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KR101661770B1 - 표적화된 인터페론이 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 발휘함 - Google Patents

표적화된 인터페론이 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 발휘함 Download PDF

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KR101661770B1
KR101661770B1 KR1020107008737A KR20107008737A KR101661770B1 KR 101661770 B1 KR101661770 B1 KR 101661770B1 KR 1020107008737 A KR1020107008737 A KR 1020107008737A KR 20107008737 A KR20107008737 A KR 20107008737A KR 101661770 B1 KR101661770 B1 KR 101661770B1
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츠-후안 황
캐이윤 쉬안
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 암에 대해 현저한 효능을 나타내는 신규한 키메라성 부분을 제공한다. 특정 구현에에서, 상기 키메라성 부분은 인터페론에 결합된 표적화 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 키메라성 부분은 암 마커에 특이적으로 결합하는 항체가 인터페론 알파 (IFN-α) 에 융합되어 있는 융합 단백질을 포함한다.

Description

표적화된 인터페론이 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 발휘함{TARGETED INTERFERON DEMONSTRATES POTENT APOPTOTIC AND ANTI-TUMOR ACTIVITIES}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은, 어떤 목적으로든 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함되는, 2007 년 9 월 21 일에 출원된 USSN 60/994,717 의 우선권 및 권리를 청구한다.
정부 지원의 표명
본 발명은 국립 보건원이 승인한 등록 번호 CA87990 하의 정부 지원으로 했다. 정부는 본 발명에 대한 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 종양학 분야에 관한 것이다. 현저한 항암 활성을 갖는 키메라성 구축물을 제공한다.
종양-회합성 항원 (TAA) 에 대한 자발적인 면역 응답성 (Hrouda 등 (1999) Semin. Oncol. 26: 455-471) 을 검출할 수 있지만 (Disis 등 (1997) J. Clin. Oncol. 15: 3363-3367), 질환을 초래하는 악성 세포들은 거부 반응을 유도하는 면역 응답성을 이끌어내는 것에는 실패했다. 많은 연구들이, 싸이토카인과 같은 면역 자극성 분자 및 공동자극 분자를 그에 도입함으로써 종양 세포의 면역원성을 증강시키는 것이 가능하다는 것을 증명했다 (Dranoff 및 Mulligan (1995) Adv. Immunol. 58: 417-454; Hrouda 등 (1999) Semin. Oncol. 26: 455-471; Hurford 등 (1995) Nat. Genet. 10: 430-435); 그러나, 유효한 유전자 이동은 여전히 도전과제로 남아있다. 추가로, 잔류하는 암 세포의 근절은, 직접적인 유전자 이동에는 접근불가한 광범위하게 산재된 미세전이성 종양 침적물들을 표적으로 하는 것을 필요로 할 수 있다.
선천적 및 적응성 면역 응답성의 두가지 모두는 감염성 병원체 및 종양에 대항하는 보호 제공에 필수적이다. 선천적 및 적응성 면역성의 혼선은 세포 및 싸이토카인 사이의 상호작용에 의해 조절된다. 선천적 면역 시스템의 세포에 의해 제공되는 싸이토카인은 적응성 면역 응답성의 세포를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화할 수 있으며, 보호적인 항종양 면역력을 이끌어내는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다 (Belardelli 및 Ferrantini (2002) Trends Immunol. 23: 201-208). 선천적 면역 시스템의 활성화에 대한 중심은 IFN-α, TNF-α 및 IL-1 과 같은 전염증성 싸이토카인의 방출을 유도하는 박테리아 산물 또는 "위험" 시그널의 검출이다.
IFN-α 는 강력한 항바이러스 및 염증조절 활성이 있는 전염증성 싸이토카인이며, 수상 세포 (DC) 의 분화 및 활성의 자극제이다 (Santini 등 (2000) J. Exp. Med. 191: 1777-1788). 타입 I IFN (IFN-α 및 IFN-β) 은 면역 응답성에 대한 다발적인 효력을 갖는다 (Theofilopoulos 등 (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 307-336). IFN-α 는 Th1 세포의 분화 (Finkelman 등 (1991) J. Exp. Med. 174: 1179-1188) 및 특이적인 항원에 대한 응답에서 CD8+ T 세포의 장기간 생존 (Tough 등 (1996) Science 272: 1947-1950) 에 있어서 역할을 한다.
많은 연구들은 IFN 이, 동물 모델 (Ferrantini 등 (1994) J. Immunol. 153: 4604-4615) 및 암 환자 (14. Gutterman 등 (1980) Ann. Intern. Med. 93: 399-406) 에 있어서 전부 항종양 효과를 발휘할 수 있는지 보여줬다. 적응성 항종양 면역 응답성 증강에 더하여, IFN-α 는 종양 세포에서, 종양 억제자 유전자 P53 의 발현을 증가시키며 (Takaoka 등 (2003) Nature 424: 516-523), 혈관형성을 저해하고 (Sidky 및 Borden (1987) Cancer Res. 47: 5155-5161), 아폽토시스를 준비시킨다 (Rodriguez-Villanueva 및 McDonnell (1995) Int. J. Cancer 61: 110-11417).
상기 특성들은 IFN-α 이 암 치료에 유효한 치료책일 것임을 시사함에도 불구하고, 그의 짧은 반감기 및 전신 독성이 그의 사용을 제한한다.
발명의 개요
각종 구현예에서, 본 발명은 표적화 부분 (예를 들어, 세포 상에서 또는 세포에 회합된 마커에 특이적으로 및/또는 우선적으로 결합하는 분자) 에 대한 인터페론의 결합이 인터페론의 효능을 실질적으로 개선하고, 전신 독성을 줄여준다는 발견사실에 관련된 것이다. 따라서, 각종 구현예에서, 본 발명은 표적화 부분에 결합된 인터페론을 포함하는 구축물, 특정한 표적 세포 (예를 들어, 암 세포) 의 성장 또는 증식을 특이적으로 및/또는 우선적으로 저해하거나 또는 심지어는 사멸시키기 위한 상기 구축물의 용도를 제공한다.
따라서, 특정 구현예에서, 종양 회합성 항원 (TAA) 에 결합하는 표적화 부분에 결합된 인터페론 (예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마 등) 을 포함하며, 종양 세포에 접촉했을 때 사멸시키거나 또는 종양 세포의 성장 또는 증식을 저해하는 결과를 가져오는 키메라성 구축물이 제공된다. 특정 구현예에서, 세포 표면 마커 또는 세포-회합성 마커에 결합하는 표적화 부분에 결합된 인터페론을 함유하며, 상기 표적화가 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커에 의해 인터페론에 결합되는 것은 아닌 키메라성 구축물이 제공된다. 각종 구현예에서, 인터페론은 타입 1 인터페론이다. 각종 구현예에서, 인터페론은 타입 2 인터페론이다. 각종 구현예에서, 인터페론은 인터페론 알파, 인터페론-베타 또는 인터페론-감마이다. 특정 구현예에서, 표적화 부분은 종양 회합성 항원에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 표적화 부분은 인터페론에 화학적으로 커플링되어 있다. 특정 구현예에서, 표적화 부분은 펩티드 링커를 이용해 인터페론에 결합되어 있다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 길이가 15 개 미만, 14 개 미만, 12 개 미만, 11 개 미만, 10 개 미만, 9 개 미만, 8 개 미만, 7 개 미만, 6 개 미만, 5 개 미만, 4 개 미만, 3 개 미만, 또는 2 개 미만의 아미노산이다. 특정 구현예에서, 링커는 길이가 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산이다. 특정 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 이 아니다. 특정 구현예에서, 링커는 단백질 가수분해에 대해 저항성이거나 또는 실질적으로 저항성이다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 Gly4Ser (서열 식별 번호 32) 이다. 특정 구현예에서, 링커는 표 2 에 제시된 아미노산을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 구현예에서, 구축물은 재조합적으로 발현된 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 항체는 EGFR, HER4, HER3, HER2/neu, MUC-I, G250, 메소텔린, gplOO, 타이로시나아제 및 MAGE 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마커에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 표적화 부분은 CD20 에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 표적화 부분은, 항-CD20 (리툭시마브), 이브리투모마브 티욱세탄, 토시투모마브, AME-133v, 오클레로마브, 오파투무마브, TRU-015, IMMU-106 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 유래의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 단일쇄-항체이다. 각종 구현예에서, 표적화 부분은 HER2 에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 C6 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 C6MH3-B1 의 VH 및 VL CDR 또는 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 각종 구현예에서, 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG3, 등), IgE, 단일쇄 Fv (scFv), FAB , (Fab')2, (ScFv)2 등이다. 특정 구현예에서, 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
Figure 112010025529064-pct00001
특정 구현예에서, 항체는 EGF 수용체 패밀리의 구성원에 결합하는 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
Figure 112010025529064-pct00002
특정 구현예에서, 구축물은 인터페론에 결합된 항-HER2 IgG1 항체를 포함한다.
약제학적 제형물이 또한 제공된다. 각종 구현예에서, 제형물은 표적화 부분에 결합된 인터페론을 포함하는 키메라성 구축물을 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라성 구축물은 상기 (및/또는 본원 하기) 기재된 바와 같은 구축물 (예를 들어, 항-CD20-인터페론 및 항-HER2-인터페론, 등) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 제형물은 단위 투여 제형물이다. 특정 구현예에서, 제형물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 특정 구현예에서, 제형물은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 직접적인 종양 투여, 흡입, 직장내 투여, 질내 투여, 경피 투여 및 피하 데포 (depot) 투여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 경유하는 투여를 위해 제형화된다.
각종 구현예에서, 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 일반적으로는 본원에 기재된 키메라성 구축물을 이용한 암 세포에 접촉시키는 것을 수반한다. 특정 구현예에서, 세포는 전이성 세포이고/이거나 고형 종양이다. 특정 구현예에서, 암 세포는 유방암 세포이다. 특정 구현예에서, 암 세포는 B 세포 림프종이다. 특정 구현예에서, 암 세포는 B 세포 림프종, 폐암, 기관지암, 직장결장암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 흑색종, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 담도암, 소장 또는 맹장 암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 지방육종, 고환암, 및 악성 섬유성 조직구종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암에 의해 생산되는 세포이다. 각종 구현예에서, 상기 접촉은 포유류에 대한 키메라성 부분의 전신적인 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 접촉은 종양 부위에 대한 키메라성 부분의 직접적인 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 접촉은 키메라성 부분의 정맥내 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 암 세포는 인간 또는 비-인간 포유류에서의 암 세포이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 키메라성 구축물을 코딩하는 핵산이 제공된다. 각종 구현예에서, 상기 핵산은 항-EGFR 패밀리 구성원 항체, 항-HER2 항체, 항-C6 단일쇄-항체, 또는 항-CD20 단일쇄 항체에 결합된 인터페론을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 각종 구현예에서, 상기 핵산에 의해 코딩되는 인터페론은 타입 I 인터페론이다. 특정 구현예에서, 인터페론은 IFN-α 또는 인터페론-β 이다. 각종 구현예에서, 상기 핵산은 C6MH3-B1 의 VH 및 VL CDR 을 포함하는 항체를 코딩한다. 각종 구현예에서, 상기 핵산은 항체를 인터페론에 결합시키는 펩티드 링커 (예를 들어, 본원에 기재된 것) 를 코딩한다. 특정 구현예에서, 상기 핵산은 항-CD20 (리툭시마브) 에 대한 CDR 및/또는 가변 영역을 코딩한다.
또한, 본원에 기재된, 키메라성 구축물을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 키메라성 구축물을 발현한다.
각종 구현예에서, 본 발명은 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하는 의약 제조에서의 본원에 기재된 키메라성 구축물의 용도를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 구축물은 특이적으로, 미국 특허 공보: US 2002/0193569 A1 에 개시된 임의의 항체를 이용하는 구축물은 배제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 구축물은 특이적으로 항-CD20 항체를 혼입하고 있는 구축물은 배제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 구축물은 특이적으로 하기의 표적들 중 임의의 것에 결합하는 항체를 혼입하고 있는 구축물들은 배제한다: CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, EGF-R, HM1.24, 포스파티딜 세린 항원, HER-2, TAG-72, 및/또는 MUC-1. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 구축물은 다발성 경화증, HCV 매개성 맥관염 등과 같은 병리의 치료에 이용될 수 있다.
정의
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하기 위해 호환되어 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학물 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드를 만들어내는 아미노산을 결합시키는 전통적인 펩티드 연결 상의 변이체를 포함한다. 바람직한 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질" 은 그의 알파 탄소가 펩티드 연결을 통해 연결된 아미노산의 사슬이다. 따라서, 사슬의 한 말단 (아미노 말단) 에서의 말단 아미노산은 유리된 아미노기를 갖고, 사슬의 다른 말단 (카르복시 말단) 에서의 말단 아미노산은 유리된 카르복실기를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노 말단" (N-말단으로 간략하게 함) 은 펩티드의 아미노 말단에서의 아미노산 상의 유리된 α-아미노기 또는 펩티드 내 임의의 기타 위치에서의 아미노산의 α-아미노기 (펩티드 결합에 참여하는 경우에는 이미노기) 를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카르복시 말단" 은 펩티드의 카르복시 말단 상의 유리된 카르복실기 또는 펩티드 내 임의의 기타 위치에서의 아미노산의 카르복실기를 지칭한다. 펩티드에는 또한 본질적으로, 이에 제한되지 않으나, 아미드 결합과는 대조적으로 에테르에 의해 결합된 아미노산과 같은 펩티드 모사체를 포함하는 임의의 폴리아미노산이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체" 는 본질적으로 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 분절에 의해 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 단백질을 지칭한다. 인식되는 면역글로불린 유전자에는, 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자 뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역이 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 차례로 각각 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 로 정의된다.
전형적인 면역글로불린 (항체) 구조 유닛은 테트라머를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 테트라머는 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70 kDa) 를 갖고 있다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식에 1 차적으로 책임이 있는 약 100 내지 110 개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 는 각각 경쇄 및 중쇄의 상기 영역들을 지칭한다.
항체는 온전한 면역글로불린으로서, 또는 각종 펩티다아제로 소화하여 생산되거나 또는 새로이 발현되는, 다수의 특징분석이 잘 되어 있는 분절들로서 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 디설파이드 연결 이하의 항체를 소화하여, 자체로, 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1 에 결합되어 있는 경쇄인 Fab 의 이량체인 F(ab)'2 를 제공한다. F(ab)'2 는 힌지 영역 내의 디설파이드 연결을 파괴할 엄격하지 않은 조건 하에 환원될 수 있으며, 그로써 (Fab')2 이량체를 Fab' 단량체로 변환시킨다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부가 있는 Fab 이다 (기타 항체 절편의 더욱 상세한 설명에 대해서 참고문헌은, Fundamental Immunology, W.E. Paul, 편저, Raven Press, N. Y. (1993)). 각종 항체 절편들이 온전한 항체의 소화 측면에서 정의되며, 당업자는 상기 Fab' 절편이 화학적으로 또는 재조합적 DNA 방법론을 이용하여 새로이 합성될 수 있다는 점을 감안할 것이다. 따라서, 용어 항체는 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 전체 항체의 개질에 의해 생산된 것이든 또는 재조합적 DNA 방법론을 이용하여 새로이 합성된 것이든, 이에 제한되지 않으나, Fab'2, IgG, IgM, IgA, IgE, scFv, dAb, 나노바디, 유니바디 및 디아바디를 포함하는 항체 절편을 포함한다. 각종 구현예에서, 바람직한 항체에는, 이에 제한되지 않으나, Fab'2, IgG, IgM, IgA, IgE, 및 단일쇄 항체가 포함되며, 더욱 바람직하게는 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해) 함께 결합되어 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일쇄 Fv (scFv) 항체이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 구축물에 사용되는 항체 및 분절들은 이중특이적이다. 이중특이적 항체 또는 절편은 몇가지 배치구조의 것일 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 단일 항체 (또는 항체 절편) 를 닮을 수 있으나, 2 개의 상이한 항원 결합 부위 (가변 영역) 을 갖는다. 각종 구현예에서, 이중특이적 항체는 화학적 기법 (Kranz 등 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78: 5807) 으로, "폴리도마" 기법으로 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 제 4,474,893 호), 또는 재조합 DNA 기법으로 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는, 하나 이상이 종양 회합 항원인 2 개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 각종 구현예에서, 항체 및 분절은 또한 헤테로항체일 수 있다. 헤테로항체는 함께 결합된 2 개 이상의 항체, 또는 항체 결합 절편 (예를 들어, Fab) 으로서, 각각의 항체 또는 절편이 상이한 특이성을 가진 것이다.
"항원-결합 부위" 또는 "결합 부분" 은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L") 의 N-말단 가변 ("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3 개의 매우 확산적인 스트렛치는, "프레임워크 영역" 또는 "FR" 으로 공지된 더욱 보존성인 측면 스트렛치 사이에 끼어든 "고변이성 영역" 으로 지칭된다. 따라서, 용어 "FR" 은 면역글로불린 내에서 고변이성 영역들 사이 및 그에 근접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3 개의 고변이성 영역 및 중쇄의 3 개의 고변이성 영역은 3 차원적 공간에서 서로 배치되어 항원 결합 "표면" 을 형성한다. 상기 표면은 표적 항원의 인식 및 결합을 매개한다. 각각의 중쇄 및 경쇄의 3 개의 고변이성 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로 지칭되며, 예를 들어, Kabat 등 Sequences of proteins of immunological interest, 제 4 판. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987) 에서 특징분석되어 있다.
용어 "인터페론" 은 전장 인터페론 또는, 전장 야생형 인터페론의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 (예를 들어, 전장 항체의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 98% 또는 99% 이상) 인터페론 절편 (절단된 인터페론) 또는 인터페론 돌연변이를 지칭한다. 인터페론에는 타입 I 인터페론 (예를 들어, 인터페론-알파 및 인터페론-베타) 뿐만 아니라 타입 II 인터페론 (예를 들어, 인터페론-감마) 가 포함된다. 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 은 본질적으로 임의의 포유류 종 유래의 것일 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 인터페론은 인간, 말, 소, 설치류, 돼지, 토끼, 고양이, 개, 쥐과동물, 염소, 양, 비-인간 영장류 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종 유래의 것이다. 각종 구현예에서, 돌연변이화된 인터페론에는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함된다.
항-HER2/neu 항체는 HER2/neu 수용체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 는, 이에 제한되지 않으나, 인간 또는, 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 마우스, 래트 또는 원숭이를 포함하는 비인간 동물을 지칭한다.
용어 "C6 항체" 는, 본원에 사용된 바와 같이, 그의 서열이, 예를 들어, 미국 특허 제 6,512,097 호 및 제 5,977,322 호에, 및 PCT 공보 WO 97/00271 에 분명하게 제공된, C6.5 로부터 유도된 항체를 지칭한다. C6 항체는 바람직하게는 HER2/neu 에 대해 약 1.6 × 108 또는 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 특정 구현예에서, C6 항체는 공지된 C6 가변 중쇄 (VH) 가 다수의 가변 경쇄 (VL) 와 조합되어 발현되거나 또는 역으로 공지된 C6 가변 경쇄가 다수의 가변 중쇄 (VH) 와 조합되어 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리를 (c-erbB-2/HER2/neu 에 대한 친화성에 대해) 스크리닝하여 유도된다. C6 항체에는 또한, 예를 들어, 미국 특허 제 6,512,097 호 및 제 5,977,322 호에, 및 PCT 공보 WO 97/00271 에 기재된 바와 같이 돌연변이를 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 또는 CDR3) 에 도입하여 제조된 항체들이 포함된다. 추가로, C6 항체에는 C6.5 에 적용된 것의 개질 방법들 중에서의 임의의 조합에 의해 제조되는 항체 및 그의 유도체가 포함된다.
"항-EGFR 패밀리 항체" 는 상피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 로도 지칭되는 ErbB-1, 인간에서는 HER2 로 지칭되고 설치류에서는 neu 로 지칭되는 ErbB-2, HER3 로도 지칭되는 ErbB-3, 및/또는 HER4 로도 지칭되는 ErbB-4 에 결합하는 항체) 를 지칭한다. 실예가 되는 항-EGFR 패밀리 항체에는, 이에 제한되지 않으나, C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 및 HER4.C7 등과 같은 항체가 포함된다 (참고문헌은, 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 공보 US 2006/0099205 A1 및 US 2004/0071696 A1).
단일쇄 Fv ("sFv" 또는 "scFv") 폴리펩티드는, 특정 구현예에서 직접 결합되거나 또는 펩티드-코딩 링커에 의해 결합되는 VH- 및 VL- 코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는, 공유결합으로 연결된 VH:VL 헤테로이량체이다. Huston, 등, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 85: 5879-5883 (1988). 자연적으로 응집되지만 화학적으로 분리되는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드 사슬을, 항체 V 영역으로부터 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3 차 구조로 폴딩할 sFv 분자로 변환시키기 위한 다수의 구조들. 참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 제 5,091,513 호 및 제 5,132,405 호, 및 제 4,956,778 호.
"CD20" 은 성숙형 B-세포의 표면에서 발현되는 비-글리코실화 인단백질이다 (참고문헌은, 예를 들어, Cragg 등 (2005) Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174). B-세포 림프종, 모양 세포성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병, 피부/흑색종 암 줄기 세포 등에서도 발견된다.
어구, 암 세포의 "성장 및/또는 증식의 저해" 는 암 세포에서의 성장 속도 및/또는 증식 속도의 감소를 지칭한다. 특정 구현예에서, 여기에는 암 세포의 (예를 들어, 아폽토시스를 통한) 사멸이 포함된다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 또한 고형 종양의 성장 및/또는 증식의 저해 및/또는 종양 크기 감소 또는 종양제거의 유도가 포함된다.
용어 "암 마커" 는 암 세포 상에서 독보적으로 또는 우선적으로 또는 차별적으로 발현되고/되거나 암 세포와 회합되어 발현됨으로써 암 세포에 우선적이거나 그에 특이적인 표적을 제공하는, 단백질, 탄수화물, 당단백질 등과 같은 생물분자를 지칭한다. 각종 구현예에서, 우선적인 발현은 유기체 내에서의 임의의 기타 세포에 비해 우선적인 발현 또는 유기체 내에서의 특정 영역 (예를 들어, 특별한 장기 또는 조직) 내에서의 우선적인 발현일 수 있다.
발명의 상세한 설명
인터페론 알파 (IFN-α) 는 선천적인 면역 응답성 개시에서 중요한 싸이토카인이며, 또한 폭넓은 항-종양 활성을 나타낸다. 그러나, 항암 약물로서의 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 의 임상적인 이용은 그의 짧은 반감기때문에 방해를 받는데, 이는 그의 치료 유효성을 현저하게 위태롭게 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인터페론의 치료 지수가 인터페론을 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포) 상의 또는 그와 회합되는 마커에 특이적으로/우선적으로 결합하는 표적화 부분에 결합시킴으로써 개선될 수 있다는 관찰사실에 근거한다. 이는 전신적 합병증이 더 적은, 표적 부위에 대한 인터페론의 더 높은 투여량의 전달을 가능케 한다. 한 구현예에서 이것은, 항-HER2/neu IgG3 및 IFN-α 로 이루어지는 융합 단백질 (항-HER2/neu-IgG3-IFN-α) 의 구축 및 이용으로 설명되며, 또다른 구현예에서는 항-CD20-IFN-α 융합 단백질의 구축 및 이용으로 설명된다.
HER2/neu-IgG3-IFN-α 구축물의 효능은 인간 HER2/neu 로 형질유도된 쥐과동물 B-세포 림프종, 38C13 상에서 시험했다. 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 융합 단백질은 생체내 38C13/HER2 종양 성장 저해에서 강력한 효력을 나타내며, 심지어는 1 μg 의 항-HER2/neu IgG3-IFN-α 의 투여는 종양 유발 후 88% 의 장기간 생존자를 그 결과로 나타냈다.
현저하게, 항-HER2/neu IgG3-IFN-α 는 확립된 38C13/HER2 종양에 대해 강력한 활성을 나타냈으며, 완전한 종양 차도가 88% 의 처리한 마우스에서 관찰되었다. 이러한 극적인 항-종양 활성은 IFN-α 유도성 아폽토시스에 의해 매개되며, 항-HER2/neu IgG3 항체에 의한 38C13/HER2 종양 세포에 대한 IFN-α 의 표적화는 이러한 효력을 증가시키기 위해 핵심적인 것이었다.
유사한 결과가 항-CD20-IgG3-IFN-α 구축물에 대해 관찰되었다 (실시예 2 참조). 이러한 결과들은, 표적화 부분 (예를 들어, 종양 특이적 항체) 에 대한 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 의 결합 (예를 들어, 융합) 이 표적 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하고 심지어는 표적 세포(들)을 사멸시키기 위해 이용될 수 있는 유효한 치료책을 제공한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 예시 구축물들은 B 세포 림프종 및 기타 암 세포의 치료를 위해 임상에서 쉽게 이용될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 표적화 부분 (예를 들어, 암 세포 사의 암 특이적 마커에 특이적으로 결합하는 항체) 에 결합된 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 을 포함하는 구축물 (예를 들어, 키메라성 부분) 을 제공한다. 구축물에는 융합 단백질 뿐만 아니라 화학물질 콘쥬게이트가 포함된다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 융합 단백질을 발현하는 핵산으로 트랜스펙션된 세포도 또한 제공된다. 암 세포의 성장 및 증식을 저해하는 방법 및, 예를 들어 본원에 기재된 키메라성 부분을 포함하는, 각종 암을 치료하기 위한 키트가 또한 제공된다.
I. 인터페론에 결합된 표적화 부분을 포함하는 키메라성 구축물
고유 (야생형) 또는 개질된 IFN (예를 들어 IFN-α) 에 결합된 표적화 부분을 포함하는 키메라성 구축물 (예를 들어, 항-종양 마커 항체) 이, 표적화 부분이 유도되는 마커와 연관되거나 또는 이를 발현하는 표적 암 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는데 효과적으로 사용될 수 있다는 것은 놀라운 발견이었다. 특정 구현예에서 표적화 부분은 인터페론과 화학적으로 컨쥬게이션되는 한편, 다른 구현예에서 표적화 부분은 IFN-α를 갖는 융합 단백질로서 발현된다. 융합 단백질로서 생성되는 경우, 표적화 부분 (예를 들어, 항체) 성분은 IFN-α에 직접적으로 융합되거나 또는 펩티드 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커, GlyGlyGlyGlySer (서열 식별 번호 32) 링커, AEAAAKEAAAKA (서열 식별 번호 33) 등에 의해 결합된다.
A) 표적화 부분
다양한 구현예에서, 표적화 부분은 표적 세포(들)에 의해 발현되거나 (예를 들어 이의 표면 상에서) 또는 표적 세포(들)과 연관되는 마커에 특이적으로 또는 바람직하게 결합하는 분자이다. 본질적으로 임의의 세포가 표적이 될 수 있지만, 특정 바람직한 세포에는 세포의 과다증식을 특징으로 하는 병리 (즉, 과다증식 장애)와 연관되는 것들이 포함된다. 예시적 과다증식 장애에는 비제한적으로, 건선, 호중구증가증, 적혈구증가증, 혈소판증가증 및 암이 포함된다.
과다증식 장애는, 비제한적으로 고체 종양, 예컨대 유방, 호흡기, 뇌, 생식 기관, 소화기, 비뇨기, 안구, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선 및 이의 원격 전이의 암을 포함하는 암을 특징으로 한다. 이들 장애에는 또한 림프종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 유방암의 예에는 비제한적으로 침습적 유관 암종, 침습적 소엽 암종, 제자리 유관 암종 및 제자리 소엽 암종이 포함된다. 호흡기 암의 예에는 비제한적으로 소세포 및 비-소세포 폐 암종 뿐 아니라 기관지 선종 및 폐모세포종이 포함된다. 뇌암의 예에는 비제한적으로 뇌 줄기 및 하이포프탈믹 (hypophtalmic) 신경교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 속질모세포종, 뇌실막세포종 뿐 아니라 신경외배엽 및 송과 종양이 포함된다. 남성 생식 기관의 종양에는 비제한적으로 전립선 및 고환암이 포함된다. 여성 생식 기관의 종양에는 비제한적으로 자궁 내막, 자궁 경부, 난소, 질 및 외음부 암 뿐 아니라 자궁 육종이 포함된다. 소화기의 종양은 비제한적으로 항문, 결장, 결장 직장, 식도, 담낭, 위, 췌장, 직장, 소장 및 침샘암이 포함된다. 비뇨기의 종양에는 비제한적으로 방광, 음경, 신장, 신우, 요관 및 요도암이 포함된다. 안구 암에는 비제한적으로 안내 흑색종 및 망막모세포종이 포함된다. 간암의 예에는 비제한적으로 간세포 암종 (섬유층판 변이체를 갖거나 또는 갖지 않는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 담관 암종) 및 혼합 간세포 담관암종이 포함된다. 피부암에는 비제한적으로 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암이 포함된다. 두경부암에는 비제한적으로 후두/하인두/코인두/입인두 암, 및 입술 및 구강암이 포함된다. 림프종에는 비제한적으로 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부상 T-세포 림프종, 호지킨 질환 및 중앙 신경계의 림프종이 포함된다. 육종에는 비제한적으로 연조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종이 포함된다. 백혈병에는 비제한적으로 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수 백혈병 및 모발상 세포 백혈병이 포함된다.
이들 장애는 인간에서 잘 분석되었으나, 기타 포유류에서도 또한 유사한 병인학으로 존재하며, 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 부분은 암 마커에 결합하는 부분 (예를 들어 항원과 연관된 종양)이다. 다양한 암 마커가 당업자에게 공지되어 있다. 마커는 암 세포에 고유할 뿐 아니라 마커의 발현이 암 세포에서 상승되거나 (정상의 건강한 세포와 비교하여) 또는 마커가 주변 조직에서 비교할만한 수준으로 존재하지 않는 (특히 키메라 부분이 국소적으로 전달됨) 면에서 효과적일 필요가 있다.
예시적 암 마커에는, 예를 들어 ND4 단일클론 항체에 의해 인지되는 종양 마커가 포함된다. 상기 마커는 불충분하게 분화된 결장 직장암 뿐 아니라 위장 신경 내분비 종양에서 발견된다 (예를 들어 Tobi 등 (1998) Cancer Detection and Prevention, 22(2): 147-152 참조). 암 면역치료요법을 위한 기타 중요한 표적은 막 결합 보체 조절 당단백질이다: CD46, CD55 및 CD59 (생체내 및 시험관내 대부분의 종양 세포에서 발현되는 것으로 발견됨). 인간 뮤신 (예를 들어 MUC1)는 gp100, 티로시나아제 및 MAGE으로서 공지되는 종양 마커이며, 이들은 흑색종에서 발견된다. 야생형 윌름 종양 (Wilms' tumor) 유전자 WT1은 대부분의 급성 골수성, 급성 림프성 및 만성 골수성 백혈병에서 뿐 아니라, 폐암을 포함하는 다양한 유형의 고체 종양에서도 높은 수준으로 발현된다.
급성 림프성 백혈병은 TAA HLA-Dr, CD1, CD2, CD5, CD7, CD19 및 CD20 로 특징지어진다. 급성 골수 백혈병은 TAA HLA-Dr, CD7, CD13, CD14, CD15, CD33 및 CD34 로 특징지어진다. 유방암은 마커 EGFR, HER2, MUC1, Tag-72 로 특징지어진다. 다양한 암종은 마커 MUC1, TAG-72 및 CEA 로 특징지어진다. 만성 림프성 백혈병은 마커 CD3, CD19, CD20, CD21, CD25 및 HLA-DR 로 특징지어진다. 모발상 세포 백혈병은 마커 CD19, CD20, CD21, CD25 로 특징지어진다. 호지킨 질환은 Leu-M1 마커로 특징지어진다. 다양한 흑색종은 HMB 45 마커로 특징지어진다. 비-호지킨 림프종은 CD20, CD19 및 Ia 마커로 특징지어진다. 그리고 다양한 전립선암은 PSMA 및 SE10 마커로 특징지어진다.
또한, 많은 종류의 종양 세포는 세포 유형 및/또는 이의 환경에 대해 부적절하거나, 또는 유기체의 발생 동안에만 정상적으로 존재하는 비정상적 항원 (예를 들어 태아 항원)을 디스플레이한다. 이러한 항원의 예에는 글리코스핑고리피드 GD2, 디시알로갱글리오시드가 포함되며, 이는 뉴런 세포의 외부 표면 막 상에서만 유의한 수준으로 정상적으로 발현되는데, 여기서 면역계에 대한 이의 노출은 혈액-뇌 장벽에 의해 제한된다. GD2 는 신경모세포종, 속질모세포종, 성상세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 골육종 및 기타 연조직 육종을 포함하는 광범위한 종양 세포의 표면 상에서 발현된다. 따라서 GD2는 면역치료요법에 대한 편리한 종양 특이적 표적이다.
기타 종류의 종양 세포는 건강한 세포의 표면 상에서 희귀하거나 없는 세포 표면 수용체를 디스플레이하며, 이는 종양 세포의 비조절된 성장 및 분할을 야기하는 세포 신호 통로를 활성화시킨다. 예에는 (ErbB2). HER2/neu, 구축적으로 활성인 세포 표면 수용체 (유방암 종양 세포의 표면 상에서 비정상적으로 높은 수준으로 생성됨)가 포함된다.
다른 유용한 표적에는 비제한적으로 CD20, CD52, CD33, 상피 성장 인자 수용체 등이 포함된다.
실예로, 적합한 종양 마커의 비제한적인 목록이 하기 표 1에 제공된다. 이들 및 기타 암 마커에 대한 항체는 당업자에게 공지되어 있으며 시중에서 수득할 수 있거나 예를 들어 파지-디스플레이 기술을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다.
표 1. 실예가 되는 암 마커 및, 참고가 되는 종양 마커 동정을 목적으로 참고문헌으로 본원에 포함되는 관련 참고문헌들
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전술한 마커 중 임의의 마커가 본 발명의 인터페론-표적화 부분 구축물을 포함하는 표적화 부분을 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 마커에는 상피 성장 인자 패밀리의 구성원 (예를 들어, HER2, HER3, EGF, HER4), CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, 5E10, CEA, HLA-DR, HM 1.24, HMB 45, 1a, Leu-M1, MUC1, PMSA, TAG-72, 포스파티딜 세린 항원 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 마커는 예시적인 것으로서 제한하려는 것이 아니다. 다른 종양 관련 항원은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
종양 마커가 세포 표면 수용체인 경우, 상기 수용체에 대한 리간드는 표적화 부분으로서 기능할 수 있다. 유사하게는, 상기 리간드의 모사체 (mimetic) 가 또한, 표적화 부분으로서 사용될 수 있다.
항체
특정 구현예에서, 표적화 부분은 종양 마커에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체, 유니바디 (unibody), 또는 아피바디 (affybody) 를 포함할 수 있다. 종양 마커에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 인간 B 세포 상에서 발현되는 CD22 항원에 결합하는 항체에는 HD6, RFB4, UV22-2, Tol5, 4KB128, 인간화된 항-CD22 항체 (hLL2) 가 포함된다 (예를 들어, Li 등, (1989) Cell. Immunol. 111: 85-99; Mason 등, (1987) Blood 69: 836-40; Behr 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 3304s-3314s; Bonardi 등, (1993) Cancer Res. 53: 3015-3021 참조).
CD33 에 대한 항체에는 예를 들어, HuM195 (예를 들어, Kossman 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755 참조), CMA-676 (예를 들어, Sievers 등, (1999) Blood 93: 3678-3684 참조) 가 포함된다.
CD38 에 대한 항체에는 예를 들어, AT13/5 (예를 들어, Ellis 등, (1995) J. Immunol. 155: 925-937 참조), HB7 등이 포함된다.
특정 구현예에서, 표적화 부분은 항-HER2 항체를 포함한다. (Her-2/neu) 로서 더 보편적으로 알려져 있는 ergB 2 유전자는 막관통 수용체를 코딩하는 암유전자이다. 여러 항체가 Her-2/neu 에 대해 개발되었으며, 이에는 트라스투주마브 (예를 들어, HERCEPTIN®; Fornier 등, (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58), TAB-250 (Rosenblum 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (Maier 등, (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369), 및 미국 특허 제 5,772,997 호; 제 5,770,195 호에 기술된 mAb (mAb 4D5; ATCC CRL 10463); 및 미국 특허 제 5,677,171 호에 기술된 mAb 가 포함된다.
예시의 항-MUC-1 항체에는 제한 없이, Mc5 (예를 들어, Peterson 등, (1997) Cancer Res. 57: 1103-1108; Ozzello 등, (1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276 참조), 및 hCTMO1 (예를 들어, Van YM 등, (1996) Cancer Res. 56: 5179-5185 참조) 이 포함된다.
예시의 항-TAG-72 항체에는 제한 없이, CC49 (예를 들어, Pavlinkova 등, (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619 참조), B72.3 (예를 들어, Divgi 등,(1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15 참조), 및 미국 특허 제 5,976,531 호에 기술된 것이 포함된다.
예시의 항-HM1.24 항체에는 제한 없이, 마우스 모노클로날 항-HM1.24 IgG2a/κ 및 인간화된 항-HM1.24 IgG1/κ 항체 (예를 들어, Ono 등, (1999) Mol. Immuno. 36: 387-395 참조) 가 포함된다.
HER2 에 특이적으로 결합하고 일부는 임상 용도에서 사용되는 많은 항체가 개발되었다. 이에는 예를 들어, 트라스투주마브 (예를 들어, HERCEPTIN®, Fornier 등, (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658 참조), TAB-250 (Rosenblum 등,(l999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (예를 들어, Maier 등, (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369 참조), 및 미국 특허 제 5,772,997 호; 제 5,770,195 호 및 제 5,677,171 호에 기술된 항체가 포함된다.
기타 완전한 인간 항-HER2/neu 항체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 항체에는 제한 없이, 다음과 같은 C6 항체가 포함된다:
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이들 및 다른 항-HER2/neu 항체는 미국 특허 제 6,512,097 호 및 제 5,977,322 호, PCT 공보 WO 97/00271, [Schier 등, (1996) J Mol Biol 255: 28-43], [Schier 등, (1996) JMoI Biol 263: 551-567] 등에 기술되어 있다.
더욱 일반적으로, 상피 성장 인자 수용체 패밀리의 다양한 구성원에 대한 항체가 본 발명의 구축물에서 표적화 부분으로서 사용되기에 적합하다. 상기 항체에는 미국 특허 제 5,844,093 호 및 제 5,558,864 호, 및 유럽 특허 제 706,799A 호에 기술된 항-EGF-R 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 기타 예시의 항-EGFR 패밀리 항체에는 다음과 같은 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 본원에 참조로서 삽입된 미국 특허 공개 US 2006/0099205 A1 및 US 2004/0071696 A1 참조):
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미국 특허 제 6,512,097 호 및 제 5,977,322 호에 기술된 바와 같이, 기타 항-EGFR 패밀리 구성원 항체는 경쇄 및/또는 중쇄를 셔플링하고, 이어서 1 회 이상의 친화성 선택에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 따라서 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 규명된 항체 및/또는 상기 규명된 공개문헌에서 기술된 CDR 인, VL 및/또는 VH 영역 내 1, 2, 또는 3 개의 CDR 의 용도를 고려한다.
다양한 구현예에서, 표적화 부분은 CD20 에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체를 포함한다. 항-CD20 항체는 당업자에게 잘 알려져 있고, 이에는 리툭시마브 (rituximab), 이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan), 및 토시투모마브 (tositumomab), AME-133v (Applied Molecular Evolution), 오크렐리주마브 (Ocrelizumab) (Roche), 오파투무마브 (Ofatumumab) (Genmab), TRU-015 (Trubion) 및 IMMU-106 (Immunomedics) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 기술된 항체의 사용을 제한할 필요가 없고, 당업자에게 알려진 바와 같은 다른 그러한 항체는 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
상기 논의는 항체에 관한 것이나, 아피바디 및/또는 유니바디가 항체 대신 사용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
유니바디
유니바디는 특정 작은 항체 형태 (format) 보다 더 긴 예상 치료 범위를 갖는, 안정하고 더 작은 항체 형태를 제조하는 항체 기술이다. 특정 구현예에서, 유니바디는 IgG4 항체로부터, 상기 항체의 힌지 영역을 제거함으로써 생성된다. 전체 크기 IgG4 항체와는 달리, 절반 분자 절편은 매우 안정하고, 유니바디라고 명명된다. IgG4 분자를 절반으로 만드는 것은 표적에 결합할 수 있는 유니바디 상에 단지 하나의 구역만을 남겨 놓았다. 유니바디를 제조하는 방법은 PCR 공보 WO2007/059782 에 기술되어 있고, 이는 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함된다 (또한, Kolfschoten 등, (2007) Science 317: 1554-1557 참조).
아피바디
아피바디 분자는 포도상구균의 단백질 A 의 IgG-결합 도메인 중 하나로부터 유도되는, 58 개 아미노산 잔기 단백질 도메인을 바탕으로 한 친화성 단백질 부류이다. 이러한 3 개의 나선형 번들 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스카폴드 (scaffold) 로서 사용되어 왔고, 이로부터 목적하는 분자를 표적으로 삼는 아피바디 변이체가 파지 디스플레이 기술을 사용해 선별될 수 있다 (예를 들어, Nord 등, (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-777; Ronmark 등, (2002) Eur. J. Biochem., 269: 2647-2655 참조). 아피바디 및 제조 방법에 대한 상세한 설명은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제 5,831,012 호 참조).
상기 기술된 항체는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 전체적인 온전한 항체 (예를 들어, IgG), 항체 절편, 또는 단일 사슬 항체로서 제공될 수 있음을 알게 될 것이다. 또한, 항체가 본질적으로는 임의의 포유류 종으로부터 유래될 수 있더라도, 면역원성을 감소시키기 위해, 구축물이 사용될 종의 항체를 사용하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 항-HER2/neu-IFN-α 키메라). 즉, 인간에서 사용하기 위해서는, 인간, 인간화된, 또는 키메라성 인간 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
B) IFN -α 및 개질된 IFN -α
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라성 부분은 표적화 부분 (예를 들어, 항-HER2/neu 항체) 에 결합된 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 을 포함한다. 인터페론은 전장 야생형 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN -γ 등), 인터페론 절편 (예를 들어, IFN-α 절편), 및/또는 돌연변이된 인터페론일 수 있다. 전형적으로, 인터페론 절편은 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98%, 99%, 100% 이상, 또는 야생형 인터페론보다 더 큰 수준의 내인성 활성을 갖는 것이다.
상기 개질된 인터페론 분자를 규명하는 방법은 당업자에게 일상적이다. 하나의 실례의 접근법에서, 절단된 (truncated) 및/또는 돌연변이된 IFN-α 의 라이브러리가 제조되고, IFN-α 활성에 대해 스크리닝된다. 폴리펩티드 변이체의 라이브러리를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어 변이 유발 PCR 을 사용하여, 돌연변이체 및/또는 절단된 IFN-α 의 라이브러리를 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 6,365,408 호).
다음, 생성 라이브러리 구성원을 당업자가 알고 있는 표준 방법에 따라 스크리닝할 수 있다. 따라서, 예를 들어, IFN-α 활성을 특정 테스트 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 측정함으로써 검정할 수 있다. IFN-α 활성을 어세이하는 키트는 시판된다 (예를 들어, Neutekbio, Ireland 사의 iLite™ 알파베타 키트).
이들 방법은 예시적인 것이고 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 제공된 교시를 이용하여, 다른 적합한 개질된 인터페론 (예를 들어, 개질된 IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등) 을 쉽게 규명하고 제조할 수 있다.
C. IFN -α 에 대한 항체 (예를 들어, 항- HER2 / neu ) 결합
일반적으로, 표적화 부분 (예를 들어, 항-HER2/neu 항체, 및 항-CD20 항체 등) 은 임의의 순서로 함께 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체는 인터페론의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 조합될 수 있다. 항체는 또한, 항체가 표적 마커 (예를 들어, HER2/neu 수용체) 에 결합하는 것을 상기 결합이 방해하지 않는 한, 인터페론의 내부 영역에 합해질 수 있거나, 또는 반대로 인터페론이 항체의 내부 위치 또는 임의의 말단에 합해질 수 있다.
항체 (예를 들어, C6 항-HER2/neu) 및 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 은 당업자에게 잘 알려진 많은 수단에 의해 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, 인터페론은 직접 또는 링커 (스페이서) 를 통해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 키메라성 부분을 융합 단백질로서 재조합적으로 발현하는 것이 바람직하다.
i) 인터페론에 대한 표적화 부분의 화학적 컨쥬게이션
특정 구현예에서, 표적화 부분 (예를 들어, 항-HER2/neu 항체, 예컨대 C6.5, C6MH3-B1, G98A, ML3-9, H3B1, B1D2 등) 은 인터페론 (예를 들어, IFN-α) 분자에 화학적으로 컨쥬게이션된다. 분자를 화학적으로 컨쥬게이션하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.
2 개의 분자를 컨쥬게이션하는 과정은 작용제의 화학 구조에 따라 다양하다. 폴리펩티드는 전형적으로 다양한 관능기를 포함한다; 예를 들어, 카르복실산 (COOH) 또는 자유 아민 (-NH2) 기 (다른 펩티드 상의, 또는 분자를 거기에 합해지는 링커 상의 적합한 관능기와의 반응에 이용가능함).
대안적으로, 항체 및/또는 IFN-α 는 추가의 반응성 관능기를 노출 또는 결합시키도록 유도체화될 수 있다. 유도체화는 Pierce Chemical Company, Rockford Illinois 에서 이용가능한 것들과 같은 임의의 많은 링커 분자의 결합을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "링커" 는 전형적으로 항체를 IFN-α 에 합하기 위해 사용되는 분자를 말한다. 다양한 구현예에서, 링커는 항체 및 IFN-α 둘 다에 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있고, 이에는 제한 없이, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로시클릭 탄소 링커, 또는 펩티드 링커가 포함된다. 특정 구현예에서, 링커(들)는 항체 및/또는 IFN-α 의 구성 아미노산에 그의 측면 기를 통해 (예를 들어, 시스테인에 대한 이황화 연결을 통해) 합해질 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 링커는 항체 및/또는 IFN-α 의 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노기 및/또는 카르복실기에 조합된다.
항체 상의 하나의 기와 반응성인 하나의 관능기 및 IFN-α 상의 또다른 반응성 기를 갖는 이관능성 링커를 사용하여 목적하는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 대안적으로, 유도체화는 표적화 부분을 화학적 처리하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 절편과 같은 폴리펩티드 상의 자유 술피드릴기의 생성 과정은 알려져 있다 (미국 특허 제 4,659,839 호 참조).
방사성핵종 금속 킬레이트, 독소 및 약물을 포함한 다양한 화합물을 항체와 같은 단백질에 결합시키기 위한 많은 과정 및 링커 분자가 알려져 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제 188,256 호; 미국 특허 제 4,671,958 호, 제 4,659,839 호, 제 4,414,148 호, 제 4,699,784 호, 제 4,680,338 호, 제 4,569,789 호, 및 제 4,589,071 호; 및 [Borlinghaus 등, (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075] 를 참조한다. 특히, 다양한 면역독소의 제조는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 ["Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe 등, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982); Waldmann (1991) Science, 252: 1657]; 미국 특허 제 4,545,985 호 및 제 4,894,443 호 등에서 찾을 수 있다.
ii ) 융합 단백질의 제조
특정 구현예에서, 키메라성 표적화 부분-인터페론 융합 단백질은 재조합 DNA 방법론을 사용해 합성된다. 일반적으로 이는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 생성하고, 상기 DNA 를 특정 프로모터의 조절 하에 발현 카세트에 두고, 숙주에서 단백질을 발현시키고, 발현된 단백질을 단리하고, 필요하다면, 상기 단백질을 재생(renature)시키는 것을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 (예를 들어, 항-HER2/neu-IFN-α, 항-CD20-IFN-α 등) 을 코딩하는 DNA 는 예를 들어, [Narang 등, (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99] 의 포스포트리에스테르 방법; [Brown 등, (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151] 의 포스포디에스테르 방법; [Beaucage 등, (1981) Tetra. Lett, 22: 1859-1862)] 의 디에틸포스포아미다이트 (diethylphosphoramidite) 방법 ; 미국 특허 제 4,458,066 호의 고체 지지체 방법 등과 같은 방법에 의한, 적절한 서열의 클로닝 및 제한, 또는 직접적인 화학적 합성을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.
화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이는 상보 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하여 DNA 중합효소를 이용한 중합에 의해 이중 가닥 DNA 로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA 의 화학적 합성이 약 100 개 염기의 서열에 제한되었더라도, 더 짧은 서열의 연결에 의해 더 긴 서열을 수득할 수 있음을 알 것이다.
대안적으로, 서열은 클로닝될 수 있고, 적절한 서열은 적절한 제한 효소를 사용해 절단될 수 있다. 다음, 절편을 연결하여, 목적하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 과 같은 DNA 증폭 방법을 사용해 클로닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, NdeI 에 대한 제한 부위를 포함하는 센스 프라이머, 및 HindIII 에 대한 제한 부위를 포함하는 안티센스 프라이머를 사용해, IFN-α 에 대한 유전자를 PCR 증폭한다. 이는 성숙형 IFN-α 서열을 코딩하고 말단 제한 부위를 갖는 핵산을 생성할 수 있다. "상보성" 제한 부위를 갖는 항체를 유사하게 클로닝한 다음, IFN-α, 및/또는 IFN-α 에 결합된 링커에 연결할 수 있다. 핵산 서열의 연결 및 벡터에의 삽입은 항-HER2/neu 항체에 조합된 IFN-α 를 코딩하는 벡터를 생성한다.
2 개의 분자가 직접 함께 합해질 수 있더라도, 당업자는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드 스페이서에 의해 분자를 분리할 수 있음을 알 것이다. 일반적으로, 스페이서는 단백질에 합해지거나 또는 어느 정도 최소의 거리 또는 그들 간의 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외의, 특정 생물학적 활성을 가지지 못할 것이다. 그러나, 특정 구현예에서, 스페이서의 구성 아미노산은 폴딩, 순 전하 (net charge), 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 주도록 선택될 수 있다.
그러나, 특정 링커가 본 발명의 융합 단백질의 제조에 부적합하다는 놀라운 발견이 있었다. 따라서, 예를 들어, (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커는 항-CD20-IFN-α 구축물의 제조에 별로 적합하지 않았다. 특정 이론에 구애되지 않으면서, 인터페론은 단백질가수분해에 의해 융합 단백질로부터 제거된 것으로 여겨진다. 항-Fc 및 항-인터페론을 사용한 웨스턴 블롯 분석은 상부 밴드 둘 다가 중쇄였으나, 오직 가장 큰 밴드만이 인터페론을 함유하였음을 확인시켜 주었다.
따라서, 특정 바람직한 구현예에서, 단백질가수분해에 내성인 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 특정 바람직한 링커는 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커가 아닌 링커이다. 특정 바람직한 링커는 길이가 15 개 아미노산보다 더 짧은 링커, 또는 길이가 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 개 아미노산보다 더 짧은 링커이다. 특정 구현예에서, 링커는 길이가 약 12 개 또는 13 개 또는 14 개 이하의 아미노산으로 된 알파 나선 링커이다.
본 발명의 구축물에서 사용하기에 적합한 특정 실예의 단백질가수분해-내성 링커는 하기 표 2 에 나타나 있다.
표 2. 실예의 단백질가수분해-내성 링커
Figure 112010025529064-pct00010
융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 대장균 (E. coli), 다른 박테리아 숙주, 효모, 및 다양한 고등의 진핵 세포, 예컨대 COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골수종 세포주를 포함한 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 전형적으로 각각의 숙주에 대한 적절한 발현 조절 서열에 조작적으로 연결된다. 대장균에 대해서, 이는 T7, trp, 또는 람다 (lambda) 프로모터와 같은 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵 세포에 대해, 조절 서열은 프로모터, 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이고, 스플라이스 공여자 및 수용체 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라스미드는 대장균에 대한 염화칼슘 형질전환, 및 포유류 세포에 대한 인산칼슘 처리 또는 전기천공과 같은 잘 알려진 방법에 의해, 선택된 숙주 세포에 수송될 수 있다. 플라스미드에 의해 형질전환된 세포는 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자와 같은, 플라스미드에 포함된 유전자에 의해 부여되는 항생제 내성에 의해 선별될 수 있다.
일단 발현되면, 재조합 융합 단백질은 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 젤 전기영동 등을 포함한 당업계의 표준 과정에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.: Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. 등 참조). 이어서, 동종성이 약 90 내지 95% 이상인 실질적으로 순수한 조성물이 약학적 용도에 바람직하고, 동종성이 98 내지 99% 이상인 조성물이 약학적 용도에 가장 바람직하다. 일단 정제되면, 부분적으로 또는 원하는 바대로 동종성이든지 간에, 폴리펩티드는 치료적으로 사용될 수 있다.
당업자는 화학적 합성, 생물학적 발현 또는 정제 후에, 융합 단백질 (예를 들어, 항-HER2/neu-IFN-α, 항-CD20-IFN-α 등) 이 구성 폴리펩티드의 본래의 구조와 실질적으로 상이한 구조를 가질 수 있음을 알게 될 것이다. 이 경우, 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 상기 폴리펩티드가 바람직한 구조로 다시 폴딩하도록 하는 것이 필요할 수 있다. 단백질의 환원 및 변성, 및 리폴딩 (refolding) 유도 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Debinski 등, (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; 및 Buchner, 등, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski 등은 예를 들어, 구아니딘-DTE 에서의 봉입체 단백질의 변성 및 환원을 기술한다. 다음, 상기 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 환원 완충제 내에서 다시 폴딩한다.
특정 구현예에서, 일시적인 발현 시스템이 본원에 기술된 키메라성 구축물 발현에 사용될 수 있다. 많은 세포주가 잠재적으로 사용될 수 있더라도, 일시적인 발현을 위해 잘 작용하는 하나의 세포주는 293T 이다. 제 0 일에서의 293T 의 일시적인 발현을 위해, 9 백만 개의 세포를 25 ml 에서 각각의 150 mm 조직 배양 플레이트에 시딩한다. 1 mg/ml 의 PEI (폴리에틸렌이민) 는 멸균수를 이용해 제조된다. 완전 항체 또는 항체 융합 단백질의 발현을 위해, 25 μg 의 각각의 H 및 L (총 50 ug) 을 플레이트 당 사용한다. 5 ml 의 부피를 각각의 150 mm 플레이트의 트랜스펙션에 사용한다. DNA 를 DMEM 과 혼합한 다음, PEI 를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한다. 1.75 μg PEI 를 DNA 의 각각의 ug 에 대해 사용한다. 트랜스펙션을 위해, 오래된 배지를 제거하고, 버리고, 20 ml 의 새 배지 (Iscoves + 5% 소 혈청) 로 대체한다. 트랜스펙션 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 빙빙 돌린다. 제 2 일에, 배지를 1% FBS (태아 소 혈청) 가 든 30 ml 의 Iscoves 배지로 대체하여, 소 Ig 의 존재량을 최소화시킨다. 제 4 일, 제 6 일 및 제 13 일에 배지를 제거하고 1% FBS 가 든 30 ml 의 새 Iscover 로 대체하여, 상기 세포로부터 상층액을 수합한다.
항-HER2/neu-IFN-α 융합 단백질의 클로닝 및 발현은 본원의 실시예 1 에서 예시되어 있는 한편, 항-CD20-IFN-α 융합 단백질의 클로닝 및 발현은 실시예 2 에 나타나 있다.
당업자는 이들 발현 방법이 예시적인 것이고 제한하려는 것이 아님을 알 것이다. 융합 단백질의 활성/효능을 감소시키지 않으면서, 본원에 기술된 융합 단백질에 변형을 줄 수 있다. 일부 변형은 표적화 분자를 융합 단백질에 클로닝, 발현 또는 혼입하는 것을 유용하게 하도록 이루어질 수 있다. 상기 변형은 당업자에게 잘 알려져 있고, 이에는 예를 들어, 아미노 말단에 메티오닌을 첨가하여 개시 부위를 제공하거나, 또는 말단 중 어느 하나에 추가의 아미노산을 위치시켜 제한 부위 또는 종료 코돈을 편리하게 위치시킬 수 있는 것이 포함된다.
혈청 반감기 및/또는 생물이용가능성을 증가시키기 위해 다른 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 변형에는 제한 없이, D 아미노산의 혼입 (특히, 링커에서), 비-자연 발생 아미노산의 사용, 융합 단백질의 PEG화 등이 포함된다.
D. 기타 다가 ( multi - valent ) 표적화 부분
특정 구현예에서, 본 발명은 인터페론을 표적 세포에 표적화시키기 위해, 다가, 바람직하게는 3 가, 4 가, 5 가 이상의 표적화 부분 (예를 들어, 항-HER2/neu 항체, 항-CD20 항체 등) 을 사용하는 것을 고려한다.
예를 들어, 다가 항-HER2/neu 부분은 많은 방법 중 하나에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 3 개, 4 개, 또는 그 이상의 반응성 부위를 갖는 링커는 항-HER2/neu 항체와 반응하여, 삼량체 이상의 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
특정 구현예에서, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 또는 기타 디스플레이 시스템을 사용하여, 다중 카피수 (예를 들어, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상 등) 의 표적화 (예를 들어, 항-HER2/neu, 항-CD20 등) 항체를 발현 및 디스플레이하여, 다가 표적화 부분을 효과적으로 제공할 수 있다.
II . 병용
본 발명의 키메라성 구축물은 표적 세포 (예를 들어, 암세포) 의 성장 및/또는 증식을 억제시키는데 유용하다. 다양한 구현예에서, 키메라성 부분은 질환 진행을 억제시키고, 종양 크기를 축소시키고/거나, 또는 퇴보/감퇴를 안정화시키는데 사용될 수 있다.
특히, 암 치료에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 또한, 추가의 치료적으로 및/또는 약제학적으로 허용가능한 작용제를 포함할 수 잇다. 예를 들어, 조성물 및 방법은 암 치료용 다른 작용제를 포함할 수 있다. 상기 작용제에는 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민 (mechlorethamine) (Mustargen), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) (Cytoxan, Neosar), 이포스파미드 (ifosfamide) (Ifex), 페닐알라닌 머스타드 (phenylalanine mustard); 멜파렌 (melphalen) (Alkeran), 클로람부콜 (chlorambucol) (Leukeran), 우라실 머스타드 (uracil mustard), 에스트라무스틴 (estramustine) (Emcyt), 티오테파 (thiotepa) (Thioplex), 부술판 (busulfan) (Myerlan), 로무스틴 (lomustine) (CeeNU), 카무스틴 (carmustine) (BiCNU, BCNU), 스트렙토조신 (streptozocin) (Zanosar), 다카바진 (dacarbazine) (DTIC-Dome), 시스-플래티늄 (cis-platinum), 시스플라틴 (cisplatin) (Platinol, Platinol AQ), 카르보플라틴 (carboplatin) (Paraplatin), 알트레타민 (altretamine) (Hexalen) 등), 항대사물질 (antimetabolites) (예를 들어, 메토트렉세이트 (methotrexate) (Amethopterin, Folex, Mexate, Rheumatrex), 5-플루오르우라실 (5-fluoruracil) (Adrucil, Efudex, Fluoroplex), 플록수리딘 (floxuridine), 5-플루오로데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine) (FUDR), 카페시타빈 (capecitabine) (Xeloda), 플루다라빈 (fludarabine): (Fludara), 시토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside) (Cytaribine, Cytosar, ARA-C), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine) (Purinethol), 6-티오구아닌 (6-thioguanine) (Thioguanine), 겜시타빈 (gemcitabine) (Gemzar), 클라드리빈 (cladribine) (Leustatin), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin); 펜토스타틴 (pentostatin) (Nipent) 등), 항생제 (예를 들어, 독소루비신 (doxorubicin) (Adriamycin, Rubex, Doxil, Daunoxome-리포좀 제제), 다우노루비신 (daunorubicin) (Daunomycin, Cerubidine), 이다루비신 (idarubicin) (Idamycin), 발루비신 (valrubicin) (Valstar), 미톡산트론 (mitoxantrone) (Novantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin) (Actinomycin D, Cosmegen), 미트라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin) (Mithracin), 미토마이신 C (mitomycin C) (Mutamycin), 블레오마이신 (bleomycin) (Blenoxane), 프로카바진 (procarbazine) (Matulane) 등), 유사분열 억제제 (예를 들어, 파클리탁셀 (paclitaxel) (Taxol), 도세탁셀 (docetaxel) (Taxotere), 빈블라스틴 술페이트 (vinblatine sulfate) (Velban, Velsar, VLB), 빈크리스틴 술페이트 (vincristine sulfate) (Oncovin, Vincasar PFS, Vincrex), 비노렐빈 술페이트 (vinorelbine sulfate) (Navelbine) 등), 크로마틴 기능 억제제 (예를 들어, 토포테칸 (topotecan) (Camptosar), 이리노테칸 (irinotecan) (Hycamtin), 에토포사이드 (etoposide) (VP-16, VePesid, Toposar), 테니포사이드 (teniposide) (VM-26, Vumon) 등), 호르몬 및 호르몬 억제제 (예를 들어, 디에틸스틸베스테롤 (Stilbesterol, Stilphostrol), 에스트라디올, 에스트로겐, 에스테르화된 에스트로겐 (Estratab, Menest), 에스트라무스틴 (estramustine) (Emcyt), 타목시펜 (tamoxifen) (Nolvadex), 토레미펜 (toremifene) (Fareston), 아나스트로졸 (anastrozole) (Arimidex), 레트로졸 (letrozole) (Femara), 17-OH-프로게스테론, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) (Megace), 고세렐린 (goserelin) (Zoladex), 류프롤라이드 (leuprolide) (Leupron), 테스토스테라온 (testosteraone), 메틸테스토스테론, 플루옥스메스테론 (fluoxmesterone) (Android-F, Halotestin), 플루타미드 (flutamide) (Eulexin), 비칼루타미드 (bicalutamide) (Casodex), 닐루타미드 (nilutamide) (Nilandron) 등), 합성 억제제 (예를 들어, 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide) (Cytadren), 케토코나졸 (ketoconazole) (Nizoral) 등), 면역조정제 (예를 들어, 리툭시마브 (rituximab) (리툭산; Rituxan), 트라스투주마브 (Herceptin), 데니루킨 디프티톡스 (denileukin diftitox) (Ontak), 레바미솔 (levamisole) (Ergamisol), 바실러스 칼메테-구에린 (bacillus Calmette-Guerin), BCG (TheraCys, TICE BCG), 인터페론 알파-2a, 알파 2b (Roferon-A, Intron A), 인터루킨-2, 알데스루킨 (aldesleukin) (ProLeukin) 등) 및 기타 작용제, 예컨대 1-아스파라기나아제 (Elspar, Kidrolase), 퍼가스파스가제 (pegaspasgase) (Oncaspar), 히드록시우레아 (Hydrea, Doxia), 류코보린 (leucovorin) (Wellcovorin), 미토탄 (mitotane) (Lysodren), 포르피머 (porfimer) (Photofrin), 트레티노인 (tretinoin) (Veasnoid) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
III . 약제학적 조성물
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 본 발명의 하나 이상의 활성제 (키메라성 부분) 를 예를 들어, 암을 진단 받은 개인에게 투여한다. 활성제(들) 를 "본래의" 형태로 투여하거나, 또는 필요하다면, 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 유도체 등의 형태로 투여할 수 있으며, 단, 상기 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 유도체가 본 발명의 방법에 약학적으로 적합한, 즉, 효과적이어야 한다. 활성제의 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 및 기타 유도체는 합성 유기 화학분야의 당업자에게 알려지고, 예를 들어, [March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. N. Y. Wiley-Interscience] 에 기술된 표준 과정을 사용해 제조될 수 있다.
예를 들어, 산 부가염은 통상의 방법론을 사용해 자유 염기로부터 제조되며, 상기 방법론은 전형적으로 적합한 산과의 반응을 포함한다. 일반적으로, 염기 형태의 약물은 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 유기 용매 내에서 용해되고, 산이 거기에 첨가된다. 생성 염은 침전되거나, 또는 덜 극성인 용매의 첨가에 의해 용액에서 끌어내질 수 있다. 산 부가염 제조에 적합한 산에는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델라산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등, 뿐만 아니라, 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등의, 2 가지 산 모두가 포함된다. 산 부가염은 적합한 염기의 처리에 의해 자유 염기로 재전환될 수 있다. 본원에서 활성제의 특히 바람직한 산 부가염은 할라이드 염이고, 염산 또는 브롬화수소산을 사용해 제조될 수 있다. 역으로, 본 발명의 활성제의 염기성 염의 제조는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 트리메틸아민 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 염기를 사용해 유사한 방식으로 제조된다. 특히 바람직한 염기성 염에는 알칼리 금속염, 예를 들어, 나트륨염, 및 구리염이 포함된다.
에스테르의 제조는 전형적으로, 약물의 분자 구조 내에 존재할 수 있는 히드록실기 및/또는 카르복실기의 관능화를 포함한다. 에스테르는 전형적으로 자유 알콜기의 아실-치환 유도체로서, 즉, 화학식 RCOOH (여기서, R 은 알킬이고, 바람직하게는 저급 알킬임) 의 카르복실산으로부터 유도되는 부분이다. 에스테르는 필요하다면, 통상의 수소화분해 또는 가수분해 과정을 사용해 자유 산으로 재전환될 수 있다.
아미드 및 전구약물은 또한 당업자에게 알려지거나 또는 관련 문헌에 기술된 기술을 이용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미드는 적합한 아민 반응물을 사용해 에스테르로부터 제조될 수 있거나, 또는 아미드는 암모니아 또는 저급 알킬 아민과의 반응에 의해 무수물 또는 산 클로라이드로부터 제조될 수 있다. 전구약물은 전형적으로 개별 대사 시스템에 의해 개질될 때까지 치료적으로 불활성인 화합물을 생성하는 부분의 공유 결합에 의해 제조된다.
본원에서 규명된 활성제는 본원에 기술된 병리학적/지표 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증 및/또는 그의 증상) 중 하나 이상의 예방 및/또는 치유적 치료를 위한, 비경구, 국소, 경구, 비내 (또는 그렇지 않다면 흡입), 직장, 또는 국소 투여, 예컨대, 에어로졸 또는 경피 투여에 유용하다. 약제학적 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여량 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여량 형태에는 분말, 정제, 알약, 캡슐, 마름모정, 좌제, 팻치, 비내 스프레이, 주사물, 이식가능한 서방성 제제, 액체 복합물 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 활성제는 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 (부형제) 와 조합되어, 약학적 조성물을 형성한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 화합물(들) 을 함유할 수 있는데, 상기 화합물은 예를 들어, 조성물을 안정화시키거나, 또는 활성제(들) 의 흡수를 증가 또는 감소시키기 위해 작용된다. 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 예를 들어, 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트화제, 저 분자량 단백질, 보호 및 흡수 증진제, 예컨대, 지질, 활성제의 소거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제가 포함될 수 있다.
기타 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 습윤제, 유화제, 분산제, 또는 방부제가 포함되고, 방부제는 미생물의 성장 또는 작용을 방지하는데 특히 유용하다. 다양한 방부제가 잘 알려져 있고, 이에는 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 당업자는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 포함한 약제학적으로 허용가능한 담체(들) 의 선택이 예를 들어, 활성제(들) 의 투여 경로, 및 활성제(들) 의 특정 생리-화학적 특징에 따라 다름을 알 것이다.
부형제는 바람직하게는 멸균성이고, 일반적으로 불필요한 물질을 갖고 있지 않다. 이들 조성물은 통상의, 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
치료적 적용에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 암 환자, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 환자 (예를 들어, 1 차 종양의 수술적 제거 후의 환자) 에, 상기 질환 및/또는 그의 합병증을 예방 및/또는 치유 및/또는 적어도 부분적으로 예방 또는 저지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양을 "치료적 유효량" 이라고 정의한다. 상기 용도에 효과적인 양은 질환의 중증도 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 다를 것이다. 조성물의 단일 또는 복수 투여는 환자에게 필요하고 용인되는 투여량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 어떤 경우든, 조성물은 환자를 효과적으로 치료 (하나 이상의 증상의 완화) 하기 위해 본 발명의 제제의 활성제를 충분한 양으로 제공해야 할 것이다.
활성제(들) 의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라, 1 차적으로 유체 부피, 점성, 체중 등을 기준으로 선택될 것이다. 그러나, 상기 농도는 전형적으로 약 0.1 또는 1 mg/kg/일 내지 약 50 mg/kg/일, 및 종종 그 이상의 범위의 투여량을 제공하도록 선택될 것이다. 전형적인 투여량의 범위는 약 3 mg/kg/일 내지 약 3.5 mg/kg/일, 바람직하게는 약 3.5 mg/kg/일 내지 약 7.2 mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 7.2 mg/kg/일 내지 약 11.0 mg/kg/일, 및 가장 바람직하게는 약 11.0 mg/kg/일 내지 약 15.0 mg/kg/일 이다. 특히 바람직한 구현예에서, 투여량의 범위는 약 10 mg/kg/일 내지 약 50 mg/kg/일이다. 특정 구현예에서, 투여량의 범위는 매일 2 회 경구로 제공되며 약 20 mg 내지 약 50 mg 이다. 상기 투여량은 특정 개체 또는 개체군에서 치료 섭생을 최적화하기 위해 다양할 수 있음을 알게 될 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 활성제는 당업자에게 잘 알려진 표준방법에 따라 경구로 (예를 들어, 정제를 통해) 또는 주사가능한 제제로서 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 펩티드는 또한, 통상의 경피 약물 전달 시스템, 즉, 경피 "팻치" 를 이용해 피부를 통해 전달될 수 있으며, 여기서, 활성제(들) 는 전형적으로 피부에 결합되는 약물 전달 장치로서 작용하는 적층화된 구조 내에 함유되어 있다. 그러한 구조에서, 약물 조성물은 전형적으로 상부 후면층 밑에 있는 층, 또는 "저장소" 내에 함유된다. 본 맥락에서의 용어 "저장소" 는 피부 표면에 전달하기에 궁극적으로 이용가능한 많은 "활성 성분(들)" 을 말한다. 따라서, 예를 들어, "저장소" 는 팻치의 후면층 상의 접착제 내에 활성 성분(들) 을 포함할 수 있거나, 또는 당업자에게 알려진 다양한 상이한 매트릭스 제제 중 임의에서 포함할 수 있다. 팻치는 단일 저장소를 함유할 수 있거나, 또는 복수의 저장소를 함유할 수 있다.
한 구현예에서, 저장소는 약물 전달 동안에 시스템을 피부에 결합하도록 작용하는 약제학적으로 허용가능한 접촉 접착 물질의 중합체성 매트릭스를 포함한다. 적합한 피부 접촉 접착 물질의 예에는 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리이소부틸렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 약물-함유 저장소 및 피부 접촉 접착제는 개별의 따로 떨어진 층으로서 존재하고, 이 경우, 저장소 밑에 있는 접착제는 상기 기술된 바와 같은 중합체성 매트릭스로서 존재할 수 있거나, 또는 액체 또는 히드로겔 저장소일 수 있거나, 또는 일부 다른 형태를 취할 수 있다. 장치의 상부 표면으로서 작용하는 이들 적층물 내 후면층은 바람직하게는 "팻치" 의 1 차 구조 원소로서 기능하고, 그의 굴곡성의 많은 부분을 가진 장치를 제공한다. 후면층용으로 선택된 물질은 바람직하게는 활성제(들) 및 존재하는 임의의 다른 물질들에 대해 실질적으로 비투과성이다.
특정 구현예에서, 상승된 혈청 반감기는 서방성 단백질 "포장" 시스템의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 서방성 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다. 한 바람직한 구현예에서, 단백질 및 펩티드용의 ProLease™ 생물분해가능한 미소구체 전달 시스템 (예를 들어, Tracy (1998) Biotechnol. Prog. 14: 108; Johnson 등, (1996), Nature Med. 2: 795; Herbert 등, (1998), Pharmaceut. Res. 15, 357 참조) 은 중합체 매트릭스 내에 활성제를 함유하는 생물분해가능한 중합체성 미소구체로 이루어진 건성 분말로서, 이는 기타 작용제가 있거나 또는 없는 건성 제제로서 화합물화될 수 있다.
ProLease™ 미소구체 제조 방법은 활성제의 본질은 유지하면서 높은 캡슐화 효능을 달성하도록 특이적으로 디자인되었다. 상기 방법은 (i) 부형제를 안정화시키면서 약물 용액을 스프레이 동결-건조시켜 벌크 (bulk) 로부터 동결-건조된 약물 입자를 제조하는 단계, (ii) 약물-중합체 현탁액을 제조하고 이어서 초음파처리 또는 균질화시켜 약물 입자 크기를 줄이는 단계, (iii) 액체 질소로의 미립자화에 의해 동결된 약물-중합체 미소구체를 제조하는 단계, (iv) 에탄올을 사용해 중합체 용매를 추출하는 단계, 및 (v) 여과 및 진공 건조시켜, 최종 건조-분말 생성물을 제조하는 단계로 이루어진다. 생성 분말에는 고체 형태의 활성제가 들어 있고, 이 활성제는 다공성 중합체 입자 내에서 균질하게 그리고 빡빡하게 분산되어 있다. 상기 방법에 가장 흔히 사용되는 중합체인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (poly(lactide-co-glycolide, PLG) 는 생물융화성이면서 생물분해가능성이다.
캡슐화는 저온 (예를 들어, -40℃) 에서 달성될 수 있다. 캡슐화 동안에, 단백질은 물이 없는 고체 상태에서 유지되고, 따라서, 단백질의 물-유도 형태 이동성을 최소화시키고, 반응물로서 물을 포함하는 단백질 분해 반응을 방지하고, 단백질이 변성을 수행할 수 있는 장소인 유기-수성 계면을 피하게 한다. 바람직한 방법은 대부분의 단백질이 불용성이어서 높은 캡슐화 효능 (예를 들어, 95% 초과) 을 달성하는 용매를 사용한다.
또다른 구현예에서, 용액의 하나 이상의 성분은 (예를 들어, 미리 측정된 부피의) 예를 들어, 희석용의 저장 용기 내에서, 또는 일정 부피의 물을 첨가하기 위한 용해성 캡슐 내에서 "농축물" 로서 제공될 수 있다.
전술한 제제 및 투여 방법은 예시적인 것이고 제한하려는 것이 아니다. 본원에 제공된 교시를 이용해, 다른 적합한 제제 및 투여 방식을 쉽게 고안할 수 있을 것으로 생각된다.
IV . 키트
특정 구현예에서, 본 발명은 1 차 암 및/또는 부가 치료법에서의 치료를 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 전형적으로 본 발명의 키메라성 부분 (예를 들어, 항-HER2/neu-IFN-α, 항-CD20-IFN-α 등) 을 함유하는 용기를 포함한다. 상기 키메라성 부분은 약제학적으로 허용가능한 부형제 내에 존재할 수 있다.
또한, 상기 키트는 임의로 키메라성 부분 (예를 들어, 암 치료를 위한 및/또는 부가 치료제로서의) 의 사용 수단을 개시하는 지시물을 포함할 수 있다. 지시물은 임의로, 바람직한 투여량, 금기사항 (counter-indication) 등을 교시할 수도 있다.
키트는 또한, 키트가 디자인되는 특정 적용을 유용하게 하기 위해 추가의 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 그리고 추가로, 상처를 소독하고, 통증을 감소시키고, 드레싱을 결합시키는 수단 등을 포함한다.
지시물이 전형적으로, 쓰여진 물건 또는 인쇄물을 포함하더라도, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지시사항을 보관하고 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에서 고려된다. 상기 매체에는 전자 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD ROM) 등이 포함된다. 상기 매체에는 상기 지시물을 제공하는 인터넷 사이트 주소가 포함될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a 내지 1o 는 본원에 기재된 각종 구축물들에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 1a 는 항-HER2/neu IgG3 중쇄-IFN-α (서열 식별 번호 1) 및 항-HER2/neu IgG3 경쇄 (서열 식별 번호 2) 에 대한 아미노산 서열을 보여준다. 단일한 밑줄은 링커이며, 이중 밑줄은 쥐과동물 IFN-α 이고, 밑줄이 없는 것은 항-HER2/neu 이다. 도 1b: αCD20 경쇄, 핵산 (서열 식별 번호 3), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 4); 도 1ca 및 도 1cb: αCD20-IgG3-muIFNα Gly4Ser 링커, 핵산 (서열 식별 번호 5), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 6); 도 1da 및 도 1 db: αCD20-IgG3-muIFNα 알파 나선 링커, 핵산 (서열 식별 번호 7), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 8); 도 1ea 및 도 1eb: αCD20-IgG3-huIFNα Gly4Ser 링커, 핵산 (서열 식별 번호 9), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 10); 도 1fa 및 도 1fb: αCD20-IgG3-huIFNα 알파 나선 링커, 핵산 (서열 식별 번호 11), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 12); 도 1g: αCD20-IgG1-muIFNα Gly4Ser 링커, 핵산 (서열 식별 번호 13), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 14); 도 1h: αCD20- IgG1-muIFNα 알파 나선 링커, 핵산 (서열 식별 번호 15), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 16); 도 1i: αCD20-IgG1-huIFNα Gly4Ser 링커, 핵산 (서열 식별 번호 17), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 18); 도 1j: αCD20-IgG1-huIFNα 알파 나선 링커, 핵산 (서열 식별 번호 19), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 20); 도 1k: αHer2/neu 경쇄 핵산 (서열 식별 번호 21), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 22); 도 1l: αHer2/neu-IgG1-muIFNα 글라이세르 링커 핵산 서열 (서열 식별 번호 23), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 24); 도 1m: αHer2/neu-IgG1-muIFNα 알파 나선 링커 핵산 서열 (서열 식별 번호 25), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 26); 도 1n: αHer2/neu-IgG1-huIFNα 글라이세르 링커 핵산 서열 (서열 식별 번호 27), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 28); 도 1o: αHer2/neu-IgG1-huIFNα 알파 나선 링커 핵산 서열 (서열 식별 번호 29), 아미노산 서열 (서열 식별 번호 30). 본 도면에서의 구축물들을 특별한 링커들과 함께 제시했지만, 특정 구현예에서 기타 링커들이 본원에 기재된 것을 대체할 수 있다는 것을 감안될 것이다.
도 2a, 2b, 2c 및 2d 는 항-HER2/neu IgG3-IFN-α 의 구축물 및 특징을 설명한다. 도 2a: 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 의 도식적인 다이어그램. 다른 색이 섞이지 않은 영역은 항-HER2/neu 가변 영역을 나타낸다. 속이 빈 영역은 인간 IgG3 및 K 불변 영역을 나타낸다. 원 영역은 쥐과동물 IFN-α 를 나타낸다. 도 2b: 비환원 (레인 1 내지 3) 또는 환원 (레인 4 내지 6) 조건 하에서의, 정제된 항-HER2/neu-IgG3 의 (레인 1 및 4), IgG3-IFN-α (레인 2 및 5), 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α (레인 3 및 6) 의 SDS-PAGE. 분자량 마커 단백질은 각 겔의 좌측에 나타낸다. 도 2c: 항-HER2/neu-IgG3 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 는 HER2/neu 에 결합한다. 높은 수준의 인간 HER2/neu 를 발현하는 쥐과동물 대장 세포주인 CT26/ HER2 는, 헤파린의 존재 또는 부재 하에 항-HER2/neu-IgG3, IgG3-IFN-α, 또는 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 와 반응시킨 후, PE-표지된 토끼 항-인간 IgG 과 반응시켰다. 빗금은 재조합성 단백질의 첨가 없이 세포로부터의 시그널을 나타낸다. 도 2d: VSV 에 대한 IFN-α 표준 및 상이한 IFN-α 융합 단백질의 보호 활성. 1 U 의 IFN-α 표준, 0.21 ng (10 pM) 의 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α, 0.21 ng (10 pM) 의 IgG3-IFN-α, 또는 0.17 ng (10 pM) 의 항-HER2/neu-IgG3 의 100 μl 중에서의 희석물을 제조하고, L-929 세포에 첨가했다. 24 시간의 인큐베이션 후, 4000 PFU 의 VSV 를 첨가했다. 48 시간 후, 살아있는 세포를 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하고, 메탄올에 녹이고, 용해된 염료를 ELISA 검독기를 이용하여 570 nm 에서 검출했다.
도 3a 및 3b 는 상이한 IFN-α 융합 단백질 및 rIFN-α 의 생체내 항종양 활성을 보여준다. C3H/HeN 마우스는 1 × 103 38C13/ HER2 세포로 s.c. 공격하고, 2.5 μg (도 3a) 또는 1 μg (도 3b) 의 표시된 단백질을 이용하여 종양 유발 후 제 1, 3 및 5 일째에 i.p. 처리했다. 각 마우스의 종양 부피를 측정했다. 동물들은 s.c. 종양의 직경이 15 mm 에 이를 때까지 관찰했다.
도 4a 및 4b 는 IgG3 의 IFN-α 에 대한 융합이 그의 항종양 활성을 개선하며 그의 생체내 반감기를 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 4a: 종양 유발 후 마우스는 9600 U 의 rIFN-α 또는 9600 U (4 μg) 의 IgG3-IFN-α 로 제 1 일 및 제 3 일째에 처리했다. 동물들은 이후 생존하다가 s.c. 종양의 직경이 15 mm 에 이르렀을 때 희생시켰다. 도 4b: 세마리 C3H/HeN 마우스의 군에 66 μCi 의 125I-표지된 rIFN-α, IgG3-IFN-α 또는, 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 를 i.p. 주사했다. 125I-표지된 단백질의 주사 후 다양한 간격을 두고, 마우스 전신 카운터를 이용하여 잔류 방사활성을 측정했다. 결과는 3 마리의 마우스의 평균을 대표한다. 바아, SD.
도 5a, 5b, 5c 및 5d 는 IFN-α 융합 단백질이 시험관내에서 38C13/HER2 세포에서 세포 증식을 저해하고 아폽토시스를 유도했다는 것을 보여준다. IFN-α 융합 단백질은 종양 세포 증식을 저해했다. 상이한 투여량의 상이한 융합 단백질을 이용한 48 시간 동안의 인큐베이션 후, 살아있는 38C13/HER2 (도 5a) 또는 38C13 (도 5b) 세포를 MTS 검정을 이용하여 측정했다. 상기 실험들은 3 개씩 3 회 수행했다; 오류 바아, 측정의 SD. 도 5c: IFN-α 융합 단백질은 38C13/HER2 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 간략하게, 1 × 106 개의 38C13/HER2 세포를 1 nM 의 표시된 단백질과 함께 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 세척하고, Alexa Fluor 488, 아넥신 V 및 PI 로 염색하고, 유세포분석으로 분석했다. 각각의 사분면에 위치한 세포의 백분율을 코너에 표시한다. 도 5d: IFN-α 융합 단백질은 생존하는 38C13/HER2 세포의 증식을 저해한다. 간략하게, 1 x 106 개의 38C13/HER2 세포를 2.5 μM CFSE 로 표지하고, 즉시 고정하거나 (빗금), 또는 PBS (가는 흑색선), 또는 1 nM 의 항-HER2/neu IgG3 (가는 흑색선, PBS 대조군과 중복), IgG3-IFN-α (두꺼운 흑색선), 또는 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α (흑색 영역) 으로 48 시간 동안 처리했다. 이어서, 세포를 세척하고, 유세포분석으로 분석했다. 히스토그램은 생세포의 집단에 대한 게이팅 온 (gating on) 으로 수득했다.
도 6a, 6b 및 6c 는 IFN-α 융합 단백질이 38C13/HER2 세포에서 STAT1 활성화를 유도한다는 것을 보여준다. 간략하게, 1 × 107 개의 38C13/HER2 세포를 1000 U/ml 의 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α (도 6a) 또는 IgG3-IFN-α (도 6b) 를 이용하여 표시된 시간 동안 처리했다. 세포 용해물을 SDS-PAGE 로 분리하고, 폴리클로날 토끼 항-포스포STAT1 을 이용하는 웨스턴 블롯으로 분석했다. 동등한 로오딩의 단백질 시료의 확인을 위해, GAPDH 에 대한 HRP 콘쥬게이션된 토끼 폴리클로날 Ab 로 블롯을 프로브했다. 도 6c: 항포스포STAT1 의 강도는 각각의 표시된 시점에 대한 항-GAPDH 의 강도를 이용해 정규화하고, 수득된 값들은 0 인 시점에서의 값으로 나누어 STAT1 에 대한 배수 활성화를 수득했다. 상기 실험들은 2 회씩 수행했다; 오류 바아, 측정의 SD, ※ 2 개 군이 0.05 미만의 p 로 상이한 유일한 지점.
도 7. IFN-α 융합 단백질은 확립된 종양의 성장을 저해한다. C3H/HeN 마우스에 1 x 103 38C13/HER2 세포를 s.c. 로 주사했다. 12 일 후, 마우스를 5 μg 의 표시된 단백질을 i.p. 로 3 일 연속하여 처리했다. 각 마우스의 종양 체적을 측정했다. 동물들은, s.c. 종양의 직경이 15 mm 에 이르렀을 때 희생시켰다.
도 8 은 CD20 을 발현하는 인간 세포에 대한 재조합성 항체의 결합을 보여준다. 다우디 세포를 재조합성 IgG3 또는 리툭시마브와 함께 인큐베이션한 후, 바이오틴화한 래트 항-인간 IgG 및 PE-표지된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하고, 유세포분석으로 분석했다. A, 2 차 항체만을 가진 세포; B, 재조합성 IgG3 를 가진 세포; C, 리툭시마브를 가진 세포
도 9 는 항체-IFN-α 융합 단백질의 중쇄의 다이어그램을 보여준다. 특히, 도면은 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 를 Gly4Ser (서열 식별 번호 32) 링커로 짧게 만든 것이 전장 αCD20-IgG3-mIFNα 의 생산을 가능케 한다는 것을 설명한다.
도 10 은 단백질 A 세파로오스로부터 용출된 분획의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커가 있는 항-CD-20-IgG3-IFNa 를 발현하는 세포 유래의 배양 상청액을, 단백질 A 세파로오스 및 용출에 앞서 결합시킨 융합 단백질에 통과시켰다. 세파로오스 및 융합 단백질은 용출 전에 결합시켰다. A. 단백질은 환원없이 통과시켰다. 레인 1, IgG3; 레인 2 내지 6, 단백질 A 세파로오스로부터 용출된 분획. B. 단백질은 분석 전에 환원시켰다. 레인 2, IgG3; 레인 3 내지 7, 분획들을 단백질 A 세파로오스로부터 용출시켰다.
도 11 은 HEK293T 세포에서의 일시적인 발현에 의해 만들어진 단백질의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 레인 1, 연장된 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커가 있는 항-CD20-IgG3-huIFNcc; 레인 2, 짧아진 Gly4Ser (서열 식별 번호 32) 링커가 있는 항-CD20-IgG3 huIFNcc; 레인 3, 연장된 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 링커가 있는 항-CD20-IgG3-muIFNcc; 레인 4, 짧아진 Gly3Ser 링커가 있는 항-CD20-IgG3-muIFNcc; 레인 5, 항-CD20 IgG3.
도 12 는 유세포분석을 이용한 다우디 세포에 대한 단백질 결합의 분석을 보여준다. 1 × 106 다우디 세포를 인간 IFN-α 또는 리툭산을 포함하는 1 μg 의 융합 단백질로 염색했다.
도 13 은 유세포분석에 의한 38C13/CD20 에 대한 단백질 결합의 분석을 보여준다.
도 14. 다우디 세포를 각종 농도의 IFN-α, 항체 또는 융합 단백질과 함께 72 시간 동안 인큐베이션했다. 성장 저해를 CellTiter 96 AQueous 세포 증식 검정을 이용하여 평가했다.
도 15. 다우디 세포를 10 pM 의 표시한 단백질들로 72 시간 동안 처리했다. 세포 생존능 및 아폽토시스를 아넥신 V 및 PI 를 이용한 염색 및 유세포분석에 의한 분석으로 측정했다.
도 16. 38C13/CD20 세포를 10 pM 의 표시한 단백질들로 48 시간 동안 처리했다. 세포 생존능 및 아폽토시스를 아넥신 V 및 PI 를 이용한 염색 및 유세포분석에 의한 분석으로 측정했다.
도 17. 상이한 단백질들을 농도를 달리하여 처리한 후 세포 증식의 저해. 38C13-CD20 세포를 표시한 단백질들로 농도를 달리하여 48 시간 동안 처리했다. 처리 후, MTS 검정을 이용하여 증식 정도를 모니터링했다.
도 18. 38C13/CD20 세포를 상이한 농도의 표시한 단백질로 48 시간 동안 처리했다. 세포 생존능 및 아폽토시스를 아넥신 V 및 PI 를 이용한 염색 및 유세포분석에 의한 분석으로 측정했다.
도 19. 다우디 세포를 72 시간 동안 상이한 농도의 융합 단백질과 함께 인큐베이션했다. 세포 생존능 및 아폽토시스를 아넥신 V 및 PI 를 이용한 염색 및 유세포분석에 의한 분석으로 측정했다.
도 20. 다우디 세포를 72 시간 동안 각종 농도의 융합 단백질과 함께 인큐베이션했다. MTS 용액을 첨가하여 세포 생존능을 정량했다.
도 21. 다우디 세포를 72 시간 동안 Gly4Ser 링커 (32) (Gly-Ser 링커) 가 있는 1 pM 의 항-CD20-IgG3-hIFNα 또는 알파 나선 링커 (알파 나선 링커) 가 있는 1 pM 의 항-CD20-IgG3-hIFNα 와 함께 인큐베이션했다. 세포 생존능 및 아폽토시스를 아넥신 V 를 이용한 염색 및 PI 및 유세포분석에 의한 분석으로 측정했다.
도 22 는, 5000 38C13-CD20 세포를 접종하고, 제 1, 2 및 3 일째에 HBSS 또는 표시된 양의 항-CD20-IFN-α 융합 단백질로 처리한 마우스의 생존을 보여준다.
도 23 는, 5000 38C13-CD20 세포를 접종하고, 제 5, 6 및 7 일째에 10 μg 의 항-CD20-IgG1, 항-CD20-IgG3, 리툭시마브 또는 항-CD20-IgG3-mIFNα 로 처리한 마우스의 생존을 보여준다.
도 24. 5000 38C13-CD20 세포를 접종하고, 제 5, 6 및 7 일째에 10 μg 의 항-CD20-IgG3, 항-CD20-IgG3 + IFNa, 항-DNS-IgG3, 또는 항-CD20-IgG3-mIFFNα 로 처리한 마우스의 생존.
도 25. 제 0 일에 5000 38C13-CD20 세포를 주사한 8 마리 마우스의 군. 제 8, 9 및 10 일째에, 이들은 HBSS 또는 100 μg 의 항-CD20-IgG3-mIFNα 로 처리했다. 종양 성장을 경시적으로 모니터링했다.
도 26. 제 0 일에 5000 38C13-CD20 세포를 주사한 8 마리 마우스의 군. 제 8, 9 및 10 일째에, 이들은 HBSS 또는 100 μg 의 항-CD20-IgG3-mIFNα 로 처리했다. 생존성을 경시적으로 모니터링했다.
실시예
청구된 본 발명을 비제한적으로 설명하기 위해 하기 실시예를 제공한다.
실시예 1
항- Her2 / Neu IgG3 및 IFN -알파 융합 단백질은 B 세포 림프종에 대한 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 입증함
현재 연구에서, 발명자는 IFN-α 및 C6MH3-B1 (20) 의 가변 영역을 갖는 항-HER2/neu-IgG3 로 이루어지는 융합 단백질을 구축하고, 인간 HER2/neu (38C13/HER2) 를 발현하는 쥐과동물 B 세포 림프종, 38C13 에 대한 이의 효과를 조사했다. 발명자는 상기 B 세포 림프종의 IFN-α (21) 에 대한 반응성이 주어진 상기 모델에서 종양에 대한 IFN-α 표적화를 선택 평가했다. IFN-α의 Ab 로의 융합은 이의 생체내 반감기를 유의하게 증가시켰다. 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 는 유효한 투여량에서 관찰된 전신 독성의 징후가 없는 작고 확립된 38C13/HER2 종양 모두의 생체내 성장을 억제하는데 있어서 효과적인 것으로 발견되었다. 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 는 38C13/HER2 세포에서 아폽토시스를 유도하였고 이의 성장을 억제했다. 이들 결과는 IFN-α의 종양-특이적 Ab 로의 융합이 B 세포 림프종의 치료에 효과적인 제제를 야기한다는 것을 나타낸다.
재료 및 방법
세포주 및 배양 조건
38C13은 C3H/HeN 마우스에서 유래된 고도로 악성인 쥐과동물 B 세포 림프종이다. 인간 HER2/neu 를 발현하는 38C13 (38C13/HER2) 의 구축 및 분석은 이미 기재되어있다 (6). 38C13 및 38C13/HER2 모두를 2 mM L-글루타민, 10 U/ml 페니실린, 10 μg/ml 스트렙토마이신 (GPS; Sigma-Aldrich) 및 10% 송아지 혈청 (Atlanta Biologicals)으로 보충된 IMDM (Irvine Scientific)에서 배양했다. 항-HER2 IgG3-IFN-α 또는 IgG3-IFN-α를 발현하는 쥐과동물 골수종 P3X63Ag8.653 (미국 미생물 보존 센터) 및 이의 유도체를 10% 송아지 혈청으로 보충된 IMDM 에서 성장시키고, GPS. L929 섬유모세포 (미국 미생물 보존 센터)를 5% 송아지 혈청 및 GPS 를 갖는 IMDM 에서 배양했다. 인간 HER2/neu를 과다발현하는 CT26/HER2, 쥐과동물 결장 샘암종 세포주의 구축 및 분석은 이미 기재되어있다 (6). CT26/HER2를, 5% 송아지 혈청 및 GPS를 갖는 IMDM 에서 배양했다.
플라스미드 구축
C6MH3-B1, 항-인간 HER2/neu scFv의 H 및 L 사슬 가변 영역을 각각 인간 γ3 H 사슬 (pAH4802) 및 κL 사슬 (pAG4622) 발현 벡터에 삽입하고 (22), 이러한 특이성의 키메라 IgG3 제조에 이용했다. 항-인간 HER2/neu-IgG3(C6MH3-B1)-IFN-α 융합 단백질을 구축하기 위해, PCR을 먼저 사용하여, 정방향 프라이머 5'-CGC GGA TCC TGT GAC CTG CCT CAG ACT C-3 (서열 식별 번호 55) 및 역방향 프라이머 5'-GCT CTA GAT CAT TTC TCT TCT CTC AGT CTT C-3 (서열 식별 번호 56) 를 이용해 BALB/c 마우스의 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭된 성숙형 쥐과동물 IFN-α 유전자의 BamH1 제한 효소 위치 상류 및 XbaI 제한 효소 위치 하류를 도입했다. 최종 PCR 생성물을 TA 벡터에 연결시켰다. 생성된 벡터를, 서열분석 후에, BamH1 및 XbaI 으로 소화시켜, CH3의 말단에서 IgG3 불변 영역을 C6MH3-B1 H 사슬 가변 영역 및 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 식별 번호 57) 펩티드 링커와 함께 함유하는 벡터 pAH9612에 삽입된 DNA 절편을 방출시켰다. 최종 PCR 생성물, pAH9616 은 항-HER2/neu-IgG3 이후 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 식별 번호 57) 펩티드 링커 및 쥐과동물 IFN-α를 포함했다.
재조합 단백질의 제조 및 정제
IFN-α 에 융합된, C6MH3-B1 가변 영역가 있는 IgG3 H 사슬을 코딩하는 플라스미드를, C6MH3-B1 가변 영역이 있는 L 사슬을 발현하는 P3X63Ag8.653 세포에 트랜스팩션시켜 (23) 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 또는 비특이적 L 사슬 (4D5; Genentech) 을 생성시켜 (6), 960 μFd 정전투여량의 진동 및 0.2V 인 전기천공에 의해 IgG3-IFN-α 를 생성시켰다. 항-HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3, 항-HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3-IFN-α, 또는 IgG3-IFN-α를 생성하는 트랜스펙션물을 선별하고 선행기술에서 기재한 바와 같이 분석했다 (6). Sepharose 4B fast flow (Sigma-Aldrich) 에 고정된 단백질 G 를 사용하여, 배양물 상청액으로부터 항-HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3 를 정제하고, Sepharose 4B fast flow 에 고정된 단백질 A (Sigma-Aldrich) 를 사용하여, 배양물 상청액으로부터 항-HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 를 정제했다. SDS-PAGE 로 분리된 단백질의 쿠마시 블루 염색으로 순도 및 무결성 (integrity)을 평가했다. 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health) 에 의해 제공된 마우스 IFN-α용 국제 참조 표준을 사용하여 융합 단백질의 IFN 활성을 측정했다. PBL Biomedical Laboratories로부터 rIFN-α 를 입수했다.
IgG3 - IFN -α 융합 단백질의 FPLC 분석
융합 단백질이 용액 중 단량체 및/또는 중합체로서 존재하는지 알기 위해, 내부 대조군이 제공되도록 400 μg의 OVA 와 함께 혼합된 100 μg 의 IgG3-IFN-α를, PBS 및 0.5 ml/분 유속을 사용하여 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에서 결합된 30 x 1.5-cm Superose 6 컬럼 상 겔 여과로 분석했다. 350 kDa의 분자량을 갖는 이량체 Ab로서 주로 존재하는 IgA2m, 및 분자량 150 kDa 의 Miles IgG 및 분자량 45 kDa의 OVA 의 혼합물의 동일 컬럼 상의 겔 여과를 사용하여 분자량 표준을 제공했다.
HER2 / neu -결합 활성의 유세포 분석기 분석
다양한 항-HER2/neu 융합 단백질과 CT26/HER2 세포와의 반응성을 검출하기 위해, 1 x 106 세포를 4℃에서 1시간 동안 10 pM의 융합 단백질과 함께 인큐베이션했다. 일부 실험에 대해, CT26/HER2 세포와 인큐베이션하기 전에 융합 단백질을 900 U의 헤파린과 함께 4℃에서 17시간 동안 예비인큐베이션했다. 이후 세포를 1/100으로 희석된 바이오틴화된 랫트 항-인간 IgG (BD Biosciences)와 반응시켰다. 결합된 바이오틴화된 Ab를 1/1500으로 희석된 PE-표지된 스트렙타비딘 (BD Biosciences)으로 검출하고, 세포를 FACScan (BD Biosciences)을 사용하여 유세포 분석기로 분석했다.
IFN -α 항바이러스성 활성
소수포성 구내염 바이러스 (VSV) 에 대해 민감한 L-929 섬유모세포 세포주를 사용하여 IFN-α의 생물학적 활성을 정량했다. L-929 세포를 4 x 104 세포/웰의 농도에서 96-웰 조직 배양 플레이트 (Falcon; BD Biosciences)에 두고 37℃에서 5% CO2 대기 중에서 하룻밤 동안 인큐베이션했다. 이후, 표준 IFN-α (마우스 IFN-α 용 국제 참조 표준; 미국 국립 보건원, Bethesda, MD) 또는 상이한 IFN-α 융합 단백질의 연속 희석물을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 이후, VSV의 4000 PFU 를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 또 다른 48 시간 동안 인큐베이션했다. 생존하는 결합성 세포를 50 μl 의 크리스탈 바이올렛 (20% 에탄올 중 0.05%) 으로 10분 동안 염색했다. 플레이트를 물로 세척하고, 100 μl 의 100% 메탄올을 첨가하여 잔류 염료를 용해시켰다. ELISA 검독기를 사용하여 595 nm 에서 플레이트를 검독했다.
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α의 항증식 효과에 대한 검정
간략하게는, 38C13 또는 38C13/HER2 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에서 1.25 x 104 세포/웰의 밀도에서 플레이팅하고, 상이한 융합 단백질의 연속 희석물을 첨가했다. 이후 플레이트를 37℃ 에서 5% CO2 대기 하에서 48 시간 동안 인큐베이션했다. 20 μl 의 MTS 용액 (Promega) 를 첨가하여 플레이트를 전개 (develop) 시키고, ELISA 검독기를 사용하여 490 nm 에서 분석했다. 증식의 억제 (%)를 하기와 같이 계산했다:
100 x [(OD실험 - OD블랭크)/(OD배지 - OD블랭크)] x 100.
아폽토시스에 대한 검정
간략하게는, 1 x 106 세포를 상이한 융합 단백질로 72시간 동안 처리했다. 이후 세포를 얼음-냉각된 PBS로 세척했다. Vybrant 아폽토시스 검정 키트 2 (Vybrant Apoptosis Assay Kit 2, Molecular Probes) 를 사용하여, 제조사가 제안한 절차에 따라 아넥신 (annexin) V/프로피듐 요오디드 (PI) 검정을 수행했다.
CFSE - 표지된 38 C13 / HER2 종양 세포의 증식
간략하게는, 1 x 106 세포를 2.5 μM CFSE (Molecular Probes) 로, 10분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 이후 세포를 1 nM의 상이한 융합 단백질로 48시간 동안 처리하고, CellTrace CFSE 세포 증식 키트 (CellTrace CFSE Cell Proliteration Kit, Molecular Probes)를 사용하여 제조사가 제안한 절차에 따라 유세포 분석기로 분석했다.
마우스
Taconic Farms 에서 입수한 6 내지 8주령의 암컷 C3H/HeN 마우스를 사용했다. 나무를 깎아낸 잠자리 짚 (wood-shaving bedding)을 포함하는 오토클레이브된 폴리카르보네이트 케이지를 사용하는 시설에서 동물을 사육시켰다. 동물은 사료 및 물을 마음대로 공급받았다. 12/12시간 명/암 주기 하에 인공광을 제공했다. 시설의 온도는 시간 당 10 내지 15 회 공기 순환으로 20℃ 였다.
반감기
쥐과동물 rIFN-α (PBL Biomedical Laboratories), IgG3-IFN-α 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 를, 제조사의 프로토콜에 따라 Iodo-Beads (Pierce) 를 이용하여 125I로 10 μCi/μg 으로 요오드화시켰다. 마우스에 66 μCi의 125I-표지된 단백질을 복강내 주사했다. 125I-표지된 rIFN-α, IgG3-IFN-α 또는 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 의 주입 후 다양한 간격에서, 마우스 전신 계수기 (Wm. B. Johnson and Associates) 를 사용하여 잔류 방사능을 측정했다.
종양 유발 및 Ab 치료요법
C3H/HeN 마우스에 1000 38C13/HER2 종양 세포를 피하 주사했다. 종양 유발 후 제 1, 3 및 5 일째 또는 제 12, 13 및 14 일째에 복강내 주사하여 처리했다. 격일로 종양을 측정하고, 하기 화학식을 사용하여 종양 부피 (1 mm3에서의) 를 어림잡았다: [길이 (mm) x 너비 (mm) x 너비 (mm)]/2 (24). 피하 주사한 종양의 길이가 15 mm 에 도달하거나, 또는 고생하거나 빈사하는 것으로 나타나는 임의 마우스가 관찰될 때까지 동물을 관찰했다. 이들 조건 하 동물을 규정상 정책에 따라 인도적으로 안락사시켰다.
웨스턴 블롯 분석 및 Ab
간략하게는, 38C13/HER2 세포를 표시된 시간 동안 상이한 융합 단백질로 처리하고, 얼음-냉각된 PBS로 세척하고, 용해 완충액 (0.125% Nonidet P-40, 0.875% Brij 97, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.4 mM Na3VO4, 0.4 mM NaF, 1 mM PMSF, 2.5 μM 류펩틴 및 2.5 μM 아프로티닌) 중 10분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 세포 용해물을 10,000 x g 에서 4℃ 에서 10분 동안 맑게 했다. 이후 단백질 샘플을, 8% SDS-PAGE 겔 상에서의 분리 전에 샘플 완충액 중에서 끓이고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 미세공성막 (Millipore) 으로 옮겼다. 150 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.6; TBS) 중 3% BSA 로 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후, 표시된 1차 Ab 로 4℃ 에서 하룻밤 동안 블롯을 탐침했다. 이후 블롯을 실온에서 TBS 중 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하고, HRP와 컨쥬게이션된 적절한 2 차 Ab 로 인큐베이션하고, 과산화효소-촉매된 ECL 검출 시스템 (ECL; Pierce) 으로 검출했다. 다클론 토끼 항-인STAT1 (antiphosphoSTAT1) 을 Cell Signaling Technology 에서 입수했다. 다클론 HRP-컨쥬게이션된 당나귀 항-토끼 IgG를 Amersham Biosciences 에서 입수했다. 다클론 토끼 항-GAPDH를 Abcam 에서 입수했다.
통계적 분석
시험관내 연구에 대해서는 양측 꼬리 스튜던트 검정 (two-tailed Student's test) 을 사용하고, 동물 생존 곡선에 대해서는 로그-랭크 (Mantel-Cox) 분석을 사용하여 통계적 분석을 수행했다.
결과
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α의 생성 및 분석
C6MH3-B1 (20) 가변 영역을 갖는 항-HER2/neu-IgG3 의 구축 및 발현은 선행기술에 기재되어있다 (23). 성숙형 쥐과동물 IFN-α 의 아미노-말단 끝을, 유연성 [(Gly4)Ser]3 (서열 식별 번호 31) 링커에 의해 분리된 항-HER2/neu-IgG3 의 카르복실-말단 끝에 융합시켰다 (도 2a). C6MH3-B1 L 사슬을 4D5 (rhuMab HER2, 헤르셉틴 (herceptin); Genentech) L 사슬로 대체하여, 동일한 융합 단백질, IgG3-IFN-α (HER2/neu 특이성 결여) 를 구축했다. 단백질 G를 사용하여 배양액 상청액으로부터 정제된 단백질을, 비환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분석했다 (도 2b). 환원제의 부재 하에, 항-HER2/neu-IgG3 (도 2b, 1 레인) 은 분자량 170 kDa으로 이동한 반면, 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α (도 2b, 2 레인) 및 IgG3-IFN-α (도 2b, 3 레인) 는 210 kDa 으로 이동하였으며, 상기 크기는 쥐과동물 IFN-α 결합된 두 분자를 갖는 완전 IgG3 에 대해 예측되었다 (도 2a). 환원제의 처리 후, 분자량 25 kDa 으로 이동하는 L 사슬이 이들 단백질에 대해 관찰되었다 (도 2b, 4 내지 6 레인). 그러나, 항-HER2/neu-IgG3 은 분자량 60 kDa 의 H 사슬을 가진 한편 (도 2b, 4 레인), IgG3-IFN-α (도 2b, 5 레인) 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α (도 2b, 6 레인) 는 예측된 바와 같이 분자량 80 kDa 의 H 사슬을 가졌다. 1레인에서의 더 낮은 밴드 (도 2b) 는, 단백질 G 컬럼에 또한 결합한 소과 IgG 이고; 소과 H 및 L 사슬을 또한 4 레인에서 관찰되었고 (도 2b), 5 및 6 레인에서는 더 낮은 정도였다 (도 2b). FPLC 분석은 IgG3-IFN-α 융합 단백질이 용액 중 단량체로서 존재한다는 것을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α의 Ag 결합 및 항바이러스 활성
항-HER2/neu-IgG3 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 모두는 높은 수준의 인간 HER2/neu를 발현하는 CT26/HER2 세포에 결합한 한편, IgG3-IFN-α 는 CT26/HER2 에 약하게 결합했다 (도 2c). IL-1, IL-2, IL-6 (25) 및 IFN-α (26) 를 포함하는 많은 사이토카인은 헤파린과 반응하는 것으로 나타났다. IgG3-IFN-α와 CT26/HER2 사이의 약한 상호 작용이 헤파린 결합으로 인한 것인지를 알기 위해, CT26/HER2 로 첨가하기 전에 단백질을 헤파린과 함께 인큐베이션했다. 헤파린은 IgG3-IFN-α 의 CT26/HER2 세포로의 결합을 억제하였으나, 항-HER2/neu-IgG3 및 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 의 결합은 억제하지 않았다 (도 2c).
이들 결과는 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 가, HER2/neu 를 인식하지 않는 Ag 및 IgG3-IFN-α 에 결합하는 이의 능력을 보유한다는 것을 입증했다. VSV 감염에 대해 민감한 L-929 섬유모세포 세포주를 사용하여, 융합 단백질의 IFN-α 생물학적 활성을 IFN-α 표준과 비교하여 정량했다. 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 모두, L-929 세포에서의 VSV-유도성 세포독성에 대해 약 2400 U의 IFN-α 활성/μg 활성을 나타낸 한편, 항-HER2/neu-IgG3 은 항-바이러스 활성을 나타내지 않았다 (도 2d).
융합 단백질의 생체내 항종양 활성
항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 의 생체내 항종양 활성을 측정하기 위해, 유전적 동계 마우스를 1 x 103 38C13/HER2 종양 세포로 피하 주사로 접종하고, 상이한 투여량의 단백질의 복강내 주사 투여에 의한 종양 유발 후 제 1, 3 및 5 일째에 처리했다 (도 3a 내지 3b). 2.5 μg 의 IgG3-IFN-α 로 처리된 마우스는 50 일 후 생존한 8 마리 마우스 중 1 마리 (13%)로, 종양 성장의 일부 퇴보를 나타내었다 (도 3a). 그러나, 종양-특이적 Ab를 사용하는 IFN-α의 종양에 대한 생체내 표적화는 이의 항종양 효과를 극적으로 개선시켰다. 2.5 μg (도 3a) 의 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 로 처리된 모든 마우스는 종양 유발 후 제 50 일째에 종양이 없었고 (PBS 대조군과 비교하여 p = 0.0048), 처리된 마우스는 독성의 증거를 나타내지 않았다. 따라서, IFN-α 의 종양 세포 표면에 대한 표적화는 비특이적 Ab 에 연결된 IFN-α 와 비교하여 유의한 항종양 활성을 야기했다 (p = 0.007). 표적대상이 된 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 는, 더 낮은 투여량이 사용된 경우 강력한 항종양 활성을 계속하여 나타내었다. 1 μg (도 3b)의 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 로 처리된 8 마리 마우스 중 7 마리 (88%)는 50일 후 종양이 없는 채로 남아 있었다. 뚜렷하게 대조적으로, 이러한 더 낮은 투여량에서 IgG3-IFN-α 로 처리된 마우스는 PBS 로 처리된 마우스와 유사한 종양 성장을 나타내었고 (p = 0.183), 8 마리 마우스 중 1마리 (13%) 만이 생존했다. 처리가 3 투여량의 5 μg 으로 증가된 경우, 38C13 세포가 IFN-α 처리에 대해 민감하다는 사실 (21, 27, 28) 을 확실히 반영하여, 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 모두는 종양 성장을 방지하는데 효과적이었다 (데이터는 나타내지 않음). 5 μg 의 항-HER2/neu-IgG3 Ab 로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 PBS 대조군에서와 같이 동일하였는데, 이는 Ab 가 단독으로 생체내 항종양 효과를 갖는다는 것을 시사한다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, 종양-특이적 Ab 에 의한 IFN-α 의 종양 세포에 대한 표적화가, 낮은 투여량이 투여된 경우 가장 명백히 나타났던 그의 유효성을 극적으로 강화시킬 수 있다는 것을 나타내었다. 중요하게는, 항종양 활성은 어떠한 명백한 독성 없이도 달성될 수 있다.
Ab 에 융합된 IFN -α 는 유리된 IFN -α 와 비교하여 개선된 항종양 활성을 야기함
상기 기재된 바와 같이, 발명자는 비종양특이적 Ab 에 융합된 IFN-α 가 항종양 활성을 나타낸다는 것을 발견했다. 가용성 rIFN-α 의 활성과 이의 항종양 활성을 비교하기 위해, 마우스를 1 x 103 38C13/HER2 종양 세포로 피하 주사하여 접종하고, 9600 U (4 μg) 의 IgG3-IFN-α 또는 9600 U의 rIFN-α 의 복강내 주사 투여에 의해 종양 유발 후 제 1 및 3 일째에 처리했다 (도 4a). 9600 U 의 IgG3-IFN-α 로 처리된 모든 마우스는 지연된 종양 성장을 나타내었고, 75%의 마우스는 종양 유발 후 제 50 일째에 종양이 없는 채로 남아 있었다 (p = 0.027). 대조적으로, 동일한 수의 rIFN-α 단위로 처리된 마우스는 그의 종양 성장 패턴에 있어서 PBS 대조군과 통계적으로 상이하지 않았다.
IFN-α는 매우 짧은 생체내 반감기를 갖는다 (29). 선행기술의 연구에서, 사이토카인에 대한 Ab 의 융합이 그의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다 (6). 125I-표지된 rIFN-α, IgG3-IFN-α 또는 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α의 일소 (clearance) 를 C3H/HeN 마우스에서 검사했다. 마우스에 66 μCi의 125I-표지된 단백질을 복강내 주사하고, 마우스 전신 계수기를 사용하여 잔류 방사능을 측정했다. rIFN-α는 약 2.5 시간까지 50% 삭제되어 빠르게 제거되었다 (도 4b). 대조적으로, 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 모두는, 50%의 주입된 방사능의 제거에 약 8 시간이 필요해, 유의하게 연장된 생체내 반감기를 나타내었다. 이러한 연장된 반감기는 IFN-α 융합 단백질의 항종양 효능에 기여할 수 있다. 따라서, IFN-α 에 대한 IgG3 Ab 의 융합은 그의 생체내 항종양 활성을 유의하게 개선시킬 수 있다. 그러나 이러한 항종양 활성은, 더 낮은 투여량에서 이를 유효하게 하는, IFN-α의 종양에 대한 표적화에 의해 보다 개선될 수 있다.
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α 는 종양 세포의 시험관내 증식을 억제함
IFN-α는 종양에 대한 직접적 세포독성 및 면역 반응을 포함하는 다수의 활성을 갖는다. 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 또는 IgG3-IFN-α 를 사용하여 나타난 항종양 효과의 잠재적 메카니즘을 조사하기 위해, 종양이 없는 채로 남아 있는 8마리 마우스 (도 3a 참조)를 1 x 103 38C13/ HER2 종양 세포로 공격했다. 놀랍게도, 모든 마우스는 비처리된 마우스와 유사하였고 부피가 큰 종양을 빠르게 진전시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, 낮은 종양 부하의 이들 실험적 조건 하에서 IFN-α 융합 단백질이 보호적 적응 면역 반응을 개시하지 않았으나, 대신에 IFN-α 융합 단백질의 강력한 항종양 활성이 선천적 면역계 또는 종양 세포 상 직접적 세포독성 효과에 의해 매개된다는 것을 의미한다.
IFN-α 융합 단백질이 종양 세포에 대해 직접적으로 세포독성인지를 측정하기 위해, 38C13/HER2 또는 부모 38C13 종양 세포를 상이한 단백질과 함께 48시간 동안 인큐베이션하고, MTS 검정을 사용하여 세포 증식을 측정했다. 항-HER2/neu -IgG3 을 이용한 처리는 38C13/HER2 또는 부모 38C13 종양 세포의 증식을 유의하게 억제하지 않았다 (도 5a 및 5b). 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 모두가 38C13/HER2 종양 세포의 증식을 억제하였지만, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 에 대해 각각 10 및 100 pM의 IP50 값으로, 항-HER2/ neu -IgG3-IFN-α가 IgG3-IFN-α 보다 더욱 효과적이었다 (도 5a). 대조적으로, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 는 부모 38C13 종양 세포에 대해 유사한 항증식 활성을 나타내었다. 이들 결과는, IFN-α 융합 단백질이 B 세포 림프종 38C13 의 증식을 직접적으로 억제할 수 있고, 종양 세포에 대한 IFN-α 의 표적화가 이러한 효과를 가능하게 했다는 증거를 제공했다.
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α 는 종양 세포에서 시험관내 아폽토시스를 유도함
IFN-α 는 일부 종양 세포주에서 아폽토시스를 유도할 수 있다. 아폽토시스가 발명자가 관찰한 항증식 효과에 기여하는지를 측정하기 위해, 상이한 단백질로 처리된 38C13/HER2 세포를, 아넥신 V-친화성 검정 (30) 을 사용하여 혈장막의 내부 소엽에서 외부 소엽으로의 포스파티딜세린의 전위에 대해 검정했다. 죽은 세포를, 분열된 혈장막을 갖는 세포에 들어가서 DNA 에 결합하는 PI로 염색했다. PBS 대조군과 비교하여, 항-HER2/neu-IgG3 으로의 처리 후, 죽은 세포 (아넥신 V/PI 선명도 (bright), 2%) 또는 초기 아폽토시스 세포 (아넥신 V 선명도, 3%)의 수에는 증가가 없었다 (도 5c). 대조적으로, 세포가 IgG3-IFN-α 로 처리되는 경우, 죽은 세포 (21%) 및 초기 아폽토시스 세포 (6%)의 수에서는 유의한 증가가 있었다. 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 를 이용한 처리는 죽은 세포 (33%) 및 초기 아폽토시스 세포 (16%)의 수 모두에 있어서의 추가적인 증가를 야기했다. 이들 결과는 IFN-α가 38C13/HER2 종양 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있고, 종양 세포에 대한 IFN-α의 표적화가 이러한 효과를 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
아폽토시스를 유도하는 것에 추가적으로, IFN-α는 종양 세포의 증식을 직접적으로 억제할 수 있다 (31). 증식 및 아폽토시스의 억제 모두가 처리된 종양 세포에서 일어날 수 있는지를 측정하기 위해, CFSE-표지된 38C13/HER2 세포를 48시간 동안 상이한 단백질로 처리하고, 생존하는 세포를 게이트화하고, 유세포 분석기로 CFSE의 수준을 측정했다. 항-HER2/neu -IgG3-처리된 세포에서의 CFSE 신호 (도 5d, 가는 선)는 PBS-처리된 세포와 중복되었고, CFSE 표지 직후 고정된 세포의 것보다 유의하게 적었는데 (도 5d, 점선), 이는 항-HER2/neu -IgG3 이 38C13/HER2 의 증식을 억제하지 않았다는 것을 나타낸다. 대조적으로, IgG3-IFN-α는 살아 있는 38C13/HER2 세포의 증식을 유의하게 억제하였고 (도 5d, 굵은 선), 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 에 의한 38C13/HER2 세포에 대한 IFN-α 의 표적화는 이러한 효과를 가능하게 했다 (도 5d, 흑색 영역). 이들 결과는, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 처리가 48 시간까지 완전한 세포 사멸을 야기하지 않았으나, 살아 있는 세포가 감소된 증식 능력을 가졌다는 것을 나타내었다.
IFN -α 융합 단백질은 종양 세포에서 STAT1 활성을 유도함
IFN-α 수용체의 개입이 다수의 STAT 단백질 활성을 개시할 수 있으나, STAT1 은 IFN-α-의존적 신호를 매개하는데 있어서 의무적 역할을 한다 (32). IFN-α 융합 단백질이 38C13/HER2 에서의 IFN-α 신호전달을 개시하고, 종양 세포에 대한 IFN-α 를 표적화하여 상기 효과를 증대시키는지를 조사하기 위해, 처리 후 STAT1 의 인산화를 검사했다. 도 6a 내지 6c 에 나타낸 바와 같이, 항-HER2/neu-IgG3-IFN-α 및 IgG3-IFN-α 는 모두 38C13/HER2 에서 확고한 STAT1 인산화를 개시하는데, STAT1 인산화가 10 분까지 8 배 증가했다. 그러나, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 에 의해 유도된 STAT1 의 인산화는 오랜 기간 동안 지속되었으며, 더 큰 STAT1 인산화가 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 로 처리된 세포에서 30, 60 및 90 분에서 관찰되었다. 이들 결과는, IFN-α 융합 단백질이 38C13 림프종 세포에서의 IFN-α 신호전달을 유도할 수 있고, 종양 세포에 대해 IFN-α를 표적화하여 상기 효과를 증대시킨다는 것을 나타내었다.
항- HER2 / neu - IgG3 - IFN -α는 확립된 종양에 대해 강력한 활성을 나타냄
항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 가 38C13/HER2 종양 세포에 대한 강력한 세포 독성을 나타내기 때문에, 발명자는 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 가 확립된 38C13/HER2 종양에 대해 효과적인지를 조사했다. 유전적 동계 마우스에 1 x 103 38C13/HER2 종양 세포를 피하주사하여 접종하고, 종양 유발 후 제 12, 13 및 14 일째에 표시된 단백질의 5 μg을 복강내 주사하여 처리했다 (도 7). 제 12 일째에서의 평균 종양 크기는 100 mm3이고, PBS 또는 10 μg 의 항-HER2/neu -IgG3 을 이용한 처리 (데이터는 나타내지 않음)는 종양 성장을 억제하지 않았다. 5 μg의 IgG3-IFN-α로의 처리는 종양 성장을 억제하는데 있어서 일부 효과를 나타내었으나; 모든 마우스는 부피가 큰 종양으로 진전되었고 이들 중 아무도 종양 유발 후 32 일째에 생존하지 못했다. 반대로 5 μg의 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 로 처리된 모든 마우스는 종양 성장이 지연되었고, 8마리 마우스 중 3마리는 완전히 종양이 퇴화되었고, 종양 유발 후 50 일째에 종양이 없는 채로 남아 있었다 (항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 대 PBS, p = 0.0001; 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 대 IgG3-IFN-α, p = 0.063). 따라서, IgG3-IFN-α 및 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 모두는 항종양 활성을 나타내었으나 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 가 종양 성장을 지연시키는데 있어서 보다 효과적이었고, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 로 처리된 마우스에서만 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. 처리 투여량이 10 μg의 융합 단백질로 증가된 경우, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 또는 IgG3-IFN-α로 처리된 거의 모든 마우스에서 완전히 종양이 퇴화되었고, 50일 후 종양이 없는 채로 남아 있었다.
10 μg의 융합 단백질의 3 투여량으로의 처리 후 종양이 없는 채로 남아 있는 마우스는 50 일째에 1 x 103 38C13/HER2 종양 세포로 재공격했다. 모든 마우스는 종양이 없는 채로 남아 있었다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는, 더 큰, 확립된 종양이 Ab에 대해 융합된 IFN-α로 처리되는 경우에 면역적 기억을 갖는 적응 면역 반응이 개시된다는 것을 시사한다.
토의
rIFN-α 가 B 세포 림프종 및 다발 골수종에 대한 활성을 나타내지만, 일관성이 없는 효능 및 전신 독성이 이의 유용성을 제한하여 왔다 (33). 본 작업은 IFN-α를 Ab에 대해 융합시키는 것이, 종양-특이적 Ab 에 의해 IFN-α 가 종양 세포에 대해 표적화되는 경우 나타난 보다 나은 개선점으로 종양에 대한 그의 효능을 개선시킨다는 것을 입증한다. 상기 항종양 효능은 임의의 명백한 독성 없이 나타난다. 이들 연구는 종양-특이적 Ab 를 이용한 IFN-α 의 융합으로 B 세포 림프종의 치료에 유효한 효과적 생물학적 제제가 수득될 수 있다는 것을 시사한다.
Ab 를 이용해 종양 부위로 IFN-α 를 보내는 것이 개선된 효능을 야기한다는 가설을 시험하기 위해, 발명자는 이에 대한 Ab가 활용가능한, 통상적인 TAA, HER2/neu를 발현하도록 조작된 잘 분석된 쥐과동물 B 세포 림프종을 선택했다. 본 발명에서는 유전자 변환에 의해 도입된 외래 Ag이 표적이었음에도 불구하고, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α는 기존에 기재된 면역치료요법보다 38C13 B 세포 림프종의 치료에 있어서 보다 효과적인 것으로 나타난다. 종양 유발 후 제 1 일째에 시작하는 1 μg 투여량의 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 를 이용한 처리는, 종양 유발 후 제 1 일째에 시작하여 5 일 동안 10 μg 의 항-Id IgG1-IL-2 융합 단백질을 이용한 처리에서와 마찬가지로 종양 성장 억제에 효과적인 것으로 나타났다 (34). 또한, 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 는 확립된 종양에 대해 효과적이었던 한편 (도 7), 항-Id IgG1-IL-2 는 종양 유발 후 제 3 또는 7 일째에 처리가 시작된 경우 약간의 항종양 활성을 가졌다 (34). 확립된 종양을 치료하는 능력은 또한, Id Ag 로 융합된 GM-CSF (35), CTLA-4 (36) 또는 CD40 리간드 (37) 보다는 Ab-표적화된 IFN-α 가 더욱 강력한 치료제라는 것을 시사하는데, 이는 이들 백신 전략 중 어느 것도 확립된 종양에 대해 효과적이지 않기 때문이다. 그러므로, 종양 세포에 대해 IFN-α 를 표적화하는 것은 B 세포 림프종을 치료하기 위한 유망한 접근법일 수 있었다.
종양-특이적 Ab로 종양 세포에 대해 IFN-α 를 표적화하는 것은 IFN-α 의 항종양 효능을 증가시킨다. 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 는 38C13/HER2 에서 증식을 억제하거나 아폽토시스를 유도하는데 있어서 IgG3-IFN-α 보다 더 효과적이고 (도 5a 내지 5d), 2.5 또는 1 μg 의 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 을 이용한 처리는 생체내 작은 종양의 성장을 억제하는데 있어서 동일 투여량의 IgG3-IFN-α 보다 더 효과적이었다 (도 3a 및 3b). 이들 결과는 종양-특이적 Ab가 IFN-α를 종양에 대해 유도함으로써, 감소된 전신 독성으로 그의 치료 지표를 개선시킨다는 것을 제안한다.
현저히, IgG3-IFN-α 는 rIFN-α 보다 더 강력한 항종양 활성을 나타내었다 (도 4a). rIFN-α가 다양한 종양의 치료에 있어서 효과적이지만 (38 내지 40), 사이토카인의 매우 짧은 반감기로 인해, 높은 투여량을 이용한 연장된 치료가 효과적 항종양 활성을 나타내기 위해 일부분 필요하다. 상기 연구에서, 발명자는 IgG3 Ab 의 IFN-α 로의 융합이 이의 반감기를 유의하게 연장시켰고 (도 4b), 이러한 연장된 반감기가 융합 단백질의 생체내 항종양 활성을 증가시키는 것에 기여할 수 있다는 것을 입증했다 (도 4a). 또한 IgG3-IFN-α 의 Fc 영역이, B 림프종 세포 상에 존재하는 Fc 수용체에 대해 IFN-α를 표적화시키는 것을 도울 수 있으며, 결과적으로 이는 항종양 활성을 증가시킨다. 그러므로, IFN-α 를 IgG3 Ab 로 융합시키는 것은 IFN-α 의 항종양 효능 개선에 다수의 장점을 제공할 수 있다.
IFN-α 가 면역 반응의 활성을 포함하는 다수의 활성을 갖지만, 직접적인 세포독성이 항-HER2/neu -IgG3-IFN-α 의 강력한 항종양 활성에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. IFN-α 융합 단백질은 모두, 이러한 효과를 유의하게 증가시키는 종양 표적화로 38C13/HER2 에 대해 아폽토시스 및 항증식 활성을 나타내었다 (도 5a 내지 5d). IFN-α 융합 단백질이 작은 종양을 치료하는데 있어서 매우 효과적이지만 (도 3a 및 3b), 생존자 중 아무도 제 2 의 종양 유발에 대해 보호되는 면역 반응을 진전시키지 못했으며, 이는 IFN-α 융합 단백질의 직접적 세포독성이 종양 세포를 사멸시킴에 있어서 매우 효과적이고, 작은 종양 부하가 있는 경우 이러한 적응 면역성은 역할을 하지 않았다는 것을 시사한다. 38C13이 극도로 악성인 B 림프종 세포주이고, 200 개 정도의 근소한 세포를 주입한 마우스가 20일 내에 부피가 큰 종양으로 진전될 수 있기 때문에 (36), IFN-α 융합 단백질은 대부분의 접종된 종양 세포를 사멸시킴에 있어서 매우 효과적이어서, 장기간 생존자들이 나오게 할 것이다. NF-κB의 하향 조절 (41), 카스파아제-3의 활성에 의한 아폽토시스 유도 (42), 및 TRAIL 및 TRAIL 수용체 모두의 상향 조절 (43)을 포함하는 다수의 메카니즘은, 종양 세포에 대한 IFN-α-매개성 세포독성에 포함되는 것으로 나타났고, 발명자는 이들 메카니즘이 Ab-IFN-α 융합 단백질을 이용했을 때 관찰된 종양 세포에 대한 직접적 세포 독성에 기여하는 것으로 예측한다. 이와 일치하여, 발명자는 융합 단백질을 이용한 종양 세포 처리 후 STAT1 활성을 관찰했다 (도 6a 내지 6c).
마우스가 종양 접종 후 제 1 일에 시작하여 처리한 경우, IFN-α 융합 단백질은 기억 면역 반응을 개시하는데 실패하였지만, 마우스가 종양 접종 후 12 일째에 처리하기 시작한 경우, IFN-α 융합 단백질은 제 2의 종양 유발에 대해 보호된 면역 반응을 개시했다. 그러므로, IFN-α 융합 단백질은 상당한 크기의 종양 부하의 존재 하 보호성 적응 면역성을 활성화시킬 수 있다. IFN-α가 DC 분화 및 성숙형의 자극을 통해 적응 면역성을 활성화시킬 수 있기 때문에 (9), 확립된 종양은 IFN-α의 존재 하 DC 활성에 대해 TAA 를 보다 더 제공할 수 있다. 또한, 외래 Ag 인간 HER2/neu 는 상기 모델에서의 종양 세포의 면역원성을 증가시켜 항종양 면역성에 기여할 수 있다.
CD20, B 세포에 의해 발현된 Ag는 대부분의 B 세포 림프종에서 발현되며 (44), 항-CD20 (리툭시마브 (rituximab), Genentech;)은 작은 독성을 가지고 림프종에 대해 엄청난 효능을 갖는 가장 성공적인 암 치료제 중 하나이다 (45). 항-HER2/neu IgG3-IFN-α 는 38C13/HER2 에 대해 가장 효과적이지만, HER2/neu 는 림프종 세포에서 정상적으로 발현되지 않으므로, 이는 아마도 림프종의 치료에서 제한된 치료적 적용을 가지지만 HER2/neu 를 발현하는 암의 치료에 있어서 효과적일 것이다. 대조적으로, IFN-α 의 항-CD20 으로의 융합은, 한 단백질 내에서 항-CD20의 항림프종 활성과 IFN-α 의 강력한 면역자극성 및 세포독성 활성을 조합하여 보다 큰 항종양 활성으로 림프종에 대해 효과적인 융합 단백질을 수득케 할 것으로 기대된다. 추가적으로 IFN-α 는, IFN-α 처리 후 B 세포 림프종을 갖는 환자에서 나타났던 바와 같이 CD20 발현을 추가적으로 상향 조절할 수 있다 (46). 발명자는 현재 B 세포 림프종의 쥐과동물 모델에서의 항-CD20-IFN-α 융합 단백질의 효과를 연구하고 있다.
요약하면, 발명자는 IFN-α가 TAA 를 인지하는 항체에 연결된 신규한 융합 단백질을 구축하고 분석했다. 본 결과는 IFN-α 의 종양-특이적 항체로의 융합이 임의 명백한 독성이 관찰되지 않은 항종양 활성으로 IFN-α 의 효능을 극적으로 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 현저하게, Ab-IFN-α 융합 단백질은 확립된 종양에 대해 효과적이었다. 그러므로, 종양-특이적 항체에 융합된 IFN (예를 들어 IFN-α) 은 B 세포 림프종의 치료에 대한 전망을 나타낸다.
참고문헌
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실시예 2
항- CD20 - IFN α 융합 단백질
도입부
본 발명자들의 초기의 연구 결과는 IFN-α 에 결합되어 있는 항-HER2/neu 가 있는 융합 단백질이 HER2/neu 발현 림프종의 치료에 유효한 치료책임을 나타냈다. 이러한 연구를 연장시켜, IFN-α 의 항-CD20 와의 융합이 CD20 발현 림프종 치료에 유효한 치료책이라는 것을 보이기로 했다. CD20 은 실제적으로 모든 림프종에 존재한다. 그러나, HER2/neu 은 다수의 암에서 발현되고, 항-HER2/neu 융합 단백질은 이들의 치료에 유효할 것임에 유의해야 한다. 항-CD20 융합 단백질에서 IFN-α 는, 종양 세포에 대한 직접적인 세포독성 효과를 발휘하고, 항-종양 면역 응답성을 이끌어내는 것을 보조할 것으로 예상했다.
CD20 에 특이적인 재조합성 항체의 제조.
항-CD20 (리툭시마브) 에 대한 가변 영역을 증폭하고, 인간 카파 경쇄 및 감마 3 중쇄를 가진 키메라성 항체 제조를 위해 발현 벡터에 클로닝했다. 단백질을 생산하고, CD20 을 인식하는 그의 능력은 유세포분석 및 인간 B-세포주 다우디를 이용하여 시험했다. 도 8 에 나타낸 바와 같이, 재조합성 단백질은 리툭시마브 및 리툭시마브 재조합성 IgG1 에도 결합한다.
CD20 에 특이적인 항체에 결합된 인간 인터페론이 있는 항체 융합 단백질을 제조함
a. 융합 단백질의 고안
융합 단백질을 제조하려던 본 발명자들의 최초의 시도에서, IFN-α 를 (Gly4Ser)3 (서열 식별 번호 31) 로 이루어진 신축성 글리신-세린 링커를 이용하여 인간 IgG3 유전자의 카르복시-말단에 결합시켰다. 중쇄는 도 9 에 도식적으로 나타냈다.
융합 단백질 벡터가 올바른 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 확인한 후, 키메라성 항-CD20 경쇄를 이용하여 NSO 세포에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션체는 IgG 의 생산에 대해 ELISA 로 스크리닝했다. 최고의 시그널을 제공하는 클론을 증량시키고, 후속 서브클로닝을 롤러 병 (roller bottle) 에서 배양했다. 이어서, 상청액을 단백질 A 세파로오스 컬럼에 통과시키고, 결합한 단백질을 용출시키고, 비환원 및 후속 환원 모두에서 SDS-PAGE 로 분석했다 (도 10 참조). 단리한 단백질이 H2L2 분자로 조립되었지만, 대부분의 단리된 단백질들은 예상보다 더 작았다. 환원 후, 대부분의 중쇄들은 예상보다 더 작았고, 감마-3 중쇄 결핍 융합 단백질과 동일한 위치에 걸렸다. 그 인터페론은 단백질가수분해에 의해 융합 단백질로부터 제거된 것으로 보였다. 항-Fc 및 항-인터페론을 이용한 웨스턴 블롯은, 상단 밴드가 모두 중쇄이나, 가장 큰 것만 인터페론을 포함한다는 것을 확인시켜줬다.
신축성 링커는 단백질가수분해 절단의 표적이 될 수 있다. 따라서, 오직 1 개 카피의 Gly4Ser 만 있게 링커를 줄였다 (서열 식별 번호 32). 상기 벡터 및 연장된 링커를 가진 벡터를 적당한 경쇄를 이용하여 HEK293T-세포로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 35S-메티오닌에서 배양하여 방사선표지했고, 면역글로불린을 단백질 A 로 침전시켰고, SDS-PAGE 로 분석했다 (도 11). 연장된 링커가 있는 융합 단백질의 절단은 순조롭게 명확하지만, 링커가 오직 1 개의 Gly4Ser 로 이루어진 링커 (서열 식별 번호 32) 의 경우에는 절단이 일어나지 않았다. 따라서, 융합 단백질 제조에 사용하는 링커는 중요하며, 그의 안정성에 영향을 줄 수 있다.
b. 융합 단백질에 의한 CD20 의 인식
융합 단백질이 CD20 를 인식하는지 여부를 알기 위해, CD20 를 발현하는 인간 세포주 다우디를, 리툭산, 항-DNS/IgG3-hu-IFN-α 또는 항-CD20/IgG3-hu-IFN-α 와 함께 인큐베이션했다. 항-CD20/IgG3-hu-IFN-α 가 리툭산보다 더 잘 결합했다 (도 12). 항-DNS/IgG3-hu-IFN-α 융합은 또한, CD20 특이적 단백질보다는 덜하지만, 소정의 결합을 보여줬다. 항-DNS/IgG3-hu-IFN-α 의 결합 및 리툭산에 비해 강화된 항-CD20/IgG3-hu-IFN-α 의 결합은 hu-IFN-α 부분이 다우디 세포 상에서 발현하는 IFN 수용체에 결합하기 때문이라는 가설을 세웠다.
Timmerman 연구실은 인간 CD20 를 발현하는 쥐과동물 림프종 38C13 의 트랜스펙션체를 제작했다. 리툭산 및 항-CD20/ IgG3-mu-IFN-α 이 모두 상기 트랜스펙션체에 결합했다. 항-DNS/IgG3-mu-IFN-α 은 결합을 나타내지 않았다 (도 13).
c. 융합 단백질의 항-바이러스 활성
hu-IFN-α 융합 단백질의 항-바이러스 활성을 평가하기 위해, HeLa 세포를 2 x 1O5 세포/ml 로 시딩하고, 융합 단백질 또는 로페론 (재조합성 인간 인터페론 2a) 의 2 배 연속 희석물로 24 시간 동안 처리했다. 이어서, 세포를 VSV (수포성 구내염 바이러스) 로 4000pfu/100 μl 의 농도로 감염시켰다. 72 시간 후, 세포를 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 바이러스 감염에 대한 보호는, 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 스팟 덴시미터를 이용하여 각 웰에서 염색량을 측정하여 생존 세포를 정량하거나 또는 플라크 갯수를 계수하여 측정했다. 두 검정에서, 융합 단백질은 현저한 IFN-α 활성을 가졌지만, 로페론에 비해서는 활성이 약 100 배 감소되었다.
융합 단백질을 이용한 다우디 림프종 세포의 성장 저해 및 사멸.
융합 단백질에 의한 CD20 를 발현하는 림프종 세포의 성장 저해/사멸을 평가하기 위해 두가지 방법을 이용했다. 상기 실험을 위해, 자연적으로 CD20 를 발현하는 인간 세포주, 다우디를 이용했다는 점에 유의한다. 첫번째 접근법에서, 다우디 세포는 각종 농도의 IFN-α, 항체 또는 융합 단백질과 72 시간 동안 인큐베이션하고, 성장 저해를 CellTiter 96 AQueous 세포 증식 검정을 이용하여 평가했다 (도 14). 항-바이러스 검정에서 더 적은 IFN-α 활성을 나타냈지만, 항-CD20/IgG3-hu-IFN-α 및 로페론은 림프종 성장 저해에 유사한 능력을 나타내, IFN-α 을 표적으로 하는 것은 그의 세포독성 효과를 증강시킨다는 점을 시사한다. 항-CD20/IgG3 + 로페론은 로페론 단독인 것에 비해 증강된 활성을 나타내지 않았다. 항-DNS/IgG3- hIFN-α, 리툭산 및 항-CD20/IgG3 은 오직 최고 사용 농도에서 소정의 성장 저해만을 보여줬다. 융합 단백질은 상기 검정에서 세포 성장 저해에 있어서 리툭산보다 더욱 활성이라는 점에 유의한다.
두번째 접근법에서, 다우디 세포는 각종 농도의 IFN-α, 항체 또는 융합 단백질과 함께 72 시간 동안 인큐베이션한 후, 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 로 처리하고, 유세포분석으로 분석했다. 10 pM 의 각종 단백질을 사용했을 때 수득한 결과를 도 15 에 나타냈다. 아폽토시스의 초기에 세포는 아넥신 V+PI- 이고; 후가 아폽토시스 및 사멸 세포는 아넥신 V+PI+ 이다.
상기 실험은 몇가지 사실을 증명한다. 리툭산 및 항-CD20/IgG3 는 두가지 모두, 심지어 시험한 최고 농도에서도, 아폽토시스를 거의 내지 전혀 유도하지 않는다. 예상한 바와 같이, 쥐과동물 IFN-α 는 인간 재조합성 IFN-α (로페론) 보다는 인간 세포주에 대해 덜 유효하며, 종양 세포를 표적으로 하지 않는 항-DNS/IgG3-mIFNα 는 재조합성 쥐과동물 IFN-α 와 유효성이 거의 같다. 그러나, 항-CD2O/IgG3-mIFN-α 를 이용한 종양 세포에 대한 쥐과동물 IFN-α 의 표적화는 세포 사멸의 유도에 유효성을 나타냈다. 항-CD20/IgG3-hIFN-α 은 항-DNS/IgG3-hIFN-α 보다 더욱 유효하여, 세포 사멸에 대한 세포 표적화의 기여를 다시금 증명한다. 상기 시험관내 검정에서, 로페론 및 항-CD2O/IgG3-hIFN-α 은 1 pM 의 낮은 농도에서 세포 사멸을 초래하는 유사한 활성을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). 그러나, 생체내 CD2O/IgG3-hIFN-α 은 종양 부위를 표적화하여 축적되지만, 로페론은 신체를 통틀어 그의 활성을 나타낼 것이라는 점을 유의해야 한다.
융합 단백질을 이용한 38 C13 - CD20 림프종 세포의 성장 저해 및 사멸
상기에 간략하게 언급한 바와 같이, Dr. John Timmerman 의 연구실에서 쥐과동물 림프종, 38C13-CD20 을 개발했는데, 이는 인간 CD20 을 발현하며, 동질유전자 C3H/HeJ 마우스에서 성장하게 된다. 상기 세포주의 이용가능함은 본 발명자들의 융합 단백질의 생체내 효능 시험을 가능하게 한다. 38C13-CD20 세포를 48 시간 동안 각종 항체 및 융합 단백질과 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 아넥신 V 및 PI 로 염색하고, 이들을 유세포분석으로 시험하여 사멸 및 아폽토시스를 측정했다. 단백질이 100 pM 의 농도로 사용되는 경우 (데이터는 나타내지 않음), 두 재조합체 mIFN-α 및 항-CD20-IgG3-mIFN-α 은 아폽토시스 유발에 매우 유효하며, 항-CD20-IgG3-mIFN-α 는 재조합성 mIFN-α 보다 어느정도 더욱 유효하다. 38C13-CD20 세포를 항-DNS-IgG3-mIFN-α 또는 리툭산으로 처리하여 소정의 아폽토시스를 유도했다. 상기 농도에서의 항-CD20/IgG3 를 이용한 처리는 세포 생존능에 전혀 영향이 없었다. 처리 농도를 10 pM 로 낮춘 경우 (도 16), 재조합성 mIFN-α 및 항-CD20/IgG3-mIFN-α 는 아폽토시스 유발에서의 유효성에 있어서는 계속되었으며, 항-CD20/IgG3-mIFN-α 는 재조합성 mIFN-α 보다는 더욱 유효했다. 항-DNS-IgG3-mIFN-α 를 이용한 처리 후 오직 소량의 아폽토시스가 관찰되었음은, 항-CD20-IgG3-mIFN-α 를 이용한 IFN-α 의 표적화는 더욱 유효한 치료제를 결과로서 제공한다는 점을 나타낸다. 상기 농도에서 리툭산은 아폽토시스를 거의 유발하지 않아서, 이는 비융합성 항-CD20 항체를 능가하는 항-CD20- IgG3/mIFN-α 융합 단백질의 우월성을 나타낸다. 다시금, 항-CD20/IgG3 를 이용한 처리는 세포 생존성에 전혀 영향을 주지 않았다. 1 pM 의 처리 투여량에서, 오직 항-CD20-IgG3-mIFN-α 만이 38C13-CD20 에서 아폽토시스를 유도했다 (데이터는 나타내지 않음). 0.1 pM 의 투여량에서, 처리한 그 어느것도 아폽토시스를 유도하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
대안적인 접근법에서, 38C13-CD20 세포는 상이한 농도의 각종 단백질로 처리하고, 성장 저해를 MTS 검정으로 모니터링했다 (도 17). 항-CD20/IgG3-mIFN-α 가 세포 성장 저해에 가장 유효했으며, 재조합성 mIFN-α 가 그 뒤를 이었다. 항-DNS/IgG3-mIFN-α 를 사용한 것은 소정의 성장 저해가 관찰되었다. 항-CD20/IgG3 및 리툭산은 세포 성장에 영향이 거의 없었다. 따라서, 본 검정에서 수득한 결과들은 아폽토시스를 모니터링할 때 관찰되는 것을 반영한다.
추가적인 IgG - IFNa 융합 단백질의 제조 및 특징분석
a. 항- CD20 - IgG1 - mIFN α 및 항- CD20 - IgG1 - hIFN α
최초의 단백질들은 인간 IgG3 골격에 융합된 IFN-α 를 이용하여 만들었다. 리툭산은 IgG1 이다. 면역글로불린 골격이 융합 단백질의 특성에 영향을 주는지여부를 알기 위해, IgG1 에 융합된 m-IFN-α 및 hu-IFN-α 가 있는 융합 단백질을 여기서 제조했다. 이들은 예상 분자량의 것이었다.
항-CD2O/IgG1-mIFN-α 는, 38C13-CD20 의 아폽토시스를 유도하는 그의 능력에 대해 평가했다 (도 18). 연구에서는, 그것이 유효하다는 것을 보여줬으며, IgG3 융합 단백질보다도 훨씬 더 유효할 수도 있다는 것을 보여줬다.
항-CD20/IgG1-hIFN-α 은 다우디 세포의 아폽토시스를 유도하는 그의 능력에 대해 평가했다. 연구는 그것이 항-CD2O/IgG3-hIFN-α 와 유사한 활성을 나타낸다는 것을 보여줬다 (도 19)
융합 단백질은 도 20 에 나타낸 바와 같이 다우디 세포의 성장을 저해하는 그의 능력에 대해 평가했다. 쥐과동물 및 인간 IFN-α 의 두가지 모두를 사용한 IgG1 융합물은 다우디 세포의 성장을 저해하는 그의 능력에 있어서 IgG3 융합물을 닮았다.
b. 알파 나선 링커를 이용해 IgG 골격에 결합된 IFN -α 와의 융합 단백질.
GlySer 링커를 서열 A(EAAAK)2A (서열 식별 번호 33) 를 가진 링커로 대체한 융합 단백질을 제조했다. 상기 서열은 알파 나선으로 폴딩하는 것으로 제안되었다.
단백질은 293T 세포에서의 임시적인 발현으로 제조했고, SDS-PAGE 로 평가했다. 단백질이 조립되고, 예상한 분자량의 것이 되었다. 링커의 절단이 전혀 관찰되지 않았다.
융합 단백질, 항-CD20-IgG3-hIFNα (α-나선 링커) 는, Gly4Ser (서열 식별 번호 32) 링커가 있는 융합 단백질과 동일한 농도로 사용되었을 때, 다우디 세포에서 아폽토시스를 유효하게 유도하는 것으로 나타났다 (도 21).
종양의 생체내 처리
Timmerman 연구소에서 인간 CD20 를 발현하도록 형질유도한 38Cl3 림프종을 본 연구에 이용했다. 38C13 은 동질유전자 C3H/HeJ 마우스에서 성장하는 공격적인 림프종이다. 형질유도체인 38C13-CD20 은 동일한 성장 특징을 나타낸다. 따라서, 면역 컴피턴트 동물에서 융합 단백질 매개성 보호를 연구하는 것이 가능하다.
a. 조기 종양의 처리
마우스 (4 마리의 군) 에 5000 38C13-CD20 세포를 제 0 일에 피하주사했다. 제 1, 2 및 3 일째에, 이들을 헤페스 완충 식염수 용액 (HBSS) 또는 0.4 μg, 2 μg 또는 10 μg 의 항-CD20-m-IFN-α 를 정맥내 처리하고, 종양 성장을 모니터링했다. 20 일째가지, HBSS 를 처리한 모든 동물들은 큰 종양을 가졌고, 희생시켜야만 했다. 대조적으로, 10 μg 의 융합 단백질을 처리한 동물에서는 종양 성장이 관찰되지 않았으며; 제 20 일 후에, 0.4 μg 의 융합 단백질을 처리한 4 마리의 동물들 중 3 마리에서 및 2 μg 를 처리한 마우스들 중 1 마리에서 종양이 자라기 시작했다. 상기 결과들은 항-CD20/IFN-α 융합 단백질이 생체내 종양 성장 저해 및 생존 증가에 매우 유효하다는 것을 보여줬다 (예를 들어, 도 22 참조).
b. 항- CD20 - mIFN α 융합 단백질은 보통 크기의 종양 치료에 있어서 리툭시마브 또는 항- CD20 / IgG3 보다 더욱 유효함
C3H/HeJ 마우스에 5000 38C13-CD20 세포를 제 0 일에 접종했다. 제 5, 6 및 7 일째에, 이들은 HBSS 또는 10 μg 의 항-CD20-IgG1 (293T 세포에서 생산), 항-CD20-IgG3, 리툭시마브 또는 항-CD20-IgG3-mIFNα 로 처리했다. 이들을 종양 성장 및 생존에 대해 모니터링했다 (예를 들어, 도 23 참조). 보통 크기의 종양 성장 저해에 있어서 항-CD20/IgG3-mIFNα 는 리툭시마브, 항-CD20/IgG3 또는 항-CD20/IgG1 보다 훨씬 더 유효했다.
융합 단백질의 종양 표적화 능력은 그의 생체내 효능을 현저하게 증강시킴
C3H/H3J 마우스에 5000 38C13-CD20 세포를 제 0 일에 접종하고, 제 5, 6 및 7 일째에 10 μg 의 항-CD20-IgG3, 10 μg 의 항-CD20-IgG3 + mIFN-α (융합 단백질에서와 동일한 몰 수로 투여량 선택), 항-DNS-IgG3-IFNα 또는 항-CD20-IgG3-mIFNα 를 처리한 후, 종양 성장 및 생존을 모니터링했다 (예를 들어, 도 24 참조). 항-CD20-IgG3-IFNα 는 종양 성장을 현저하게 지연시키고 생존을 촉진하여, 항체 조합 부위를 이용하여 IFNα 를 종양에 대해 표적화으로 하는 것은, 융합된 IFNα (항-DNS-IgG3-IFNα) 을 표적으로 하지 않는 융합 단백질을 주입하거나 또는 공유적으로 회합하지 않는 IFNα 과 함께 항-CD20 (항-CD20-IgG3 + mIFN-α) 를 주입하는 것보다 훨씬 더 유효한 치료책이 되도록 한다는 것을 시사한다.
융합 단백질 처리는 확립된 종양에 대해 유효함
여덟마리 C3H/HeJ 마우스의 군에 5000 38C13-CD20 세포를 접종하고, 제 8, 9 및 10 일째에 100 μg 의 항-CD20-mIFN-α 또는 HBSS 를 처리했다. 종양 성장 (도 25 참조) 및 생존 (도 26 참조) 에 대해 마우스를 모니터링했다. 항-CD2O-mIFN-α 를 접종한 마우스는 개선된 생존을 보인다 (도 26).
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 오직 설명을 목적으로 한 것이고, 이들의 견지에서 각종 개질 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 그것이 본 출원의 진의 및 목적 및 첨부되는 특허청구범위의 범위에 포함되는 것임이 이해될 것이다. 본원에 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 그 어떤 목적으로든 본원에 그의 전체가 참고문헌으로 포함된다.
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caccaaggca ggccccgtct gactcctcac 840 ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttccacc 900 aggctccggg caggcacagg ctggatgccc ctaccccagg cccttcacac acaggggcag 960 gtgctgcgct cagagctgcc aagagccata tccaggagga ccctgcccct gaccgagctc 1020 aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 1080 gacacacctc ccccgtgccc aaggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctcccccg 1140 tgcccaaggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccgtgccc aaggtgccca 1200 tgatttcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg 1260 aggtccagtt caagtggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagctgc 1320 gggaggagca gtacaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg 1380 actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca 1440 tcgagaaaac catctccaaa gccaaaatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg 1500 tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga 1560 acaactacaa caccacgcct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca 1620 agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacat cttctcatgc tccgtgatgc 1680 atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatctg 1740 gtggcggtgg atcctgtgat ctgcctcaaa cccacagcct gggtagcagg aggaccttga 1800 tgctcctggc acagatgagg agaatctctc ttttctcctg cttgaaggac agacatgact 1860 ttggatttcc ccaggaggag tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc atccctgtcc 1920 tccatgagat gatccagcag atcttcaatc tcttcagcac aaaggactca tctgctgctt 1980 gggatgagac cctcctagac aaattctaca ctgaactcta ccagcagctg aatgacctgg 2040 aagcctgtgt gatacagggg gtgggggtga cagagactcc cctgatgaag gaggactcca 2100 ttctggctgt gaggaaatac ttccaaagaa tcactctcta tctgaaagag aagaaataca 2160 gcccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atctttttct ttgtcaacaa 2220 acttgcaaga aagtttaaga agtaaggaat ga 2252 <210> 12 <211> 757 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 12 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Ile Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly 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245 250 255 Ser Cys Leu Asp Ala Ser Arg Leu Cys Ser Pro Ser Pro Gly His Gln 260 265 270 Gly Arg Pro Arg Leu Thr Pro His Pro Glu Ala Ser Ala Arg Pro Thr 275 280 285 His Ala Gln Gly Glu Gly Leu Leu Ala Phe Ser Thr Arg Leu Arg Ala 290 295 300 Gly Thr Gly Trp Met Pro Leu Pro Gln Ala Leu His Thr Gln Gly Gln 305 310 315 320 Val Leu Arg Ser Glu Leu Pro Arg Ala Ile Ser Arg Arg Thr Leu Pro 325 330 335 Leu Thr Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 340 345 350 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 355 360 365 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 370 375 380 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 385 390 395 400 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 405 410 415 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 420 425 430 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Leu Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 435 440 445 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 450 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cgtctctgca 420 gctagccaac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg 480 ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg ggagcccaaa 540 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccaatga tctcccggac ccctgaggtc 600 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 660 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 720 taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 780 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 840 aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 900 tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtcctacag ggcagccccg agaaccacag 960 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1020 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1080 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1140 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1200 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1260 tctggtggcg gtggatcctg tgacctgcct cagactcata acctcaggaa caagagagcc 1320 ttgacactcc tggtacaaat gaggagactc tcccctctct cctgcctgaa ggacaggaag 1380 gactttggat tcccgcagga gaaggtggat gcccagcaga tcaagaaggc tcaagccatc 1440 cctgtcctga gtgagctgac ccagcagatc ctgaacatct tcacatcaaa ggactcatct 1500 gctgcttgga atgcaaccct cctagactca ttctgcaatg acctccacca gcagctcaat 1560 gacctgcaag gttgtctgat gcagcaggtg ggggtgcagg aatttcccct gacccaggaa 1620 gatgccctgc tggctgtgag gaaatacttc cacaggatca ctgtgtacct gagagagaag 1680 aaacacagcc cctgtgcctg ggaggtggtc agagcagaag tctggagagc cctgtcttcc 1740 tctgccaatg tgctgggaag actgagagaa gagaaatga 1779 <210> 14 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 14 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Ile Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 Glu Trp 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tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcgacttac 360 tacggcggtg actggtactt caatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctctgca 420 gctagccaac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg 480 ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg ggagcccaaa 540 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccaatga tctcccggac ccctgaggtc 600 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 660 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 720 taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 780 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 840 aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 900 tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtcctacag ggcagccccg agaaccacag 960 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1020 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1080 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1140 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1200 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1260 tctggtggcg gtggatcctg tgacctgcct cagactcata acctcaggaa caagagagcc 1320 ttgacactcc tggtacaaat gaggagactc tcccctctct cctgcctgaa ggacaggaag 1380 gactttggat tcccgcagga gaaggtggat gcccagcaga tcaagaaggc tcaagccatc 1440 cctgtcctga gtgagctgac ccagcagatc ctgaacatct tcacatcaaa ggactcatct 1500 gctgcttgga atgcaaccct cctagactca ttctgcaatg acctccacca gcagctcaat 1560 gacctgcaag gttgtctgat gcagcaggtg ggggtgcagg aatttcccct gacccaggaa 1620 gatgccctgc tggctgtgag gaaatacttc cacaggatca ctgtgtacct gagagagaag 1680 aaacacagcc cctgtgcctg ggaggtggtc agagcagaag tctggagagc cctgtcttcc 1740 tctgccaatg tgctgggaag actgagagaa gagaaatga 1779 <210> 16 <211> 599 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 16 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Ile Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala 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tggagctatt tatcccggaa atggtgatac ttcctacaat 240 cagaagttca aaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcgacttac 360 tacggcggtg actggtactt caatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctctgca 420 gctagccaac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg 480 ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg ggagcccaaa 540 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccaatga tctcccggac ccctgaggtc 600 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 660 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 720 taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 780 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 840 aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg gcccaccctc 900 tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtcctacag ggcagccccg agaaccacag 960 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1020 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1080 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1140 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1200 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1260 tctggtggcg gtggatcctg tgatctgcct caaacccaca gcctgggtag caggaggacc 1320 ttgatgctcc tggcacagat gaggagaatc tctcttttct cctgcttgaa ggacagacat 1380 gactttggat ttccccagga ggagtttggc aaccagttcc aaaaggctga aaccatccct 1440 gtcctccatg agatgatcca gcagatcttc aatctcttca gcacaaagga ctcatctgct 1500 gcttgggatg agaccctcct agacaaattc tacactgaac tctaccagca gctgaatgac 1560 ctggaagcct gtgtgataca gggggtgggg gtgacagaga ctcccctgat gaaggaggac 1620 tccattctgg ctgtgaggaa atacttccaa agaatcactc tctatctgaa agagaagaaa 1680 tacagccctt gtgcctggga ggttgtcaga gcagaaatca tgagatcttt ttctttgtca 1740 acaaacttgc aagaaagttt aagaagtaag gaatga 1776 <210> 18 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 18 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Ile Ile Val Phe Leu 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gctccaagtc tggcacctca gcctccctgg ccatcagtgg gttccggtcc 300 gaggatgagg ctgattatta ctgtgcctcc tgggactaca ccctctcggg ctgggtgttc 360 ggaggaggga ccaaggtcac cgtcctaggt gag 393 <210> 22 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 22 Met Gly Trp Ser Trp Val Ile Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile 35 40 45 Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 85 90 95 Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp 100 105 110 Tyr Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val 115 120 125 Leu Gly Glu 130 <210> 23 <211> 1676 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid encoding fusion protein. <400> 23 atgggatgga gctgggtaat gcatctttct cctgtcagta actgcagatg cccgggaaag 60 gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac agcccgtcct 120 tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac ttgcaatgga 180 gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac gtgggatatt 240 gcaccgaccg gacttgcgca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc cagggcaccc 300 tggtcaccgt ctcctcagct agccaaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc 360 ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc 420 cgaaccggga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccaatgatct 480 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 540 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 600 agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 660 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 720 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 780 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctacagggc 840 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 900 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 960 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1020 gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1080 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 1140 ccctgtctcc gggtaaatct ggtggcggtg gatcctgtga cctgcctcag actcataacc 1200 tcaggaacaa gagagccttg acactcctgg tacaaatgag gagactctcc cctctctcct 1260 gcctgaagga caggaaggac tttggattcc cgcaggagaa ggtggatgcc cagcagatca 1320 agaaggctca agccatccct gtcctgagtg agctgaccca gcagatcctg aacatcttca 1380 catcaaagga ctcatctgct gcttggaatg caaccctcct agactcattc tgcaatgacc 1440 tccaccagca gctcaatgac ctgcaaggtt gtctgatgca gcaggtgggg gtgcaggaat 1500 ttcccctgac ccaggaagat gccctgctgg ctgtgaggaa atacttccac aggatcactg 1560 tgtacctgag agagaagaaa cacagcccct gtgcctggga ggtggtcaga gcagaagtct 1620 ggagagccct gtcttcctct gccaatgtgc tgggaagact gagagaagag aaatga 1676 <210> 24 <211> 557 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 24 Met Gly Trp Ser Trp Val Met His Leu Ser Pro Val Ser Asn Cys Met 1 5 10 15 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser 20 25 30 Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val 35 40 45 Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro 50 55 60 Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly 85 90 95 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gln Pro Arg Ala His 100 105 110 Arg Ser Ser Pro Trp His Pro Pro Pro Arg Ala Pro Leu Gly Ala Gln 115 120 125 Arg Pro Trp Ala Ala Trp Ser Arg Thr Thr Ser Pro Asn Arg Glu Pro 130 135 140 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Met Ile Ser 145 150 155 160 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 165 170 175 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 180 185 190 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 195 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gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac gtgggatatt 240 gcaccgaccg gacttgcgca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc cagggcaccc 300 tggtcaccgt ctcctcagct agccaaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc 360 ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc 420 cgaaccggga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccaatgatct 480 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 540 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 600 agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 660 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 720 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 780 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctacagggc 840 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 900 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 960 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1020 gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1080 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 1140 ccctgtctcc gggtaaagca gaggccgcag ctaaagaggc cgcagccaaa gcgggatcct 1200 gtgacctgcc tcagactcat aacctcagga acaagagagc cttgacactc ctggtacaaa 1260 tgaggagact ctcccctctc tcctgcctga aggacaggaa ggactttgga ttcccgcagg 1320 agaaggtgga tgcccagcag atcaagaagg ctcaagccat ccctgtcctg agtgagctga 1380 cccagcagat cctgaacatc ttcacatcaa aggactcatc tgctgcttgg aatgcaaccc 1440 tcctagactc attctgcaat gacctccacc agcagctcaa tgacctgcaa ggttgtctga 1500 tgcagcaggt gggggtgcag gaatttcccc tgacccagga agatgccctg ctggctgtga 1560 ggaaatactt ccacaggatc actgtgtacc tgagagagaa gaaacacagc ccctgtgcct 1620 gggaggtggt cagagcagaa gtctggagag ccctgtcttc ctctgccaat gtgctgggaa 1680 gactgagaga agagaaatga 1700 <210> 26 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 26 Met Gly Trp Ser Trp Val Met His Leu Ser Pro Val Ser Asn Cys Met 1 5 10 15 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile 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gcattggggc cagggcaccc 300 tggtcaccgt ctcctcagct agccaaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc 360 ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc 420 cgaaccggga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccaatgatct 480 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 540 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 600 agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 660 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 720 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 780 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctacagggc 840 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 900 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 960 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1020 gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1080 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 1140 ccctgtctcc gggtaaatct ggtggcggtg gatcctgtga tctgcctcaa acccacagcc 1200 tgggtagcag gaggaccttg atgctcctgg cacagatgag gagaatctct cttttctcct 1260 gcttgaagga cagacatgac tttggatttc cccaggagga gtttggcaac cagttccaaa 1320 aggctgaaac catccctgtc ctccatgaga tgatccagca gatcttcaat ctcttcagca 1380 caaaggactc atctgctgct tgggatgaga ccctcctaga caaattctac actgaactct 1440 accagcagct gaatgacctg gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg acagagactc 1500 ccctgatgaa ggaggactcc attctggctg tgaggaaata cttccaaaga atcactctct 1560 atctgaaaga gaagaaatac agcccttgtg cctgggaggt tgtcagagca gaaatcatga 1620 gatctttttc tttgtcaaca aacttgcaag aaagtttaag aagtaaggaa tga 1673 <210> 28 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein. <400> 28 Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Ile Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro 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cagggcaccc 300 tggtcaccgt ctcctcagct agccaaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc 360 ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc 420 cgaaccggga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccaatgatct 480 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 540 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 600 agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 660 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 720 aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc 780 cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctacagggc 840 agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 900 aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 960 agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1020 gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1080 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 1140 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Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Gln Pro 130 135 140 Arg Ala His Arg Ser Ser Pro Trp His Pro Pro Pro Arg Ala Pro Leu 145 150 155 160 Gly Ala Gln Arg Pro Trp Ala Ala Trp Ser Arg Thr Thr Ser Pro Asn 165 170 175 Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 180 185 190 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 245 250 255 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gly Thr Arg Gly Val Arg 275 280 285 Gly Pro His Gly Gln Arg Pro Ala Arg Pro Thr Leu Cys Pro Glu Ser 290 295 300 Asp Arg Cys Thr Asn Leu Cys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 305 310 315 320 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 325 330 335 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 340 345 350 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 355 360 365 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 370 375 380 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 385 390 395 400 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 405 410 415 Ser Pro Gly Lys Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 420 425 430 Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 435 440 445 Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys 450 455 460 Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe 465 470 475 480 Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile 485 490 495 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 515 520 525 Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met 530 535 540 Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 545 550 555 560 Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 565 570 575 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 580 585 590 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 595 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 33 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 34 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 35 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 36 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 37 Gly Gly Ala Gly Gly 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 38 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 39 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 40 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 41 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 42 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 43 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 44 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 45 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 46 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 47 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 48 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 49 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 50 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 51 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 52 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 53 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 54 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer. <400> 55 cgcggatcct gtgacctgcc tcagactc 28 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer. <400> 56 gctctagatc atttctcttc tctcagtctt c 31 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker. <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (50)

  1. 전장 항-CD20 항체에 결합된 인터페론 알파를 함유하는 키메라성 구축물로서, 상기 인터페론 알파는 단백질가수분해-내성 펩티드 링커에 의해 상기 항체에 결합되어 있고, 링커의 아미노산 서열은 SGGGGS 이며, 상기 구축물은 종양 세포에 접촉하는 경우 상기 종양 세포를 사멸시키거나 또는 그의 성장 또는 증식을 저해하는, 키메라성 구축물.
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  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 리툭시마브의 VH 및 VL CDR 을 포함하는 항체인 구축물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 리툭시마브의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체인 구축물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 리툭시마브인 구축물.
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  13. 약제학적으로 허용되는 부형제 및 제 1 항의 구축물을 함유하는, 암 세포를 사멸시키거나 또는 암 세포의 성장 또는 증식을 저해하기 위한 약제학적 제형물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 제형물이 단위 투여 제형물인 약제학적 제형물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 제형물이 비경구 투여용으로 제형화된 약제학적 제형물.
  16. 제 13 항에 있어서, 상기 제형물이 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 직접적인 종양 투여, 흡입, 직장내 투여, 질내 투여, 경피 투여 및 피하 데포 (depot) 투여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여용으로 제형화되는 약제학적 제형물.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 제형물이 단위 투여 제형물인 약제학적 제형물.
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  22. 암 세포를 사멸시키거나 또는 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하기 위한 의약으로서, 제 1 항의 구축물을 포함하는 의약.
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  24. 제 22 항에 있어서, 상기 암 세포가 전이성 세포인 의약.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 암 세포가 고형 종양인 의약.
  26. 제 22 항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암 세포인 의약.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 암 세포가 B 세포 림프종인 의약.
  28. 제 22 항에 있어서, 상기 암 세포가 B 세포 림프종, 폐암, 기관지암, 결장 직장암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계암, 말초신경계암, 식도암, 자궁경부암, 흑색종, 자궁 또는 자궁내막암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 담도암, 소장 또는 맹장암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 지방육종, 고환암, 및 악성 섬유성 조직구종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암에 의해 생산되는 세포인 의약.
  29. 전장 항체 또는 전장 항체의 사슬에 링커 펩티드에 의해 결합된 인터페론 알파를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로서, 여기에서, 상기 항체는 항-CD20 항체이고, 상기 링커의 아미노산 서열은 SGGGGS 로 이루어지는, 핵산.
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  37. 제 29 항의 핵산을 포함하는 세포.
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