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KR101673889B1 - Ｆⅷ-유래 펩타이드 - Google Patents

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KR101673889B1
KR101673889B1 KR1020117028276A KR20117028276A KR101673889B1 KR 101673889 B1 KR101673889 B1 KR 101673889B1 KR 1020117028276 A KR1020117028276 A KR 1020117028276A KR 20117028276 A KR20117028276 A KR 20117028276A KR 101673889 B1 KR101673889 B1 KR 101673889B1
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아피토프 인터내셔날 엔브이
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Abstract

본 발명은 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능하며 FⅧ에서 적어도 부분적으로 유래 가능한 펩타이드를 제공한다. 특히 본 발명은 서열 EDNIMVTFRNQASR을 포함하거나 구성되는 펩타이드를 제공한다. 또한 본 발명은 혈우병 A 및/또는 후천성 혈우병 내 저해제 항체 형성의 방지 또는 억제를 위한 이러한 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

ＦⅧ-유래 펩타이드{ＦⅧ-derived peptides}
본 발명은 펩타이드에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 인자 Ⅷ(FⅧ)에서 유래 가능한 적어도 핵심 서열인 펩타이드에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 예를 들어 혈우병 A 및 후천성 혈우병 치료시 인자 Ⅷ 저해제 항체 형성을 감소시키거나 방지하는데 사용될 수 있다.
혈우병
혈우병은 혈우병 A, 혈우병 B(크리스마스병) 및 폰 빌레브란드 병(Von Willebrand's disease)을 포함한 유전성 혈액 장애 그룹에 속한다.
혈우병에서 필수적인 응고 인자가 부분적 또는 완전하게 소실되기 때문에 혈액의 혈액 응고능이 현격히 감소되어 증가된 출혈 시간을 야기한다. 혈우병 A는 응고 인자 Ⅷ의 결손인 반면 혈우병 B는 응고 인자 Ⅸ의 결손이다. 양 질병 모두에서 결함 유전자는 X 염색체 상에서 발견되고, 따라서 이러한 이상은 X-연관이다. 혈우병 A는 혈우병 B보다 5배 이상 흔하다.
혈우병은 평생 유전되는 유전자 이상이고, 이는 여성을 보인자로, 남성을 이러한 이상을 유전시키도록 작용한다. 종전 가족력이 없는 경우는 새로운 진단의 약 1/3이다. 이는 전세계적이고 모든 인종군에서 발생한다. 약 6.000명의 인구가 영국에서 혈우병을 앓고 있다.
혈우병은 손상 후 연장된 시기 동안 출혈된다. 절단 및 찰과상과 같은 외부 손상은 일반적으로 심각한 문제를 야기하지 않는다: 어느 정도의 압력을 가하고 영향 받은 부위를 감싸는 것(예를 들어 석고로)에 의해 출혈을 중단시키는 것이 가능하다.
주요한 문제점은 관절, 근육 및 연조직 내의 내출혈이고, 이는 동시에 발생 가능하다. 뇌출혈과 같은 내출혈은 관리하기 매우 어렵고 치명적일 수 있다. 관절 내 반복된 출혈은 급성 통증을 유발하고 관절염 및/또는 장애를 유발하는 장기간 관절 손상을 유발할 수 있다.
혈우병 치료는 일반적으로 소실된 응고 인자의 대체에 의한 것이다. 약하거나 중간 정도의 혈우병의 경우 주사는 출혈 발생시 제공된다(필요시 치료법). 그러나 중증 혈우병의 경우 혈액 응고를 돕고 장기간 관절 손상의 가능성을 최소화하기 위해 정기적인 예방 주사가 제공된다.
혈우병 A에 대한 응고 인자 대체 요법의 가능한 중증 합병증은 인자 Ⅷ의 응고촉진 기능을 무효화시키는 항체의 발달이다. 인자 Ⅷ 저해제는 중증 혈우병 A 환자의 약 25%에서 발생한다. 선천성 혈우병 A 환자는 FⅧ의 유전적 결함을 지닐 수 있기 때문에 저해제 합성은 출혈 에피소드를 예방하거나 치료하기 위해 투여된 외부 단백질에 대한 동종면역 반응이다.
CD4+ T 세포는 FⅧ에 대한 면역 반응에 중추 역할을 한다. 항원-제시 세포(APC)에 의한 처리 후 FⅧ은 펩타이드 단편으로의 단백질 분해성 분해를 수행한다(Reding et al (2006) Haemophilia 12(supp 6) 30-36). 이후 이들 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 결합하여 APC의 표면 상에 제시된다. 이후 이들 복합체는 FⅧ에 특이적인 CD4+ 세포의 T 세포 수용체에 의해 인식된다. 적당한 동시자극 신호의 존재시 이러한 인식은 결국 CD4+ 세포가 B 세포에 의해 항체 합성을 지시하도록 한다.
저해제 형성의 발생은 먼저 인자 Ⅷ 처리 수에 따라 증가되나 50∼100 노출일 후 안정 상태를 유지하는 것으로 판단된다. 저해제 형성은 중간 정도 또는 약한 질병보다 중증 혈우병에서 더욱 더 흔하고, 인자 Ⅷ 경쇄 내 가장 명백한 큰 결실 및 넌센스 돌연변이인 일부 분자 결함은 저해제 형성 성향을 지니게 하는 것으로 판단된다. 대체 인자의 농도, 형태(정제 또는 재조합) 및 치료 내력과 같은 파라미터도 항체 생성의 가능성에 영향을 미친다.
혈우병 환자의 저해제로의 치료는 진행 중인 도전이다. 탈감작 기술을 이용한 면역 내성 유도(ITI)는 인자 Ⅷ에 대한 동종항체를 지닌 일부 환자에서 성공적이다. 이러한 치료법은 인자 대체 요법으로의 진행 중인 노출을 요구하고, 따라서 장기 전략이다.
ITI는 성공적일 수 있으나 유의적인 환자 비율(약 30%)이 ITI에 반응하지 못한다. 높은 저해제 역가를 지닌 환자는 치료에 덜 반응한다. 또 다른 유의적인 기여 요인은 ITI를 착수하는 시작 연령으로, 환자가 20세 이상인 경우 성공률이 크게 감소된다(Hay et at (2005) Seminars in Thrombosis and Hemostasis 32:15-21).
ITI 치료법이 성공적이지 못하고, 저해제가 생명을 지속시킬 때, 이러한 환자들은 일반적으로 고-반응자이기 때문에, 활성화된 프로톰빈(prothombin) 복합체 농축물(FEIBATM) 및 재조합-활성화된 FⅦ와 같은 FⅧ 바이패싱(bypassing) 산물을 지닌 출혈 에피소드를 치료하기 위해 필요하다. 그러나 이러한 제제의 이용은 파종 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation), 급성 심근경색증(acute myocardial infraction), 폐색전(pulmonary embolus), 혈전증과 같은 유해사례와 관련된다(Acharya and DiMichele(2006) Best Practice & Research Clinical Heamatology 19:51-66).
면역억제 치료법은 종종 ITI에 반응하지 못하는 환자에 이용된다. 치료는 면역 체계를 비-특이적으로 타겟하는 사이클로포스파마이드, 프레드니손, 아자티오프린 및 사이클로스포린과 같은 면역억제제의 투여를 포함한다. 이들 치료는 일반적인 면역억제와 관련된 부작용을 지닐 수 있다.
B 세포 CD20 항원에 대한 인간화 단일클론 항체인 RituximabTM을 이용한 선택적 B 세포 결핍 상에 재개된 관심이 존재한다. 그러나 주입 반응, 혈청병 및 기회 감염이 이러한 약물로 치료된 일부 소아에서 발생하였다 (DiMichele (2007) J Thromb Haemost 5:143-50).
후천성 혈우병
후천성 혈우병은 100만 명 중 1 내지 4명에 작용하는 드문 자가면역 이상이다. 이러한 이상에서 혈우병을 지니고 태어나지 않은 피험체는 인자 Ⅷ와 같은 응고 인자 중 하나에 대한 항체를 발달시킨다. 임신, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환 및 암이 후천성 혈우병 발달 위험률을 증가시키는 것으로 판단된다. 그의 생성을 유발하는 근원적인 면역 메커니즘 내 차이가 있으나 FⅧ 저해제의 임상 소견은 응고 인자 대체 요법에 반응하여 생성되었고 후천성 혈우병에서 생성된 것들은 유사하다.
후천성 혈우병 환자는 부분적으로 획득 저해제와 중증 출혈 합병증과의 관련으로 인해 25%에 근접하는 사망률을 지닌다. 획득 자가항체 저해제 요법은 주로 급성 출혈 합병증을 조절하거나 예방하는 필요성을 기반으로 하고, 이는 주로 수명 및 사지에 위협적이고 이차적으로 정상 응고를 복구시키기 위해 자가항체를 박멸한다.
낮은 역가 자가항체 저해제(< 5 Bethesda 단위)와 관련된 일부 출혈은 고용량으로 투여된 FⅧ 농축물로 효과적으로 치료된다. 돼지 FⅧ 농축물은 실험실에서 주입-후 FⅧ 응고 활성 수치를 실질적으로 측정하는 기회를 제공하는 유일한 대체 요법이기 때문에 후천성 혈우병-관련 출혈에 대한 중요한 제일선의 치료법으로 이전에 간주되었다. 이러한 제품은 돼지 파보바이러스에 의한 돼지 혈장 저장고의 오염으로 인해 2004년 시장에서 제거되었다. 현재 "바이패싱(bypassing)" 약제는 가장 일반적으로 사용되나 잠재적인 혈전형성 위험률이 존재하고 각각의 제품의 경우 약 80% 만의 효능이 존재한다. 혈장분리반출술 및 체외 면역흡착을 통한 혈장 교환은 적당한 지혈을 제공하기 위해 바이패싱 약제 또는 FⅧ 대체에 충분한 저해제 역가를 일시적으로 감소시키는데 필요하다.
자가항체 저해제의 박멸은 (1) 3∼6주 내 30%∼50% 효능을 지닌 코르티코스테로이드의 투여; (2) 예를 들어 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 2-사이클로데옥시아데노신과 같은 세포독성 및 골수억제성 화학요법제의 이용; (3) 정맥내 면역글루불린으로의 면역제어; 및 (4) rituximab으로의 선택적 B-림프구 결핍과 같은 면역억제 측정에 따라 달라진다. RituximabTM 반응제는 스테로이드의 동시 이용을 필요로 하고 재발은 재치료에 반응한다.
따라서 모든 현재 이용 가능한 혈우병 A 치료 및 후천성 혈우병의 자가항체 생성과 관련된 동종항체 생성을 감소시키는 방법은 결점을 지닌다. 따라서 혈우병 A 및 후천성 혈우병 내 항-FⅧ 항체의 문제점을 해결하는 개선된 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명자들은 FⅧ-유래 펩타이드로 환자를 예비-내성화함으로서 FⅧ 저해제 항체 형성을 방지하는 것이 가능함을 발견하였다.
본 발명의 관점의 개요
따라서 본 발명의 첫 번째 관점은 FⅧ에 대한 내성을 유도하거나 복구시키는 것이 가능한 FⅧ에서 유래 가능한 서열의 적어도 일부인 펩타이드에 관한 것이다.
첫 번째 실시태양에서, 본 발명은 하기의 FⅧ-유래 서열 중 하나를 포함한 펩타이드를 제공한다:
Figure 112011093921011-pct00001

하기의 변형 중 하나 또는 그 이상을 지님:
(ⅰ) 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산의 제거;
(ⅱ) 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산을 전하를 띠는 친수성 아미노산로 대체; 및
(ⅲ) 하나 또는 양 말단(ⅰ)에서 전하를 띠는 아미노산의 삽입
변형된 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
"모체"(변형되지 않은) 펩타이드는 PRCLTRYYSSFVNME 또는 DNIMVTFRNQASRPY이다.
두 번째 실시태양에서 본 발명은 다음의 서열을 포함한 펩타이드를 제공한다.
X(aa)n-핵심 서열-(aa)m
여기서 X는 전하를 띠는 친수성 잔기;
aa는 아미노산이며;
n은 0∼5 사이의 정수;
m은 0∼5 사아의 정수; 및
"핵심 서열"은 하기의 FⅧ-유래 펩타이드 군에서 선택된다:
Figure 112011093921011-pct00002
여기서 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
예를 들면 펩타이드는 다음 서열
XDNIMVTFRNQAS
을 포함한다.
세 번째 실시태양에서, 본 발명은 다음의 서열을 포함한 펩타이드를 제공한다:
Y(aa)n-핵심 서열-(aa)mZ
여기서 Y 및 Z는 역 극성을 지닌 전하를 띠는 아미노산이며;
aa는 아미노산이며;
n은 0∼5 사이의 정수;
m은 0∼5 사아의 정수; 및
"핵심 서열"은 하기의 FⅧ-유래 펩타이드 군에서 선택된다:
Figure 112011093921011-pct00003
여기서 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
예를 들면 펩타이드는 다음 서열
YDNIMVTFRNQASZ
을 포함한다:
세 번째 실시태양에서 예를 들면 Y가 양 전하를 띤 아미노산이고 Z는 음 전하를 띤 아미노산이다. 그렇지 않으면 Y가 음 전하를 띤 아미노산이고 Z가 양 전하를 띤 아미노산이다.
예를 들면 전하를 띠는 즉 친수성인 아미노산은 D, E, K, H 또는 R이다. 예를 들어 양 전하를 띤 아미노산은 K, H 또는 R이다. 예를 들어 음 전하를 띤 아미노산은 D 또는 E이다.
본 발명의 첫 번째 관점에서의 펩타이드는 예를 들어 서열 EDNIMVTFRNQASR로 구성되거나 포함한다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점의 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함한 약학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 FⅧ에 대한 내성을 유도하거나 복구시키는 것이 가능한 FⅧ에서 완전히 또는 부분적으로 유래 가능한 다수의 펩타이드를 포함한다.
상기 조성물은 다수의 펩타이드가 개별적으로 별도, 후속, 연속 또는 동시 투여로 제공되는 키트 형태이다.
본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 인자 Ⅷ 저해제 항체 발달을 억제하거나 감소시키거나 방지시키는데 이용된다.
또한 본 발명은 인자 Ⅷ 저해제 항체의 발달을 억제시키거나 감소시키거나 방지하기 위한 약물 제조시 이러한 펩타이드 또는 조성물의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 피험체에 이러한 펩타이드 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한 피험체 내 인자 Ⅷ 저해제 항체의 발달을 억제시키거나 방지하거나 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 피험체는 FⅧ 결핍이다. 더욱 상세하게는 상기 피험체는 혈우병 A를 지니고, 인자 Ⅷ 대체 요법을 진행 중이거나 수행할 예정이다.
또한 상기 피험체는 후천성 혈우병을 지니거나 이에 걸릴 위험이 있다.
인자 Ⅷ 저해제는 HLA-DR2를 발현하는 개체에서 더욱 빈번하게 발견된다. 따라서 본 발명의 방법으로 치료받는 상기 피험체는 HLA-DR2 양성이다.

도 1: rhFⅧ/CFA로 프라임된 FⅧ+DR2+ 마우스 유래의 림프절 세포(LNC)에 대한 회상 반응
a) FⅧ 펩타이드 1-6에 대한 LNC 증식
b) FⅧ 펩타이드 7-12에 대한 LNC 증식
c) FⅧ 펩타이드 1, 3 및 11에 대한 LNC 증식
도 2: FⅧ-유래 펩타이드에 특이적인 FⅧ+DR2+ T 세포 하이브리도마 클론의 대표적 예시
도 3: rhFⅧ/CFA로 프라임된 FⅧ-DR2+ 마우스 유래의 LNC에 대한 회상 반응
도 4: FⅧ-유래 펩타이드에 특이적인 FⅧ-DR2+ T 세포 하이브리도마 클론의 대표적 예시
도 5: a) DNIMV 및 b) PRCLT에 특이적인 FⅧ-/- 클론
도 6: rhFⅧ/CFA로 프라임 전 펩타이드로 3x i.p 처리된 FⅧ+DR2+ 마우스에 있어서 FⅧ에 대한 LNC의 회상 반응.
도 7: FⅧ-유래 중복 펩타이드에 특이적인 FⅧ-DR2+ T 세포 하이브리도마 클론을 이용한 아피토프로 작용 가능한 펩타이드 에피토프 범위의 측정. 원본 펩타이드는 0으로 표시한다. N 말단 쪽으로 하나의 아미노산의 이동은 -1로, N말단 쪽으로 두 개의 아미노산의 이동은 -2로 표시한다. C 말단 쪽으로 하나의 이동은 +1로 표시한다.
도 8: FⅧ-유래 펩타이드 PRCLT, DNIMV 또는 이 둘의 혼합물로 처리된 FⅧ-DR2+ 마우스에 있어서 FⅧ에 대해 반응하는 림프절 세포 IFN-감마 생성.
도 9: EDNIMVTFRNQASR (EDNIMV) 또는 대조군 펩타이드 (DNIMV)로 자극시킨 천연 또는 순응시킨 마우스에서의 반응.
펩타이드
본 발명은 펩타이드에 관한 것이다.
용어 "펩타이드"는 일반적으로 α-아미노와 인접 아미노산의 카르복실기 사이의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되는 일반적으로 L-아미노산인 잔기 시리즈를 의미하는 일반적인 의미로 사용된다. 상기 용어는 변형된 펩타이드 및 합성 펩타이드 유사체를 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 화학 방법(Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer- Verlag, Berlin.)을 이용하여 제조된다. 예를 들어 펩타이드는 고형상 기술(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고, 수지에서 절단되고 고성능 액체 크로마토그래피(예를 들어 Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)에 의해 정제될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 제조사에 의해 제공되는 지침에 따라 ABI 43 1 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다.
또한 펩타이드는 재조합 수단 또는 인자 Ⅷ로부터의 절단에 뒤이어 하나 또는 양쪽 말단의 변형에 의해 제조된다. 펩타이드 조성물은 아미노산 분석 또는 서열분석(예를 들어 Edman 분해 절차)에 의해 확인된다.
실질적인 목적의 경우 펩타이드가 나타내는 다른 다양한 특성이 존재한다. 예를 들어 펩타이드는 생체 내에서 이론적으로 이용 가능하도록 충분히 안정함이 중요하다. 생체 내 펩타이드의 반감기는 10분, 30분, 4시간 또는 24시간 이상이다.
또한 펩타이드는 생체 내 우수한 생체이용율을 입증한다. 펩타이드는 간섭 없이 세포 표면에서 MHC 분자에 이를 결합시킬 수 있는 생체 내 입체형태를 유지한다.
핵심 잔기
적응성 면역 반응시 T 림프구는 단백질 항원의 내부 에피토프를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포(APC)는 단백질 항원을 포획하여 짧은 펩타이드 단편으로 분해시킨다. 펩타이드는 세포 내부에서 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 Ⅰ 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 세포 표면으로 운반된다. MHC 분자와 함께 세포 표면에 제시되면 펩타이드는 펩타이드가 T 세포 에피토프인 경우 T 세포(T 세포 수용체(TCR)를 통해)에 의해 인식된다.
따라서 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈(groove)에 결합하고 T 세포에 의해 인식 가능한 항원에서 유래 가능한 펩타이드이다.
최소 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈에 결합 가능하고 T 세포에 의해 인식 가능한 에피토프에서 유래 가능한 최소 단편이다. 일정한 면역 영역의 경우 일반적으로 최소 에피토프를 포함하나 그의 측면 영역과는 상이한 에피토프로 작용하는 중복 펩타이드의 "네스티드 세트(nested set)"를 생성하는 것이 가능하다.
동일한 토큰에 의해 절단된 펩타이드에 대한 반응을 측정함으로서 특정 MHC 분자:T 세포 결합에 대한 최소 에피토프를 확인하는 것이 가능하다. 예를 들어 반응이 중복 라이브러리 내 1∼15개 잔기를 포함한 펩타이드에 대해 수득되는 경우 양 말단에서 절단된 세트(즉 1∼14, 1∼13, 1∼12 등 및 2∼15, 3∼15, 4∼15 등)는 최소 에피토프를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 하가의 리스트에서 선택되는 FⅧ의 "핵심 잔기" 서열을 포함한 펩타이드를 제공한다:
Figure 112011093921011-pct00004
이들 핵심 잔기 서열은 실시예에서 나타난 바와같이 각 영역에 대한 최소 에피토프를 나타내거나 포함한 HLA-DR2 결합 알고리즘을 이용하여 예측된다.
아피토프
본 발명자들은 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드의 능력과 생체 내 내성을 유도할 수 있는 펩타이드의 능력 사이에 연계가 존재함을 종전 측정한 바 있다(WO 02/16410). 펩타이드가 너무 길어서 추가 처리(예를 들어 트리밍(trimming)) 없이 MHC 분자의 펩타이드 결합 홈에 결합할 수 없거나 부적당한 입체형태로 결합되는 경우 생체 내 내성생성성이 되지 않을 것이다. 한편 펩타이드가 MHC 펩타이드 결합 홈에 직접 결합하기에 적당한 크기 및 입체형태인 경우 이러한 펩타이드는 내성 유도에 유용할 것으로 예측될 수 있다.
따라서 시험관 내에서 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는지 여부를 조사함으로서 펩타이드의 내성생성 능력을 조사하는 것이 가능하다.
본 발명의 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 인자 Ⅷ 특이적 T 세포로부터 반응을 자극시킬 수 있다는 점에서 아피토프(Antigen Processing-Indepent epiTOPES)이다. 이러한 아피토프는 WO 02/16410에 기재된 규칙-기반 방법에 따라 FⅧ에 대한 내성을 유발할 것으로 예측될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 추가 처리 없이 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합 가능한 어떠한 길이도 된다. 일반적으로 본 발명의 펩타이드는 MHC 클래스 Ⅱ에 결합 가능하다.
MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 7 내지 13개, 더욱 일반적으로는 8 내지 10개 아미노산 길이이다. 펩타이드의 결합은 펩타이드의 주요 사 내 분자와 모든 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드-결합 홈 내 불변 사이트 사이의 접촉에 의해 양 말단에서 안정화된다. 펩타이드의 아미노 및 카로복시 말단에 결합하는 홈의 양 말단에 불변 사이트가 존재한다. 변동은 주로 필요한 유연성을 가능하게 하는 프롤린 및 글리신 잔기에서의 펩타이드 골격 내 비틀림에 의해 조절되는 펩타이드 길이이다.
MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 8 내지 20개 아미노산 길이, 더욱 일반적으로는 10 내지 17개 아미노산 길이이고, 더 길 수 있다(예를 들어 40개 아미노산까지). 이들 펩타이드는 양 말단에서 개방된 MHC Ⅱ 펩타이드-결합 홈(MHC 클래스 I 펩타이드-결합 홈과 달리)을 따라 확장된 입체형태 내에 놓인다. 펩타이드는 주로 펩타이드-결합 홈을 정렬시키는 보존 잔기와의 주-사슬 원자 접촉에 의해 적소에 유지된다.
펩타이드 서열
본 발명의 첫 번째 실시태양은 하기 핵심 잔기 서열 중 하나를 포함한 펩타이드에 관한 것이다:
Figure 112011093921011-pct00005
하기의 변형 중 하나 또는 그 이상을 지님:
(ⅰ) 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산의 제거;
(ⅱ) 하나 또는 그 이상의 소수성 아미노산을 전하를 띠는 친수성 아미노산로 대체; 및
(ⅲ) 하나 또는 양 말단(ⅰ)에서 전하를 띠는 아미노산의 삽입
변형된 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
측쇄 극성, 측쇄 전하 및 소수성 지수와 표준 아미노산의 목록을 표 1에 나타내었다.
아미노산 3-문자 1-문자 측쇄 극성 측쇄 전하
(pH 7)		 소수성지수
알라닌 Ala A 비극성 중성 1.8
아르기닌 Arg R 극성 양성 -4.5
아스파라긴 Asn N 극성 중성 -3.5
아스파트산 Asp D 극성 음성 -3.5
시스테인 Cys C 비극성 중성 2.5
글루탐산 Glu E 극성 음성 -3.5
글루타민 Gln Q 극성 중성 -3.5
글리신 Gly G 비극성 중성 -0.4
히스티딘 His H 극성 양성 -3.2
이소류신 Ile I 비극성 중성 4.5
류신 Leu L 비극성 중성 3.8
라이신 Lys K 극성 양성 -3.9
메티오닌 Met M 비극성 중성 1.9
페닐알라닌 Phe F 비극성 중성 2.8
프롤린 Pro O 비극성 중성 -1.6
세린 Ser S 극성 중성 -0.8
트레오닌 Thr T 극성 중성 -0.7
트립토판 Trp W 비극성 중성 -0.9
타이로신 Tyr Y 극성 중성 -1.3
발린 Val V 비극성 중성 4.2
소수성 아미노산은 G, C, M, A, P, I, L, V 및 방향족 아미노산 F 및 W을 포함한다. 소수성 아미노산은 서열의 말단에서 또는 서열 내에서 제거된다.
전하를 띤 친수성 아미노산은 K, R, D, H 및 E를 포함한다. 소수성 아미노산은 서열의 말단 또는 서열 내에서 전하를 띤 친수성 아미노산으로 교환된다.
하나 또는 그 이상의 전하를 띤 아미노산은 서열의 N-말단에서 삽입된다. 이롭게도 양 전하를 띤 아미노산이 한쪽 말단에서 삽입 또는 치환되고, 전하 쌍극자를 만들기 위해서 음 전하를 띤 아미노산이 다른 쪽 말단에서 삽입/치환된다.
모체 서열의 변형은 MHC 분자의 펩타이드 결합 홈에 펩타이드를 결합시키는 것, T 세포에 의해 인식되는 능력, 또는 에피토프로 작용하는 능력(MHC 분자에 결합하고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 존재하는)을 크게 악화시키지는 않는다. 이것은 공지된 항원 제시 에세이 및 T-세포 하이브리도마를 이용하여 테스트된다.
본 발명의 두 번째 실시태양은 다음의 서열을 포함한 펩타이드에 관한 것이다
X(aa)n-핵심 서열-(aa)m
여기서 X는 전하를 띤 친수성 잔기;
aa는 아미노산이며;
n은 0∼5 사이의 정수;
m은 0∼5 사아의 정수; 및
"핵심 서열"은 하기의 FⅧ-유래 펩타이드 군에서 선택된다:
Figure 112011093921011-pct00006
여기서 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
서열 (aa)n 또는 (aa)m 은 4와 5 아미노산 사이의 어떠한 서열일 수도 있다. 예를 들면 상기 펩타이드는 다음 서열을 지닌다:
XDNIMVTFRNQAS
이 경우 n=3, m=0 이다.
본 발명의 세 번째 실시태양은 다음의 서열을 포함한 펩타이드에 관한 것이다:
Y(aa)n-핵심 서열-(aa)mZ
여기서 Y 및 Z는 역 극성을 지닌 전하를 띤 아미노산이며;
aa는 아미노산이며;
n은 0∼5 사이의 정수;
m은 0∼5 사아의 정수; 및
"핵심 서열"은 하기의 FⅧ-유래 펩타이드 군에서 선택된다:
Figure 112011093921011-pct00007
여기서 펩타이드는 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하고 인자 Ⅷ 특이적 T 세포에 의해 인식 가능함을 특징으로 한다.
예를 들면 펩타이드는
EDNIMVTFRNQASR
Y=E;
(aa)n=DNI
m=0; 및
Z=R이다.
수득된 펩타이드가 추가 항원 처리 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합 가능함을 조건으로 상기 펩타이드는 N 및/또는 C 말단(각각 (aa)n 및 (aa)m)에서 추가 측면 서열과 함께 핵심 잔기 서열을 포함한다.
측면 N 및/또는 C 말단 서열은 인간 FⅧ 내 핵심 잔기 서열의 측면에 위치한 서열에서 유래 가능하다.
APIPS
하기를 포함한 다양한 항원 처리 독립적 제시 시스템(APIPS)이 알려져 있다:
a) 고정된 APC(CD28에 대한 항체 존재 또는 부재시);
b) 클래스 I 또는 Ⅱ MHC 분자를 포함한 지질막(CD28에 대한 항체 존재 또는 부재시); 및
c) 플레이트-결합 형태의 정제된 천연 또는 재조합 MHC(CD28에 대한 항체 존재 또는 부재시).
이들 시스템 모두는 MHC 분자와 함께 항원을 제시할 수 있으나 항원을 처리하는 것은 불가능하다. 이들 모든 시스템에서 처리 기능은 부재하거나 무능력하다. 이는 펩타이드가 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합하고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는지 여부를 조사하는 것을 가능하게 한다.
T 세포 반응을 조사하기 위한 고정된 APC의 이용은 절단된 펩타이드에 대한 반응을 측정함으로서 예를 들어 폴리펩타이드 내 최소 에피토프를 조사하는 연구와 같은 분야에 잘 알려져 있다(Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). APC는 예를 들어 포름알데하이드(일반적으로 파라포름알데하이드) 또는 글루타르알데하이드를 이용하여 고정된다.
지질막(평면 막 또는 리포솜임)은 인공 지질을 이용하여 제조되거나 APC 유래의 형질막/미세소체 분획이다.
이용시 APIPS는 조직 배양 플레이트의 웰에 도포된다. 이후 펩타이드 항원이 첨가되고 APIPS의 MHC 부분으로의 펩타이드 결합이 선택된 T 세포주 또는 클론의 첨가에 의해 검출된다. T 세포주 또는 클론의 활성화는 예를 들어 3H-티미딘 통합 또는 사이토카인 분비를 통해 당분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 측정된다.
인자 Ⅷ
본 발명의 펩타이드는 인자 Ⅷ에서 유래 가능하다. 또한 하나 또는 두 개의 측면 서열((aa)n 및 (aa)m))은 인자 Ⅷ에서 유래 가능하다.
인자 Ⅷ는 혈액 응고의 내인성 경로에 관여한다; 인자 Ⅷ는 Ca+2 및 인지질 존재시 인자 X를 불활성화 형태 Xa로 전환시키는 인자 Ⅸa에 대한 보조인자이다.
인자 Ⅷ 유전자는 2개의 양자 택일로 스플라이스된 전사체를 생성한다. 전사체 변이체 1은 혈장 내에서 순환되고 비공유결합 복합체 내에서 폰 빌레브란드 인자와 결합되는 거대 당단백질인 이소폼 a를 암호화한다. 이러한 단백질은 다수의 분열 이벤트를 수행한다. 전사체 변이체 2는 주로 인자 Ⅷc의 인지질 결합 도메인으로 구성되는 추정되는 소단백질인 이소폼 b를 암호화한다.
인간 인자 Ⅷ 유전자의 완전한 186,000개 염기쌍 서열은 1980년 중반에 규명되었다(Gitschier et al (1984) Nature 312 326-330). 동시에 완전한 2351개 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 클론이 배양된 포유류 세포 내에서 생물학적으로 활성인 인자 Ⅷ를 생성하는데 이용되었다(Wood et al (1984) Nature 312:330-337). 인간 인자 Ⅷ에 대한 완전한 2,351개 아미노산 서열은 서열번호: 1에 제공된다.
본 발명의 펩타이드의 핵심 잔기는 인자 Ⅷ에서 유래 가능하다. 측면 서열이 천연 FⅧ 폴리펩타이드의 핵심 서열의 측면에 위치한 서열과 동일하면 선택적으로 측면 서열은 인자 Ⅷ에서 유래 가능하다. 이 서열은 인자 Ⅷ 서열의 분절로부터 수득가능하거나 수득된다.
용해도
본 발명의 첫 번째 실시태양의 펩타이드는 하기의 펩타이드 중 하나의 변형된 형태이다:
Figure 112011093921011-pct00008

이들 펩타이드가 아피토프로 작용한다는 것과 생체 내에서 내성을 유발한다는 것은 이미 밝혀졌다(실시예와 국제 특허 출원 No.PCT/GB2008/003996 참고).
용해도가 펩타이드-메개 내성 유도시 중요한 고려사항이라는 것이 밝혀졌다. 용해도는 하기의 하나 또는 그 이상의 의해 개선된다:
(ⅰ) 하나 또는 그 이상의 소수성 잔기의 제거;
(ⅱ) 하나 또는 그 이상의 전하를 띤 친수성 잔기를 첨가하기 위해 첨가/치환
(ⅲ) 전하 쌍극자를 만드는 양쪽 말단에서 양 전하 및 음 전하를 띤 아미노산을 놓는다.
변형된 펩타이드는 모체(변형되지 않은) 펩타이드보다 더 용해성이다. 변형된 펩타이드는 모체 펩타이드보다 2,3,4 또는 5배정도 더 큰 용해성을 가진다. 상기 펩타이드는 0.5 mg/ml, 1 mg/ml 또는 5 mg/ml까지의 농도에서 용해된다.
내성
T 세포 에피토프는 자가 또는 외부의 어떠한 항원에 대한 적응성 면역 반응에 중추 역할을 한다. 과민 질환(알레르기, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함) 내 T 세포 에피토프에 의한 중추 역할은 실험 모델의 이용을 통해 입증되었다. 보조제와 함께 합성 펩타이드(T 세포 에피토프의 구조를 기반으로 한)의 주입에 의한 염증 또는 알레르기 질환을 유도하는 것이 가능하다.
이와 대조적으로 용해성 형태의 펩타이드 에피토프의 투여에 의한 특정 항원에 대한 면역 내성을 유도하는 것이 가능한 것으로 나타났다. 용해성 펩타이드 항원의 투여는 실험 자가면역 뇌척수염(EAE - a model for multiple sclerosis (MS)) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159- 1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); 및 관절염, 당뇨병 및 포도막망막염(상기 Anderton and Wraith (1998)에서 관찰됨)의 실험 모델 내 질환을 억제하는 효과적인 방법으로 입증되었다. 또한 이는 EAE(상기 Anderton and Wraith (1998)) 내 진행성 질환의 치료 방법으로서 입증되었다.
내성은 항원에 반응하지 않는 것이다. 자가 항원에 대한 내성은 면역 체계의 필수적인 특징이고, 이것이 소실되면 자가면역 질환이 유발될 수 있다. 적응성 면역 체계는 다양한 막대한 감염성 작용제에 반응할 수 있는 능력을 유지하면서 그 자신의 조직 내에 포함된 자가 항원의 자가면역 공격을 방지해야 한다. 이는 대부분 흉선(중추 내성) 내 아폽토시스성 세포사멸에 대한 미성숙 T 림프구의 민감성에 의해 제어된다. 그러나 모든 자가 항원이 흉선 내에서 탐지되지 않고, 따라서 자가-반응성 흉선세포의 사멸이 불완전하게 유지된다. 따라서 말초 조직(말초 내성) 내 숙성 자가-반응성 T 림프구에 의해 내성이 수득되는 메커니즘이 존재한다. 중추 및 말초 내성의 메커니즘 고찰은 Anderton et al (1999)(Immunological Reviews 169:123-137)에 제공되어 있다.
혈우병 A에서 환자는 인자 Ⅷ 유전자의 결함을 지닌다. 이는 인자 Ⅷ가 면역 체계에 의해 "자가" 항원으로 인식되니 않음을 의미한다. 인자 Ⅷ이 응고 인자 대체 요법 동안 투여되면 이에 따라 동종면역 반응이 외부 단백질에 대해 생성되어 FⅧ 저해제 항체의 생성을 유발한다.
본 발명의 펩타이드는 인자 Ⅷ에 대한 내성을 유도하는 것이 가능하여 FⅧ이 치료상 투여되는 경우 면역 반응을 유도하지 않고 FⅧ 저해제가 발달되지 않는다.
후천성 혈우병은 인자 Ⅷ에 대한 내성이 붕괴된 자가면역 질환이다. 이러한 경우 이러한 자가 단백질에 대한 내성을 복구시키고 병원성 면역 반응을 축소시키기 위해 본 발명의 펩타이드가 투여된다.
내성은 CD4+ T 세포의 일부부 이상에서 아네르기의 유도에 의해 유발되고 이를 특징으로 한다. T 세포를 활성화시키기 위해 펩타이드는 T 세포에 2개의 신호를 전달하는 것이 가능한 "전문적인" APC와 결합되어야 한다. 첫 번째 신호(신호 1)는 MHC-펩타이드 복합체에 의해 APC의 세포 표면 상에 전달되고 TCR을 통해 T 세포에 의해 수신된다. 두 번째 신호(신호 2)는 CD80 및 CD86과 같은 동시자극 분자에 의해 APC의 표면 상에 전달되고 CD28에 의해 T 세포의 표면 상에서 수신된다. T 세포가 신호 2의 부재 하에 신호 1을 수신하는 경우 불활성화되는 것으로 판단되고, 실제로 아네르기가 된다. 아네르기성 T 세포는 후속 항원 유발에 불응성이고, 다른 면역 반응을 억제하는 것이 가능하다. 아네르기성 T 세포는 T 세포 내성을 매개하는데 관련된 것으로 판단된다.
이론에 속박되지 않고 본 발명자들은 펩타이드가 숙성 항원 제시 세포에 의해 조종되어야 하기 때문에 MHC 분자와 함께 제시될 수 있기 전에 처리를 필요로 하는 펩타이드는 내성을 유도하지 않음을 예측하였다. 숙성 항원 제시 세포(대식세포, B 세포 및 수지상 세포와 같은)는 항원을 처리할 뿐만 아니라 신호 1 및 2 모두를 T 세포로 전달하여 T 세포 활성화를 유발하는 것이 가능하다. 한편 아피토프는 미숙성 APC 상에서 클래스 Ⅱ MHC에 결합할 수 있을 것이다. 따라서 이들은 동시자극 없이 T 세포에 제시되어 T 세포 아네르기 및 내성을 유발할 수 있을 것이다.
물론 아피토프도 숙성 APC의 세포 표면에서 MHC 분자에 결합 가능하다. 그러나 면역 체계는 숙성 보다는 더 많은 미숙성 APC를 포함한다(10% 이하의 수지상 세포가 활성화됨이 제안되었음, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). 따라서 아피토프에 대한 디폴트 위치는 활성화보다는 아네르기/내성이 될 것이다.
FⅧ에 대한 내성 유도는 당분야의 기술자에 의해:
(ⅰ) FⅧ 저해 항체:
(ⅱ) FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포
(ⅲ) FⅧ 저해 항체를 분비하는 것이 가능한 B 세포
의 수치 감소를 관찰함으로서 생체 내에서 모니터될 수 있다.
내성이 펩타이드 투여에 의해 유도되는 경우 항원-특이적 CD4+ T 세포의 증식 능력이 감소되는 것으로 나타났다. 또한 이들 세포에 의한 IL-2, IFN-γ 및 IL-4 생성은 하향-조절되나 IL-10의 생성은 증가된다. 펩타이드-유도 내성 상태의 마우스 내 IL-10의 중화는 질환에 대한 감수성을 완전하게 복구시키는 것으로 나타났다. 조절 세포군은 IL-10을 생성하고 면역 조절을 매개하는 내성 상태에서 지속됨이 제안되었다(Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).
따라서 내성 유도는
(a) CD4+ T 세포 내 아네르기의 유도(시험관 내 FⅧ와의 후속 유발에 의해 검출될 수 있음);
(b) (ⅰ) 증식 감소;
(ⅱ) IL-2, IFN-γ 및 IL-4 생성의 하향-조절; 및
(ⅲ) IL-10 생성의 증가를 포함한
CD4+ T 세포군의 변화
를 포함한 다양한 기술에 의해 모니터될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "내성 유발"은 내성을 유도하는 것이 가능함을 의미한다.
조성물
또한 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함한 약제학적 조성물과 같은 조성물에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6개의 본 발명의 펩타이드와 같은 다수의 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 조성물은 예방 또는 치료 용도이다.
예방 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 FⅧ에 대한 면역 반응의 생성을 감소시키거나 방지한다. 면역 반응 수치는 상기 조성물로 치료되지 않은 환자에서 수득되는 것 이하이다. "감소시킨다"라는 용어는 상기 조성물로 치료되지 않은 환자에서 관찰되는 반응(또는 동일한 시간-프레임에 대한 비치료 환자에서 관찰되는 반응)의 50%, 70%, 80% 또는 90% 감소와 같은 면역 반응의 부분적 감소가 관찰됨을 나나탠다. "방지한다"라는 용어는 FⅧ에 대한 감지 가능한 면역 반응이 관찰되지 않음을 나타낸다.
치료 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 FⅧ에 대한 이미 진행중인 면역 반응을 억제한다. "억제한다"라는 용어는 펩타이드 치료 전 수치와 비교시 진행중인 면역 반응의 수치 또는 치료가 제공되지 않은 동일 시점에서 관찰되는 수치의 감소를 나타낸다.
본 발명의 조성물로의 치료는 하기의 어느 하나 또는 전부의 수치 감소를 유발한다:
(ⅰ) FⅧ 저해 항체:
(ⅱ) FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포
(ⅲ) FⅧ 저해 항체를 분비하는 것이 가능한 B 세포.
이들 인자 모두의 검출은 ELISA, FACS 등과 같은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물로의 치료는 FⅧ에 특이적인 CD4+ T 세포에서 아네르기를 유발한다. 아네르기는 예를 들어 시험관 내 FⅧ로의 후속 유발에 의해 검출될 수 있다.
FⅧ에 대한 모든 면역 반응이 병원성은 아님을 명심하는 것이 중요하다. 비-저해 항-FⅧ 항체가 저해제 없는 혈우병 환자(Moreau et al (2000) Blood 95:3435-41) 및 건강한 혈액 공여자의 약 15%(Algiman et al (1992) 89:3795-9)에서 발견된다.
FⅧ 저해제는 정상 혈장 내 FⅧ를 불활성화시키는 환자 혈장의 능력이 시험되는 응고 Bethesda 분석의 Nijmegen 변형에 의해 검출된다. Bethesda 유니트는 혈장 FⅧ 활성의 50%를 중화시키는 항체 함량으로 정의되고, 0.6 BU 이상의 역가는 항체의 존재를 나타낸다.
저해제는 일반적으로 수치가 <5 BU인 경우 낮은 역가로 ≥5 BU인 경우 높은 역가로 분류된다
순환 FⅧ 저해 항체의 수치는 치료받지 않은 환자에서 관찰되는 항체 수치의 90%, 75%, 50%, 20%, 10%, 5%로 감소된다.
순환 FⅧ 저해 항체의 수치는 5, 4, 3, 2, 1 또는 0.5 BU로 감소된다.
본 발명의 펩타이드 및 조성물은 환자의 응고를 돕는데 이용 가능한 치료상 투여된 FⅧ의 함량 또는 비율을 증가시킨다. 이는 그의 치료 기능 발휘로부터 FⅧ 부분을 효과적으로 제거하는 FⅧ 저해제의 감소에 기인한다. 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 예를 들어 10%, 25%, 50% 75% 또는 100%까지 이용 가능한 FⅧ의 함량을 증가시킨다.
따라서 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 환자의 응고를 돕기 위해 투여될 필요가 있는 FⅧ의 함량을 감소시킨다.
제형
상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조되고; 주입 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태도 제조된다. 또한 제제는 유화되거나 펩타이드는 리포솜 내에 피막화된다. 활성 성분은 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수(예를 들어 인산염-완충 식염수), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 조성물은 습윤제 또는 유화제 및/또는 pH 완충제와 같은 최소 함량의 보조 물질을 포함한다. 완충염은 인산염, 구연산염, 아세트산염을 포함한다. 염산 및/또는 수산화나트륨은 pH 적정제로 사용된다. 안정화를 위해 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 이당류가 사용된다.
상기 조성물이 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 펩타이드의 상대 비율은 거의 동일하다. 또한 각각의 펩타이드의 상대 비율은 예를 들어 자가반응 T-세포의 특정 서브-세트 상에 내성 유발 반응을 집중시키기 위해 또는 하나의 펩타이드가 특정 HLA 형태의 다른 것 보다 더 우수하게 작용하는 경우 변경된다.
제형화 후 상기 조성물은 멸균 용기 내에 통합된 후 밀봉되고 저온 예를 들어 4℃에서 보관되거나 동결-건조된다.
통상적으로 상기 조성물은 동결건조된 분말로 제조된다. 동결건조는 안정화된 형태로 장기가-보관을 가능하게 한다. 동결건조 절차는 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html 참조. 만니톨, 덱스트란 또는 글리세린과 같은 충전제는 일반적으로 동결-건조 전에 사용된다.
상기 조성물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 설하, 비강내, 피내, 좌약 경로 또는 이식(예를 들어 서방성 분자를 이용)과 같은 통상적인 방식으로 투여된다.
상기 조성물은 비강내, 피하 또는 피내 경로를 통해 유리하게 투여된다.
본 발명의 펩타이드 및 조성물은 인간 피험체를 치료하는데 이용된다. 상기 피험체는 혈우병 A 특히 중증 혈우병 A를 지닌다. 상기 피험체는 FⅧ에 유전적으로 결함을 지닌다. 상기 피험체는 후천성 혈우병을 지닌다. 상기 피험체는 저해 항-FⅧ 항체를 지닌다.
상기 피험체는 FⅧ으로의 응고 대체 요법을 수행하거나 수행 예정이다.
상기 피험체는 FⅧ 유전자로의 유전자 요법을 수행하거나 수행 예정이다.
상기 피험체는 저해 항-FⅧ 동종항체 또는 자가항체를 발달시키기 위해 소인과 결합되는 HLA-일배체이다. 상기 피험체는 HLA-DR2를 발현시킨다. 개체의 HLA 일배체를 측정하는 방법은 당분야에 알려져 있다.
일반적으로 의사는 개별적인 피험체에 가장 적당한 실질적인 용량을 결정할 것이고 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변동될 것이다.
바람직한 실시태양에서 다수의 용량이 상승 농도로 환자에 제공되는 "용량 단계적 확대" 프로토콜이 수행된다. 이러한 방법은 예를 들어 봉독 알레르기에 대한 면역치료 적용시 포스포리파제 A2 펩타이드에 사용되었다(Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).
키트
편리하게는 상기 조성물이 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 혼합 조성물 또는 칵테일의 형태로 함께 투여된다. 그러나 동시, 개별적, 연속적 또는 혼합 투여를 위한 키트 형태로 개별적으로 펩타이드를 제공하는 것이 바람직한 경우도 존재한다.
또한 키트는 혼합 및/또는 투여 수단(예를 들어 비강내 투여를 위한 분사기; 또는 피하/피내 투약을 위한 주사기 및 바늘). 또한 키트는 사용 설명서를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 키트는 질병을 치료하고/또는 예방하는데 사용된다.
더욱 상세하게는 상기 조성물/키트는 혈우병 A 또는 후천성 혈우병을 치료하고/또는 예방하는데 사용된다.
혈우병 A
혈우병 A(전형적인 혈우병)는 인자 Ⅷ의 결함에 의해 유발된다.
혈우병 A는 남성 10,000명 중 1명의 추정 발병률을 지니는 반면 혈우병 B는 남성 40,000명 중 1명으로 발생하는 것으로 추정된다. 여성 5,000명 중 약 1명이 혈우병 A의 보인자이고, 20,000명 중 1명이 혈우병 B의 보인자이다.
혈우병은 일반적으로 3가지 종류로 분류된다: 혈액 내 응고 인자 수치를 기반으로 한 중증, 중등도 및 경증. 중증 혈우병의 경우 정상 응고 인자의 1 퍼센트 이하가 존재한다. 중증도의 정도는 세대에서 세대로 일관된 경향이 있다.
항간의 믿음과는 반대로 작은 절개 및 상처는 일반적으로 혈우병 환자에 위협을 제공하지 않는다. 오히려 가장 큰 위험은 관절 및 근육에서 발생하는 자연 출혈에서 기인한다. 이는 일반적으로 5 내지 15세의 연령의 빠른 성장 연령 동안 발생하는 경향이 있다.
관절 내 반복된 자연 출혈은 관절염을 유발하고, 인접한 근육은 연약해진다. 혈액 축적에 의해 유발된 신경 상의 압력은 통증, 저림 및 영향 받은 부위를 일시적으로 움직일 수 없음을 초래한다.
혈우병 A는 일반적으로 응고 효과를 측정하고 응고 인자 수치가 비정상인지 여부를 조사하는 혈액 검사로 진단된다.
공여자 혈액에서 분리되고 1970년대에 정제된 응고 인자의 개발은 혈우병에 대한 장기간 견해를 유의적으로 개선시켰다. 경증 내지 중등도 혈우병은 ad hoc 기준 상에서 FⅧ로의 치료를 이용할 수 있는 반면 중증 혈우병은 규칙적이고 기한 없는 치료를 필요로 한다.
종전 환자들은 수천의 혈장 기증으로 혼주된 인자 Ⅷ 농축물이 제공되었다. 이는 바이러스성 병원균 특히 인간 면역결핍 바이러스 및 간염 바이러스로의 오염의 상당한 문제점을 유발한다. 단일클론 항체 정제 기술, 열 불활성화 및 바이러스 사멸 세정제 처리는 혈장-유래 농축물을 비교적 안전하게 한다.
현재 재조합 DNA 기술은 RecombinateTM 및 KogenateTM과 같은 합성 제품 시리즈를 제공하였다. Kogenate는 인간 인자 Ⅷ를 발현하는 미숙 햄스터 신장 세포를 이용하여 제조된다. 수득된 인자는 매우 정제되고 혈장으로부터 바이러스의 전달의 어떠한 가능성도 배제시킨다.
본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 인자 Ⅷ 대체 요법 이전 및/또는 동안 투여된다.
혈우병 A는 ⅰ) 단일 확인 유전자 내 돌연변이에 의해 유발되고, ⅱ) 생체 내 응고 인자 수치의 경미한 증가가 중증 혈우병에서 경증 질병으로 전환시킬 수 있고, ⅲ) 현재 대체 요법은 차선책으로 간주되기 때문에 유전자 요법에 대한 이상적인 질병 타겟이다. 또한 응고 활성의 바람직한 수치의 "과대증"이 존재하는 경우 광범한 안정성이 존재한다.
불행하게도 현재 응고 인자의 장기간 발현을 가능하게 하기 위해 충분히 비-면역원성인 유전자 전달 시스템을 발견하는데 어려움이 있기 때문에 혈우병에 대한 치료법으로서 유전자 요법의 전망은 실현되지 않고 있다.
본 발명의 펩타이드는 인자 Ⅷ로의 유전자 요법 이전에 피험체를 내성화하고 또는 유전자 요법 후 환자에서 FⅧ 저해제 형성을 조종하는데 적당할 것이다.
후천성 혈우병
후천성 혈우병은 종전 정상 응고를 지닌 개체 내에서 FⅧ에 대한 자가항체 저해제 존재를 특징으로 한다. 연간 100만명의 개체군 당 1∼3의 추정 발병률을 지닌 드문 이상이다. 후천성 자가항체 저해제와 관련된 사망률은 동종항체를 지닌 개체의 실질적으로 낮은 사망 위험률과 대비하여 25%에 근접한다.
동종항체 저해제 환자와 비교시 후천성 혈우병은 (1) 더욱 심한 출혈 패턴; (2) 고령 개체군에서의 높은 발병률; (3) 약 50%의 사례로 자가면역 질환, 림프세포증식성 또는 악성 고형 종양, 임신 중이고, 페니실린 및 설폰아마이드와 같은 특정 항생제를 사용하는 것으로 확인된 바와 관련한 발생률; 및 (4) 일반적으로 환자 혈장 내 2%∼18% 범위의 잔여 인자 Ⅷ 수치를 유발하는 자가항체에 의한 타겟된 응고 인자 활성의 불완전한 중화를 지닌 타입 Ⅱ 약동학 패턴을 따르는 시험관 내 저해제 활성을 특징으로 한다.
본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 예를 들어:
ⅰ) 예를 들어 페니실린 또는 설폰아마이드로의 절박 치료
ⅱ) 종양 또는 다른 악성의 진행
ⅲ) 절박 또는 초기 임신으로 인한
후천성 혈우병 환자 또는 후천성 혈우병 발병 위험이 있는 것으로 판단되는 환자에게 투여된다.
본 발명은 본 발명 수행시 당업자를 돕고자 하고 본 발명의 범위를 한정하고자 하지 않는 실시예에 의해 더욱 기재될 것이다.
실시예
실시예 1: HLA-DR2 인자 Ⅷ 펩타이드의 선택
FDⅧ 15mer 펩타이드 시리즈는 3개의 HLA-DR 결합 알고리즘을 이용하여 비교되었다:
SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)
ProPred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/) 및
IEDB(http://www.immuneepitope.org/home.do).
하나 이상의 프로그램에 의해 HLA-DR2-결합이 예측되는 펩타이드가 선택되었고 측면 서열은 예측된 핵심 잔기에 대해 고안되었다(표 2).
펩타이드
번호		 FVIII First
AA		 단일아미노산
코드서열
1 2140 GTLMVFFGNVDSSGI GTLMV
2 0208 TQTLHKFILLFAVFD TQTLH
3 2114 SLYISQFIIMYSLDG SLYIS
4 2161 PPIIARYIRLHPTHY PPIIA
5 2318 PPLLTRYLRIHPQSW PPLLT
6 250 MHTVNGYVNRSLPGL MHTVN
7 322 LGQFLLFCHISSHQH LGQFL
8 478 DTLLIIFKNQASRPY DTLLI
9 545 PRCLTRYYSSFVNME PRCLT
10 607 TENIQRFLPNPAGVQ TENIQ
11 1788 DNIMVTFRNQASRPY DNIMV
12 2322 RYLRIHPQSWVHQIA RYLRI
실시예 2: 펩타이드에 대한 인자 Ⅷ 면역화 마우스 유래의 HLA - DR2 제한 세포의 반응 조사
HLA-DR2 형질전환 마우스는 보조제 내 인간 인자 Ⅷ로 면역화되었다. 배출 림프절 세포가 채취되고 상이한 농도의 표 2의 12개 펩타이드로 시험관 내에서 재자극되었다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
인자 Ⅷ 면역화 마우스 유래의 HLA-DR2 제한 세포는 펩타이드 DNTMV(1st 아미노산 1788)에 강하게 반응한다. 또한 펩타이드 PRCLT(545) 및 PPIIA(2161)에도 반응한다.
실시예 3: 펩타이드에 대한 HLA-DR2 마우스 유래의 T 세포의 반응 조사
HLA-DR2 마우스는 보조제 내 인자 Ⅷ로 먼저 면역화되었다. 면역 마우스 유래의 비장 세포는 인자 Ⅷ로 시험관 내에서 재자극되었고 수득된 림프모구는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 BW5147 흉선종과 융합되었다.
T-세포 하이브리도마가 HAT 배지 내에서 선택되었고 하이브리도마는 클론되고 인자 Ⅷ에 대한 반응이 시험되었다. 이후 하이브리도마는 12개의 예측 펩타이드에 대한 반응에 대해 선별되었다. PPIIA에 대한 반응이 더 약하고 덜 특이적이었으나 선별된 27개 하이브리도마 중 11개는 DNIMV에, 3개는 PRCLT에, 3개는 PPIIA에 반응하였다. DNIMV 및 PRCLT에 특이적인 2개의 하이브리도마의 반응은 도 2에 나타나 있다.
실시예 4 - 펩타이드에 대한 FⅧ-DR2+ 마우스 유래 림프절 세포의 반응 조사
HLA-DR2 형질전환 마우스는 인자 Ⅷ 결함 마우스와 교배되어 인간 HLA 클래스 Ⅱ MHC 분자를 발현하는 혈우병 모델을 생성하였다.
이들 FⅧ-DR2+ 동물은 보조제 내 인자 Ⅷ로 면역화되었다. 배출 림프절이 분리되고 펩타이드 패널에 대한 그들의 반응에 대해 시험되었다. 도 3에 나타난 바와 같이 이들 세포는 PRCLT 및 DNIMV에 잘 반응하였다. GTLMV에 대한 미약한 반응 및 RYLRI에 대한 유의적인 반응이 존재하였다.
실시예 5 - 펩타이드에 대한 HLA-DR2 마우스 유래 T 세포 반응 조사
HLA-DR2를 발현하는 인자 Ⅷ 결함 마우스는 보조제 내 인자 Ⅷ로 면역화되었다. 면역화 마우스 유래의 비장 세포는 인자 Ⅷ로 시험관 내에서 재자극되었고 수득된 림프모구는 상기 기재된 바와 같이 BW5147과 융합되었다. T-세포 하이브리도마는 12개 예측 펩타이드에 대한 반응에 대해 선별되었다. 또다시 대부분의 하이브리도마가 펩타이드 DNIMV 및 PRCLT에 반응하였다. 인자 Ⅷ에 특이적인 19개 하이브리도마 중 10개는 DNIMV에, 6개는 PRCLT에, 1개는 PPIIA에, 1개는 SLYIS에, 1개는 DTLLI에 반응하였다. 이들 하이브리도마에 의한 반응 예는 도 4에 나타나 있다.
이들 실험을 기반으로 2개의 펩타이드 DNIMV(첫 번째 아미노산 번호 1788) 및 PRCLT(첫 번째 아미노산 545)가 인간 인자 Ⅷ에 대한 HLA-DR2 제한 T-세포 반응시 면역우세 T-세포 에피토프로 구성됨이 명백하다.
실시예 6 - DNIMV 및 PRCLT는 아피토프로 작용함
아피토프가 되기 위해 펩타이드는 추가 항원 처리(즉 트리밍) 없이 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합 가능하고 T 세포에 제시되어야 한다. 현재의 경우 고정된 APC에 의해 제시되는 펩타이드의 능력이 조사되었다.
Mgar 세포는 신선하거나 1% 파라포름알데하이드로 고정되었다. 클론은 100 ㎕의 하이브리도마 세포를 20 ㎍/ml rhFⅧ 또는 펩타이드 에피토프의 존재 및 부재 하에 밤새 5 x 104 Mgar 세포와 배양함으로서 항원 특이성에 대해 시험되었다. 이후 상청액이 채취되고 ELISA에 의해 IL-2 생성에 대해 평가되었다. rhFⅧ가 생존 Mgar 세포에 의해 제시되어야 한다는 사실은 무손상 단백질이 제시되기 위해 항원 처리를 필요로 함을 입증한다. 한편 펩타이드 DNIMV 및 PRCLT는 생존 및 고정 Mgar 세포 모두에 의해 제시되고, 이는 이들 펩타이드가 아피토프로 작용함을 나타낸다(도 5).
실시예 7 - 아피토프로 작용 가능한 펩타이드 에피토프 범위의 측정
DNIMV 및 PRCLT 주변 서열 내에서 아피토프로 작용 가능한 펩타이드 에피토프 범위는 중복 펩타이드의 패널을 준비하고(페이지 53-55에 나타남) 실시예 5와 동일한 방법을 이용하여 T-세포 하이브리도마를 이용하여 이를 선별함으로서 확인되었다(도 7).
실시예 8 - DNIMV 및 PRCLT는 전체 인자 Ⅷ 단백질에 대한 내성을 유도함
HLA-DR2 형질전환 마우스는 보조제 내 인자 Ⅷ로 면역화 전에 2개의 용해성 펩타이드 또는 대조군의 PBS로 처리되었다. 마우스의 면역 상태를 평가하기 위해 배출 림프절이 분리되고 세포는 인자 Ⅷ 단백질로 시험관 내에서 재자극되었다. 도 6에 나타난 바와 같이 DNIMV 또는 PRCLT로 마우스 처리는 인자 Ⅷ에 대한 면역 반응의 실질적인 억제를 유발하였다.
실시예 9 - DNIMV 및 PRCLT가 인자 Ⅷ 넉아웃 마우스에서 내성을 유도 가능한지 여부의 조사
실시예 8로부터 이들 2개 펩타이드가 내인성 인자 Ⅷ를 발현하는 마우스 내에서 인자 Ⅷ에 대한 면역 반응을 방지할 수 있음이 나타났다. 실험은 이들 펩타이드가 인자 Ⅷ 결함 마우스에서 인자 Ⅷ에 대한 면역 반응을 방지하는지 여부도 측정하기 위해 FⅧ-DR2+ 동물로 반복되었다.
실시예 10 - DNIMV 및 PRCLT가 함께 인자 Ⅷ 넉아웃 마우스에서 내성을 유도 가능한지 여부의 조사
실시예 9에서 개별적으로 인자 Ⅷ 결함 마우스에서 인자 Ⅷ에 대한 면역 반응을 감소시키는 것으로 나타난 2개의 펩타이드가 결합되었다. 도 8에 나타난 바와 같이 DNIMV 및 PRCLT 모두로의 마우스 처리는 IFN-감마 생성의 감소에 의한 나타난 바와 같이 인자 Ⅷ에 대한 면역 반응의 실질적인 억제를 유발하였다. IFN-감마는 마우스에서 항체를 중화하는데 필요한 주요한 종류의 스위치 림포카인이다. 입증된 효과는 펩타이드 단독을 사용하여 관찰된 것보다 컸다.
실시예 11 - 변형된 펩타이드를 이용한 내성의 유도
펩타이드 DNIMV는 완전히는 아니고 부분적으로 용해성이 있다. 펩타이드의 용해도를 향상시키기 위해, 변형된 버전은 다음의 서열로 제조된다: EDNIMVTFRNQASR.
이것은 전하를 띤 친수성 잔기를 첨가하기 위해 N-말단에서 확장된다. 또한 프롤린 및 티로신 잔기를 제거하기 위해 C-말단에서 절단된다. 더욱이 펩타이드의 양쪽 말단에서 양 전하 및 음 전하를 띤 아미노산을 놓음으로써, 전하 쌍극자가 용해도를 증가시키는 것으로 보고되었다.
변형된 펩타이드는 DNIMV보다 더 용해성이 있으며, 비강 내 펩타이드 전달을 허용할 정도로 충분히 용해성이다. 이 펩타이드 에피토프를 이용한 내성의 유도를 평가하기 위해, FⅧ 결핍 마우스는 변형된 EDNIMV 펩타이드로 반 처리되었다(도 9에 '순응'으로 나타냄). 그 다음에 상기 마우스는 CFA의 DNIMV로 면역화되었으며, 10일 후 배출 림프절이 채취되고 DNIMV 또는 EDNIMV로 시험관 내에서 자극되었다. 도 9는 시험관 내에서 DNIMV 또는 EDNIMV로 자극된 천연 또는 순응 마우스의 반응에 대한 결과를 나타낸 것이다.
상기 결과는 EDNIMV가 DNIMV로 면역화된 마우스에서 면역 반응을 회상할 수 있다는 것을 증명한다. 또한 상기 경과는 CFA의 DNIMV로 프라이밍 후에 시험관 내에서 DNIMV 또는 EDNIMV에 대한 반응의 부재에 의해 밝혀진 바와 같이 EDNIMV로 순응된 마우스는 생체 내에서 DNIMV에 대한 면역 반응을 시작하지 못 한다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 12 - EDNIMV는 전체 인자 Ⅷ 단백질에 대한 내성을 유도함
EDNIMV가 전체 인자 Ⅷ 단백질에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 증명하기 위해 실시예 8에 기술된 바와 같은 실험이 변형된 펩타이드 EDNIMV에 대해 반복되었다.
방법
(ⅰ) rhFⅧ로 프라임된 DR2+ 마우스에 대한 회상 반응
HLA-DR2+ 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 무효(null) 마우스는 꼬리 밑면에서 피하로 400 ㎍ 열-사멸된 M. tuberculosis H37Ra이 보충된 Complete Freunds Adjuvant 내에서 유화된 40 ㎍ rhFⅧ로 면역화되었다. 10일 후 마우스는 희생되고 배출 림프절이 채취되었다. 단일 세포 현탁액이 제조되고 림프구는 추가 16시간 동안 0.5 μCi/웰 삼중수소 표지 티미딘으로 펄스 전 표시된 농도의 펩타이드 또는 대조군 항원과 72시간 동안 96-웰 평편 바닥 플레이트 내에서 웰 당 4∼5x105 세포수로 인큐베이트되었다. 이후 플레이트는 세포가 유리 필터 매트 상에서 채취되기 전 동결되었고 방사능 통합은 액체 섬광 β-계측기를 이용하여 측정되었다.
(ⅱ) DR2+ 마우스에서 생성된 T 세포 하이브리도마의 FⅧ 펩타이드 특이성
HLA-DR2+ 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 무효(null) 마우스는 상기와 같이 면역화되었다. 10일째에 배출 림프절이 채취되고 림프구는 20 ㎍/ml rhFⅧ의 존재 하에 24 웰 플레이트 내의 1 ml/웰, 2.5x106 세포수/ml로 3일간 배양되었다. 이러한 자극 후 림프구는 회수되고 세척되고 Nelson et al (1980) PNAS 77(5):2866에 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 TCRα-β- BW 융합 파트너 세포와 1개 림프구에 대해 4개 BW 세포의 비율로 융합되었다. 융합된 세포는 조심스럽게 세척된 후 HAT 배지 첨가 전 2일간 평편 바닥 96 웰 플레이트 내에서 평판배양되어 T 세포 하이브리도마에 대해 선택되었다. 세포는 성장에 대해 모니터되었고 융합 약 10일 후 수행되었고, 개별적인 클론이 선택되고 HAT 배지 내에서 24 웰 플레이트로 이동되었다. 클론은 HT 배지 후 완전 배지로 옮겨지기 전에 2주 이상 동안 HAT 배지에서 유지되었다. 클론은 100 ㎕의 하이브리도마를 20 ㎍/ml rhFⅧ의 존재 및 부재 하에 5x104 Mgar 세포와 밤새 배양함으로서 항원 특이성에 대해 시험되었다. 이후 상청액이 채취되고 FⅧ-특이성에 대해 양성으로 간주된 rhFⅧ에 대한 반응시 IL-2를 생성하는 클론으로 ELISA에 의해 IL-2 생성에 대해 평가되었다. 예측된 FⅧ 펩타이드의 레퍼토리를 조사하기 위해 20 ㎍/ml의 각각의 12개 펩타이드로의 밤새 인큐베이션 후 FⅧ-특이적 클론이 다시 IL-2 생성에 대해 시험되었다.
(ⅲ) rhFⅧ로 프라임된 FⅧ-/- 마우스에 대한 회상 반응
마우스가 FⅧ-결함, HLA-DR2+ 및 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 무효인 점을 제외하고는 (ⅰ)과 동일한 방법이 수행되었다.
(ⅳ) FⅧ-/- 마우스에서 생성된 T 세포 하이브리도마의 FⅧ 펩타이드 특이성
마우스가 FⅧ-결함 및 HLA-DR2+인 점을 제외하고는 (ⅱ)과 동일한 방법이 수행되었다.
(ⅴ) 면역우세 FⅧ 펩타이드로의 전-처리에 의한 DR2+ 마우스 내 FⅧ-특이적 반응의 내성화
HLA-DR2+ 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 무효 마우스는 PBS 내에 용해된 100 ㎍의 DNIMV, PRCLT 또는 PPIIA 또는 동일 부피의 PBS 단독으로 3회 처리되었다. 펩타이드는 각각의 투여 사이의 3∼4일로 복강내로 투여되었다. 최종 투여 후 마우스는 (ⅰ)의 경우와 같이 Complete Freunds Adjuvant 내에 유화된 rhFⅧ로 프라임되었다. 10일 후 배출 림프절이 회수되고 이후 림프구는 (ⅰ)의 경우와 같이 삼중수소 표지 티미딘 첨가 전 72시간 동안 대조군 항원뿐만 아니라 rhFⅧ 또는 각각의 내성화 펩타이드와 함께 시함관 내에서 배양되었다.
(ⅵ) 결합 면역우세 FⅧ 펩타이드로의 전-처리에 의한 DR2+ 마우스 내 FⅧ-특이적 반응의 내성화
HLA-DR2+ 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 무효 마우스는 PBS 내에 용해된 DNIMV, PRCLT 또는 DNIMV와 PRCLT 모두의 결합 또는 동일 부피의 PBS 단독으로 3회 처리되었다. 펩타이드는 8일에 걸쳐 복강내로 투여되었다. 최종 투여 후 마우스는 (ⅰ)의 경우와 같이 Complete Freunds Adjuvant 내에 유화된 rhFⅧ로 프라임되었다. 10일 후 배출 림프절이 회수되고 이후 림프구는 rhFⅧ로 시험관 내에서 재-자극되었다. 이후 상청액이 수집되고 IFN-감마가 측정되었다.
상기 명세서 내에 언급된 모든 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기재되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 분자 면역학 또는 관련 분야의 업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 존재한다.
서열번호: 1
Figure 112011093921011-pct00009

실시태양 7에서 제조된 중복 펩타이드 패널
DTLLIIFKNQASRPY에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00010

PRCLTRYYSSFVNME에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00011

DNIMVTFRNQASRPY에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00012

SLYISQFIIMYSLDG에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00013

PPIIARYIRLHPTHY에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00014

RYLRfflPQSWVHQIA에 대한 중복 세트
Figure 112011093921011-pct00015
<110> Apitope Technology (Bristol) Limited <120> PEPTIDE <130> FP-1440 <150> PCT/GB2010/000997 <151> 2010-05-17 <150> GB 0908515.0 <151> 2009-05-18 <160> 83 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu 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5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val 1 5 10 15

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  1. 삭제
  2. 삭제
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  6. 삭제
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  10. 서열 EDNIMVTFRNQASR으로 구성된(consisting of) 펩타이드.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 10항에 있어서, 상기 펩타이드는 피험체의 혈우병 치료용임을 특징으로 하는 펩타이드.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 펩타이드는
    (a) 혈우병 A를 지니고, 인자 Ⅷ 대체 요법을 시행 중이거나 시행 예정; 또는
    (b) 후천성 혈우병을 지니거나 발병 위험;
    을 지닌 피험체의 혈우병 치료용임을 특징으로 하는 펩타이드.
  17. 삭제
  18. 제 15항에 있어서, 상기 피험체는 HLA-DR2임을 특징으로 하는 피험체의 혈우병 치료용 펩타이드.
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