KR101784288B1

KR101784288B1 - 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101784288B1
Application number: KR1020170053907A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 이성란; 유한봉; 김태현; 최태원; 최종남; 권형일; 노우연; 정태화
Original assignee: (주)넥스젠바이오텍
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-10-11
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: WO2018199392A1; US20220192958A1

Abstract

본 발명은 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11(growth differentiation factor 11)과 열 충격 단백질 10(heat shock protein 10)의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 추후 기능성 화장품 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물{Fusion protein comprising growth differentiation factor 11 and heat shock protein 10 with increased skin cell proliferation effect and cosmetic composition for improving skin wrinkle comprising the same as effective component}

본 발명은 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11(growth differentiation factor 11)과 열 충격 단백질 10(heat shock protein 10)의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

다양한 성장 인자는 세포의 성장, 증식 및 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 성장 인자들의 특징은 특정 수용체와 결합하여 각각의 기능을 나타낸다는 것이다. 이들 성장 인자들은 짧은 반감기 및 안정성 부족으로 대량 생산에 많은 어려움이 있었으나, 유전자 재조합 기술의 발전으로 이러한 문제점을 해결할 수 있게 되었다.

2013년 미국 하버드 대학 와저스(Amy Wagers) 교수는 항노화와 밀접한 관련성이 있는 성장 분화 인자 11(Growth differentiation factor 11, GDF 11)를 발견하였다. 늙은 쥐와 젊은 쥐의 병체결합(parabiosis)을 통해 늙은 쥐가 젊음을 회복한다는 사실을 기반으로 2014년 성장 분화 인자 11의 항노화 기능 관련 논문을 발표하였다. 하지만 노바티스 생의학 연구소 연구자들은 근육생성을 억제하는 마이오스타틴(myostatin)의 아미노산 서열과 성장 분화 인자 11의 아미노산 서열이 매우 유사하다는 사실을 통해 성장 분화 인자 11에 의한 항노화 효과가 아닐 것이라는 반박을 내세웠다. 아직까지 이러한 논쟁은 지속되고 있으나 성장 분화 인자 11은 섬유아세포 및 콜라겐, 엘라스틴 등 피부 재생과 탄력에 도움을 주는 단백질로 알려져 있다.

열 충격 단백질(heat shock protein)은 극한 환경에 세포가 노출되었을 때 세포가 받는 피해를 막기 위해 발현되는 단백질 중 하나이다. 대부분의 열 충격 단백질은 극한 환경 노출에 따른 단백질의 기능 상실을 막아주는 샤페론(chaperon) 기능을 가지고 있으며, 다량의 에너지(ATP)를 필요로 한다. 피부에 있어서, 고온 및 자외선은 대표적인 극한 환경으로, 특히 자외선은 피부 노화의 직접적인 원인이 된다. 최근 자외선 차단 효과를 나타내는 열 충격 단백질에 대한 연구가 진행 중이며, 화장품 조성료로 사용하고자 하는 시도가 다양하게 진행 중이다.

본 발명에서는 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10을 융합하여 피부재생 효과가 우수한 성장 분화 인자 11 융합단백질을 개발하였으며, 이를 유효 성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물을 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제1032271호에는 혈관내피성장인자 및 섬유아세포성장인자를 포함하는 '피부세포 재생용 조성물, 그 제조방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0084825호에는 Hsp70의 발현을 억제하는 양파피 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 '자외선 노출에 의한 피부 과민 반응 예방 및 개선용 조성물과 이를 이용한 화장료'가 개시되어 있으나, 본 발명의 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 대장균 코돈에 최적화한 성장 분화 인자 11 코딩 유전자와 열 충격 단백질 10 코딩 유전자를 융합하여 신규의 융합 단백질을 제조하였다. 또한, 제조된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 피부 세포주에 처리한 결과, 개별 단백질 처리보다 융합단백질을 처리한 경우에 세포 증식 효과가 보다 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11(growth differentiation factor 11)과 열 충격 단백질 10(heat shock protein 10)의 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 숙주세포에서 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 대장균 코돈 최적화된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 코딩 유전자를 이용한 대장균에서의 생산 방법은 대장균 내에서 재조합 단백질이 응집체 형태로 발현되어 생산공정을 간소화하였으며, 재조합 단백질의 대량생산을 가능하게 하였고, 상기 방법에 의해 생산된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질은 피부 재생 및 주름 개선 기능이 우수하여, 신규의 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질(GDH10)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드(pET22b::GDH10)의 제작 과정 및 대장균으로의 형질전환에 관한 모식도이다.
도 2는 대장균에서 본 발명의 융합단백질 발현 여부 및 분리정제의 확인 결과로, A는 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질(GDH10)의 발현 및 니켈 아가로즈 컬럼 정제 과정을 SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 확인한 결과이며, B는 최종적으로 분리정제한 GDH10 단백질의 전기영동 결과이다. M, 크기 마커; 1, 발현 유도(induction) 후 응집체(inclusion bodies)로부터 가용화한 시료; 2, 컬럼에 붙진 않은 통과액(Flow through); 3, 컬럼 세척액(washing sample); 4~5, 용출 시료(elution sample).
도 3은 성장 분화 인자 11(GDF11), 열 충격 단백질 10(HSP10) 및 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질(GDH10)을 피부섬유아세포에 각각 처리한 후, 피부섬유아세포의 세포 증식을 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자(growth differentiation factor) 11과 열 충격 단백질(heat shock protein) 10의 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 피부 재생 및 주름 개선 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 성장 분화 인자 11-열 충격 단백질의 융합단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 성장 분화 인자 11-열 충격 단백질 10의 융합단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 말한다.

본 발명의 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열 중 2번째 내지 110번째 아미노산 서열로 이루어진 성장 분화 인자 11 단백질과, 111번째 내지 211번째 아미노산 서열로 이루어진 열 충격 단백질 10을 융합시켜 제작된 신규 단백질이다.

본 발명은 또한, 상기 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 1의 염기서열은 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 재조합 벡터는, pET22b 벡터에 합성한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 5' 말단(NdeI 제한효소 사이트)과 3' 말단 (XhoI 제한효소 사이트)에 인프레임(in frame)으로 융합하여 제조하였으며, 상기 유전자를 lac 프로모터(lac promoter)와 lacI 리프레서(lacI repressor)에 의하여 효과적으로 발현시켜 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, HEK 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 형질전환된 숙주세포는 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질의 융합백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.00002 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물의 제조

본 발명의 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 다음의 방법으로 제작하였다.

성장 분화 인자 11(Growth differentiation factor 11) 단백질과 파트너 단백질로 사용되는 열 충격 단백질 10(Heat shock protein 10)을 코딩하는 유전자를 주형으로 사용하여 숙주 미생물 내에서 발현될 있도록 최적화된, 211개의 아미노산으로 이루어진 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 단편을 제작 및 합성하였다.

성장 분화 인자 11의 C-말단(C-terminus)에 열 충격 단백질 10이 결합된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질(서열번호 2)을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 정방향 프라이머 1(5'-AAGGAGATATACATATGAACCTGGGTCTG-3'; 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 1(5'-CTGACCCGCGGAGCAGCCGCAGC-3'; 서열번호 4)을 이용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 성장 분화 인자 11을 코딩하는 330개의 뉴클레오티드(서열번호 1의 1~330번째 염기 서열)를 합성하였으며, 정방향 프라이머 2(5'-GCTGCGGCTGCTCCGCGGGTCAG-3'; 서열번호 5)와 역방향 프라이머 2(5'-GTGCTCGAGGTCAACGTA-3'; 서열번호 6)를 사용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 열 충격 단백질 10을 코딩하는 303개의 뉴클레오티드(서열번호 1의 331~633번째 염기 서열)를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 각각의 성장 분화 인자 11 단백질과 열 충격 단백질 10을 코딩하는 유전자를 주형으로 하여 정방향 프라이머 1(서열번호 3)과 역방향 프라이머 2(서열번호 6)를 사용하여 최종적으로 성장 분화 인자 11 단백질의 C-말단에 열 충격 단백질 10이 결합된 융합단백질을 코딩하는 633개의 뉴클레오티드로 구성된 유전자를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 합성하였다.

상기 유전자 단편과 재조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5' 말단 NdeI 및 3' 말단 XhoI)로 절단하고 삽입하여, 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::GDH10)를 제작하였다. 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli TOP10에 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다.

그 후, 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS(Novagen, 독일)에 형질전환시켜서, 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다.

실시예 2. 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 발현 유도, 분리 및 정제

실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS를 각각 1ℓ LB 배지(10% 트립토판, 10% 염화나트륨 및 5% 효모 추출물) 혹은 BSB 배지(1% 트립토판, 0.5% 효모 추출물, 1% 글루코스 및 0.1% HEPES(pH 7.0), ㈜넥스젠바이오텍)를 사용하여 회분 배양(batch culture) 시 OD₆₀₀=0.6~0.8이 될 때까지, 또는 20ℓ 발효기를 사용하여 연속 배양 시에는 OD₆₀₀=15~20이 될 때까지 배양하였다. 이 후, 세포 배양 배지에 각각 최종 1~5mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 가하여 재조합 대장균의 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도 후 3~4시간 더 배양하고 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, 8g 염화나트륨, 0.2g 염화칼륨, 1.44g 제2인산나트륨(Na₂HPO₄), 0.24g 인산이수소칼륨(KH₂PO₄)/ℓ, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질을 포함하는 용액을 분리하였다.

상기 분리된 용액들을 시료로 하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 단백질 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, IPTG 또는 락토오즈를 통해 발현 유도를 한 세포 조용해물에서 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 2A).

발현이 확인된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 분리, 정제하기 위해서 응집체(inclusion body)를 가용화 완충용액(5M 요소(urea), pH 11)으로 가용화한 후 초미세 여과방법(0.45㎛ 정밀여과막과 1K 초미세여과막)을 이용하여 재접힘(refolding) 과정을 수행하였으며, 저장용 완충용액(PBS)을 사용하여 최종적으로 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 분리하였다.

상기 융합단백질을 완전히 정제하기 위해 분리한 융합단백질을 니켈-아가로즈 컬럼에 1~3㎖/분의 속도로 통과시켰다. 이어 바인딩 완충용액으로 컬럼을 수 회 세척한 후 50, 100 및 250 mM 이미다졸 용액(pH 7.4)을 컬럼에 적용하여 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 컬럼에서 1㎖씩 분획, 용출시킨 후 10mM 인산칼륨(potassium phosphate) 버퍼를 사용하여 버퍼 내 이미다졸을 제거하여 최종적으로 융합단백질을 순수하게 정제하였고, 그 결과를 알아보기 위해 15% SDS-아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 최종 정제된 융합단백질을 예측된 크기 근처 (약 24~25kDa 히스 태그 포함)에서 확인할 수 있었다(도 2B).

실시예 3. 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 활성 측정-피부섬유아세포의 세포 증식 효과

실시예 2에서 분리, 정제된 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여 융합 단백질의 활성을 측정하였다.

피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)를 배양한 후 세포에 각각 0, 0.02ppm, 0.2ppm 농도의 성장 분화 인자 11(GDF11), 열 충격 단백질 10(HSP10), 또는 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 각각 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이 후 크리스탈 바이올렛 염색법으로 피부섬유아세포의 증식 여부를 확인하였다.

그 결과 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 농도가 증가할수록 피부섬유아세포의 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 각각의 단일 단백질 처리군(GDF11 및 HSP10의 활성 도메인)과 비교하여 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질(GDH10)의 세포 증식 효과가 비슷한 수준으로 관찰되었다. 이는 융합단백질 내의 GDF11 및 HSP10이 각각의 전체(full-length) 단백질에 해당되는 것이 아닌 GDH10 융합단백질 제조에 이용된 각각의 활성 도메인에 해당하고, 동일한 농도(예를 들면, 0.02ppm)의 각 단일 단백질 및 융합단백질을 처리한 경우에 융합단백질의 몰수는 각각의 단일 단백질(즉, GDF11 및 HSP10 활성 도메인)에 비해 대략 1/2 정도가 된다. 따라서, 동일한 농도에 대해 비슷한 피부섬유아세포 증식 효과가 나타난다면 융합단백질은 각각의 GDF11 및 HSP10에 비해 2배 정도의 피부섬유아세포 증식 효과를 갖는 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 처리한 경우가 각각의 GDF11 및 HSP10과 비교하여 피부섬유아세포 증식 효과가 비슷하게 확인되므로 적어도 2배 이상의 피부섬유아세포 증식 효과를 갖는다는 것을 알 수 있는 것이다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질은 피부 세포 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

<110> Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Fusion protein comprising growth differentiation factor 11 and heat shock protein 10 with increased skin cell proliferation effect and cosmetic composition for improving skin wrinkle comprising the same as effective component <130> PN17163 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF11-HSP10 fusion protein <400> 1 atgaacctgg gtctggattg tgacgagcac tcttctgaaa gccgttgttg ccgttaccct 60 ctgactgtag acttcgaagc attcggttgg gactggatca tcgctccaaa acgctacaag 120 gcgaactact gcagcggtca atgtgaatac atgtttatgc agaaataccc gcacacccat 180 ctggtccagc aggccaaccc gcgtggttcc gcgggcccgt gttgcacgcc gaccaaaatg 240 tctccgatta acatgctgta tttcaatgat aaacagcaga tcatctatgg caaaattccg 300 ggcatggtgg ttgatcgctg cggctgctcc gcgggtcagg cgttccgtaa attcctgccg 360 ctgttcgacc gtgttctggt tgaacgttct gcggcggaaa ccgttaccaa aggtggtatc 420 atgctgccgg aaaaatctca gggtaaagtt ctgcaggcga ccgttgttgc ggttggttct 480 ggttctaaag gtaaaggtgg tgaaatccag ccggtttctg ttaaagttgg tgacaaagtt 540 ctgctgccgg aatacggtgg taccaaagtt gttctggacg acaaagacta cttcctgttc 600 cgtgacggtg acatcctggg taaatacgtt gac 633 <210> 2 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF11-HSP10 fusion protein <400> 2 Met Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys 1 5 10 15 Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys 35 40 45 Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln 50 55 60 Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 65 70 75 80 Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr 85 90 95 Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser Ala Gly 100 105 110 Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu 115 120 125 Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met Leu Pro Glu 130 135 140 Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala Val Gly Ser 145 150 155 160 Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser Val Lys Val 165 170 175 Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys Val Val Leu 180 185 190 Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys 195 200 205 Tyr Val Asp 210 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaggagatat acatatgaac ctgggtctg 29 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctgacccgcg gagcagccgc agc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctgcggctg ctccgcgggt cag 23 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtgctcgagg tcaacgta 18

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11(growth differentiation factor 11)과 열 충격 단백질 10(heat shock protein 10)의 융합단백질.
제1항의 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항 또는 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질의 생산 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.