의 어닐링 온도를 선정하였다.
Influenza, which was distributed from the Disease Control Headquarters, was produced through milk culture and each station showed the activity of 2 7 to 2 10 by hemagglutinin assay. The RNA was extracted from the produced virus and cDNA was synthesized and used as a PCR template. PCR was carried out by mixing 1 μl of cDNA as a template and primers divided into types and using a concentration of 5 pmole per reaction. The PCR reaction conditions were first heated at 95 ° C for 2 minutes to dissociate the double stranded cDNA. Thereafter, a temperature gradient of 95 ° C for 10 seconds, 48 ° C at 2 ° C intervals to 60 ° C was formed, and the reaction was repeated 35 times at 10 seconds and 72 ° C for 10 seconds. Finally, the reaction was completed at 72 ° C for 2 minutes. 35 cycles were used as a basis for all PCR. As a result, as shown in FIG. 1A, the expected PCR products of influenza A / H1N1, A / H3N2 and B types were confirmed, and the optimum temperature for PCR was selected as the annealing temperature of 50 ° C.
실시예Example 3. 인플루엔자 진단 3. Influenza Diagnosis PCRPCR
PCR은 1㎕ cDNA를 주형으로 사용하였다. PCR의 조건은 최초 95℃에서 2분간 가열하여 이중가닥을 형성한 cDNA를 해리시켰다. 그 후에 95℃ 5-10초, 50℃ 5-10초, 72℃ 5-10초의 조건으로 35회 반복하였으며, 마지막 72℃ 2분으로 마무리하였다. 모든 PCR에서 35회 반복을 기본으로 사용하였다. PCR 조성은 cDNA 1㎕, 프라이머 각각 5pmole을 사용하였으며, Bio-Rad에서 구입한 2x Sso Fast EvaGreen Supermix를 사용하여 진행하였다. PCR 반응물의 조성은 표 4에 명시하였다.PCR was performed using 1 cDNA cDNA as a template. The PCR conditions were initially heated at 95 ° C for 2 minutes to dissociate the double stranded cDNA. Thereafter, the reaction was repeated 35 times at 95 ° C for 5-10 seconds, 50 ° C for 5-10 seconds, and 72 ° C for 5-10 seconds, and the reaction was terminated at 72 ° C for 2 minutes. 35 cycles were used as a basis for all PCR. PCR was carried out using 1 μl of cDNA and 5 pmoles of each primer, using 2x Sso Fast EvaGreen Supermix purchased from Bio-Rad. The composition of the PCR reaction product is shown in Table 4.
PCR 생성물은 1x TAE 완충액을 이용한 아가로스 전기영동으로 인플루엔자 타입을 진단하였다. 도 1B 및 도 1C는 인플루엔자 각 타입별로 cDNA를 이용한 PCR에서 각각 타입에 맞는 PCR 생성물을 확인할 수 있었다. 즉 A/H1N1은 106bp의 매트릭스 생성물과 244bp 헤마글루티닌 H1 생성물을, A/H3N2의 경우는 106bp의 A 타입의 매트릭스 생성물과 221bp 헤마글루티닌 H3 생성물을, 그리고 B 타입의 경우는 130bp의 단일 생성물을 보여 줌으로써 각각의 타입을 PCR을 이용하여 분석할 수가 있었다(도 1B). A/H7N9의 경우는 각각 97bp의 헤마글루티닌과 119bp의 뉴라미니데이즈의 생성물을 확인할 수 있었다(도 1C). 결과에서 각각의 타입에 따른 교차 반응은 확인할 수가 없었으며, 각 타입에 맞는 PCR 산물만 확인할 수 있었다.
PCR products were analyzed for influenza type by agarose electrophoresis using 1x TAE buffer. 1B and 1C, PCR products using the cDNA for each type of influenza can be identified for each type of PCR product. That is, the A / H1N1 matrix product and the 244 bp hemagglutinin H1 product are 106 bp, the A type matrix product and the 221 bp hemagglutinin H3 product of 106 bp in the case of A / H3N2, and the 130 bp By showing a single product, each type could be analyzed using PCR (FIG. 1B). In the case of A / H7N9, 97bp of hemagglutinin and 119bp of neuraminidase were confirmed, respectively (Fig. 1C). In the results, we could not confirm the cross-reaction according to each type and only the PCR product for each type could be confirmed.
실시예Example 4. 멀티플렉스 4. Multiplex PCRPCR (( MultiplexMultiplex PCRPCR ) 진단) Diagnosis
현재 시판되고 있는 인플루엔자 진단 키트들은 전통의 PCR(conventional PCR)을 이용한 것과 실시간 PCR을 이용한 것으로 제공되고 있다. 전자는 인플루엔자 A/H1, A/H3, B 타입을 진단할 수 있으며, 후자의 경우는 인플루엔자 A, B 타입 진단 키트와 인플루엔자 A/H1, A/H3, A/H5를 진단할 수 있는 것으로 구분되어 있어 다양한 타입의 인플루엔자를 진단하기 위해서 반복 검사를 해야하는 제한사항이 있었다. 따라서 본 실험에서는 다양한 인플루엔자를 한번의 진단으로 타입을 구분할 수 있는 다중진단 키트 (multiplex PCR kit)를 개발하고자 하였다. 도 1에서 확인된 프라이머를 사용하여 모든 타입의 프라이머(인플루엔자 A, A/H1, A/H3, A/H5, A/H7, A/N9, B 유전자)를 일정 비율(1:1)로 혼합하여 다중진단용 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적으로, 인플루엔자 분석대상 타입의 특이 염기서열을 포함할 수 있도록 올리고뉴클레오타이드 형태의 14종 프라이머를 제작하였는데, 각 타입별 PCR용 프라이머의 길이는 18 내지 30 염기가 되도록 하고, Tm(melting temperature) 값이 45~60℃, 그리고 각 PCR 산물의 크기는 타입별로 구분이 가능하도록 320bp 이하로 10bp 이상의 차이가 나도록 하였으며, 멀티플렉스 PCR이 가능하도록 프라이머간 간섭이 없음을 확인하였다. 상기 멀티플렉스 PCR용 프라이머는 각 타입별로 간섭이 없는 특이서열의 프라이머를 1:1의 비율로 섞어서 최종 농도 각각 5pmole/㎕가 되도록 제작하였다.Currently available influenza diagnostic kits are available using conventional PCR and real-time PCR. The former can diagnose influenza A / H1, A / H3, and B type. In the latter case, it can diagnose influenza A and B type diagnosis kit and influenza A / H1, A / H3 and A / And there was a restriction to perform repeated tests to diagnose various types of influenza. Therefore, in this experiment, we tried to develop a multiplex PCR kit that can distinguish types of influenza by one diagnosis. (1: 1) of all types of primers (influenza A, A / H1, A / H3, A / H5, A / H7, A / N9 and B genes) using the primers identified in FIG. To prepare a multiple diagnostic primer set. Specifically, 14 kinds of primers of the oligonucleotide type were prepared so as to include a specific base sequence of influenza analysis target type. The length of PCR primers for each type was set to be 18 to 30 bases, and the value of Tm (melting temperature) And the size of each PCR product was determined to be more than 10bp below 320bp in order to be able to distinguish the type of each PCR product, and it was confirmed that there was no interference between primers to enable multiplex PCR. The multiplex PCR primers were prepared so that the primers of specific sequence having no interference for each type were mixed at a ratio of 1: 1 to a final concentration of 5 pmole / μl.
본 실험에서 제공되는 인플루엔자 5 타입 7 유전자를 동시 증폭할 수 있는 멀티플렉스 PCR용 프라이머의 특징 및 이들에 의한 PCR 증폭 산물의 크기는 표 6과 같다.Table 6 shows the characteristics of the multiplex PCR primer capable of simultaneously amplifying the influenza 5 type 7 gene provided in this experiment and the size of the PCR amplification product thereof.
(%)GC
(%)
도 2에 의하면 인플루엔자 cDNA로부터 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 인플루엔자 5 타입 7 가지의 분석대상 유전자를 증폭하였다. 그 결과 각각의 타입별로 2 또는 3 종류의 PCR 산물을 동시에 증폭할 수 있도록 제작된 각각의 프라이머를 혼합하여 프라이머 세트를 제조하였다. 프라이머 세트는 인플루엔자 A 타입의 매트릭스를 증폭할 수 있고, 동시에 각각의 타입별로 H1, H3, H5, H7, N9, B를 증폭할 수 있는 특이 염기서열을 포함하도록 하였다. 각 세트에 포함된 프라이머의 농도는 각각 5 pmole/㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응물 조성은 표 4와 같으며, 상용화된 PCR 예비 혼합액 중에서 2×Sso Fast PCR Pre Mix(Bio-Rad)를 사용하였다.2, seven influenza 5 types of genes to be analyzed were amplified from influenza cDNA using a multiplex PCR method. As a result, a primer set was prepared by mixing the respective primers prepared so as to simultaneously amplify two or three kinds of PCR products for each type. The primer set was able to amplify the influenza A type of matrix and at the same time contain a specific base sequence capable of amplifying H1, H3, H5, H7, N9 and B for each type. The concentrations of the primers contained in each set were adjusted to be 5 pmole / l each. The composition of the PCR reaction mixture is shown in Table 4, and 2 x Sso Fast PCR Pre Mix (Bio-Rad) was used in the PCR primer mixture.
멀티플렉스 PCR은 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5-10초간 변성(denaturation), 50℃에서 5-10초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5-10초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 하였다. 상기 PCR 산물을 3% 아가로스겔, 1x TAE에서 전개하여 인플루엔자의 타입을 진단할 수 있도록 하였다. 그 결과 각각 인플루엔자 A/H1 타입에서는 106bp의 A 타입 진단용 PCR 산물과 244bp의 H1 타입진단용 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 또한 H3 타입을 구분할 수 있는 221bp의 산물, H5를 진단할 수 있는 320bp의 산물, H7을 진단할 수 있는 97bp, N9을 진단할 수 있는 119bp, 그리고 B 타입을 구분할 수 있는 130bp의 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 인플루엔자 A/H1, A/H3, A/H5, A/H7N9, B 타입에 대한 한 번의 PCR로 타입을 진단할 수 있는 다중 진단법을 개발하였다. 즉 기존의 타입분석용으로 사용하는 인플루엔자 타입 A, B 분석과 인플루엔자 A 타입에서 H1, H3, H5의 아형을 2회에 걸쳐 분석하던 것을 본 실험에서는 한번의 PCR로 분석할 수 있도록 멀티플렉스 PCR을 구축하였다. 기존의 2가지 또는 3 가지를 구분하던 방법에서 본 실험에서는 기존의 5 가지를 포함하여 최근 중국에서 발생한 A/H7N9을 추가하여 진단할 수 있도록 7가지를 한 번에 진단할 수 있도록 개발하였다. 본 발명은 인플루엔자에서 7가지를 동시에 한번의 PCR로 진단할 수 있는 장점을 가지고 있다.
Multiplex PCR was performed by denaturation at 95 ° C for 2 minutes, denaturation at 95 ° C for 5-10 seconds, primer annealing at 50 ° C for 5-10 seconds, extension at 72 ° C for 5-10 seconds ) Was repeated 35 times, followed by extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. The PCR product was developed on 3% agarose gel and 1x TAE to allow diagnosis of influenza type. As a result, 106bp A type diagnostic PCR product and 244bp H1 type diagnostic PCR product were confirmed in influenza A / H1 type. We also identified a product of 221 bp that can distinguish H3 type, a product of 320 bp that can diagnose H5, 97 bp that can diagnose H7, 119 bp that can diagnose N9, and 130 bp that can distinguish type B I could. As a result of the above, we developed a multiple diagnosis method which can diagnose the type of influenza A / H1, A / H3, A / H5, A / H7N9, H1, H3, and H5 subtypes were analyzed twice in influenza type A and B influenza type A and B influenza A strains, which were used for conventional type analysis. In this experiment, multiplex PCR Respectively. In this experiment, we developed seven new diagnostic methods to diagnose A / H7N9 by adding 5 existing A / H7N9 in China. The present invention has the advantage of being able to diagnose 7 kinds of influenza simultaneously by PCR.
실시예Example 5. 5. OneOne stepstep RTRT -- PCRPCR
인플루엔자는 RNA 바이러스로서 PCR 증폭을 위해서는 반드시 역전사효소 반응을 수행하여야 한다. 역전사효소 반응은 일반적으로 5분에서 60분의 시간이 소요되며, 인플루엔자와 같은 RNA로부터 진단하는데 있어서 진단시간을 연장시키는 원인이 된다. 본 실험에서는 위와 같은 RNA로부터 PCR을 수행함에 있어 역전사효소 반응과 PCR 반응을 동시에 진행함으로써 진단 시간을 단축시키고 노동력을 줄이기 위하여 시도하였다. 역전사효소 반응과 PCR 반응은 역전사효소와 DNA 중합효소와 같이 서로 다른 효소에 의하여 반응하기 때문에 효소의 선택이 매우 중요하다. 본 실험에서는 One Step RT-PCR을 수행하기 위하여 인플루엔자 RNA 추출물 1㎕를 주형으로 사용하였으며, 각 세트에 포함된 프라이머의 농도는 각각 5 pmole/㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응물 조성은 표 3과 같으며, 상용화된 cDNA 합성 키트(iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad))와 PCR premix kit (2×Sso Fast PCR pre Mix(Bio-Rad))를 섞어서 사용하였다(표 3). 이와 같은 One step RT-PCR의 조성은 cDNA 합성과 표전 유전자의 증폭에 다른 어떤 조합보다도 탁월한 최적 조건을 제공하였다. Influenza is an RNA virus, and reverse transcriptase reaction must be performed for PCR amplification. The reverse transcriptase reaction generally takes 5 to 60 minutes and causes the diagnosis time to be extended in diagnosis from RNA such as influenza. In this experiment, we tried to reduce the diagnostic time and labor by performing reverse transcriptase reaction and PCR reaction at the same time in performing PCR from the above RNA. Reverse transcriptase and PCR reactions react with different enzymes such as reverse transcriptase and DNA polymerase, so enzyme selection is very important. In this experiment, 1 μl of influenza RNA extract was used as a template to perform One Step RT-PCR, and the concentration of each primer contained in each set was 5 pmole / μl. The PCR product composition was as shown in Table 3 and was used in combination with a commercially available cDNA synthesis kit (iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)) and PCR premix kit (2 × Sso Fast PCR pre-mix (Bio-Rad) 3). The composition of this one-step RT-PCR provided superior optimization over any other combination of cDNA synthesis and amplification of the putative gene.
One Step RT-PCR의 조건은 50℃에서 5분으로 cDNA를 합성하고, 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5초간 변성(denaturation), 50℃에서 5초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 하였다. 상기 PCR 산물을 3% 아가로스겔, 1x TAE에서 전개하여 인플루엔자의 타입을 진단할 수 있도록 하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 인플루엔자 A/H1N1, A/H3N2, B 타입에 대하여 One step RT-PCR에서 표적 유전자에 대한 정확한 생성물을 확인함으로써 진단시간과 노동력을 단축할 수 있는 방법을 개발하였다.
One Step RT-PCR was performed by denaturing at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 5 seconds, annealing at 50 ° C for 5 seconds, , Extension at 72 ° C for 5 seconds was repeated 35 times, followed by extension at 72 ° C for 2 minutes. The PCR product was developed on 3% agarose gel and 1x TAE to allow diagnosis of influenza type. As shown in FIG. 3, one step RT-PCR for influenza A / H1N1, A / H3N2 and B types confirmed the exact product of the target gene, thereby shortening the diagnostic time and labor.
실시예Example 6. 6. RealReal timetime PCRPCR 키트Kit
본 실험에서 사용한 GeneChecker(도 5)라는 장비는 일반 PCR에서 사용하는 튜브타입의 반응 용기를 사용하지 않고 플라스틱 칩을 사용하였다. 플라스틱 칩은 두께가 0.2um의 두께로 튜브보다 얇아 열 전도율이 높고 소량의 용액을 사용할 수 있는 장점이 있다. GeneChecker는 한번에 8개를 반응할 수 있는 플라스틱 칩을 사용하며, 반응이 완료되면 PCR 여부를 SYBR을 통하여 육안으로 구분할 수 있도록 시창을 제작하였다. 이에 본 실험에서는 GeneChecker를 이용하여 인플루엔자의 타입을 실시간 육안으로 구분할 수 있도록 실시간 PCR 키트를 개발하였다. 도 2에서 확인한 바와 같이 인플루엔자 5가지 타입에 대하여 다중 진단 PCR로 한 번에 진단할 수 있었다. 이는 현재 인플루엔자 A, A/H1, A/H3, A/H5, A/H7, A/N9, B 타입의 7가지를 진단할 수 있는 다중진단 키트로서 각 타입을 정확하게 진단하였다. 또한 도 3에서와 같이 One step RT-PCR을 이용하여 인플루엔자 RNA로부터 각 타입을 진단할 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 다중진단 PCR을 포함하여 GeneChecker를 이용한 신속하고 실시간으로 야전에서 인플루엔자를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 하였다. GeneChecker는 8개의 샘플을 동시에 반응시킬 수 있는 것으로서 상기 진단법에서 진단한 5 타입의 인플루엔자에서 7가지를 진단할 수 있는 것을 적용하면 1개의 음성반응을 포함하여 7가지의 유전자에 대한 각각의 프라이머를 사용한다면 한번의 PCR 진단으로 인플루엔자의 타입을 구분할 수 있을 것으로 판단하였다. 따라서 멀티플렉스 PCR에 사용하였던 진단용 프라이머를 타입별로 유전자별로 각각의 칩에서 One step RT-PCR 반응을 진행하였다. 반응 조건은 50℃에서 5분으로 cDNA를 합성하고, 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 후, 95℃에서 5초간 변성(denaturation), 50℃에서 5초간 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 5초간 연장(extension) 과정을 35회 반복 후, 72℃에서 2분간 연장반응을 하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 각각의 타입에 맞는 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 또한 SYBR을 이용한 실시간 육안 진단에서도 각 타입별로 확인을 할 수가 있었다. 이와 같이 GeneChecker를 이용한 인플루엔자 진단은 역전사효소반응을 포함하여 25분 이내에 인플루엔자 RNA로부터 정확한 타입을 진단할 수 있는 키트를 개발하였다.The instrument GeneChecker (FIG. 5) used in this experiment used a plastic chip instead of a tube-type reaction vessel used in general PCR. The plastic chip has a thickness of 0.2 um and is thinner than the tube, which has a high thermal conductivity and can use a small amount of solution. GeneChecker uses a plastic chip that can react eight times at a time, and when the reaction is completed, the PCR can be visually distinguished by SYBR. In this experiment, a real-time PCR kit was developed to identify the type of influenza by visual inspection using GeneChecker. As shown in FIG. 2, diagnosis was made at one time by multiplex diagnosis PCR for five types of influenza. This is a multiple diagnostic kit that can diagnose seven types of influenza A, A / H1, A / H3, A / H5, A / As shown in Fig. 3, one type of RT-PCR was used to diagnose each type of influenza RNA. Therefore, in this experiment, we developed a kit that can diagnose influenza in field quickly and real-time using GeneChecker including multiple diagnosis PCR. GeneChecker is capable of reacting 8 samples at the same time. It can diagnose 7 kinds of 5 types of influenza diagnosed by the above-mentioned diagnosis method, and it is possible to use 7 kinds of primers for 7 genes including 1 negative reaction If the diagnosis of influenza can be made by one PCR diagnosis, Therefore, one step RT-PCR reaction was performed on each chip for each type of diagnostic primer used for multiplex PCR. The reaction conditions were as follows: cDNA was synthesized at 50 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 2 minutes, denaturation at 95 ° C for 5 seconds, primer annealing at 50 ° C for 5 seconds, The extension process was repeated 35 times, followed by extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. As a result, as shown in FIG. 4, PCR products suitable for each type were confirmed. In real-time visual inspection using SYBR, we were able to confirm each type. In this way, the GeneChecker Influenza Diagnosis kit developed a kit that can diagnose the correct type of influenza RNA within 25 minutes including reverse transcriptase reaction.
<110> The Armed Forces Medical Command <120> Primer set for rapid and exactly diagnosing influenza virus subtype, and uses thereof <130> PN13337 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaccratcct gtcacctctg ac 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agggcattyt ggacaaakcg tcta 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttgccggttt cattgaaggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccatcatcaa cttttttatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcagtaccaa acggaacgat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgctgcgtt caacaaaaag 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggaaatttca ttgctccaga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caaccatcta ccattccctg 20 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggtttagct tcggggc 17 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aaatagtgca ccgcatgttt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agcaatgaca cayactag 18 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctccattgtt mttattdccr gga 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaaaaatacg gtggattaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caggaggtct atatttggtt 20 <110> The Armed Forces Medical Command <120> Primer set for rapid and exact diagnosing influenza virus subtype, and uses thereof <130> PN13337 <160> 14 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaccratcct gtcacctctg ac 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agggcattyt ggacaaakcg tcta 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttgccggttt cattgaaggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccatcatcaa cttttttatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcagtaccaa acggaacgat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgctgcgtt caacaaaaag 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggaaatttca ttgctccaga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caaccatcta ccattccctg 20 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggtttagct tcggggc 17 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aaatagtgca ccgcatgttt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agcaatgaca cayactag 18 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctccattgtt mttattdccr gga 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaaaaatacg gtggattaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caggaggtct atatttggtt 20
Claims (12)
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 검출하는 방법.Isolating total RNA from the algae or livestock;
Amplifying the target sequence by performing RT-PCR using the separated total RNA as a template and using a primer set for detecting influenza virus according to any one of claims 1, 3, and 4; And
And detecting the amplification product. ≪ Desc / Clms Page number 19 >
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