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KR101646929B1 - 에리트로포이에틴 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

에리트로포이에틴 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR101646929B1
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Abstract

본 발명은 화학식 (Ⅰ)의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 제조방법을 제공하며, 여기서 R1, R2, R3, R4, R5, n1, n2는 명세서 내에 정의된 바와 같다. 또한, 본 발명은 화학식 (Ⅰ)의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 낮은 수준의 EPO 또는 불충분하거나 손상된 적혈구 분포에 의해 특징지워진 질환의 치료에서 화학식 (Ⅰ)의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도와, 조성물의 용도를 제공한다.
R1-R2-(CH2)n1-R3-(CH2)n2-R4-R5
(Ⅰ)

Description

에리트로포이에틴 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이의 용도{AN ERYTHROPOIETIN MIMETIC PEPTIDE DERIVATIVES AND ITS PHARMACEUTICAL SALT, THE PREPARATION AND USES THEREOF}
본 발명은 EPO 수용체에 결합하고 EPO 수용체를 활성화시키거나 또는 EPO의 작용효과를 갖는 에리트로포이에틴(EPO) 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 활성 메톡시 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 에리트로포이에틴(EPO) 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이용한 낮은 수준의 EPO 또는 불충분하거나 손상된 적혈구 분포에 의해 특징지워진 질환의 치료에 관한 것이다.
EPO는 약 34kD의 분자량을 갖는 당단백질 호르몬이다. 혈장 내 EPO는 높은 정도의 당화를 갖는 165개 아미노산으로 구성되어 있으며, 글리코실의 주요 성분은 살리신산이다. 탄수화물 함량을 기준으로, 자연적으로 발생하는 EPO는 두가지 타입, 즉 α 및 β-타입으로 나뉘며, α-타입은 34%의 탄수화물을 함유하고, β-타입은 26%의 탄수화물을 함유한다. 이러한 두 가지 타입은 동일한 생물학적 특성, 항원성(antigenicity) 및 임상적 효과를 갖는다. 인간 EPO 유전자는 길이 7 - 면적 22의 염색체에 위치해 있다. 이의 cDNA는 1985년에 성공적으로 복제되었고, 재조합 인간 EPO(rHuEPO)는 유전자 재조합 기술을 이용하여 대량생산되었으며 임상적으로 널리 사용되어 왔다. EPO는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생합성되었고(Egrie, JC,Strickland, TW, Lane, J etc. (986) Immunobiology (Immunobiol)72: 213-224), 이는 CHO 세포(chinese hamster ovary cells)로 주입되고 거기서 발현되는 복제된 인간 EPO 유전자의 산물이다. 자연적으로 발생하는 인간 EPO는 먼저 166번 위치에 있는 알기닌과 함께 166개의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드 사슬로 번역된다. 번역 후 변형에서, 166번 위치에서 알기닌은 히드록실 펩티다제를 이용하여 분해된다. 글리코실이 없는 인간 EPO의 분자량은 18236Da이다. 손상되지 않은 EPO 분자에서, 글리코실은 총분자량의 약 40%를 차지한다(J.Biol.Chem.262: 12059).
EPO는 임상에 적용된 첫번째 사이토카인이고, 단일 및 안전한 효과를 갖는 가장 잘 알려진 헤모글로빈-증가 제제이다. 이것은 신장성 빈혈(renal anemia), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 발작성 야간혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hematuria)에 대해 특정 효과를 가지고 있다. 또한, EPO의 적용은 수술에서 수혈양과 악성종양, 화학요법 및 류마티스성 관절염에 의해 야기되는 치료 빈혈을 어느 정도 감소시킬 수 있다. EPO는 주로 신세뇨관 내피세포(renal tubular endothelial cells)에 의해 발생되기 때문에, 신장 질환에 의해 야기되는 빈혈은 EPO의 첫번째 징후이며; 신장성 빈혈에 대한 EPO의 치료 효능은 거의 100%이나, EPO는 신장 기능을 개선시키지는 않는다. EPO로의 치료는 안전하고 효과적이며 장기간 치료에 적합하다; 또한, 혈액공급의 부족의 문제를 처리한다. 2006년 글로벌 바이오텍-약물 수요에 대해, EPO 재조합 약물이 119억 달러를 나타내어 거대한 시장력이 있다.
일찍이 1989년, 재조합 EPO(EPOGEN)가 신장성 빈혈 치료용으로 미국 FDA에 의해 승인받았으나, 단지 1992년부터 EPOGEN이 중국시장에 진출하였다. 중국에서 만성 신염(chronic nephritis)의 연간 질병율은 약 0.25%이나, 환자의 상당한 비율이 결국 신부전증에 걸릴 것이다. 신장성 빈혈 환자의 수는 매년 약 50만~60만명이다. 기타 암-관련 빈혈에서의 소비액과 함께 어림잡아, 국내 시장력은 약 12억~16억 이상이다(현재 가격 30~40 CNY/dose 으로 계산, 환자의 평균 체중 50㎏). 1990년대 후반부터, EPO는 중국의 주요 도시에서 가장 잘 팔리는 약물로 평가되었다. 2003년 중국 전역의 주요 도시의 샘플 병원에서 소비량은 6,213만 위안이고, 56위에 랭킹되었다. 2004년 중국 전역의 주요 도시의 샘플 병원에서 EPO의 지출비용은 전년 대비 30% 상승한 8,049만 CNY로 증가하였다.
내인성 호르몬(endogenous hormone)이 골수조혈세포(marrow hematopoietic cells)에 작용하여 혈구줄기세포(erythroid progenitor cells)의 증식, 분화 및 최종 성숙을 촉진시킴으로써, EPO는 신체의 산소상태를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 초기 배아에서, EPO는 간에 의해 생성된 다음 서서히 신장으로 이동한다. EPO는 생성 후 신세뇨관 간질세포(renal tubular interstitial cells)에 의해 주로 분비된다.
EPO에 의해 적혈구 전구세포(red progenitor cell) 분화를 유도하는 동안, 글로불린이 유도되어 철 합성 기능을 갖는 헤모글로빈을 세포에 더 보충하여 성숙된 적혈구에서 산소와 결합할 수 있다; 따라서, 적혈구와 헤모글로빈은 신체에 산소를 공급하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 과정은 EPO와 적혈구 전구세포의 표면 수용체 사이의 상호작용에 의해 야기된다.
신체가 건강한 상태이면, 조직은 이미 존재하는 적혈구로부터 충분한 산소를 얻을 수 있다. 이때, 신체의 EPO 농도는 매우 낮다. 이러한 EPO의 낮으나 정상 농도는 자극하기에 충분하여 적혈구의 생성을 촉진하며, 노화되는 동안 정상적으로 잃는다.
순환계에서 적혈구에 의해 수송된 산소 수준이 감소되고 저산소증이 나타나면, 신체에서 EPO의 양이 증가할 것이다. 신체 저산소증 상태는 과다 방사선, 고위도 또는 장기간 혼수상태에 기인한 감소된 산소 섭취량, 다양한 종류의 빈혈 등에 의해 야기될 수 있다. 신체의 저산소증 스트레스에 대한 반응으로서, 더 높은 수준의 EPO는 적혈구 전구세포의 분화를 자극하여 이의 능력을 향상시켜 적혈구를 생성할 수 있다. 신체에서 적혈구의 수가 정상 조직의 필요량을 초과하면, 순환계에서 EPO의 수준은 감소된다. 정확히 말하면, EPO가 적혈구의 형성에 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 호르몬은 적혈구의 적은 생성 및 결핍에 의해 특징지워진 혈액 질환의 치료 및 진단을 위해 매우 넓은 가능성이 있다. 최근 연구는 만성 신부전증 (CRF) 환자의 빈혈 치료에 EPO의 사용, 및 AIDS 환자에 EPO의 투여를 포함하는 다양한 질환, 장애, 및 혈액학적 이상소견(hematologic abnormality)에서 EPO의 치료 효과를 예측하고 화학요법을 받는데 근거를 제공한다(Danna, RP, Rudnick,SA,Abels,RI：edited by MB, Garnick, EPO in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker; 1990:p301-324).
EPO의 생물학적 효과의 일부는 세포막 위에서 표면 수용체의 내부 역할에 의해 조절될 수 있다. 이전에, 마우스 비장으로부터 분리된 미성숙된 적혈구를 이용하여 EPO 단백질을 세포 표면에 결합하는 연구를 하였을 때, 이 단백질이 두개의 폴리펩티드로 구성되고, 이의 분자량이 대략 85000~100000kD 임을 발견하였다(더 상세한 설명을 위해 Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84:3690-3694 참조). EPO의 결합 사이트 수 또한 계산되었다. 각 세포막은 약 800~1000 사이트를 함유한다. 이러한 결합 사이트에서, 약 300개의 결합 사이트는 90pM의 Kd 수준을 갖는다. 남아있는 결합 사이트의 결합은 약 570pM로 약하다. 몇몇 연구는, 친한 바이러스 빈혈 변종으로 감염된 마우스의 비장으로부터 적혈구의 EPO에 대한 반응으로부터 약 400개의 결합 사이트가 확인되었으며, 몇몇은 100pM의 높은 Kd 수준을 가지며, 몇몇은 800pM의 낮은 Kd 수준을 가진다는 것을 보여주었다.
이후 연구는 두 종류의 EPO 수용체가 단일 유전자에 의해 전사되는 것이다. 상기 유전자는 바로 복제된다. 예를 들어, 마우스 및 인간 EPO 수용체의 DNA 서열과 펩티드 암호화 서열이 WO90/08822에 기재되었다. 현재 모델은 EPO 수용체에 EPO의 결합이 두개의 EPO 수용체의 활성과 이량화로 되는 것을 보여준다. 또한, 이러한 이량화는 신호를 개시한다.
EPO의 복제된 유전자의 적용은 이러한 중요한 수용체의 작용제 및 길항제를 찾아내는데 도움이 된다. EPO 수용체에 어느 정도 작용할 수 있는 펩티드가 동정 및 기재되었다. 상게하게는, 주요 펩티드 단편을 함유하는 펩티드 군을 동정하였고, 이는 EPO 수용체에 결합할 수 있고 EPO 세포의 분화 및 증식을 자극할 수 있다. 그러나, EPO 세포의 분화 및 증식을 자극할 수 있는 펩티드의 EC50는 20nM~250nM로 매우 낮다. 따라서, 이러한 펩티드의 임상 적용은 매우 제한적이다. 현행 기술의 결점을 극복하기 위하여, 본 발명은 더 우수한 생물학적 활성 및 더 높은 생체이용율을 갖는 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 더 우수한 생물학적 활성 및 더 높은 생체이용율을 갖는 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 낮은 수준의 EPO 또는 불충분하거나 손상된 적혈구 분포에 의해 특징지워진 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생체 내 생물학적 활성을 갖는 화학식 (Ⅰ)의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
R1-R2-(CH2)n1-R3-(CH2)n2-R4-R5
(Ⅰ)
여기서, R1,R5는 생체 내 생물학적 활성을 갖는 EPO 모방 펩티드 단량체 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택되며; nl,n2는 독립적으로 0~10으로부터 선택된 정수이고; R2,R4는 -CO 또는 -CH2로부터 선택되며; R3는 O, S, CH2, N(CH2)n3NHR6, NCO(CH2)n4NHR6, CHOCONH(CH2)n5NHR6, CHSCON(CH2)n5NHR6 또는 CHNHCON(CH2)n5NHR6로부터 선택되고, 여기서 n3는 1~10으로부터 선택된 정수이며, n4는 2~10으로부터 선택된 정수이고, n5는 2~10으로부터 선택된 정수이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체로부터 선택된다.
바람직하게는, R1,R5는 독립적으로 생체 내 생물학적 활성을 갖는 화학식 Y1X1X2X3GX4X5TWX6X7Y2Y3의 EPO 모방 펩티드 단량체 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택되며, 여기서 각 아미노산은 하나의 표준 문자로 나타내고, R1,R5의 아미노산 서열이 일치하거나 또는 일치하지 않을 수 있으며, 더 바람직하게는 R1,R5의 아미노산 서열은 일치하고, R1,R5의 N-말단은 아세틸화되어 있다; X2,X3,X4,X5,X6,Y3는 독립적으로 20개의 유전적으로 암호화하는 L-아미노산 또는 비-자연적 아미노산 중 어느 하나로부터 선택된다; Y1,Y2는 독립적으로 20개의 유전적으로 암호화하는 L-아미노산 또는 비-자연적 아미노산 또는 이러한 아미노산에 의해 형성된 펩티드 단편으로부터 선택된다; X1,X7는 C, K, D, E, Orn 또는 Hoc로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, R1,R5는 디설파이드 결합 또는 아미드 결합에 의해 고리화된 고리형 펩티드이며; 여기서 만일 R1,R5가 디설파이드 결합에 의해 고리화된 고리형 펩티드이면, X1,X7는 독립적으로 C 또는 Hoc로부터 선택된다; 또한, 만일 R1,R5가 아미드 결합에 의해 고리화된 고리형 펩티드이면, X1,X7는 독립적으로 K, D, E 또는 Orn으로부터 선택된다.
상기 바람직한 예를 포함하는 면에서, Y3는 바람직하게는 K, H 또는 R로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 Y3는 K이다.
상기 바람직한 예를 포함하는 면에서, R1,R5의 아미노산 서열 길이는 바람직하게는 13~40개의 아미노산으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 22개의 아미노산이고, 여전히 더욱 바람직하게는 고리형 펩티드를 갖는 하기 구조이나 이에 한정되지 않고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 ~ 서열번호 8의 고리형 펩티드이나 이에 한정되지 않는다.
Figure 112010043601199-pct00001
이러한 면에서, 4개의 바람직한 구체예가 있다:
[1] n1,n2는 2이고, R2,R4는 -CO이며, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, n5는 2이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[2] n1,n2는 1이고, R2,R4는 -CO이며, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, n4는 2이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[3] n1,n2는 2이고, R2,R4는 -CH2이며, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, n5는 2이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[4] n1,n2는 1이고, R2,R4는 -CH2이며, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, n4는 2이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
상기 4개의 바람직한 구체예는 동시에 포함하지 않거나 또는 진보적인 관계이다.
상기 4개의 바람직한 구체예에서, R6는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이고, 여기서 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 분자량은 5,000 ~ 100,000 달톤이며, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 구조는 분기형 또는 선형으로부터 선택된다.
더 바람직하게는, 하기의 4개의 바람직한 구체예를 얻을 수 있다:
[1] n1,n2는 2이고, R1,R5는 서열번호 1 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이며, 여기서 n5는 2~10으로부터 선택되고, 바람직하게는 2이며; R6는 선형 구조와 20,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[2] n1,n2는 1이고, R1,R5는 서열번호 1 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이며, 여기서 n4는 2~10으로부터 선택되고, 바람직하게는 2이며; R6는 선형 구조와 20,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[3] n1,n2는 2이고, R1,R5는 서열번호 1 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, 여기서 n5는 2~10으로부터 선택되고, 바람직하게는 2이며; R6는 분기형 구조와 40,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
[4] n1,n2는 1이고, R1,R5는 서열번호 1 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, 여기서 n4는 2~10으로부터 선택되고, 바람직하게는 2이며; R6는 분기형 구조와 40,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이다.
가장 바람직하게는, EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 구조식으로부터 선택된다:
Figure 112010043601199-pct00002
Figure 112010043601199-pct00003
Figure 112010043601199-pct00004
Figure 112010043601199-pct00005
여기에 제공된 EPO 모방 펩티드 유도체는 양쪽성 화합물로, 기술분야에서 당업자에 의해 통상적으로 공지된 기술을 통해 산성 또는 알칼리성 화합물과 반응하여 염을 형성할 수 있다. 통상적으로 사용된 산은 염산, 브롬산, 요오드화수소산 (hydroiodic acid), 황산, 인산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐 설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산으로부터 선택되며; 설페이트, 피로포스페이트, 트리플루테이트(triflutate), 설파이트(sulfite), 바이설파이트(bisulfite), 포스페이트, 바이포스페이트, 디히드릭포스페이트, 메타포스테이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 에난테이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트(suberate), 푸마레이트, 말레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로린 벤조에이트, 메틸 벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 페닐아세테이트, 펜프로피오네이트(phenpropionate), 페닐부틸레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로필설포네이트, 나프탈린-1-설포네이트(naphtalin-1-sulfonate), 나프탈린-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함하는 염, 바람직하게는 트리플루테이트를 형성한다.
또한, 알칼리성 물질은 EPO 모방 펩티드 유도체와 반응하여 염을 생성할 수 있다. 이러한 알칼리성 물질은 암모늄, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물, 카보네이트, 바이카보네이트로부터 선택되고, 일반적으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공한다:
(1) 유전공학 또는 화학적 합성 방법을 통해 R1H, R5H를 제조하는 단계(R1 및 R5는 생물학적 기능을 갖는 EPO의 모방 펩티드 단량체 펩티드 및 이의 유사체이다);
(2) 화학식 (Ⅱ)의 기능적 소분자를 제조하는 단계;
R7-CO-(CH2)n1-Z2-(CH2)n2-CO-R8
(Ⅱ)
여기서, n1,n2은 독립적으로 0~10으로부터 선택된 정수이고;
R7,R8은 OH 또는 H로부터 선택되며;
Z2는 O, S, CH2, N(CH2)n6NHR9, NCO(CH2)n7NHR9, CHOCONH(CH2)n8NHR9, CHSCON(CH2)n8NHR9 또는 CHNHCON(CH2)n8NHR9로부터 선택되고, 여기서 n6은 1~10으로부터 선택된 정수이며, n7은 2~10으로부터 선택된 정수이고, n8은 2~10으로부터 선택된 정수이며, R9는 Boc 또는 Cbz로부터 선택된다,
(3) R1H,R5H와 화학식 (Ⅱ)의 기능적 소분자를 반응시켜 화학식 (Ⅲ)의 화합물을 제조하는 단계;
R1-R2-(CH2)n1-Z2-(CH2)n2-R4-R5
(Ⅲ)
여기서, R2,R4는 독립적으로 -CO 또는 -CH2로부터 선택된다,
(4) Boc 또는 Cbz를 제거한 후, 공유결합을 통해 활성 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 결합하는 단계.
또한, 본 발명은
(1) 치료적 유효량의 상기 화학식 (Ⅰ)의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
(2) 약학적으로 허용가능한 약물 담체를 포함하는, 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 이용한 낮은 수준의 EPO 또는 불충분하거나 손상된 적혈구 군에 의해 특징지워진 질환, 특히 하기 질환의 치료를 위한 약물의 용도를 제공한다: 진보적 신부전증 또는 투석; AIDS-관련 빈혈, 자가면역 질환 또는 악성 종양; 낭성섬유증(cystic fibrosis); 초기 미성숙 빈혈; 만성 염증 질환-관련 빈혈; 척수외상(spinal cord injury); 급성 실혈(acute blood loss); 노화 및 적혈구를 비정상적으로 생성하는 암.
본 발명에서 제공된 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 마우스 말초 혈구 및 망상적혈구 수의 증가를 유의하게 촉진시킬 수 있으며, 이는 이들이 적혈구 생성(erythropoiesis)을 자극한다는 것을 나타낸다; 또한 동시에 이들은 신체에서 결합체의 반감기를 크게 늘릴 수 있다. EPO 모방 펩티드 유도체 및 EPO 단백질은 성숙 적혈구, 적혈구 용적율, 헤모글로빈 함량에 유의한 영향을 미치지 않고, 말초 백혈구 수에도 영향을 미치지 않는다.
EPO 모방 펩티드 단량체는 고체상 합성을 이용하여 합성된다. 이의 기본 원리로는, 먼저 불용성 고분자 수지로 합성된 펩티드 사슬의 히드록실-말단 아미노산의 히드록실을 공유결합으로 결합한다. 그 다음, 고체상 담체에 부착된 아미노산을 아미노 성분으로 사용하여 아미노 보호기를 제거하고 과량의 활성 카복실 성분과 반응하여 폴리펩티드 사슬을 확장한다. 이러한 공정(축합 -> 세척 -> 탈보호 -> 세척 -> 다음 회전의 축합)을 되풀이하여 원하는 합성 펩티드 사슬 길이를 얻는다. 마지막으로, 수지로부터 펩티드 사슬을 제거한다. 정제 처리 후, 원하는 펩티드를 생성한다. 축합 및 탈보호의 반응 단계의 중간 제어는 닌히드린 검출 방법을 이용한다. 즉, 수지 펩티드 사슬이 자유 아미노기를 가지면, 닌히드린 시약으로 염색 후 푸른색이 나타날 것이다. 만일 자유 아미노기가 없으면, 발색 반응이 나타나지 않을 것이다(닌히드린 시약 자체는 노란색). 따라서, 축합반응을 수행하고 닌히드린으로 검출한 후, 만일 노란색이 나타나면(닌히드린 시약 자체의 색), 이것은 이 결합 단계가 완결되고 다음 아미노산의 결합 전에 탈보호 공정을 수행할 수 있다는 것을 의미한다. 만일 푸른색이 나타나면, 펩티드 사슬에 약간의 자유 아미노기가 여전히 있다는 것을 의미한다. 수지-펩티드가 닌히드린으로 검출 후 노란색을 나타낼 때까지 반복된 발색반응 또는 현 축합 시약의 변형이 더 필요하다.
단량체 펩티드의 고리화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 디설파이드 결합의 고리화는 산화제에 의해 주로 단량체 펩티드의 아미노산의 측쇄 내 설프히드릴을 디설파이드 결합으로의 산화를 통해서 이루어진다. 상세하게는, 단량체 펩티드를 DMSO 용액 또는 5% 아민 바이카보네이트 용액에 넣고 자동 산화하거나, 또는 I2를 함유한 아세트산 용액에 가하여 산화하며, 바람직하게는 I2를 함유한 아세트산 용액에 가하여 산화하는 것이다. 아미드 결합의 고리화는 주로 축합 시약 존재 하에 단량체 펩티드의 아미노 측쇄의 카복실기와 아미노기 사이의 아미드 결합의 형성을 통해 이루어진다. 첨가된 축합 시약은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 DIC, EDC, HATU, Pybop 등을 포함한다.
이량체 펩티드는 주로 EPO 모방 펩티드 단량체의 아미노산 잔기의 측쇄의 아미노기와 기능적 소분자 사이의 -NH-CH2- 결합 또는 -NH-CO- 결합의 형성을 통해 합성된다. 기술분야에서 당업자는 기능적 소분자를 합성하고, 이것을 공지된 기술을 통해 단량체 펩티드 고리형 펩티드와 용이하게 결합할 수 있다.
이량체 펩티드 및 활성 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 유도된다. 반응계는 유기용매 또는 이용할 수 있는 완충계로부터 선택될 수 있다. 이량체 펩티드의 PEG화 반응이 유기용매에서 수행될 때, 알칼리를 적당량 첨가할 수 있으며, 상기 알칼리는 트리에틸아민, 디이소프로필 에틸아민, 피리딘, 2,4,6-트리메틸 피리딘을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 유도 반응이 완충계에서 수행될 때, 완충계는 다양한 공지된 이용할 수 있는 완충액으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 pH 7.7 인산염 완충액이다.
본 발명에 의해 제공된 EPO 또는 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 생물학적 활성은 이 기술분야에서 알려진 다양한 분석법으로 측정될 수 있다. 생체 내 활성 시험은 하기와 같이 수행된다: 본 발명에 의해 제공된 EPO, 및 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 마우스에 3일 연속 피하주사하고, 마우스를 희생시킨다. 전혈(whole blood)을 취하여 말초 혈구 및 망상적혈구 수를 얻는다. 혈구 수는 자동 혈구 분석기로 수행하여 얻는다. 마카크(Macaques)에 1.35㎎/㎏의 복용량으로 정맥투여하여 약력학 연구 (pharmacodynamic study)를 수행한다. 대조 약물로서 EPO 단백질의 복용량은 240㎍/㎏이다. 약물을 일주일에 3번씩 투여하고 6주 동안 계속한다. 혈액 시료를 모아 관련 혈액 지표 분석을 수행한다.
본 발명에 사용된 약자의 요약
Figure 112010043601199-pct00006
도 1은 EPO 모방 펩티드 유도체(HH-EPO-018)가 마카크 적혈구 용적율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 EPO 모방 펩티드 유도체(HH-EPO-018)가 마카크 헤모글로빈에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
본 발명의 더 상세한 설명을 위해, 하기 실시예를 제시한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않는다.
실시예 1 : EPO 모방 펩티드 단량체 펩티드의 합성
EPO 모방 펩티드 단량체 펩티드의 합성은 고체-상 펩티드 합성 방법으로 수행하였다. 이 펩티드 합성 방법은 많은 문헌에 보고되었다[stewart, J.M., and Young, J.D., solid phase peptide synthesis 2nd edition, novabiochem peptide synthesis notes]. 본 발명에 의해 제공된 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드는 설명서 합성 방법으로 수행되었다. 수지는 링크 아민드 수지(rink amind resin)이다. 아미노산 유도체의 α-아미노기는 Fmoc(플루오렌-포밀 카보닐)로 보호되었다. 시스테인 측쇄의 티올기, 글루타민 측쇄의 아미노기, 및 히스티딘 측쇄의 이미다졸기는 Trt(트리틸)로 보호되었다. 알기닌 측쇄의 구아니딘기는 Pbf(2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-설포닐)로 보호되었다. 트립토판 측쇄의 인돌기, 리신 측쇄의 아미노기는 Boc(tert-부톡시카보닐)로 보호되었다. 트레오닌 측쇄의 히드록실기, 티로신 측쇄의 페놀기, 및 세린 측쇄의 히드록실기는 tBu(tert-부틸)로 보호되었다. 합성된 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드의 펩티드 사슬의 C-말단의 카복실기를 불용성 수지(링크 아민드 수지)에 공유결합으로 부착하였다. 그 다음 고체상 담체에 부착된 아미노산을 아미노 성분으로 사용하여 20% 피페리딘/DMF 용액으로 아미노 보호기를 제거하고 과량의 아미노산 유도체와 반응시켜 폴리펩티드 사슬을 확장하였다. 이러한 공정(축합 -> 세척 -> 탈보호 -> 세척 -> 다음 회전의 축합)을 되풀이하여 원하는 합성 펩티드 사슬 길이를 얻었다. 마지막으로, 트리플루오로아세트산, 물, 에틸렌 머캅탄, 3-이소프로필 실란의 혼합 용액(92.5: 2.5: 2.5: 2.5)을 사용하여 수지로부터 펩티드 사슬을 제거하였다. 에테르로 침전시킨 후, 정제하지 않은 EPO 모방 펩티드 유도체의 단량체 펩티드를 얻었다. 정제하지 않은 단량체 펩티드를 C18 역상 분취 컬럼으로 분리 및 정제하여, EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드를 얻었다. 축합 및 탈보호의 반응 단계의 중간 제어는 닌히드린 검출 방법을 이용하였다. 즉, 수지 펩티드 사슬이 자유 아미노기를 가지면, 닌히드린 시약으로 염색 후 푸른색이 나타날 것이다. 만일 자유 아미노기가 없으면, 발색 반응이 나타나지 않을 것이다(닌히드린 시약 자체는 노란색). 따라서, 축합반응을 수행하고 닌히드린으로 검출한 후, 만일 노란색이 나타나면(닌히드린 시약 자체의 색), 이것은 이 결합 단계가 완결되고 다음 아미노산의 결합 전에 탈보호 공정을 수행할 수 있다는 것을 의미한다. 만일 푸른색이 나타나면, 펩티드 사슬에 약간의 자유 아미노기가 여전히 있다는 것을 의미한다. 수지-펩티드가 닌히드린으로 검출 후 노란색을 나타낼 때까지 반복된 발색반응 또는 현 축합 시약의 변형이 더 필요하다.
실시예 2 : 기능적 소분자의 제조(LG-1)
Figure 112010043601199-pct00007
단계 1: LG-1-A의 제조
이미노디아세트산 디에틸 에스터(10.0g, 52.8mmol), Boc-β-알라닌(10.0g, 52.8mmol)을 100㎖의 디클로로메탄에 녹이고, DIC(8.0㎖, 52.8mmol)를 가한 다음 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 반응용액을 여과하고, 여과액을 100㎖의 포화 NaHCO3 용액, 50㎖의 0.5N HCl 용액, 100㎖의 포화 소금물로 차례로 세척하고, 유기층을 분리한 다음 무수 MgSO4로 건조하였다. 유기층을 여과하고 농축하여 무색의 오일 물질인 액체 LG-1-A 17g을 얻었다.
단계 2: LG-1-B의 제조
17g의 LG-1-A를 100㎖의 MeOH:THF = 1:1 혼합용매에 녹인 다음, 25㎖의 물과 5g의 NaOH(125mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 6N HCl 용액으로 pH를 1로 맞추었다. 반응용액을 에틸 아세테이트로 4번 추출하였다. 유기층을 소금물로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압 하에서 농축시켜 흰색의 반-고체를 얻었다. 생성물을 50㎖의 디클로로메탄에 녹이고, 300㎖의 n-헥산을 가하였다. 상기 용액은 흰색 페이스트이다. 감압 하에서 농축시키고 흰색 고체 LG-1-B 14g을 얻었다(수율: 90%).
단계 3: LG-1-C의 제조
7g의 LG-1-B(23mmol)를 80㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 교반하면서 4.6g의 N,N-메톡시-메틸-아민 히드로클로라이드(46mmol)와 5.1g의 트리에틸아민 (51mmol)을 가한 다음, 4.4g의 DIC(32mmol), 4.7g의 HOBT(32mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 다음날, 반응용액을 물에 가하고 350㎖의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 200㎖의 2N HCl 수용액, 200㎖의 포화 중탄산나트륨 용액, 100㎖의 포화 소금물로 차례로 세척하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산마그네슘으로 2시간 동안 건조한 다음 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키면 오일 물질이 된다. 컬럼 크로마토그래피 후, 표적 생성물 LG-1-C 4.2g을 얻었다(수율: 70%).
단계 4: LG-1의 제조
4.0g의 LG-1-C(10.2mmol)를 60㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 얼음욕조에서 0℃로 냉각시킨 다음, LiAlH4(340㎎, 8.9mmol)을 가하였다. 0℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 4㎖의 물, 4㎖의 15% NaOH 용액을 차례로 가하였다. 반응용액을 여과하고, 여과액을 테트라히드로퓨란으로 세척하였다. 유기층을 건조하여 농축시킨 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, LG-1 1.63g(6mmol)을 얻었다(수율: 58.8%).
실시예 3 : 기능적 소분자의 제조(LG-2)
Figure 112010043601199-pct00008
4g의 LG-1-B(13mmol)를 100㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 히드록시석신이미드(3.1g, 21mmol), DIC(4㎖, 26mmol) 및 DMAP(4-디메틸아미노피리딘) (12㎎, 0.08mmol)을 가하였다. 반응용액을 밤새도록 교반한 후, 반응용액을 감압 하에서 농축하였다. 잔류물을 80㎖의 에틸 아세테이트에 녹이고, 불용성 물질을 여과하여 제거하였다. 유기층을 40㎖의 포화 중탄산나트륨 용액, 40㎖의 포화 소금물, 40㎖의 0.5N HCl 용액, 40㎖의 포화 소금물로 차례로 한번씩 세척하고, 유기층을 분리한 다음 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 유기층을 여과하고 감압 하에서 농축하여 흰색 고체 LG-2 4.4g을 얻었다(수율: 약 68%).
실시예 4 : 기능적 소분자의 제조(LG-3)
Figure 112010043601199-pct00009
단계 1: LG-3-A의 제조
7.0g의 펜탄온 팔미트산(0.04mol)을 100㎖의 메탄올에 녹이고, 교반하면서 5% CsCO3 메탄올 용액을 가하고 반응용액의 pH를 8.5로 하였다(정확한 pH 시험종이로 평가). 첨가를 완료한 후, 30분 동안 교반하였다. 반응용액을 여과하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 오일 물질을 얻었다. 오일 물질을 100㎖의 DMSO에 녹이고 60℃로 승온시킨 다음, 14g(0.08mol)의 벤질 브로마이드를 가하였다. 8시간 동안 반응시킨 후, 반응용액을 여과하고, 소량의 에테르로 고체를 세척하였다. 400㎖의 에테르를 모액에 가하고, 200㎖의 포화 소금물로 세척하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산마그네슘으로 2시간 동안 건조하고 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축하여 원래 부피의 1/5로 하고, -20℃ 냉동고에 넣어 밤새도록 결정화하였다. 다음날, 고체를 여과하고 건조하여 흰색 고체 LG-3-A 10.5g을 얻었다(수율: 74%).
단계 2: LG-3-B의 제조
2g의 LG-3-A(0.0056mol)를 20㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 반응용액의 온도를 -10℃ 이하로 유지하면서 교반하고, 626㎎의 NaBH4(0.0168mol)를 가하였다. 1시간 동안 반응시킨 후, 200㎖의 냉각된 에테르를 가하고 150㎖의 포화 중탄산나트륨 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 포화 소금물로 한번 세척한 다음, 무수 Na2SO4로 2시간 동안 건조시키고 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고 LG-3-B 1.9g을 얻었다(수율: 94.6%).
단계 3: LG-3-C의 제조
3.2g의 LG-3-B(0.009mol)를 50㎖의 디클로로메탄에 녹이고, 교반하면서 0℃ 이하에서 4.34g의 트리에틸아민(0.043mol)을 가하였다. 1.33g(0.0045mol)의 트리포스젠을 25㎖의 디클로로메탄에 녹인 다음, 상기 용액에 한방울씩 가하였다. 1시간 후에 2.8g의 tert-부톡시카보닐-에틸렌디아민을 가하였다. 3시간 동안 반응시킨 후, 빙초산으로 반응 혼합물을 중성으로 맞추어 침전물을 생성하였다. 침전물을 여과하여 버리고, 여과액을 감압 하에서 농축시킨 다음 에테르에 녹였다. 그 다음, 물로 3번 세척하고, 포화 소금물로 한번 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산마그네슘으로 2시간 동안 건조시킨 다음 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키면 오일로 된다. 오일 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 10:1)로 정제하였다. 표적 생성물을 모으고, 농축하여 흰색 고체 LG-3-C 1.5g을 얻었다(수율: 38.8%).
단계 4: LG-3-D의 제조
13g의 LG-3-C(0.031mol)를 8㎖의 메탄올에 녹이고, 교반하면서 약 200㎎의 10% Pd-C를 가하였다. 대기압, H2 하에서 4시간 동안 반응시킨 후, 활성 탄소를 여과하여 버리고, 여과액을 농축하여 오일 물질 LG-3-D 8.28g을 얻었다(수율: 96.7%).
단계 5: LG-3의 제조
5g의 LG-3-D(0.018mol)를 10㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 교반하면서 4.7g의 p-니트로페놀(0.043mol)과 4.2g(0.043mol)의 DIC 용액을 가하고, 밤새도록 교반하였다. 다음 날, 침전물을 여과하여 제거하고, 여과 케이크를 소량의 에틸 아세테이트로 세척하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물에 100㎖의 에틸 아세테이트를 가하여 녹이고, 50㎖의 포화 소금물로 한번 세척하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산마그네슘으로 2시간 동안 건조시킨 다음, 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축하여 오일 물질을 얻었다. 오일 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액: 헥산/에틸 아세테이트 = 20/1 ~ 10/1)로 정제하였다. 표적 생성물을 모으고, 감압 하에서 농축하고 건조하여 흰색 고체 LG-3 3.5g을 얻었다(수율: 32%).
실시예 5 : 기능적 소분자의 제조(LG-4)
Figure 112010043601199-pct00010
단계 1: LG-4-A의 제조
5g의 LG-3-D(0.018mol)를 60㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 교반하면서 3.51g의 N,N-메톡시-메틸-아민 히드로클로라이드(0.036mol)와 4.0g의 트리에틸아민 (0.04mol)을 가하였다. 그 다음 3.4g의 DIC(0.027mol)와 3.65g의 HOBT(0.027mol)을 가하고 실온에서 밤새도록 교반하였다. 다음 날, 반응용액을 200㎖의 물에 가하고, 200㎖의 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 유기층을 모으고, 50㎖의 2N HCl 용액, 100㎖의 포화 NaHCO3 용액, 100㎖의 포화 소금물로 차례로 한번씩 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산마그네슘으로 2시간 동안 건조시킨 다음, 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축하여 오일 물질을 얻었다. 오일 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출액: 헥산/에틸 아세테이트 = 10/1)로 정제하였다. 표적 생성물을 모으고, 감압 하에서 농축하여 흰색 고체 LG-4-A 6.24g을 얻었다(수율: 80%).
단계 2: LG-4의 제조
4.0g의 LG-4-A(9mmol)를 50㎖의 테트라히드로퓨란에 녹이고, 실온에서 300㎎의 LiAlH4(7.9mmol)를 가하고 얼음욕조에서 0℃ 이하로 냉각시키고, 0℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.3㎖의 물, 0.9㎖의 15% NaOH 용액, 0.3㎖의 물을 차례로 가하여 침전물을 생성하였다. 침전물을 여과하여 제거하고, 여과 케이크를 테트라히드로퓨란으로 한번 세척하였다. 여과액을 모으고 감압 하에서 농축시켜 건조하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 LG-4 1.65g을 얻었다(수율: 55.5%).
실시예 6 : HH-EPO-005의 제조
Figure 112010043601199-pct00011
단계 1: 고리형 펩티드(서열번호 5)의 제조
9g의 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드(서열번호 5, 실시예의 방법으로 합성)를 3000㎖의 20% 빙초산에 녹인 다음, 노란색이 사라지지 않을 때까지 5% 요오드 메탄올 용액을 천천히 한방울씩 가하였다. 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 3.0g의 고리형 펩티드(서열번호 5)를 제조하였다(수율: 15.6%).
단계 2: HH-EPO-005의 제조
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 5)를 150㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 147㎎(1.46mmol), 368㎎의 기능적 소분자(LG-3) (0.61mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드를 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 그 다음, 흰색 고체를 50㎖의 20% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다.흰색 고체를 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-005 1.0g을 제조하였다(수율: 약 33%).
실시예 7 : HH-EPO-006의 제조
Figure 112010043601199-pct00012
단계 1: 고리형 펩티드(서열번호 6)의 제조
9g의 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드(서열번호 6, 실시예의 방법으로 합성)를 3000㎖의 20% 빙초산에 녹인 다음, 노란색이 사라지지 않을 때까지 5% 요오드 메탄올 용액을 천천히 한방울씩 가하였다. 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 3.0g의 고리형 펩티드(서열번호 6)를 제조하였다(수율: 15.3%).
단계 2: HH-EPO-006의 제조
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 6)를 150㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 147㎎(1.46mmol), 368㎎의 기능적 소분자(LG-3) (0.61mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드를 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 그 다음, 흰색 고체를 50㎖의 20% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 흰색 고체를 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-006 3.98g을 제조하였다(수율: 약 32.7%).
실시예 8 : HH-EPO-007의 제조
Figure 112010043601199-pct00013
단계 1: 고리형 펩티드(서열번호 7)의 제조
9g의 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드(서열번호 7, 실시예의 방법으로 합성)를 3000㎖의 20% 빙초산에 녹인 다음, 노란색이 사라지지 않을 때까지 5% 요오드 메탄올 용액을 천천히 한방울씩 가하였다. 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 3.15g의 고리형 펩티드(서열번호 7)를 제조하였다(수율: 16.4%).
단계 2: HH-EPO-007의 제조
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 7)를 150㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 147㎎(1.46mmol), 368㎎의 기능적 소분자(LG-3) (0.61mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드를 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 그 다음, 흰색 고체를 50㎖의 20% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 흰색 고체를 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-007 3.98g을 제조하였다(수율: 약 33%).
실시예 9 : HH-EPO-008의 제조
Figure 112010043601199-pct00014
단계 1: 고리형 펩티드(서열번호 8)의 제조
27g의 EPO 모방 펩티드 유도체 단량체 펩티드(서열번호 8, 실시예의 방법으로 합성)를 3000㎖의 20% 빙초산에 녹인 다음, 노란색이 사라지지 않을 때까지 5% 요오드 메탄올 용액을 천천히 한방울씩 가하였다. 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 9.3g의 고리형 펩티드(서열번호 8)를 제조하였다(수율: 15.7%).
단계 2: HH-EPO-008의 제조
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 8)를 150㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 147㎎(1.46mmol), 368㎎의 기능적 소분자(LG-3) (0.61mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드를 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 그 다음, 흰색 고체를 50㎖의 20% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 흰색 고체를 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-008 1.12g을 제조하였다(수율: 약 33%).
실시예 10 : HH-EPO-008A의 제조
Figure 112010043601199-pct00015
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 8)를 150㎖의 아세트산 완충액 (20mmol, pH 5.0)에 녹인 다음, 201㎎의 기능적 소분자(LG-4) (0.61mmol)와 10㎖의 아세토니트릴을 가하였다. 반응용액을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-008A 0.75g을 제조하였다(수율: 25%).
실시예 11 : HH-EPO-008B의 제조
Figure 112010043601199-pct00016
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 8)를 150㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 147㎎(1.46mmol), 322㎎의 기능적 소분자(LG-2) (0.61mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, N,N-디메틸포름아미드를 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 그 다음, 흰색 고체를 50㎖의 20% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용매를 감압 하에서 농축하였다. 200㎖의 에테르를 잔류물에 가하고 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다. 흰색 고체를 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-008B 1.3g을 제조하였다(수율: 약 43%).
실시예 12 : HH-EPO-008C의 제조
Figure 112010043601199-pct00017
3.0g(1.22mmol)의 고리형 펩티드(서열번호 8)를 150㎖의 아세트산 완충액 (20mmol, pH 5.0)에 녹인 다음, 165㎎의 기능적 소분자(LG-1) (0.61mmol)와 10㎖의 아세토니트릴을 가하였다. 반응용액을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 반응용액을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 분취 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-008C 0.8g을 제조하였다(수율: 27%).
실시예 13 : HH-EPO-018의 제조
Figure 112010043601199-pct00018
0.5g의 HH-EPO-008(0.98mmol)를 100㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 39.6㎎(0.196mmol), 3.8g의 mPEG2-OSU(40K)(0.96mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 600㎖의 차가운 에테르에 넣고 고체를 침전시켰다. 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 정제하지 않은 HH-EPO-018을 얻었다. 정제하지 않은 HH-EPO-018을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-018 1.8g을 제조하였다(수율: 약 47%).
실시예 14 : HH-EPO-018A의 제조
Figure 112010043601199-pct00019
0.5g의 HH-EPO-008(0.9mmol)를 100㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 39.6㎎(0.196mmol), 3.8g의 mPEG2-OSU(40K)(0.96mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 600㎖의 차가운 에테르에 넣고 고체를 침전시켰다. 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 정제하지 않은 HH-EPO-018을 얻었다. 정제하지 않은 HH-EPO-018을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴 (0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-018A 1.5g을 제조하였다(수율: 약 39%).
실시예 15 : HH-EPO-018B의 제조
Figure 112010043601199-pct00020
0.5g의 HH-EPO-008(0.9mmol)를 100㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 39.6㎎(0.196mmol), 3.8g의 mPEG2-OSU(40K)(0.96mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 600㎖의 차가운 에테르에 넣고 고체를 침전시켰다. 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 정제하지 않은 HH-EPO-018을 얻었다. 정제하지 않은 HH-EPO-018을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴 (0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-018B 1.7g을 제조하였다(수율: 약 45%).
실시예 16 : HH-EPO-018C의 제조
Figure 112010043601199-pct00021
0.5g의 HH-EPO-008(0.9mmol)를 100㎖의 N,N-디메틸포름아미드에 녹이고, 트리에틸아민 39.6㎎(0.196mmol), 3.8g의 mPEG2-OSU(40K)(0.96mmol)를 가하였다. 반응용액을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 600㎖의 차가운 에테르에 넣고 고체를 침전시켰다. 2시간 동안 냉장고에 넣은 다음 원심분리하고 진공 건조하여 정제하지 않은 HH-EPO-018을 얻었다. 정제하지 않은 HH-EPO-018을 컬럼 충전제로 옥타데실 실란이 결합된 실리카겔(Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5㎛, 4.6*100㎜)을 이용하여 역상 크로마토그래피로 정제하였으며, 여기서 컬럼 온도는 60℃, 검출 파장은 214㎚이었고; 다른 비율의 물(0.05% 트리플루오로아세트산 함유)과 아세토니트릴 (0.05% 트리플루오로아세트산 함유)을 이동상으로 사용하였다. 표적 분획을 모으고, 대부분의 아세토니트릴을 감압 하에 증류하여 제거한 후, 동결건조하여 HH-EPO-018C 1.4g을 제조하였다(수율: 약 37%).
실시예 17 : EPO 모방 펩티드 유도체가 마우스의 적혈구 생성에 미치는 영향
실험 목적:
EPO 모방 펩티드 유도체 및 EPO 단백질이 마우스의 적혈구 생성에 미치는 영향을 평가 및 비교하기 위한 것이다.
재료 및 방법:
HH-EPO-001, HH-EPO-002, HH-EPO-003, HH-EPO-004, HH-EPO-005, HH-EPO-006, HH-EPO-007, HH-EPO-008, HH-EPO-015, HH-EPO-016, HH-EPO-017 및 HH-EPO-018을 포함하는 EPO 모방 펩티드 유도체는 지앙수 한소 제약회사에 의해 제공받았다. EPO는 심양 산셍 제약회사로부터 구입하였다. 25~30g의 암컷 군밍 마우스(Kunming mice)는 중국 과학원 상하이 실험 동물 센터로부터 구입하였다. 각 군의 동물수는 10마리이다.
EPO 모방 펩티드 유도체 및 EPO 단백질을 마우스에 3일 연속 피하주사하였다. 그 다음, 마우스를 희생시키고, 전혈을 취하여 말초 혈구 및 망상적혈구 수를 자동 혈구 분석기로 수행하여 얻었다.
결과 및 토의:
현 투여방법에 따르면, EPO 모방 펩티드 유도체 및 EPO 단백질은 마우스 말초 혈액 망상적혈구 수의 증가를 유의하게 촉진시킬 수 있으며, 이는 이들이 적혈구 생성을 자극한다는 것을 나타낸다(표 1 참조). EPO 모방 펩티드 유도체 및 EPO 단백질은 성숙 적혈구, 적혈구 용적율, 헤모글로빈 함량에 중요한 영향을 미치지 않고(표 2 참조), 말초 백혈구 수에도 영향을 미치지 않는다(표 3 참조).
[표 1]
EPO 모방 펩티드 유도체가 마우스 망상적혈구 생성에 미치는 영향
Figure 112010043601199-pct00022
[표 2]
EPO 모방 펩티드 유도체가 마우스 적혈구 생성, 적혈구 용적율, 헤모글로빈 함량에 미치는 영향
Figure 112010043601199-pct00023
[표 3]
EPO 모방 펩티드 유도체가 마우스 혈소판, 백혈구 생성에 미치는 영향
Figure 112010043601199-pct00024

실시예 18 : EPO 모방 펩티드 유도체가 마카크의 적혈구 생성에 미치는 영향
실험 목적:
EPO 모방 펩티드 유도체가 마카크의 적혈구 생성에 미치는 영향을 평가하기 위한 것이다.
재료 및 방법:
EPO 모방 펩티드 유도체 HH-EPO-018은 지앙수 한소 제약회사에 의해 제공받았다. EPO는 심양 산셍 제약회사로부터 구입하였다. 이들 물질은 사용하기 전에 0.1% BSA를 함유한 소금물로 희석하였다. 5.5~8.5㎏의 자웅 마카크는 수쪼우 시산 쫑케 실험 동물 센터(Suzhou Xishan Zhongke Laboratory Animal Center)로부터 구입하였다. 마카크는 헤모글로빈을 기준으로 각 군당 3마리씩 나누었다. HH-EPO-018 1.35㎎/㎏은 일주일에 한번 정맥주사하였고; EPO 240㎍/㎏는 일주일에 3번 정맥주사하였다. 일주일에 1~2번 혈액 지표를 측정하였다.
결과 및 토의:
HH-EPO-018를 마카크에 단회 정맥주사하여 말초 혈액 헤모글로빈 함량을 증가시키고 적혈구 용적율을 증가시켰는데, 이는 HH-EPO-018이 적혈구 생성을 자극한다는 것을 나타낸다. 투여 후 35일째에 자극이 최고였고, 그 다음 서서히 감소하였다. 헤모글로빈의 촉진 효과는 약 33%이었다. 양성대조군으로서 EPO 또한 마카크에서 말초 혈액 헤모글로빈 함량 및 적혈구 용적율의 동일한 증가를 나타내었으며, 이의 효과는 약물 투여를 중지한 후 서서히 감소하였다. 현 투여방법에 따르면, 마카크에 대한 HH-EPO-018 및 EPO의 자극은 중요하다(도 1, 2 참조).
실시예 19 : EPO 모방 펩티드 유도체 HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B와 양성대조군 AF37702가 마우스의 적혈구 생성에 미치는 영향을 평가 및 비교
재료 및 방법:
HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702는 지앙수 한소 제약회사에 의해 제공받았으며, AF37702는 아피맥스(Affymax)사에 의해 생산된 EPO 모방 펩티드 유도체이다(상품명: 헤마티드(Hematide)). 이들 물질은 사용하기 전에 0.1% BSA를 함유한 소금물로 희석하였다. 25~30g의 암컷 군밍 마우스는 중국 과학원 상하이 실험 동물 센터로부터 구입하였다. 각 군의 동물수는 10마리이다. 적응 후, 동물에 HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702를 피하주사하였다. 첫번째 투여 후 6일째에 마우스를 희생시키고, 전혈을 취하여 말초 혈구 및 망상적혈구 수를 ADVIA 자동 혈구 분석기로 수행하여 얻었다.
결과 및 토의:
HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702 모두 한번의 피하 주사로 마우스 말초 혈액 망상적혈구 비율과 수를 유의하게 증가시켰으며; HH-EPO-018B의 효과가 상대적으로 강하였고; HH-EPO-018 및 AF37702의 효과는 그 다음이고; HH-EPO-015의 효과가 가장 약하였으며; HH-EPO-018 및 AF37702의 효과는 대략 동등하였다(표 4 참조). HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702는 마우스 말초 혈액 적혈구 용적율과 헤모글로빈 함량을 상승시켰다. 이의 효과는 대략 동등하나, 이들 모두 말초 적혈구 수에 유의한 영향을 미치지는 않는다(표 5 참조).
[표 4]
HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702가 마우스 말초 혈액 망상적혈구 생성에 미치는 영향
Figure 112010043601199-pct00025
[표 5]
HH-EPO-015, HH-EPO-018, HH-EPO-018B 및 AF37702가 마우스의 말초 적혈구 생성, 적혈구 용적율, 헤모글로빈 함량에 미치는 영향
Figure 112010043601199-pct00026
<110> Jiangsu Hansen Pharmaceutical Co., LTD <120> AN ERYTHROPOIETIN MEMETIC PEPTIDE DERIVATIVES AND ITS PHARMACEUTICAL SALT, THE PREPARATION AND USES THEREOF <130> 78017CPCT <150> CN200710198751.9 <151> 2007-12-12 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetylation:(1)..(1), Amide:(6)..(15) <400> 1 Gly Gly Leu Tyr Ala Asp His Tyr Gly Pro Ile Thr Trp Val Lys Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetylation:(1)..(1), Amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(15)..(15) Xaa=Orn <400> 2 Gly Gly Leu Tyr Ala Asp His Tyr Gly Pro Ile Thr Trp Val Xaa Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15) <400> 3 Gly Gly Leu Tyr Ala Lys His Tyr Gly Pro Ile Thr Trp Val Asp Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(6)..(6) Xaa=Orn <400> 4 Gly Gly Leu Tyr Ala Xaa His Tyr Gly Pro Ile Thr Trp Val Asp Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 5 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(7, 21) No.7 Xaa=Nle; No.21 Xaa=bAla <400> 6 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Xaa Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 7 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ser Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 8 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ala Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15) <400> 9 Gly Gly Leu Tyr Ala Asp His Tyr Gly Pro Met Thr Trp Val Lys Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(15)..(15) Xaa=Orn <400> 10 Gly Gly Leu Tyr Ala Asp His Tyr Gly Pro Met Thr Trp Val Xaa Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(6)..(6) Xaa=Orn <400> 11 Gly Gly Leu Tyr Ala Xaa His Tyr Gly Pro Met Thr Trp Val Asp Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly Gly Lys 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=Orn <400> 12 Gly Gly Thr Tyr Ser Lys His Phe Gly Pro Met Thr Trp Val Asp Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 13 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(15, 21) No.15 Xaa=Homocysteine; No.21 Xaa=bAla <400> 14 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Met Thr Trp Val Xaa Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(15, 21) No.15 Xaa=Homocysteine; No.21 Xaa=bAla <400> 15 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Xaa Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(7, 15, 21) No.7 Xaa=Nle; No.15 Xaa=Homocysteine; No.21 Xaa=bAla <400> 16 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Xaa Phe Gly Pro Met Thr Trp Val Xaa Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(7, 21) No.7 Xaa=Nle; No.21 Xaa=bAla <400> 17 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys Xaa Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 18 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 19 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ser Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), amide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 20 Gly Gly Thr Tyr Ser Lys His Phe Gly Ser Met Thr Trp Val Glu Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15) <400> 21 Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Ser Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Leu 1 5 10 15 Pro Met Ala Gly Gly Lys 20 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15) <400> 22 Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Ser Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Leu 1 5 10 15 Pro Met Ala Gly Gly Lys 20 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 23 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ala Met Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 24 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Ala Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 25 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 26 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15) <400> 27 Gly Gly Met Tyr Ser Cys Arg Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gly 1 5 10 15 Pro Ser Arg Gly Gly Lys 20 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15) <400> 28 Gly Gly Met Tyr Ser Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Gly 1 5 10 15 Pro Ser Arg Gly Gly Lys 20 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(21)..(21) Xaa=bAla <400> 29 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Xaa Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetylation:(1)..(1), disulfide:(6)..(15), MISC_FEATURE:(6, 21) No.6 Xaa=Homocysteine; No.21 Xaa=bAla <400> 30 Gly Gly Thr Tyr Ser Xaa His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Arg 1 5 10 15 Pro Gln Arg Gly Xaa Lys 20

Claims (21)

  1. 화학식 (Ⅰ)의 에리트로포이에틴(EPO) 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    R1-R2-(CH2)n1-R3-(CH2)n2-R4-R5
    (Ⅰ)
    여기서, R1,R5는 서열번호 5 내지 8, 12 내지 20, 23 내지 26, 29 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되며; nl,n2는 독립적으로 0~10으로부터 선택된 정수이고; R2,R4는 -CO 또는 -CH2로부터 선택되며; R3는 NCO(CH2)n4NHR6, CHOCONH(CH2)n5NHR6, 또는 CHSCON(CH2)n5NHR6 로부터 선택되고, n4는 2~10으로부터 선택된 정수이고, n5는 2~10으로부터 선택된 정수이며, R6는 H 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체로부터 선택된다.
    Figure 712015502098730-pct00035
  2. 제 1항에 있어서, R1,R5의 아미노산 서열은 일치하거나 또는 일치하지 않는 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, R1,R5의 N-말단은 아세틸화된 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, R1,R5는 디설파이드 결합에 의해 고리화된 고리형 펩티드인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, R1,R5는 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    Figure 712015502098730-pct00036
  6. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EPO 모방 펩티드는 하기의 펩티드로부터 선택된 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    n1,n2는 2이고, R2,R4는 -CO이며, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, n5는 2이며;
    n1,n2는 1이고, R2,R4는 -CO이며, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, n4는 2이며;
    n1,n2는 2이고, R2,R4는 -CH2이며, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, n5는 2이며;
    n1,n2는 1이고, R2,R4는 -CH2이며, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, n4는 2이다..
  7. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6는 H인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, R6는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이고, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 분자량은 5,000 ~ 100,000 달톤인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제 8항에 있어서, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 구조는 분기형 또는 선형으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 20,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 구조인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 40,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 구조인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  12. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, n1,n2는 2이고, R1,R5는 서열번호 5 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이며, 여기서 n5는 2~10으로부터 선택된 정수이고; R6는 선형 구조와 20,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이며;
    n1,n2는 1이고, R1,R5는 서열번호 5 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이며, 여기서 n4는 2~10으로부터 선택된 정수이고; R6는 선형 구조와 20,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이며;
    n1,n2는 2이고, R1,R5는 서열번호 5 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 CHOCONH(CH2)n5NHR6이고, 여기서 n5는 2~10으로부터 선택된 정수이고; R6는 분기형 구조와 40,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체이며; 또는
    n1,n2는 1이고, R1,R5는 서열번호 5 ~ 서열번호 8로부터 선택되며, R2,R4는 -CO, -CH2로부터 선택되고, R3는 NCO(CH2)n4NHR6이고, 여기서 n4는 2~10으로부터 선택된 정수이고; R6는 분기형 구조와 40,000 달톤의 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 유도체인 것을 특징으로 하는, EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  13. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 구조식으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 EPO 모방 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 712015502098730-pct00037

    Figure 712015502098730-pct00038
  14. (1) R1및 R5가 서열번호 5 내지 8의 고리형 펩티드, 12 내지 20의 고리형 펩티드, 23 내지 26의 고리형 펩티드, 및 29 내지 30의 고리형 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 R1H, R5H를 제조하는 단계;
    (2) 화학식 (Ⅱ)의 기능적 소분자를 제조하는 단계;
    R7-CO-(CH2)n1-Z2-(CH2)n2-CO-R8
    (Ⅱ)
    여기서, n1,n2은 독립적으로 0~10으로부터 선택된 정수이고;
    R7,R8은 OH 또는 H로부터 선택되며;
    Z2는 NCO(CH2)n7NHR9, CHOCONH(CH2)n8NHR9 또는 CHSCON(CH2)n8NHR9 로부터 선택되고, 여기서 n7은 2~10으로부터 선택된 정수이고, n8은 2~10으로부터 선택된 정수이며, R9는 Boc 또는 Cbz로부터 선택된다,
    (3) R1H,R5H와 화학식 (Ⅱ)의 기능적 소분자를 반응시켜 아미드화 또는 환원성 아민화 반응을 통해 화학식 (Ⅲ)의 화합물을 제조하는 단계;
    R1-R2-(CH2)n1-Z2-(CH2)n2-R4-R5
    (Ⅲ)
    여기서, R2,R4는 독립적으로 -CO 또는 -CH2로부터 선택된다,
    (4) Boc 또는 Cbz를 제거한 후, 활성 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 아미드화 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅱ)에서
    n1,n2은 1 또는 2이고, R7,R8은 OH이며, Z2는 NCO(CH2)n7NHR9 또는 CHOCONH(CH2)n8NHR9로부터 선택되고, n7은 2~10으로부터 선택된 정수이며, n8은 2~10으로부터 선택된 정수이고, R9는 Boc이고; 또는
    n1,n2은 1 또는 2이고, R7,R8은 H이며, Z2는 NCO(CH2)n7NHR9 또는 CHOCONH(CH2)n8NHR9로부터 선택되고, n7은 2~10으로부터 선택된 정수이며, n8은 2~10으로부터 선택된 정수이고, R9는 Boc인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. (1) 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    (2) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는,
    진보적 신부전증, AIDS-관련 빈혈, 자가면역 질환, 악성 종양, 낭성섬유증, 초기 미성숙 빈혈, 만성 염증 질환-관련 빈혈, 척수외상, 급성실혈, 노화, 및 적혈구를 비정상적으로 생성하는 암으로 이루어진 군에서 선택되는 질환 치료용 약학 조성물.
  17. 진보적 신부전증 또는 투석; AIDS-관련 빈혈; 자가면역 질환; 악성 종양; 낭성섬유증(cystic fibrosis); 초기 미성숙 빈혈; 만성 염증 질환-관련 빈혈; 척수외상(spinal cord injury); 급성 실혈(acute blood loss); 및 노화 및 적혈구를 비정상적으로 생성하는 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료용 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 EPO 모방 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 사용방법.
  18. 진보적 신부전증 또는 투석; AIDS-관련 빈혈; 자가면역 질환; 악성 종양; 낭성섬유증(cystic fibrosis); 초기 미성숙 빈혈; 만성 염증 질환-관련 빈혈; 척수외상(spinal cord injury); 급성 실혈(acute blood loss); 및 노화 및 적혈구를 비정상적으로 생성하는 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료용 약제의 제조에서 제 16항의 약학 조성물의 사용방법.
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